Essai basé sur l’immunofluorescence pour la détection des foyers nucléaires RAD51 comme marqueur de la réparation homologue de la recombinaison dans les cellules cancéreuses de l’ovaire

Résumé

Les foyers nucléaires RAD51 sont un marqueur de l’activité de recombinaison homologue (HR). Ce manuscrit décrit une méthode simple d’immunofluorescence pour détecter ces foyers dans les cellules cancéreuses, permettant l’évaluation de la fonction HR et soutenant l’investigation préclinique des réponses aux agents endommageurs de l’ADN.

Résumé

RAD51 est une protéine centrale de la voie de recombinaison homologue (HR) et est essentielle à la réparation précise des ruptures de double brin (DSB) d’ADN. Après la formation des DSB, la résection terminale de l’ADN génère des substrats d’ADN simple brin qui facilitent le recrutement et l’assemblage des filaments de nucléoprotéines RAD51 aux sites de dommage. Ce processus aboutit à la formation de foyers nucléaires RAD51 discrets, qui servent de lecture fonctionnelle largement acceptée de l’activité des RH et de marqueur substitutif de la compétence en HR. Parce que les défauts de la HR sont fréquents dans plusieurs cancers, en particulier les cancers de l’ovaire et du sein, l’évaluation de la formation des foyers RAD51 s’est imposée comme une approche importante pour évaluer la capacité de réparation de l’ADN et prédire la réponse aux thérapies endommageant l’ADN, y compris les composés de platine et les inhibiteurs de poly(ADP-ribose) polypolymérase (PARP), dont l’efficacité est fortement influencée par le statut de réparation de la HR. Ce manuscrit décrit un protocole simple, fiable et reproductible basé sur l’immunofluorescence pour la détection et la quantification des foyers nucléaires RAD51 dans les cellules de cancer de l’ovaire en culture. La méthode consiste en l’induction des dommages de l’ADN par rayonnement ionisant (IR), suivie d’une fixation, d’immunocoloration avec des anticorps contre RAD51 et γH2AX, de microscopie confocale et d’analyse quantitative manuelle des foyers co-localisés RAD51/γH2AX. Le protocole peut être appliqué dans des conditions basales ou après perturbations génétiques et pharmacologiques afin de déterminer leurs effets sur la fonction de la HR. Les résultats représentatifs démontrent une induction robuste des foyers RAD51 dans les cellules cancéreuses de l’ovaire compétentes en HR après des dommages à l’ADN, tandis que la déplétion de RAD51 réduit nettement la formation des foyers malgré des niveaux comparables de DSB, confirmant la spécificité du test. Dans l’ensemble, ce protocole fournit un test fonctionnel robuste et reproductible pour évaluer la compétence en RH, avec des applications étendues dans la recherche préclinique et potentiellement translationnelle sur le cancer.

Introduction

Les ruptures à double brin de l’ADN (DSB) figurent parmi les formes les plus graves de dommages à l’ADN car une réparation inexacte peut compromettre la stabilité du génome et contribuer au développement tumoral ou à la mort^{cellulaire 1,2,3}. Pour contrer ces menaces, les cellules utilisent plusieurs voies de réparation de l’ADN, dont la recombinaison homologue (HR), considérée comme le mécanisme le plus précis pour réparer les DSB ^2,4,5. Contrairement aux voies de réparation sujettes aux erreurs, HR utilise une séquence d’ADN homologue comme modèle pour restaurer l’information génétique sur le site endommagé. Par conséquent, la HR fonctionne principalement pendant les phases S et G2 du cycle cellulaire, lorsque des chromatides sœurs sont disponibles pour servir de modèles de réparation ^2,5. Notamment, la HR est essentielle à la réparation précise des DSB provenant de sources endogènes telles que le stress de réplication, ainsi que des insultes exogènes telles que les radiations ionisantes (RI) et les agents chimiothérapeutiques nuisant à^{l’ADN 2,5.}

