Un flux de travail rentable pour l'immunofluorescence mono- et multiplexe dans des cultures cellulaires bidimensionnelles adhérentes sur lamelles de verre

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail économique pour l'immunofluorescence simple et multiplexe (IF) de cultures cellulaires adhérentes en deux dimensions, réduisant les coûts expérimentaux grâce à l'utilisation de lamelles en verre peu coûteuses, de plaques standard à 24 puits et de conditions de coloration à faible volume qui minimisent la consommation d'anticorps, tout en offrant une approche représentative de la localisation des protéines par microscopie de fluorescence classique.

Résumé

La microscopie en immunofluorescence (IF) est une technique largement utilisée pour visualiser la localisation et la co-distribution des protéines à la résolution unicellulaire, tout en préservant la morphologie cellulaire et l'organisation subcellulaire. L'objectif de ce protocole est de présenter un flux de travail pratique et économique pour la coloration en immunofluorescence simple ou multiplexe de cultures cellulaires adhérentes en 2D, en utilisant des matériaux de laboratoire standards. La méthode repose sur la culture de cellules sur des lamelles en verre peu coûteuses placées dans des plaques classiques à 24 puits, et met en œuvre le multiplexage par séparation des anticorps primaires selon l'espèce d'origine, l'utilisation de fluorophores spectralement distincts, et des conditions de contrôle rigoureuses, incluant des contrôles sans anticorps primaire, sans anticorps, de coloration unique et de recouvrement (crosstalk), afin d'assurer l'interprétabilité des résultats d'IF multiplexe. Des étapes de coloration à faible volume sont employées pour réduire la consommation de réactifs et d'anticorps, sans compromettre la qualité du signal. Ce protocole élimine le besoin de plaques ou de chambres d'imagerie spécialisées et est compatible avec une microscopie à fluorescence classique en champ large ou confocale. Dans l'ensemble, ce protocole fournit un flux de travail en immunofluorescence accessible et pratique pour une évaluation représentative de la localisation et de la co-distribution des protéines dans des cultures cellulaires adhérentes. Son adaptation à d'autres types cellulaires ou panels d'anticorps nécessite une optimisation spécifique à la cible, incluant la validation des anticorps, les conditions de fixation et de perméabilisation, le choix des fluorophores, ainsi que la compatibilité avec le microscope et les jeux de filtres.

Introduction

La microscopie en immunofluorescence (IF) est couramment utilisée pour visualiser la localisation subcellulaire, l'abondance relative et la colocalisation des protéines dans des cellules fixées, établissant ainsi un lien entre les marqueurs moléculaires et la morphologie cellulaire ainsi que le contexte subcellulaire^1,2. Contrairement aux méthodes d'analyse en masse (par exemple, le immunoblotting) ou aux essais dissociatifs à l'échelle monocellulaire (par exemple, la cytométrie en flux), l'IF préserve l'organisation spatiale cellulaire et s'avère particulièrement utile pour évaluer l'hétérogénéité phénotypique d'une cellule à l'autre ainsi que les modifications de la distribution subcellulaire des protéines à la résolution monocellulaire^3,4,5. Comme les questions expérimentales exigent de plus en plus l'évaluation simultanée de plusieurs marqueurs, l'IF multiplexe permet la détection concomitante de deux cibles ou plus au sein du même échantillon, généralement en combinant des anticorps primaires produits chez différentes espèces hôtes avec des fluorophores aux spectres distincts⁶ (Figure 1), en utilisant des stratégies de détection directe et/ou indirecte (Figure 2). Toutefois, le multiplexage introduit des défis techniques majeurs, notamment la réactivité croisée des anticorps et les interférences spectrales, qui peuvent compromettre l'interprétation des résultats si ces problèmes ne sont pas résolus par une conception rigoureuse du panel et des conditions de contrôle strictes^7,8.

L'objectif général de cette méthode est de fournir un protocole pratique et peu coûteux, largement applicable aux anticorps validés par immunofluorescence et optimisé pour l'imagerie courante de cultures adhérentes en 2D. La multiplexion est mise en œuvre par séparation des espèces d'origine des anticorps, fluorophores spectralement distincts et groupes témoins permettant de vérifier les niveaux de fond et la performance de la coloration^9,10. En utilisant des lamelles en verre de 12 mm dans des plaques standard à 24 puits plutôt que des lames à chambre spécialisées, ce protocole évite l'utilisation d'un consommable dédié plus coûteux, au profit de matériaux couramment disponibles dans la plupart des laboratoires de culture cellulaire. Ce protocole utilise également nettement moins de solution de coloration par unité de surface de croissance (150 µL pour ≈1,13 cm², soit ≈133 µL/cm²) que les formats classiques de lamelles en chambre^11,12, qui nécessitent généralement 300 à 500 µL/cm², ce qui correspond à une réduction d'environ 2 à 4 fois de la consommation d'anticorps et de réactifs par unité de surface. En conséquence, le protocole permet une évaluation qualitative de la localisation et de la co-distribution de plusieurs cibles à l'aide de microscopes à champ large ou confocaux standards, ainsi que des contre-colorations du cytosquelette et du noyau. Ce protocole est destiné à l'immunofluorescence multiplexe classique sur cellules fixées, basée sur la séparation par espèce d'origine et la distinction spectrale, et n'est pas conçu pour des approches multiplexes itératives ou à haute dimensionnalité.

Protocole

Cette étude n'a pas impliqué de participants humains ni de sujets animaux. Toutes les expériences ont été réalisées à l'aide de la lignée cellulaire D17 de ostéosarcome canin, une lignée cellulaire établie obtenue auprès d'une banque publique de cellules (Banco de Células do Rio de Janeiro, n° de catalogue 0276). Aucune approbation éthique n'était donc requise.

