Développement d’un protocole de reconstitution des vésicules COPII sans cellules pour étudier le tri STING dans un système basé sur les cellules HEK-293

Résumé

Ce protocole décrit un système optimisé sans cellules pour reconstituer l’incorporation de STING dans les vésicules COPII, permettant une analyse biochimique contrôlée du tri des marchandises lors de l’exportation de RE.

Résumé

La voie cGAS–STING est un élément central de l’immunité innée. À l’activation, la protéine résidente du réticulum endoplasmique (RE) STING est emballée dans des vésicules COPII et transportée vers l’appareil de Golgi pour initier la signalisation en aval. Malgré l’importance de ce processus, les mécanismes moléculaires régissant le tri STING dans les vésicules COPII restent incomplètement compris. Ici, un flux de travail optimisé est présenté pour la reconstitution in vitro des vésicules COPII afin de faciliter une analyse contrôlée de la sélection des cargaisons. Une méthode évolutive est décrite pour préparer des cytosols à haute concentration (30–40 mg/mL) à partir de cellules en suspension HEK-293F, combinée à une procédure simple pour générer des cellules HEK-293T semi-perméabilisées comme source membranaire définie. Comparé aux systèmes traditionnels à base de cellules adhérentes, cette approche améliore la scalabilité, réduit les coûts et améliore la reproductibilité. En utilisant STING comme cargo modèle, le bourgeonnement de vésicules COPII et l’incorporation du cargo sont validés par l’analyse Western blot, avec une efficacité d’emballage basale d’environ 20 % dans des conditions définies. Ce système permet une manipulation contrôlée des paramètres biochimiques, y compris la stimulation des nucléotidiques, afin d’évaluer leurs effets sur l’incorporation des cargaisons. Ce protocole offre une plateforme robuste et adaptable pour étudier le tri des cargaisons médié par le COPII et peut être étendu à l’étude d’autres protéines transmembranaires et des facteurs régulateurs impliqués dans l’exportation de RE.

Introduction

La voie de signalisation cGAS-STING sert de mécanisme fondamental du système immunitaire inné, détectant l’ADN cytosolique double brin (dsDNA) pour initier une réponse antivirale. Lors de la détection de l’ADN ds, l’enzyme cGAS produit le dinucléotide cyclique cGAMP, qui agit comme un second messager se liant au STING ^1,2. De manière cruciale, STING réside sous forme de dimère inactif dans le réticulum endoplasmique (RE) en conditions d’état^{stationnaire 3}. Son activation nécessite une translocation rapide et fortement régulée de l’ER vers l’appareil de Golgi. C’est au Golgi que STING recrute et active les kinases en aval TBK1 et IRF3, conduisant à la production d’interférons de type I et de cytokines^{pro-inflammatoires 4}.

Le transport de STING est assuré par des vésicules recouvertes de COPII, les véhicules universels d’exportation de protéines issus de l’ER⁵. L’assemblage de la couche COPII — comprenant la petite GTPase Sar1, le complexe intérieur Sec23/24 et le complexe de couche extérieure Sec13/31 — est responsable à la fois de la déformation de la membrane ER en vésicules et du recrutement sélectif de la^{cargaison 6,7}. La Sec22b est triée en vésicules COPII via un épitope structurel reconnu par le complexe Sec23/24 de COPII⁸. D’autres cargaisons incluent la famille p24 et le marqueur ERGIC ERGIC-53, qui dépendent tous deux d’un motif φC dihydrophobe C-terminal pour trier^{le 9}. En revanche, certaines protéines ancrées dans le RE, telles que la ribophorine I (RPN1), restent confinées au RE et servent de marqueurs de structures intactes du RE, car elles ne sont pas transportées via les vésicules^{COPII 10}. Par conséquent, dans les expériences de reconstitution de vésicules COPII sans cellule, les Sec22b et p24 sont souvent considérés comme des cargaisons COPII, tandis que la ribophorine sert de marqueur pour surveiller la contamination par ER dans les préparations de vésicules. Bien que la machinerie générale du transport des COPII soit bien caractérisée, les indices moléculaires spécifiques qui déclenchent la séquestration sélective de la STING activée dans ces vésicules restent insaisissables. Comprendre ces mécanismes de tri est essentiel, car la dysrégulation du transport STING est liée à diverses maladies auto-immunes et autoinflammatoires, telles que la vasculopathie associée à la STING avec début en bas âge (SAVI) et le syndrome^{COPA 11}. Cependant, l’étude de ces événements transitoires et hautement dynamiques dans les cellules intactes reste techniquement un défi.