RAD51 est un effecteur central de la voie HR et joue un rôle crucial dans la recherche d’homologie et l’invasion des brins lors de la réparation médiée par HR des DSB ^2,5. Après la formation du DSB, les extrémités de l’ADN subissent une résection, un processus initié par le complexe MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) et les facteurs associés qui génèrent des surplombs d’ADN simple brin 3′. Ces régions à simple brin sont initialement recouvertes par la protéine de réplication A (RPA), qui empêche la formation de structures secondaires et stabilise l’intermédiaire^{de réparation 4,5,6}. La HR est ensuite lancée par les actions coordonnées de BRCA1, PALB2 et BRCA2, qui facilitent le recrutement et le chargement de RAD51 sur l’ADN réséqué, déplaçant la RPA et favorisant la formation de filaments nucléoprotéiques contenant ^{RAD51 4,5,6}. Une fois assemblés, ces filaments recherchent des séquences d’ADN homologues au sein de la chromatide sœur et catalysent l’échange de brins, facilitant ainsi une restauration fidèle de l’ADN^{endommagé 4,5,6}. L’accumulation de RAD51 aux sites DSB apparaît microscopiquement sous forme de foyers nucléaires ponctués qui peuvent être détectés par l’immunofluorescence 7,8,9,10. Parce que la formation de ces foyers reflète l’engagement réussi de la machine RH, l’analyse des foyers RAD51 est devenue une approche fonctionnelle largement utilisée pour évaluer la capacité de la FC et la compétence en réparation de l’ADN dans les cellules^{7, 8, 9, 10}. Il est important de noter que ce test mesure la capacité des cellules à exécuter une réponse de fréquence cardiaque après une lésion de l’ADN, plutôt que de se fier uniquement aux niveaux d’expression des gènes ou protéines associés à la fréquence cardiaque.

Les défauts de la FC sont fréquemment observés dans le cancer, en particulier dans les tumeurs présentant des altérations des paralogues BRCA1, BRCA2, RAD51, ou d’autres gènes impliqués dans la HR, et sont particulièrement fréquents dans les cancers de l’ovaire^{et du sein} 4,11,12,13,14. La carence en HR a d’importantes implications thérapeutiques, car elle confère une sensibilité accrue aux agents nuisibles à l’ADN tels que la thérapie au platine et aux inhibiteurs de poly(ADP-ribose) polymérases (PARP) grâce au principe de létalité^synthétique 4,11,12,13,14,15 . Par conséquent, des tests fonctionnels fiables pour évaluer l’activité des RH sont essentiels tant pour les études mécanistes que pour la recherche translationnelle.

Ce protocole décrit un test basé sur l’immunofluorescence pour la détection et la quantification des foyers nucléaires de RAD51 après des dommages à l’ADN dans les cellules cancéreuses de l’ovaire. Le flux de travail comprend l’induction de DSB d’ADN à l’aide de l’IR, suivie d’une détection immunofluorescente de RAD51 et γH2AX et de la quantification des foyers nucléaires co-localisés par microscopie confocale. Le protocole est démontré avec des cellules OVCAR-8 compétentes en HR et des cellules ABT^R2 résistantes à l’inhibiteur de PARP acquises, et fournit une approche fonctionnelle reproductible pour évaluer l’activité de la HR après la formation du DSB. Bien que l’analyse des foyers RAD51 soit largement utilisée comme mesure fonctionnelle de l’activité du HR, les méthodes disponibles se concentrent souvent sur des contextes expérimentaux spécifiques et manquent fréquemment de directives détaillées sur l’intégration de l’induction contrôlée de dommages à l’ADN, la confirmation de la formation de la DBS de l’ADN, les contrôles de validation des essais et la quantification standardisée basée sur l’image. De plus, des approches alternatives pour évaluer la fonction de la HR, y compris les tests de cicatrices génomiques, les signatures mutationnelles et les analyses d’expression de gènes ou de protéines, fournissent des mesures indirectes du statut de HR et n’évaluent pas directement la capacité cellulaire à recruter RAD51 vers les sites de dommages à l’ADN. Les tests basés sur des reporters tels que DR-GFP permettent des mesures directes de l’activité de la HR mais nécessitent un génie génétique stable et ne sont pas facilement applicables à de nombreux modèles expérimentaux. Ainsi, le flux de travail décrit ici combine des dommages à l’ADN induits par IR avec une coloration immunofluorescence double RAD51/γH2AX afin de vérifier simultanément la formation de DSB et de quantifier le recrutement de RAD51 vers la chromatine endommagée. Cette approche fournit une méthode pratique, biologiquement pertinente et largement applicable pour l’évaluation fonctionnelle directe de la compétence en RH dans les cellules cancéreuses cultivées, tout en intégrant des contrôles d’essai, des étapes de validation et des procédures standardisées de quantification des focalises.