1. Entretien des lignées cellulaires

1. Entretenir les cellules adhérentes dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % CO₂, incubateur humidifié) en utilisant le milieu complet approprié pour la lignée cellulaire utilisée.
   REMARQUE : À titre d'exemple représentatif, les cellules de l'ostéosarcome canin D17 (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], n° de catalogue 0276) sont entretenues dans le milieu de Dulbecco modifié (DMEM) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % d'antibiotique-antimycotique, et sont repiquées à une confluence de 70 à 80 % à l'aide de trypsine-EDTA (acide éthylènediaminotétraacétique), puis utilisées dans une gamme de passages validée (par exemple, passages 5 à 20).
2. Confirmer l'absence de mycoplasmes avant les expériences à l'aide d'un test de détection de mycoplasmes validé.

2. Préparation de la plaque 24 puits et des lamelles en verre

REMARQUE : Les surfaces des lamelles doivent être nettoyées par immersion dans de l'éthanol à 70 % (5 min, répété 3 fois)×) avant la stérilisation par l'une ou l'autre des méthodes décrites ci-dessous ; après stérilisation, les lamelles doivent être conservées dans un récipient fermé à température ambiante jusqu'à leur utilisation.

1. Placer des lamelles en verre rondes propres de 12 mm dans une boîte de Pétri en verre (ou un support pour lamelles) et stériliser à l'autoclave. Stériliser également une paire de pinces métalliques à pointes fines à l'autoclave.
2. Alternative : nettoyer les lamelles et les pinces avec de l'éthanol à 70 %, laisser sécher à l'air, puis décontaminer la surface par exposition aux ultraviolets (UV) (30 min) à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique avant utilisation. Conserver les lamelles stérilisées dans un récipient fermé à température ambiante jusqu'à utilisation.
3. Dans une hotte de sécurité biologique, utiliser les pinces stériles pour transférer une lamelle stérile dans chaque puits désigné pour les groupes expérimentaux d'une plaque de culture cellulaire 24 puits.
4. Facultatif : recouvrir les lamelles de revêtements favorisant l'adhésion selon les instructions du fabricant ou les protocoles de laboratoire établis, si nécessaire pour le type cellulaire utilisé.
   NOTE : Les options de revêtement (poly-L-lysine, collagène I ou fibronectine) ainsi que leurs concentrations de travail sont indiquées dans le Tableau des matériaux. Pour la plupart des lignées cellulaires adhérentes cultivées sur verre, des lamelles non revêtues et stérilisées sont suffisantes ; les composants de revêtement pouvant être antigéniques, le revêtement choisi ne doit pas présenter de réaction croisée avec les anticorps du panel.
5. Si les lamelles ont été revêtues, aspirer l'excès de solution de revêtement, rincer une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS), puis laisser les lamelles sécher à l'air dans la hotte de sécurité biologique avant la mise en culture cellulaire.

3. Groupes expérimentaux

1. Inclure un panel de contrôles adapté à la conception multiplex.
   REMARQUE : Un contrôle sans anticorps (ni anticorps primaire ni secondaire) révèle l'autofluorescence intrinsèque, et un contrôle sans primaire (cocktail d'anticorps secondaires sans aucun anticorps primaire) évalue la liaison non spécifique des secondaires et le bruit de fond sur tous les canaux simultanément ; comme ce protocole utilise exclusivement des anticorps secondaires à spectres distincts, ce seul contrôle permet d'évaluer chaque anticorps secondaire indépendamment dans son canal respectif, remplissant ainsi la même fonction qu'un contrôle avec secondaire seul pour chaque fluorophore. Des contrôles monocolorés, dans lesquels chaque paire primaire–secondaire est appliquée individuellement, valident le rendement de chaque anticorps avant leur combinaison multiplexe et, par comparaison avec la condition multiplexe, permettent d'évaluer les interférences spectrales pour chaque couple de fluorophores. Dans la mesure du possible, un contrôle positif exprimant l'antigène cible est utilisé pour confirmer la performance du test.

4. Ensemencement cellulaire (mise en culture) sur des lamelles

1. Dans une cabine de sécurité biologique, détacher les cellules à l’aide de trypsine (ou d’une autre méthode de dissociation appropriée), neutraliser et resuspendre dans du milieu de culture complet.
2. Compter les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre.
3. Effectuer une dilution des cellules à 6 × 10⁴–1 × 10⁵ cellules/mL.
4. Ajouter 0,5 mL de suspension cellulaire par puits (final : 3 × 10⁴–5 × 10⁴ cellules/puits).
   REMARQUE : Si nécessaire, une pointe de pipette stérile peut être utilisée pour s’assurer délicatement que le lamelle repose à plat au fond du puits, sans le rayer.
5. Incuber les cellules dans des conditions standard (37 °C, 5 % CO₂) jusqu’à ce qu’elles adhèrent et atteignent la confluence souhaitée ou que le point temporel expérimental soit atteint.

5. Traitement des cellules (facultatif)

1. Sélectionnez le moment du traitement en fonction du plan expérimental. Le traitement peut inclure une thérapie pharmacologique, une stimulation par des cytokines, une manipulation génétique pour induire ou inhiber l'expression d'un gène cible, ou d'autres interventions expérimentales, selon le cas.
2. Étiquetez les puits afin d'identifier les groupes témoins et traités.
3. Incubez pendant les durées requises ; évitez la sur-confluence, car une croissance excessive augmente le bruit de fond et compromet la morphologie.
   NOTE : Les cellules doivent être adhérentes au lambeau avant la fixation, sauf si le protocole prévoit une fixation immédiate après l'ensemencement.
4. Pour les cibles rapidement sécrétées (par exemple, les cytokines), ajoutez de la brefeldine A (BFA) dans le milieu de culture à une concentration finale de 1 à 10 µg/mL (généralement 5 µg/mL) et incubez pendant 4 à 6 h à 37 °C, 5 % CO₂ avant la fixation.
5. Retirez le milieu contenant la BFA et passez immédiatement à l'étape de fixation.

6. Coloration en immunofluorescence

REMARQUE : À partir de la fixation, une technique stérile n'est pas requise ; la coloration peut être effectuée sur le plan de travail, en utilisant une hotte chimique chaque fois qu'un réactif signalé par un AVERTISSEMENT est manipulé. Les échantillons ne doivent jamais sécher à aucun moment ; lors de l'aspiration, un fin film de tampon est laissé, et la solution suivante est ajoutée immédiatement.