Pour relever ces défis, un système optimisé de reconstitution sans cellules a été développé afin d’interroger les exigences moléculaires du tri des cargaisons médié par COPII. Bien que les tests de bourgeonnement in vitro soient depuis longtemps un pilier de la biologie cellulaire¹², leur adoption généralisée est souvent limitée par le coût élevé et la complexité de la préparation de composants de haute qualité. Dans cette étude, un flux de travail simplifié est introduit utilisant les cellules en suspension HEK-293F comme source économique de cytosol actif et les cellules HEK-293T semi-perméabilisées comme donneur de membranes robustes. Le flux de travail global du système de reconstitution des vésicules COPII sans cellules est illustré à la Figure 1. Dans ce système, le Sec22b était utilisé comme contrôle positif pour confirmer l’incorporation de la cargaison dans les vésicules, tandis que le RPN1 était utilisé comme contrôle négatif pour surveiller et écarter une contamination par membrane RE. En utilisant STING comme prouve de concept, cette étude a démontré que le système modélise efficacement les aspects biochimiques essentiels du tri STING. Cette plateforme offrait un outil polyvalent et évolutif pour identifier les facteurs cytosoliques et les signaux membranaires qui régissent le tri STING, avec des applications potentielles pour étudier un large éventail d’autres voies de transport vésiculaires.

Protocole

Les lignées cellulaires HEK-293F (RRID : CVCL_6642) et HEK-293T (RRID : CVCL_0063) ont été obtenues auprès du Cell Resource Center du Collège Médical Union de Pékin. Les deux lignées cellulaires ont été authentifiées par profilage en tandem court (STR) et ont été confirmées exemptes de contamination par mycoplasme. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

Aucun participant humain ni vertébré n’a participé à cette étude. Par conséquent, une approbation éthique n’était pas requise. Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux directives institutionnelles de biosécurité.

1. Préparation du cytosol des cellules HEK-293F

1. Des cellules HEK-293F de semence à une densité de 1 × 10⁶ cellules/mL dans un milieu de culture de mammifère défini de 100 mL, complétés en pénicilline-streptomycine à 1 %. Cultivez les cellules dans une fiole conique de 500 mL.
2. Incubez la culture en suspension à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans un incubateur secoué pendant 60 heures.
3. Prélever les cellules par centrifugation à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Déterminez le nombre total de cellules à l’aide d’un compteur automatique.
4. Lavez la granule cellulaire avec 50 mL de solution physiologique phosphatée tamponnée (PBS). Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
5. Resuspendez la pellete cellulaire dans un volume égal de tampon de B88 glacé (20 mM HEPES, pH 7,3 ; 250 mM sorbitol ; 150 mM acétate de potassium ; 5 mM acétate de magnésium).
6. Lisez les cellules sur de la glace en faisant passer la suspension à travers une seringue de 5 mL équipée d’une aiguille de calibre 22 pour plus de 100 coups.
7. Examinez la lyse cellulaire par microscopie optique. Retirez les débris cellulaires par centrifugation à 20 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C.
8. Transférez le surnageant dans des tubes ultracentrifuge. Centrifugez à 100 000 × g pendant 1 h à 4 °C.
   ATTENTION : Assurez-vous que les tubes d’ultracentrifuge sont correctement équilibrés pour éviter les dommages aux équipements et les risques pour la sécurité.
9. Récupérez le surnageant clarifié. Concentrez l’échantillon à l’aide d’un dispositif d’ultrafiltration à seuil de poids moléculaire (MWCO) de 3 kDa à 4 000 × g à 4 °C.
10. Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique (BCA). Ajustez la concentration à 30–40 mg/mL.
    ATTENTION : Manipuler l’azote liquide avec un équipement de protection approprié pour éviter les dommages cryogéniques.
11. Aliquote le cytosol. Congeler instantanément les aliquotes dans de l’azote liquide et les stocker à −80 °C (Figure 2A)
    ATTENTION : Évitez plus de deux cycles de gel-dégel. Conservez les aliquotes à −80 °C pendant jusqu’à 6 mois.