Protocole

Tous les matériaux et réactifs utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux, y compris les informations du fabricant, les numéros de catalogue et les dilutions d’anticorps. Un aperçu du protocole est présenté à la Figure 1.

REMARQUE : Les lignées cellulaires du cancer de l’ovaire OVCAR-8 et ABT^R2 sont utilisées dans ce protocole et ont déjà été^décrites 15,16,17,18,19,20. Les cellules OVCAR-8 ont été généreusement fournies par le Dr Larry Karnitz (Mayo Clinic), qui les avait initialement reçues du Dr Dominic Scudiero (National Cancer Institute, NIH). Les cellules^{ABT R2}ont été généreusement fournies par le Dr Scott Kaufmann (Mayo Clinic⁾²⁰. ABT^R2 est une dérivée résistante aux PARPi du BRCA2.- la lignée cellulaire mutée du cancer de l’ovaire PEO1 qui a acquis une résistance par restauration de l’expression de BRCA2. Parce que la restauration BRCA2 a rétabli la charge RAD51 et l’activité de la fréquence cardiaque, les cellules^{ABT R}2 servent de modèle représentatif de la compétence en fréquence cardiaque. L’identité des lignées cellulaires a été vérifiée sur la base de la provenance des sources et des caractéristiques établies rapportées dans la^{littérature 15, 16, 17, 18, 19, 20}. Des expériences ont été réalisées avec des cellules à faible passage (voies 3 à 12) maintenues en culture pendant un mois maximum après la décongélation. Les lignées cellulaires étaient régulièrement testées pour la contamination par mycoplasmes tous les 6 mois à l’aide d’un kit de détection de mycoplasmes, et toutes les cultures utilisées dans cette étude se sont révélées exemptes de mycoplasmes.

ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique et doit être préparé et manipulé dans une hotte chimique certifiée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié. Les lignées cellulaires d’origine humaine doivent être manipulées conformément aux procédures institutionnelles de biosécurité, en utilisant des pratiques de confinement appropriées. Le Triton X-100, le support de montage et le vernis à ongles doivent être manipulés conformément aux recommandations de sécurité du fabricant. La RI doit être administrée uniquement par du personnel formé et conformément aux politiques institutionnelles de sécurité radiologique. Éliminer les déchets chimiques, biologiques et liés aux radiations conformément aux exigences institutionnelles et réglementaires locales.