1. Fixation (choisir l'une des options) :
   REMARQUE : Le fixateur est choisi en fonction de la localisation ciblée et de la sensibilité de l'épitope (voir Discussion) : le paraformaldéhyde (PFA) (formaldéhyde préparé à partir de paraformaldéhyde) convient à la plupart des cibles et est compatible avec la phalloïdine ; le méthanol peut améliorer la détection de certains épitopes nucléaires ou phospho-épitopes, mais altère la coloration de l'actine F.
   1. Fixation au PFA (recommandée pour la plupart des cibles) :
      1. Aspirez le milieu et rincez délicatement une fois avec du tampon Tris-saline (TBS) (0,5 mL/puits).
      2. Ajouter 4 % de PFA dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) (0,5 mL/puits) et incuber pendant 10 min à température ambiante (≈25 °C).
      3. Aspirer le PFA et laver 3 fois× avec du TBS (aspirer rapidement ; ne pas laisser les puits sécher).
         REMARQUE : ATTENTION : Le PFA est toxique et peut être cancérigène. Manipulez les solutions de PFA dans une hotte chimique certifiée tout en portant des équipements de protection individuelle appropriés (blouse de laboratoire, gants et protection oculaire). Évitez toute inhalation et tout contact cutané, et éliminez les déchets conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique.
2. Alternativement, fixation par le méthanol (utile pour certains antigènes nucléaires et certains épitopes phospho) :
   1. Prérefroidir le méthanol à 100 % à −20 °C.
   2. Ajouter du méthanol glacé directement aux cellules (0,5 mL/puits) et incuber pendant 5 min à −20 °C.
   3. Laver 3 fois× avec du TBS (aspirer rapidement ; ne pas laisser les puits sécher).
      REMARQUE : Après la fixation au méthanol, une perméabilisation supplémentaire peut s'avérer inutile et doit être optimisée selon l'anticorps ou l'épitope ciblé. La fixation au méthanol peut endommager les épitopes membranaires et altérer la coloration par la phalloïdine marquée aux fluorophores ou l'actine F. PRÉCAUTION : Le méthanol est toxique, volatil et hautement inflammable. Manipuler en zone bien ventilée ou sous hotte à vapeurs chimiques ; porter des équipements de protection individuelle adaptés ; tenir éloigné des flammes nues et des sources de chaleur. POINT D'ARRÊT FACULTATIF : Après fixation, conserver les échantillons à 4 °C dans du PBS contenant une faible concentration de fixateur (par exemple, PBS + 0,1 % de PFA) pendant jusqu'à une semaine ; valider la durée de stockage pour chaque antigène.
3. Inactivation des aldéhydes (facultatif)
   1. Incuber avec 50 mM de glycine dans du TBS (0,5 mL/puits) pendant 5 min à température ambiante (≈25 °C).
   2. Laver 3 fois× avec TBS + 0,05 % de polysorbate 20.
      REMARQUE : La glycine neutralise les groupes aldéhyde libres restants après la fixation au PFA, réduisant ainsi l'autofluorescence liée à la fixation et améliorant la spécificité de la coloration par anticorps.
4. Perméabilisation
   1. Si l'on cible des protéines membranaires, omettre la perméabilisation et passer à l'étape 6.5.1.
   2. Si l'on cible des protéines intracellulaires ou nucléaires, effectuer une perméabilisation avec un détergent non ionique à 0,1–0,3 % dans du TBS (0,5 mL/puits) pendant 5 à 10 minutes à température ambiante≈25 °C).
   3. Laver 3 fois× avec TBS + 0,05 % de polysorbate 20 (TBST).
      REMARQUE : La concentration et la durée d'exposition au détergent non ionique éthoxylé de l'octylphénol sont optimisées en fonction de la cible ; l'adéquation est évaluée par un signal localisé dans le compartiment correct, une morphologie préservée, un F-actine bien défini et un fond faible (voir Discussion). Si du saponine est utilisé, il est maintenu dans tous les tampons d'anticorps et de lavage ultérieurs. PRÉCAUTION : Le détergent non ionique éthoxylé de l'octylphénol est nocif en cas d'inhalation ou de contact avec la peau et peut provoquer une irritation oculaire. Manipuler avec des gants et éviter la formation d'aérosols.
5. Blocage
   1. Ajouter 0,5 mL/puits de solution de blocage (albumine sérique bovine (BSA) à 5 %) dans du TBS) et incuber pendant 30 min à température ambiante (≈25 °C).
   2. Aspirer le tampon de blocage.
   3. Passez directement à l'incubation avec l'anticorps primaire (ne pas laver).
6. Incubation avec l'anticorps primaire
   REMARQUE : Les dilutions des anticorps primaire et secondaire sont établies empiriquement par titrage (voir Discussion).
   1. Préparer des panels d'anticorps primaires simples ou multiplexes dans une solution tamponnée au Tris contenant 0,05 % de polysorbate 20 et 1 % de BSA (TBST-BSA) 1 %), en utilisant des concentrations d'anticorps pré-optimisées pour chaque cible.
   2. Pour l'immunofluorescence multiplex, combiner tous les anticorps primaires non conjugués dirigés contre des antigènes distincts provenant d'espèces hôtes différentes (par exemple, anti-interféron de sourisβ (IFN-β) + lapin anti-p14ARF + chèvre anti-actine) en un seul cocktail d'anticorps.
   3. Ajouter 150 µL par puits, en veillant à ce que toute la lame couvre-object soit entièrement recouverte par la solution d'anticorps.
      REMARQUE : Pour éviter l'évaporation à faible volume, la plaque est incubée dans une chambre humidifiée (par exemple, une boîte hermétique contenant un tissu humide).
   4. Incuber pendant 1,5 h à température ambiante (≈25 °C) ou 12 à 16 h à 4 °C.
   5. Laver 3 fois× avec TBST pendant 3 min chacun à température ambiante (≈25 °C), aspirez rapidement après chaque lavage.
7. Incubation avec l'anticorps secondaire (et avec les anticorps primaires directement conjugués, le cas échéant)
   REMARQUE : À partir de cette étape, les échantillons sont conservés à l’abri de la lumière afin d’éviter le photoblanchiment. Des fluorochromes spectralement distincts sont utilisés pour les anticorps secondaires et pour tout anticorps primaire directement conjugué, afin de minimiser les interférences. Des anticorps secondaires hautement cross-adsorbés et spécifiques d’espèce sont employés pour réduire la liaison aux anticorps primaires non spécifiques. La conception du panel de fluorochromes, incluant les marqueurs nucléaires et du cytosquelette, ainsi que la compatibilité avec les longueurs d’excitation et d’émission du microscope, sont abordées dans la Discussion.
   1. Diluer les anticorps secondaires dans une solution de TBST-BSA à 1 % en utilisant des concentrations préalablement optimisées. Pour la détection multiplex, combiner tous les anticorps secondaires correspondant aux espèces hôtes des anticorps primaires utilisés (un anticorps secondaire par espèce hôte) en un seul cocktail.
   2. Ajouter 150 µL par puits, en veillant à ce que le rond de couverture soit entièrement recouvert.
   3. Incuber pendant 1 h à température ambiante (≈25 °C).
      REMARQUE : Si le panneau comprend un ou plusieurs anticorps primaires directement conjugués, les ajouter conjointement au cocktail d'anticorps secondaires et prolonger l'incubation à 1,5 heure à température ambiante (environ 25 °C).
   4. Laver 3 fois× avec TBST pendant 3 min chacun à température ambiante (≈25 °C), en aspirant rapidement après chaque lavage.