2. Préparation des cellules HEK-293T semi-perméabilisées

1. Plaques de cellules HEK-293T exprimant une STING humaine de pleine longueur à une densité de 3 × 10⁶ cellules par plat de 15 cm dans un DMEM de 15 mL complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 heures.
2. Prélève les cellules à environ 60 % de confluence.
3. Aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec 10 mL de PBS glacé.
4. Ajoutez 2 mL de trypsine–EDTA à 0,25 %. Incubez à température ambiante pendant 2 à 3 minutes pour détacher les cellules.
5. Ajoutez 200 μL d’inhibiteur de trypsine du soja (1 mg/mL) pour stopper la trypsinisation. Resuspendez les cellules dans un tampon KHM glacial de 10 mL (20 mM HEPES, pH 7,2 ; 110 mM acétate de potassium ; 2 mM acétate de magnésium).
6. Pelletez les cellules par centrifugation à 250 × g pendant 3 minutes. Jetez le surnageant.
   ATTENTION : La Digitonine est toxique. Manipulez dans une hotte à fumée avec un équipement de protection individuelle approprié.
7. Résuspendez les cellules dans un tampon KHM glacé de 6 mL. Ajoutez 6 μL de solution de digitonine (40 mg/mL en DMSO).
8. Mélangez doucement par inversion. Incubez sur glace pendant 5 minutes.
9. Ajoutez 8 mL de tampon KHM pour diluer la digitonine. Centrifugez à 250 × g pendant 3 minutes pour collecter les cellules perméabilisées.
10. Résuspendez le pellet dans un tampon HEPES glacé de 14 mL (50 mM HEPES, pH 7,3 ; 90 mM acétate de potassium). Incubez sur glace pendant 10 minutes.
11. Centrifugez à 250 × g pendant 3 minutes. Résuspendez la pellete dans 1 mL de KHM· glacé(e) Tampon Cl (20 mM HEPES, pH 7,3 ; 110 mM KCl ; 2 mM MgCl₂).
12. Centrifugeuse à 10 000 × g pendant 15 secondes. Jetez le surnageant.
13. Resuspendez le pellet à 50 μL KHM· Cl buffer. Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un test BCA et ajustez à 5–7 mg/mL.

3. Expérience de reconstitution des vésicules COPII sans cellules

1. Préparez tous les réactifs listés dans le tableau des matériaux. Aliquot et conserver à −80 °C.
2. Préparez un mélange réactionnel de 50 μL contenant 110 mM de KCl, 20 mM de HEPES (pH 7,2), 2 mM de MgCl₂, un cocktail inhibiteur de protéase (1×), 0,2 mM de GTP, et un système de régénération d’ATP (40 mM de phosphate de créatine, 0,2 mg/mL de phosphokinase de créatine, 1 mM d’ATP).
3. Ajoutez du cGAMP à une concentration finale de 10 μM. Incubez la réaction à température ambiante pendant 15 minutes.
4. Ajouter 50 μg de cellules HEK-293T semi-perméabilisées. Mélangez doucement.
5. Ajouter 80 μg de cytosol HEK-293F pour initier la formation de la vésicule. Incubez à 37 °C pendant 45 minutes.
6. Placez la réaction sur de la glace pour arrêter le bourgeonnement. Centrifugez à 12 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C.
7. Récupérez les vésicules contenant le surnageant. Conservez la granule contenant les organites.
8. Ultracentrifugez le surnageant à 100 000 × g pendant 1 h à 4 °C. Résuspendez la pastille de vésicule dans un tampon de charge protéique de 30 μL.
9. Chauffez à 95 °C pendant 5 minutes. Centrifugez à 20 000 × g pendant 5 minutes pour éliminer les précipités.
10. Effectuer SDS-PAGE et transférer les protéines vers les membranes de PVDF. Sonde avec des anticorps contre la Sec22b, STING et RPN1.