1. Culture cellulaire et entretien

1. Des cellules de culture dans le milieu de croissance du Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 complétées avec 8 % de sérum fœtal bovin dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   REMARQUE : Ces conditions de culture sont cohérentes avec celles utilisées dans nos études précédentes sur les cellules OVCAR-8 et ABT^R215,16,17,18,19. Dans ces conditions, les deux lignées cellulaires présentent une croissance robuste et des phénotypes de réponse aux dommages à l’ADN reproductibles.
2. Si désiré, effectuer des perturbations (par exemple, knockdown/knockout du gène), suivant des conditions expérimentales^{optimisées 15,17}.
   REMARQUE : Dans ce protocole, le knockdown médié par le SIRNA de RAD51 est fourni comme exemple représentatif de perturbation génique avant l’analyse d’immunofluorescence.
   1. Préparez 5 × 10⁶ cellules dans un milieu RPMI-1640 à 180 μL complété avec 8 % de sérum bovin fœtal.
   2. Ajoutez 20 μL de solution de siRNA à 20 μM (2 μM de siRNA par transfection) et mélangez doucement.
      REMARQUE : Utilisez les siRNA suivants : siARN luciférase contrôle non ciblant (siLUC) : 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′ ; ARN RAD51 (siRAD51.) : 5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3′. Tous les siRNA ont été achetés auprès de Horizon Discovery.
   3. Transférez la suspension de la cellule sur une cuvette d’électroporation de 4 mm.
   4. Électroporez les cellules à l’aide d’un électroporateur BTX ECM 830 avec deux impulsions de 10 ms à 280 V.
   5. Transférez les cellules dans un milieu de croissance complet et incubez dans des conditions de culture standard dans un plat de 10 cm pendant 24 heures.
   6. Répétez l’électroporation du siRNA en utilisant les mêmes conditions décrites aux étapes 1.2.1–1.2.4.
   7. Incubez les cellules dans des conditions de culture standard dans un plat de 15 cm pendant 48 heures supplémentaires.
   8. Semez une partie des cellules pour le test d’immunofluorescence décrit à l’étape 2. Réservez les cellules restantes pour la validation du knockdown de RAD51 par immunoblotting.
   9. Validez le knockdown du RAD51 par immunoblotting
      1. Cellules de lyse dans un tampon de lyse glacé contenant 50 mM de HEPES (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA, 1 % de Triton X-100, 10 mM de NaF, 30 mM de pyrophosphate de sodium, 1 mM de Na₃VO₄, 10 mM de β-glycérophosphate, et un cocktail inhibiteur de protéase (1 comprimé par tampon de lyse de 10 mL).
      2. Clarifiez les lysats par centrifugation à 18 800 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Transférez le surnageant dans un tube microcentrifuge frais et déterminez la concentration en protéines à l’aide d’un test protéique approprié.
      3. Mélangez une quantité appropriée de lysat protéique avec 4× tampon d’échantillon de Laemmli pour obtenir une concentration finale de 1×.
      4. Ajoutez β-mercaptoéthanol à une concentration finale de 20 %, et chauffez les échantillons à 95 °C pendant 12 minutes avant la FDS-PAGE.
      5. Séparer des quantités égales de protéines par SDS-PAGE et transférer les protéines vers une membrane appropriée pour l’analyse immunoblot.
      6. Bloquez la membrane dans du lait à 5 % pendant 30 minutes à température ambiante en secouant.
      7. Lavez la membrane trois fois (5 min chacun) avec 1× de solution physiologique tris-tamponnée avec Tween 20 (TBST) à température ambiante en secouant.
      8. Incubez la membrane avec l’anticorps polyclonal de lapin anti-RAD51 (dilution 1:1 000) ou l’anticorps anti-ACTIN (dilution 1:1000) à 4 °C pendant 16 à 18 heures en secouant.
      9. Lavez la membrane avec 1× TBST (5 min chacun) à température ambiante en secouant.
      10. Incubez la membrane avec un anticorps secondaire IgG anti-lapin ou anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (dilution 1:10 000) pendant 1 h à température ambiante avec secouement.
      11. Laver la membrane avec 1× TBST (5 min chacun) à température ambiante en secouant, détecter les bandes immunoréactives à l’aide d’une méthode appropriée de détection de chimiluminescence, et confirmer la déplétion de RAD51 par rapport aux cellules transfectées avec le siRNA témoin non ciblant.

2. Ensemencement cellulaire

1. Lorsque les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique (environ 70–80 % de confluence), aspirez le milieu de culture et lavez doucement les cellules une fois avec une solution stérile de solution tampon phosphate (PBS) pour éliminer le sérum résiduel.
2. Ajouter suffisamment de solution de trypsine–EDTA à 0,25 % pour recouvrir la monocouche cellulaire (par exemple, 1 à 2 mL par flasque T175) et incuber à 37 °C pendant 2 à 5 minutes, en surveillant le décollement cellulaire au microscope.
3. Une fois les cellules détachées, neutraliser immédiatement la trypsine en ajoutant un volume équivalent de milieu de culture complet contenant FBS.
4. Collectez la suspension de la cellule dans un tube conique de 15 mL
5. Déterminez la viabilité et la concentration cellulaires à l’aide d’exclusion de bleu de trypan et d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé avant l’ensemencement.
6. Préparez une suspension unicellulaire dans un milieu de croissance complet à une concentration de 4 × 10⁴ cellules/mL.
7. Semez 200 μL de la cellule en suspension dans chaque puits d’une lame à chambre vitrée à 8 puits pour atteindre une densité finale de 8 000 cellules par puits.
8. Incubez les lames de chambre pendant 24 heures à 37 °C avec 5 % de CO₂ pour permettre l’attachement cellulaire.
   REMARQUE : Le nombre de cellules à semer peut varier selon le type cellulaire. Préparez une suspension à cellules excédentaires suffisante pour au moins un puits supplémentaire afin de tenir compte de la variabilité du pipetage. Semez chaque condition en double ou plus pour garantir la reproductibilité. Si une modulation pharmacologique de la HR est souhaitée, les cellules doivent être traitées après une fixation nocturne (12–16 h après l’ensemencement). La densité de semis doit être ajustée selon les besoins afin de garantir que les cellules atteignent la confluence appropriée au moment du traitement et de l’analyse en aval, en tenant compte des effets attendus de l’agent pharmacologique sur la prolifération ou la viabilité cellulaire. Comme la HR survient principalement pendant les phases S et G2 du cycle cellulaire, maintenir les cultures en croissance logarithmique et éviter la surconfluence. Pour les expériences impliquant des traitements susceptibles de modifier la progression du cycle cellulaire, l’incorporation d’EdU, l’analyse du contenu de l’ADN ou d’autres mesures du cycle cellulaire peuvent être réalisées afin de faciliter l’interprétation des résultats des foyers RAD51. Inclure des contrôles non traités (–IR) et irradiés (+IR) dans chaque expérience afin d’établir respectivement la formation des foyers basaux et induits par des dommages causés par l’ADN. Lors de la réalisation de perturbations médiées par les siRNA, inclure les siRNA de contrôle non ciblés (par exemple,si LUC) et les conditions spécifiques de siRNA à la cible (par exemple,si RAD51). Des contrôles sans anticorps primaires et sans anticorps secondaires sont recommandés lors de l’optimisation des anticorps afin d’évaluer la coloration non spécifique et la fluorescence de fond.