7. Coloration de contre-marquage nucléaire et coloration de l'actine F

1. Ajouter la contre-coloration nucléaire Hoechst 33342 (1:5000) diluée dans du TBS et incuber pendant 15 min à température ambiante (≈25 °C), protégé de la lumière. Si l'F-actine doit être marquée avec de la phalloïdine plutôt qu'avec un anticorps anti-actine, ajouter la phalloïdine (1:400) dans la même solution.
2. Laver 3 fois× avec du TBST, en aspirant rapidement après chaque lavage (ne pas laisser les puits sécher).
3. Ajouter 0,5 mL de TBS dans chaque puits pour maintenir les lamelles immergées jusqu'à leur prélèvement ou montage.

8. Récupération des lamelles et montage des lames

1. Tant que les lamelles restent immergées dans le TBS, insérez la pointe d'une aiguille fine ou d'un scalpel sous le bord de la lamelle et soulevez-la délicatement jusqu'à ce qu'un côté soit partiellement relevé. À l'aide de pinces fines, saisissez la lamelle et retirez-la du puits.
   REMARQUE : Retirer une lamelle lorsqu'elle n'est pas immergée peut provoquer son adhérence ferme au fond du puits en raison de la tension superficielle, augmentant ainsi le risque de casse.
2. Tenant la lamelle avec des pinces, absorbez soigneusement l'excès de TBS sur les bords à l'aide d'un aspirateur sous vide ou d'un papier absorbant. Évitez de toucher la surface recouverte de cellules.
   REMARQUE : Il convient d'éviter tout liquide résiduel excédentaire, car il pourrait diluer le milieu de montage et nuire à la clarté et au contraste de l'image.
3. Placez la lamelle, côté cellules vers le bas, sur une lame en verre propre contenant une petite goutte (≈3 µL) de milieu de montage.
   REMARQUE : On peut utiliser un milieu antifade auto-durcissant du commerce ou un milieu maison à base de glycérol 80 %/solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ; les montages à base de glycérol sont scellés avec du vernis incolore, et les milieux sans colorant nucléaire sont choisis après contre-coloration. Les limites de conservation et les recommandations sur la stabilité des fluorochromes sont indiquées dans la Discussion.
4. Laissez les lames durcir horizontalement pendant ≈24 h, à l'abri de la lumière, avant l'acquisition des images.

Résultats

Ce protocole permet la coloration immunofluorescente mono- et multiplex de cellules tumorales canines adhérentes cultivées sur des lamelles en verre, permettant la visualisation simultanée de marqueurs nucléaires, cytoplasmiques et du cytosquelette tout en préservant la morphologie cellulaire. Les résultats représentatifs sont illustrés dans la Figure 3.

Dans les expériences réussies, les cellules de carcinome ostéogénique canin D17 modifiées génétiquement pour exprimer le p14ARF canin et l'IFN-β canin (section 5.1) ont présenté de forts signaux fluorescents, spatialement bien localisés, avec un fond faible et une coloration non spécifique minimale. Pour les cellules exprimant le p14ARF (Figure 3A), l'immunofluorescence a révélé une localisation principalement nucléaire, conforme à la distribution sous-cellulaire connue du p14ARF. L'utilisation d'un détergent non ionique éthoxylé de l'octylphénol à 0,3 % pour la perméabilisation a permis un accès efficace des anticorps aux épitopes nucléaires tout en préservant la morphologie nucléaire et l'intégrité du cytosquelette, comme en témoignent la contre-coloration nucléaire nette et les structures d'actine visualisées à l'aide d'un anticorps anti-actine (fluorophore émettant en orange).

Pour les cellules exprimant l'IFN-β (Figure 3A), un signal cytoplasmique a été observé après incubation avec la BFA afin de bloquer la sécrétion des protéines, permettant ainsi l'accumulation intracellulaire et la détection de cette cytocine soluble. Dans ces conditions, une perméabilisation plus douce a suffi pour permettre la pénétration des anticorps sans extraction excessive du contenu cytoplasmique. Une coloration réussie se caractérisait par une fluorescence cytoplasmique ponctuée à diffuse, un crosstalk nucléaire minimal et une architecture de l'actine préservée.