Résultats

Lors de la préparation du cytosol cellulaire HEK-293F, deux paramètres ont été évalués pour évaluer la qualité du cytosol. Les cellules HEK-293F ont été cultivées à haute densité, produisant des extraits cytosoliques avec de fortes concentrations de protéines. De plus, l’ampleur de la perturbation cellulaire après la lyse à la seringue a été évaluée par microscopie optique, confirmant une lyse cellulaire efficace dans les conditions appliquées (Figure 2B).

Discussion

La reconstitution des réactions biochimiques essentielles in vitro a posé les bases des systèmes sans cellules, qui ont joué un rôle clé dans de nombreuses découvertes majeures. Cela inclut l’identification du cGAS comme capteur d’ADN^{cytosolique 14,15}, l’élucidation du rôle du cytochrome c dans l’apoptose, et la découverte de la première déméthylase d’histones, JHDM1^16,17

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringues stériles de 5 mL	WEGO	V526273	Utilisé pour la lyse cellulaire mécanique
Adénosine 5 et triphosphate (ATP)	MCE	HY-B2176	100 mM de stock dans de l’eau, pH 7,3, stocké à &minus ; 80 & degrés C
Adobe Illustrator	Adobe Systems Incorporated	SCR_010279	Utilisé pour créer des illustrations conceptuelles et des schémas
Système de régénération ATP (10 et plus fois)	&mdash ;	&mdash ;	Mélange régénérant l’énergie contenant du phosphate de créatine, de la créatine kinase et de l’ATP
Kit de test protéique BCA	Thermo Fisher	23227	Dosage des protéines colorimétriques
BioRender	BioRender	SCR_018361	Utilisé pour créer des illustrations conceptuelles et des schémas
BSA	Biorigin	BN20815	Réactif de blocage
Incubateur secouant le dioxyde de carbone	ZhiChu	ZCZY-CS8	Maintient la température, le CO2, et l’agitation pour la culture en suspension
Incubateur CO2	Thermo Fisher	3110	Maintient la température et le CO2 pour la culture adhérente
Microscope conventionnel	Olympe	CX43	Utilisé pour évaluer la lyse cellulaire et la morphologie
Créatine kinase	Roche	CKRO	20 mg/mL de bouillon en tampon, stocké à &minus ; 80 & degrés C
Phosphate de créatine	Roche	CRPHO-RO	Composante du système de régénération ATP
Centrifugeuse de bureau	Eppendorf	5810R	Utilisé pour la centrifugation à basse vitesse
Digitonin	Sigma	D5628	Stock de 40 mg/mL dans DMSO, stocké à &minus ; 20 & degrés C
DMEM	Corning	10-013-CMR	Milieu de croissance pour les cellules HEK-293T
D-Sorbitol	Sangon	A100691	Solution de stock de 1 M dans l’eau, stockée à 4 degrés ; C
Réactif de détection ECL	Biorigin	BN16009	Substrat chimiluminescent
Réservoir d’électrophorèse	Bio-Rad	1658001	Appareil pour SDS-PAGE
Sérum fœtal bovin (FBS)	Corning	35-015-CV	Supplément sérique
Rotor à angle fixe (TFT 80.2)	Thermo Fisher	54456	Rotor pour ultracentrifugation
Cellules FreeStyle 293-F	Thermo Fisher	R79007	Utilisation pour la préparation du cytosol
IgG anti-souris de chèvre (H+L)	Invitrogen	31430	Anticorps secondaire conjugué HRP
IgG anti-lapin des chèvres (H+L)	Invitrogen	31460	Anticorps secondaire conjugué HRP