3. Induction des dommages à l’ADN par la résistance à la résistance à la résistance

1. Les cellules exposées sur les lames de la chambre à l’IR à une dose de 6 Gy²¹ pour induire des DSB d’ADN.
2. Retournez immédiatement les lames dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂.
3. Incubez les cellules pendant 6 heures après la résistance à la radiointervention.
   REMARQUE : L’IR était livré à l’aide d’un irradiateur biologique RS-2000 fonctionnant à 160 kV et 25,0 mA (position de l’étagère 5). Les cellules ont été irradiées à température ambiante avec une dose unique de 6 Gy (environ 4,8 Gy/min) puis immédiatement retournées dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pour la récupération. L’irradiateur était régulièrement calibré selon les recommandations du fabricant, et toutes les procédures étaient réalisées conformément aux directives institutionnelles de sécurité radiologique. L’incubation post-RI de 6 h a été^{établie auparavant à 15, 17, 22}. Le timing optimal peut varier selon les types cellulaires et doit être optimisé pour chaque lignée cellulaire.

4. Fixation et perméabilisation

1. Aspirez soigneusement le milieu de culture des puits sans perturber les cellules.
2. Fixez les cellules avec du paraformel à 3 % fraîchement préparé dans 1× PBS pendant 12 minutes à température ambiante.
3. Aspirez doucement le fixateur et lavez les puits trois fois avec 500 μL de 1× PBS par puits.
4. Perméabiliser les cellules avec 0,2 % de Triton X-100 dans 1× PBS pendant 12 minutes à température ambiante.
5. Lavez les puits trois fois avec 1× PBS.
   REMARQUE : Effectuez doucement des étapes de fixation, de perméabilisation et de lavage en ajoutant et retirant des solutions le long de la paroi de chaque puits afin de minimiser le détachement cellulaire. Sauf indication contraire, utilisez 500 μL de 1× PBS par lavage.

5. Blocage

1. Préparez une solution bloqueante en dissolvant 5 % (v/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans 1× PBS.
2. Incubez les cellules dans une solution bloqueante pendant 60 minutes à température ambiante pour réduire la liaison aux anticorps non spécifiques.

6. Incubation primaire des anticorps

1. Retirez la solution bloqueante et lavez les cellules trois fois avec 1× PBS.
2. Préparez les anticorps primaires aux dilutions appropriées dans la solution bloquante. Les anticorps anti-RAD51 polyclonal de lapin (1:1000) et anti-phospho-histone monoclonal de souris (γH2AX) (1:1000) sont utilisés, γH2AX servant de marqueur pour les DSB^23,24.
3. Ajoutez 100 μL de solution diluée d’anticorps primaires à chaque puits.
4. Incubez les lames à température ambiante pendant 16 à 18 heures dans une chambre humidifiée pour éviter l’évaporation.
   REMARQUE : Les deux anticorps principaux peuvent être combinés dans la même solution pour une coloration simultanée.

7. Incubation secondaire des anticorps

1. Préparez les anticorps secondaires à des dilutions appropriées dans la solution bloquante. L’IgG anti-lapin conjugué Alexa Fluor 488 (1:350) est utilisé pour détecter le RAD51, et l’IgG anti-souris conjugué Alexa Fluor 594 (1:350) est utilisé pour détecter le γH2AX.
2. Aspirez la solution primaire d’anticorps et lavez les cellules trois fois avec 1× PBS.
3. Ajoutez 100 μL de solution secondaire diluée d’anticorps à chaque puits.
4. Incubez les lames pendant 1 heure à température ambiante dans le noir.
   REMARQUE : Les deux anticorps secondaires peuvent être combinés pour une détection simultanée. À partir de cette section, effectuez toutes les étapes dans un espace protégé de la lumière pour minimiser le photoblanchiment.