Des résultats sous-optimaux ont été observés lorsque les paramètres clés n'ont pas été correctement optimisés. Une perméabilisation insuffisante a entraîné un signal nucléaire faible ou absent pour p14ARF, comme illustré dans la condition non perméabilisée (0 % de détergent non ionique éthoxylé de l'octylphénol ; Figure 3B et Figure supplémentaire 1). Inversement, une perméabilisation excessive (≥ 0,5 % de détergent non ionique éthoxylé de l'octylphénol ou des temps d'incubation prolongés) peut entraîner une perte partielle de la coloration du cytosquelette, une fluorescence de fond accrue et une morphologie cellulaire altérée. Dans les expériences impliquant des protéines sécrétées rapidement (par exemple IFN-β), l'omission de la BFA a souvent produit un signal intracellulaire plus faible, reflétant une sécrétion rapide plutôt qu'un échec du protocole.

Les témoins unicolores (Supplementary Figure 2) ont montré un signal uniquement dans le canal correspondant à chaque cible, ce qui confirme la spécificité de la coloration immunofluorescente observée. Les conditions témoins négatives, incluant les témoins sans anticorps primaire et sans anticorps (Supplementary Figure 2), ont révélé une coloration nucléaire attendue, avec un signal négligeable dans les canaux dépendants des anticorps, indiquant une faible autofluorescence et une liaison non spécifique minimale de l'anticorps secondaire.

Ensemble, ces résultats représentatifs démontrent que le protocole permet la détection de protéines présentant des localisations subcellulaires distinctes lorsque la fixation, l'intensité de la perméabilisation et les stratégies spécifiques dépendant de la cible (par exemple, le blocage de la sécrétion) sont adaptées à la biologie de la cible. Une optimisation adéquate donne lieu à une fluorescence intense et spécifique, avec un fond faible et une morphologie cellulaire préservée, tandis que des conditions non optimales entraînent des signaux plus faibles ou plus bruités ainsi qu'une structure cellulaire altérée.

Figure 1 : Schéma général du protocole d'immunofluorescence simple et multiplex. Étapes principales, de l'entretien des cultures cellulaires jusqu'à l'acquisition des images, incluant les deux points de décision nécessitant une sélection dépendante de la cible : la méthode de fixation (PFA contre méthanol) et la perméabilisation (selon la localisation sous-cellulaire de la cible). Un traitement expérimental facultatif, incluant une préincubation avec l'acide brefeldin A (BFA) pour les protéines rapidement sécrétées, est indiqué comme une étape alternative avant la fixation. Des étapes facultatives non représentées pour plus de clarté (par exemple, l'inactivation des aldéhydes) sont décrites dans le protocole complet. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Représentation schématique des stratégies de détection par fluorescence basées sur les anticorps. La détection directe utilise des anticorps primaires conjugués à un fluorophore, tandis que la détection indirecte utilise des anticorps primaires non conjugués associés à des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore, stratégie adoptée tout au long de ce protocole. Pour les applications multiplex, la détection indirecte nécessite des anticorps primaires non conjugués produits chez différentes espèces hôtes, permettant à chaque anticorps secondaire de reconnaître spécifiquement son anticorps primaire correspondant sans réaction croisée. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Immunofluorescence multiplexe de cellules canines D17 d'ostéosarcome Cellules D17 (5 × 10⁴) ont été ensemencées sur des lamelles en verre dans des plaques de 24 puits et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 10 min à 25 °C. Les cellules ont été soumises à une immunofluorescence multiplexe en utilisant des anticorps anti-p14ARF (1:200 ; fluorophores émettant en vert), anti-actine (1:200 ; fluorophores émettant en orange) et anti-interféron-β (IFN-β) (1:200 ; fluorophores émettant dans le proche infrarouge) d'anticorps primaires, avec les anticorps secondaires correspondants à 1:500. Les noyaux ont été contre-colorés. Avant l'IFN-β détection, les cellules ont été traitées avec de la BFA (5 µg/mL, 4 h) pour bloquer la sécrétion des protéines. (A) Les cellules ont été perméabilisées avec un détergent non ionique à 0,3 % pendant 10 min à 25 °C. (B) Cellules traitées sans perméabilisation (0 % de détergent non ionique). Images représentatives provenant de 2 réplicats biologiques indépendants, chacun réalisé en 2 réplicats techniques. Seuls les canaux fusionnés sont montrés dans cette figure ; les canaux individuels sont fournis dans Figure supplémentaire 1. Des différences de marquage sont observables entre les conditions, particulièrement pour p14ARF (A ; flèches), une cible intranucléaire, dont le signal était absent dans le groupe non perméabilisé (B). Les panneaux A et B ont été acquis et traités en utilisant des paramètres identiques (Tableau supplémentaire 1). Les contrôles négatif et de monomarquage correspondant à ce panneau sont présentés dans Figure supplémentaire 2. Échelle : 100 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Canaux de fluorescence individuels correspondant à la Figure 3, organisés par marqueur avec des échantillons perméabilisés (colonne de gauche) et non perméabilisés (colonne de droite). Conditions présentées côte à côte : Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D ; fluorophores émettant en vert), l’actine (E, F ; fluorophore émettant en orange) et l’IFN-β (G, H ; fluorophores émettant dans le proche infrarouge), ainsi que les panneaux fusionnés correspondants (I, J), correspondant respectivement aux Figures 3A et 3B. Les flèches indiquent une coloration nucléaire représentative de p14ARF ; les ellipses indiquent respectivement une coloration représentative de l’actine (E) et de l’IFN-β (G). La perte du signal nucléaire de p14ARF, ainsi qu’un marquage sous-optimal de l’IFN-β et de l’actine, est évidente dans les conditions non perméabilisées. Le signal résiduel observé sur l’image (D ; astérisque) reflète un recouvrement spectral provenant des fluorophores présents simultanément, ce qui est confirmé par son absence dans les contrôles de coloration simple et de secondaire seul (Figure supplémentaire 2). Échelle : 100 µm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Contrôles d'immunofluorescence combinée correspondant au panel multiplex de la figure 3. Pour chaque groupe témoin, les canaux individuels (Hoechst 33342, fluorophores émettant dans le vert, fluorophore émettant dans l'orange et fluorophores émettant dans le proche infrarouge) sont présentés aux côtés de l'image fusionnée (cinquième colonne).A–E) Contrôle sans anticorps : cellules traitées sans anticorps primaire ni secondaire. (F–J) Contrôle secondaire uniquement : cellules incubées avec le cocktail d'anticorps secondaires en l'absence d'anticorps primaires. (K–O) contrôle simple coloration p14ARF (fluorophores émettant en vert). (P–T) Contrôle avec coloration unique de l'actine (fluorophore émettant en orange). (U–Y) IFN-β contrôle de coloration unique (fluorophores émettant dans le proche infrarouge). Les paramètres d'acquisition et de traitement étaient identiques à ceux utilisés dans la Figure 3 (Tableau supplémentaire 1). Échelle : 100 µm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Spécifications des cubes de filtres de fluorescence et ordre d'acquisition. Les images ont été acquises séquentiellement sur un microscope à fluorescence en champ large inversé (objectif 40×/0,80) en utilisant les cubes de filtres énumérés ci-dessous, dans l'ordre indiqué, pour chaque champ imagé dans la Figure 3, la Figure supplémentaire 1 et la Figure supplémentaire 2. Les images ont été acquises sous forme de plans optiques uniques (pas d'empilement en z).L'intensité d'excitation a été réglée à l'aide de la commande d'intensité de fluorescence aux niveaux indiqués, le diaphragme du champ lumineux incident étant maintenu à la position 6 pour tous les canaux. Les paramètres de la caméra (numérisation 8 bits, format 3072×2048, gamma 1,0) et un réglage fixe de netteté numérique étaient identiques pour tous les canaux et panneaux, y compris les images témoins de la Figure supplémentaire 2. Un seul ajustement linéaire de luminosité/contraste a été appliqué de manière identique à tous les canaux et panneaux pour l'affichage. Les images ont été exportées au format TIFF. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Guide de dépannage pour les problèmes techniques courants dans le protocole d'immunofluorescence. Problèmes fréquents, causes probables et mesures correctives à travers le protocole.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Plusieurs étapes sont essentielles pour assurer une performance reproductible de ce protocole d'immunofluorescence basé sur des lamelles. Toutes les manipulations sont effectuées à l'intérieur d'un puits de culture de 24 puits, ce qui simplifie la manipulation, limite les interventions sur l'échantillon et permet une couverture complète de la lamelle en utilisant de faibles volumes de réactifs, réduisant ainsi la consommation d'anticorps par expérience. Étant donné que ces solutions à faible volume sont sujettes à l'évaporation, les incubations doivent être réalisées de préférence dans une chambre humidifiée, et les échantillons ne doivent jamais sécher : une dessiccation même brève augmente la fluorescence de fond et dégrade la morphologie cellulaire. Lors de l'aspiration, un fin film de tampon est laissé sur la lamelle, et la solution suivante est ajoutée immédiatement.