GraphPad Prism	Logiciel GraphPad	SCR_002798	Utilisé pour effectuer une analyse statistique (ANOVA unidirectionnelle) et générer le graphique à barres quantitatif de la Figure 4D.
Guanosine 5&prime ;-triphosphate (GTP)	MCE	HY-113225	10 mM de stock dans de l’eau, pH 7,3, stocké à &minus ; 80 & degrés C
Cellules HEK-293T exprimant une SPIN humaine	&mdash ;	&mdash ;	Généré en interne ; Utilisé comme source membranaire
Tampon HEPES (1 M, pH 7,3)	Beyotime	C0215	Composant tampon pour la préparation de la solution
Système d’imagerie	Bio-Rad	12003153	Utilisé pour la détection de signaux
Tétrahydrate d’acétate de magnésium	Recherche à Hampton	HR2-561	Composant tampon pour la préparation du B88
Chlorure de magnésium hexahydraté	Recherche à Hampton	HR2-559	Composant tampon
Microcentrifugeuse	Eppendorf	5420R	Utilisé pour la centrifugation à vitesse moyenne
Microcentrifugeuse	Eppendorf	5420	Utilisé pour la centrifugation de routine
Spectrophotomètre NanoDrop	Thermo Fisher	840-317400	Utilisation pour la quantification des protéines
Média OPM-CD Trans293	OPM	P82019	Milieu sans sérum pour la culture de suspension HEK-293F
Pénicilline & ndash ; Streptomycine (100 fois)	Servicebio	G4003	Complément antibiotique pour culture cellulaire
Phénylméthylsulfonylfluorure (PMSF)	Sangon	A610425	Inhibiteur de la protéase
Inhibiteurs de phosphatase	Lead de laboratoire	C0104	Prévenir la déphosphorylation des protéines
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)	Servicebio	G4202	Tampon pour laver les cellules
Acétate de potassium	Sigma	236497	Solution de stock de 1 M dans l’eau, stockée à 4 degrés ; C
Alimentation électrique	Bio-Rad	1645052	Fournit une tension pour l’électrophorèse
Cocktail inhibiteur de protéase, sans EDTA	Roche	4693132001	Mélange d’inhibiteurs de protéases à large spectre
Membrane PVDF	Millipore	ISEQ00010	Membrane pour le Western blotting
Anticorps RPN1 (mab de lapin)	Abcam	ab197888	Marqueur ER
Gel SDS-PAGE (4 & ndash ; 20%)	&mdash ;	&mdash ;	Utilisé pour la séparation des protéines
TAMPON DE CHARGEMENT SDS-PAGE (5 fois)	Solarbio	P1040	Tampon de préparation d’échantillons de protéines
Anticorps Sec22b (AB de lapin)	Abcam	ab181076	Marqueur de cargaison COPII
Inhibiteur de trypsine de soja (SBTI)	Sigma	T9128	1 mg/mL de bouillon dans PBS, stocké à &minus ; 20 & degrés C
Anticorps de la MORSURE (mab chez le lapin)	CST	13647	Anticorps primaire
Tampon TBST	Servicebio	G0004	Tampon de lavage pour l’immunobuvage
Cycleur thermique	Bio-Rad	186-1096	Utilisé pour le chauffage et l’incubation
Bain métallique thermostatique	DLAB	5062102100	Maintient une température constante
Cellule de transfert	Bio-Rad	1703930	Utilisé pour le transfert de protéines
Trypsine-EDTA (0,25 %)	Servicebio	G4011	Utilisé pour le détachement cellulaire
Ultracentrifuge	Thermo Fisher	75000100	Utilisé pour la centrifugation à grande vitesse
Tubes ultracentrifuge (2 mL)	Thermo Fisher	54460	Tubes compatibles avec l’ultracentrifugation
Tube d’ultrafiltration (4 mL, 10 kDa MWCO)	Millipore	UFC8010	Utilisé pour la concentration de cytosols