8. Contre-coloration et montage nucléaire

1. Préparez la solution Hoechst 33342 à une dilution 1:1 000 dans 1× PBS pour colorer les noyaux.
2. Aspirez la solution secondaire d’anticorps et lavez les cellules une fois avec 1× PBS.
3. Incubez les cellules avec une solution diluée de Hoechst 33342 pendant 90 secondes à température ambiante.
4. Aspirez la solution Hoechst 33342 et lavez les cellules trois fois avec 1× PBS.
5. Retirez le 1× PBS et détachez la chambre supérieure des lames en verre, puis ajoutez environ 25 μL de montage antifade à chaque puits.
6. Placez des lames de verre sur les cellules montées, assurant un contact uniforme avec le support de montage.
7. Enlever doucement les bulles d’air et sceller les bords avec du vernis à ongles.
   REMARQUE : La contre-coloration nucléaire fournit une référence pour les noyaux, facilitant la localisation et la quantification précises des foyers nucléaires RAD51 et γH2AX.

9. Imagerie et quantification des foyers RAD51 dans les DSB

1. Image diapositive immédiatement ou stockée à 4 °C dans une boîte de diapositives dans le noir jusqu’à analyse.
   REMARQUE : Pour minimiser la dégradation potentielle du signal et le photoblanchiment, prenez les images dès que possible, de préférence dans la semaine suivant le montage.
2. Acquérez les images à l’aide d’un microscope confocal avec des lignes laser et des ensembles de filtres appropriés : Hoechst 33342 (405 nm) pour les noyaux, Alexa Fluor 488 (488 nm) pour RAD51, et Alexa Fluor 594 (561/594 nm) pour γH2AX.
3. Réalisez l’imagerie confocale à l’aide d’un objectif à fort grossissement adapté à la résolution des structures subcellulaires.
4. Quantifier manuellement les foyers RAD51 en comptant les foyers nucléaires discrets qui co-localisent avec γH2AX ; excluez les foyers non co-localisés avec γH2AX.
   REMARQUE : Validez la performance des anticorps avant analyse quantitative en confirmant les foyers nucléaires RAD51 et γH2AX induits par l’IR dans les cellules témoins et la diminution du signal RAD51 après le traitement par SIRNA RAD51. Quantifier uniquement les foyers nucléaires RAD51 discrets qui co-localisent avec γH2AX dans des noyaux avec une morphologie intacte et des motifs de coloration clairs ; excluent les colorations diffuses ou non nucléaires, les signaux RAD51 non colocalisés, les cellules qui se chevauchent ou multinucléées, les cellules mitotiques et les cellules apoptotiques. Maintenir des paramètres d’imagerie identiques dans chaque expérience et appliquer des critères de notation manuels cohérents dans toutes les conditions. Analysez ~50 noyaux par condition à partir de plusieurs champs de vision pour chaque réplication biologique et effectuez au moins trois réplications biologiques indépendantes. Rapportez le nombre de foyers co-localisés RAD51/γH2AX par noyau à l’aide d’une analyse statistique appropriée.

10. Analyse statistique

1. Quantifier les foyers co-localisés RAD51/γH2AX à partir d’environ 50 noyaux par condition.
2. Présentez les données comme moyenne ± SD provenant d’au moins trois réplications biologiques indépendantes.
3. Effectuer des comparaisons statistiques en utilisant un test statistique approprié (par exemple, un test t de Student à deux queues non apparié pour les comparaisons en deux groupes ou une ANOVA unidirectionnelle pour les comparaisons multigroupes)
4. Considérons p. < 0,05 statistiquement significatif.
5. Effectuer des analyses statistiques et la génération de graphes à l’aide de GraphPad Prism (version 10.6.1).

Résultats

L’IR induit la formation de foyers RAD51 aux DSB d’ADN dans les cellules OVCAR-8
Pour évaluer fonctionnellement l’activité de la fréquence cardiaque, la formation des foyers RAD51 a été examinée chez des cellules cancéreuses de l’ovaire OVCAR-8 compétentes en HR après l’induction des DSB d’ADN par la résistance à la résistance à la radio. Pour établir la spécificité du test et confirmer que les foyers observés représentent de véritables événements cardiaques dépendant...