Une densité adéquate de semis cellulaire et un taux de confluence contrôlé au moment de la fixation sont essentiels pour limiter le bruit de fond et préserver la morphologie, car une surcroissance augmente le bruit de fond et compromet l'architecture cellulaire. Un contrôle précis de la durée et de la température d'incubation est également nécessaire tout au long du protocole, car ces deux paramètres influencent l'efficacité de la fixation, la liaison des anticorps et le signal de fond^5,13. Lorsque les conditions ambiantes varient, l'utilisation d'un incubateur ou d'un four sec thermostaté à 25 °C, combinée à des temps d'incubation constants entre les réplicats, améliore la reproductibilité.

La fixation est la première étape décisive, car elle détermine la préservation des antigènes et l'architecture cellulaire⁵, et le fixateur est choisi en fonction de la localisation ciblée et de la sensibilité de l'épitope. Le PFA est recommandé pour la plupart des cibles associées à la membrane, cytoplasmiques, nucléaires et cytosquelettiques, car il préserve l'architecture, maintient la distribution des antigènes et est compatible avec la coloration de l'F-actine basée sur la phalloïdine. Le méthanol peut être préféré pour certains antigènes nucléaires mal détectés après une fixation par réticulation, en particulier les épitopes phospho ou sensibles aux aldéhydes, mais il perturbe l'intégrité membranaire, extrait les protéines solubles et altère la coloration phalloïdine/F-actine ; la compatibilité doit être validée pour chaque cible ^13,14,15,16. Pour les cytokines solubles et d'autres protéines rapidement sécrétées, la fixation par PFA combinée à un prétraitement par la BFA permet de conserver le signal intracellulaire avant la fixation : la BFA bloque le transport des protéines du réticulum endoplasmique vers l'appareil de Golgi, favorisant l'accumulation intracellulaire des protéines sécrétées et permettant leur détection par immunofluorescence. Lorsque des cibles ayant des exigences de fixation contradictoires doivent être détectées simultanément, une optimisation empirique est nécessaire. Le glyoxal, un petit dialdéhyde, a été décrit comme une alternative au PFA, offrant une réticulation plus rapide, une meilleure préservation des antigènes et une compatibilité avec l'immunofluorescence et la microscopie de super-résolution ; nous n'avons aucune expérience directe avec la fixation au glyoxal et la présentons comme une option soutenue par la littérature^17,18.

Après la fixation, une perméabilisation appropriée permet l'accès des anticorps aux épitopes intracellulaires et nucléaires tout en préservant l'intégrité structurelle⁵. Une perméabilisation insuffisante donne généralement un signal faible ou absent malgré une morphologie intacte, indiquant un accès restreint des anticorps, tandis qu'une perméabilisation excessive extrait les protéines solubles, perturbe les membranes, entraîne une perte de coloration du cytosquelette et augmente le fond. Le type de détergent, sa concentration et le temps d'incubation doivent donc être optimisés en fonction de la cible. Une perméabilisation adéquate peut être évaluée selon quatre critères : (i) un signal spécifique dans le compartiment sous-cellulaire attendu ; (ii) une morphologie préservée, avec des limites nucléaires et cytoplasmiques bien définies, mises en évidence respectivement par l'Hoechst 33342 et la phalloïdine ; (iii) une coloration bien définie de l'actine F, car un signal cytosquelettique diffus ou perdu indique une sur-perméabilisation ; et (iv) un fond faible dans les contrôles négatifs. Si ces critères ne sont pas satisfaits, la concentration de détergent non ionique éthoxylé de l'octylphénol et/ou le temps d'incubation sont ajustés empiriquement. Lorsque des antigènes associés à la membrane et des antigènes intracellulaires sont combinés dans un même panel, des conditions plus douces (concentration plus faible en détergent, temps d'incubation plus court) permettent de préserver les épitopes membranaires tout en assurant l'accès intracellulaire, et un cours temporel commençant à 5 min et augmentant progressivement s'avère utile. Si la saponine est utilisée à la place, elle doit être maintenue dans tous les tampons d'anticorps et de lavage ultérieurs, car son effet perméabilisant est réversible.

Les concentrations en anticorps sont déterminées empiriquement par titrage, plutôt que d'être adoptées à partir de recommandations génériques. Une approche pratique consiste à réaliser une série de dilutions en série couvrant au moins 3 à 4 concentrations au-dessus et en dessous de la dilution suggérée par le fabricant (par exemple, 1:50, 1:100, 1:200 et 1:400 pour une dilution recommandée de 1:200), appliquée à des lamelles en réplication dans des conditions identiques. Chaque dilution est évaluée en fonction de l'intensité du signal spécifique dans le compartiment attendu ; du rapport signal sur bruit, en comparant les échantillons marqués avec le contrôle sans anticorps primaire et le bruit de fond du secondaire avec le contrôle sans anticorps ; ainsi que de la préservation de la morphologie. La concentration la plus faible produisant un signal intense et spécifique avec un fond minimal est retenue. Un bruit de fond élevé persistant est généralement atténué par un titrage supplémentaire, un blocage prolongé ou une augmentation de la sévérité des lavages, tandis qu'un signal faible peut résulter d'une fixation excessive, d'une concentration d'anticorps sous-optimale, de l'incapacité de l'anticorps primaire à reconnaître son épitope cible, d'une incompatibilité entre l'anticorps secondaire et l'espèce hôte de l'anticorps primaire (par exemple, un secondaire anti-lapin utilisé avec un primaire d'origine murine), ou d'une perte du signal fluorophore due à la dégradation de l'anticorps secondaire causée par la date de péremption ou un stockage inadéquat, en particulier une exposition répétée à la lumière. En cas d'absence de signal à toutes les dilutions, il peut être utile d'allonger l'incubation primaire ou de la prolonger toute la nuit à 4 °C, de confirmer l'expression de l'antigène dans la lignée cellulaire, de vérifier la compatibilité de l'anticorps avec les conditions de fixation et de perméabilisation, de contrôler le lot, le stockage et la date de péremption des anticorps primaire et secondaire, de s'assurer que le microscope dispose des filtres d'excitation et d'émission appropriés pour le fluorophore, et, si le problème persiste, de tester un clone alternatif. Lors de la préparation des solutions de travail, le volume nécessaire du cocktail correspond au nombre de puits multiplié par 150 µL, auquel on ajoute environ 10 % en excès pour compenser les pertes lors du pipetage ; le volume de stock de chaque anticorps est égal à ce volume total divisé par son facteur de dilution (par exemple, 825 µL ÷ 200 = 4,13 µL pour une dilution 1:200), le reste étant complété avec du TBST–BSA à 1 %. Le même calcul s'applique au cocktail secondaire, en remplaçant par le facteur de dilution correspondant.

Les performances du multiplexage dépendent fondamentalement de la conception du panel de fluorochromes. Les fluorochromes attribués aux cibles principales, à la contre-coloration nucléaire et au marqueur du cytosquelette doivent être choisis de manière coordonnée afin d'éviter les chevauchements spectraux ou la duplication de signaux, et le système d'imagerie doit permettre l'excitation et la détection de chaque fluorochrome sélectionné^9,10 ; les plages d'excitation et d'émission de chaque cube de filtres sont indiquées dans le Tableau supplémentaire 1, permettant une comparaison directe de la compatibilité spectrale entre les différents fluorochromes du panel. Les utilisateurs adaptant ce panel à d'autres fluorochromes sont invités à choisir des combinaisons présentant un chevauchement minimal entre canaux adjacents, dans la mesure du possible, et à vérifier l'absence de crosstalk dans des contrôles monocolorés avant de combiner les cibles, comme cela a été fait ici. Un signal résiduel attribuable à la présence concomitante de fluorochromes a été observé dans tous les canaux acquis du panel multiplexé (Figure supplémentaire 1), mais était absent dans les contrôles correspondants monocolorés et témoins sans anticorps primaire (Figure supplémentaire 2), indiquant un crosstalk spectral dû aux jeux de filtres à large bande utilisés en acquisition en champ large (éventuellement réductible grâce à une excitation laser en microscopie confocale). Étant donné la séparation spatiale entre la localisation nucléolaire de p14ARF et la distribution filamentaire/cytoplasmique de l'actine et de l'IFN-β, ce crosstalk ne compromet pas l'interprétation de la localisation de p14ARF dans le panel multiplexé. Ce protocole repose sur un multiplexage classique basé sur des fluorochromes, dans lequel le nombre de cibles résolvables simultanément est limité par le nombre d'espèces hôtes disponibles pour les anticorps et par le nombre de fluorochromes spectralement distincts. Un multiplexage d'ordre supérieur peut être réalisé par immunofluorescence cyclique ou imagerie spectrale, permettant respectivement des cycles répétés de coloration/décoloration ou le démixage linéaire de fluorochromes chevauchants, mais ces approches nécessitent un équipement et un logiciel spécialisés non abordés ici^19,20.