Discussion

La détection par immunofluorescence des foyers nucléaires RAD51 décrite ici offre une approche fiable et fonctionnelle pour évaluer l’activité de la fréquence cardiaque dans les cellules de cancer de l’ovaire en culture. Contrairement aux analyses génomiques ou transcriptomiques qui déduisent indirectement le statut de HR, la formation des foyers RAD51 reflète directement la capacité de la cellule à recruter et assembler la machinerie de HR centrale sur les sites des DSB d’ADN. Ainsi, ce...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	Home-made	NA	Gel de résolution pour SDS-PAGE
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	Home-made	NA	Gel d'empilement pour SDS-PAGE
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	Utilisé pour détacher les cellules adhérentes lors du passage de routine et avant l'ensemencement des cellules.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	Dilué à 1× et utilisé pour les étapes de lavage, la solution de blocage, les dilutions d'anticorps, la fixation et la perméabilisation.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	Home-made	NA	Exécution de l'échantillon de protéines dans le gel
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	Home-made	NA	Transfert de la protéine du gel à la membrane
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	tampon
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	Pour SDS-PAGE
ABTR2 cells	Mayo clinic	NA	lignée cellulaire de cancer ovarien résistante au PARPi acquise
AKT Lysis Buffer Recipe (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, and 20 mM microcystin-LR.	Home-made	NA	Tampon de lyse cellulaire
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	16107000	biologie moléculaire en tant que polymérisation pour les gels et agent oxydant utilisé comme initiateur de radicaux libres
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	Anticorps primaire utilisé pour détecter les foci de γH2AX. Utilisé à une dilution de 1:1000
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Anticorps primaire utilisé pour détecter les foci nucléaires de RAD51 comme marqueur de l'activité de recombinaison homologue. Utilisé à une dilution de 1:1000
Bovine serum albumin Protease free	GoldBio	A-420-250	Utilisé pour préparer une solution de blocage (5% de BSA dans PBS) afin de réduire la liaison non spécifique des anticorps lors de la coloration immunofluorescence.
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	système d'imagerie
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	Zeiss LSM 780	Imagerie par immunofluorescence, analyse des foci de γH2AX, quantification des foci de RAD51, colocalisation des protéines et acquisition d'images 3D
Countess II FL Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000	Compteur cellulaire automatisé
Cover slips	Cardinal Health	M6045-10A	Placés sur les échantillons montés pour protéger les cellules colorées et permettre une imagerie haute résolution.
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Hbio-BTX	45-2052	Système d'électroporation adapté aux applications de transfert génique dans les cellules mammifères
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Ajoutée au RPMI-1640 (à 8%) pour soutenir la croissance et la viabilité cellulaire.
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	tampon
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Anticorps secondaire utilisé pour détecter l'anticorps primaire γH2AX. Utilisé à une dilution de 1:350
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	Anticorps secondaire utilisé pour détecter l'anticorps primaire RAD51. Utilisé à une dilution de 1:350
GraphPad Prism	GraphPad Software	version 10.6.1	Analyse statistique, génération de graphiques et visualisation des données.
HEPES 1M	Corning	25060-C1	Tampon de maintien du pH dans la plage de pH 7,2 à 7,6
Hoechst 33342 solution (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	a été utilisé pour la coloration nucléaire
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7076S	Anticorps secondaire utilisé pour la détection de l'anticorps primaire de souris (β-actine) en Western blotting.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbitimmunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7074S	Anticorps secondaire utilisé pour la détection de l'anticorps primaire de lapin (RAD51) en Western blotting.
Instant non-fat dry milk	Hyvee	G461A323	réactif de blocage
Laemmli Sample Buffer (4×)	Bio-Rad	1610747	Tampon d'échantillon
Lonza's MycoAlert Mycoplasma Detection Assays	Lonza Bioscience	LT07-218	Utilisé pour confirmer régulièrement que les cultures cellulaires sont exemptes de contamination par les mycoplasmes.
Lower gel Recipe is (1 L)(Tris 181.7 g+SDS 4.0 g)PH to 8.8 w/cenc HCl	Home-made	NA	Gel de résolution pour SDS-PAGE
Mouse monoclonal Anti-