Le milieu de montage influence à la fois la qualité de l'image et la durabilité du signal. Un milieu antifade auto-durcissant du commerce ou, en alternative maison, du glycérol à 80 % dans du PBS (sans antifade, sans durcissement automatique) peut être utilisé ; les montages maison à base de glycérol sont scellés avec du vernis à ongles incolore pour éviter le dessèchement et le déplacement du coverslip, et les milieux ne contenant pas de colorants nucléaires sont choisis une fois la contre-coloration nucléaire effectuée. Il est préférable d'acquérir les images rapidement après durcissement. Lorsqu'une acquisition immédiate n'est pas possible, les lames montées peuvent être conservées dans une boîte sombre à 4 °C pendant 2 à 4 semaines ou à −20 °C pendant jusqu'à 6 mois, en gardant à l'esprit que les fluorophores très photolabiles (par exemple, les fluorophores émettant dans le vert) perdent progressivement leur signal même dans des conditions de stockage optimales. Les milieux antifade commerciaux prolongent nettement la stabilité des fluorophores par rapport aux milieux maison à base de glycérol ; lorsqu'on utilise ces derniers, il est fortement recommandé d'effectuer l'acquisition dans les 24 à 48 heures. Le vernis à ongles incolore est compatible avec la plupart des fluorophores et n'affecte pas de manière significative la préservation du signal, à condition de laisser un temps de durcissement à l'obscurité d'au moins 30 minutes avant le stockage.

À partir de l'étape de fixation, la technique stérile n'est plus requise, et la coloration peut être effectuée sur le plan de travail, en réservant une hotte chimique certifiée pour tout réactif portant l'avertissement MISE EN GARDE. Les lignées cellulaires tumorales, comme D17 et autres, sont manipulées conformément aux directives institutionnelles de biosécurité applicables aux matériaux du groupe de risque 1 ou 2. Tous les matériaux ayant été en contact avec les cellules cultivées, les lamelles, les pointes, le milieu et les déchets liquides sont décontaminés avant élimination : les déchets liquides sont inactivés par de l'eau de Javel à une concentration finale de 10 % pendant au moins 30 min, et les déchets solides sont jetés dans des conteneurs appropriés pour déchets biologiques. Les déchets chimiques contenant du PFA, du méthanol ou du détergent non ionique éthoxylé d'octylphénol sont séparés et éliminés conformément aux réglementations institutionnelles de sécurité chimique.

Bien qu'il ait été conçu pour être largement utile, ce protocole doit être considéré comme adaptable selon la cible plutôt qu'une procédure rigide et universelle ; son application réussie dépend de la compréhension par l'expérimentateur de la localisation, de la solubilité, de l'accessibilité de l'épitope et de la sensibilité de chaque antigène à la fixation et à la perméabilisation. Deux limitations doivent être soulignées. Premièrement, l'évaluation de la coloration présentée ici est qualitative, fondée sur la comparaison avec des contrôles négatifs et la localisation subcellulaire attendue, plutôt que sur une quantification formelle du rapport signal sur fond ; par conséquent, la reproductibilité indiquée ici reflète une coloration qualitative reproductible sur plusieurs lamelles et conditions de contrôle, et non une performance validée quantitativement. Un guide de dépannage consolidé résumant les problèmes courants, leurs causes probables et les mesures correctives est fourni dans le Tableau supplémentaire 2. Les laboratoires nécessitant des résultats quantitatifs peuvent utiliser un logiciel d'analyse d'images open source pour mesurer l'intensité moyenne, soustraire le fond, effectuer une quantification basée sur une région d'intérêt (ROI) et tracer le profil d'intensité²¹. Deuxièmement, les données représentatives proviennent d'une seule lignée tumorale canine adhérente (D17), de sorte que l'application à d'autres types cellulaires, espèces ou combinaisons d'antigènes exigera une ré-optimisation spécifique à la cible des conditions de fixation, de perméabilisation et d'anticorps.

En résumé, ce protocole propose un flux de travail souple et économique pour l'immunofluorescence simple et multiplexe dans des cultures adhérentes en 2D, combinant une faible consommation de réactifs à des performances de marquage constantes sur des équipements de laboratoire standards, tout en permettant une adaptation ciblée et dépendante des antigènes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques de culture tissulaire 24 puits	Corning	3524	Ensemencement et coloration sur lamelles
Antibiotique-antimycotique	Gibco	15240062	Utilisé pour prévenir la contamination bactérienne et fongique en culture cellulaire.
Solution de dilution d'anticorps (TBST-BSA à 1 %)	Préparé en interne	—	Pour 10 mL : 2 mL de solution de blocage BSA à 5 % + 5 µL de Tween-20 + 7,995 mL de TBS 1x (solution travail) pour un volume final de 10 mL (final : BSA à 1 %, Tween-20 à 0,05 % dans TBS ; pH 7,6). Préparer frais ; si stocké, conserver à 4 °C à l’abri de la contamination et utiliser dans la semaine.
Solution de blocage	Préparé en interne	—	Pour 10 mL : 0,5 g de BSA dissous dans 10 mL de TBS 1x (1 mL de stock TBS 10x + 9 mL d’eau distillée) ; pH 7,6. Incuber 30 min à 25 °C ; préparer frais.
(BSA à 5 % dans TBS)
Brefeldine A	Sigma-Aldrich	B7651	5 µg/mL ; prétraitement de 4 h pour bloquer la sécrétion des protéines avant la détection des cytokines.
BSA (albumine sérique bovine)	Sigma-Aldrich	A7906	À 5 % dans TBS pour le blocage ; à 1 % dans TBS + 0,05 % de Tween-20 pour la dilution des anticorps.
Réactif à base de collagène (revêtement de lamelles, facultatif)	Corning	354231	Collagène de type I d’origine dermique bovine ; dilué à 50 µg/mL dans du HCl 0,01 N ; appliqué à raison de 5–10 µg/cm² (≈100 µL/puits) ; incuber 1 h à température ambiante (≈25°C) ; aspirer et rincer avec du PBS avant l’ensemencement cellulaire.
Lamelles en verre, rondes, 12 mm	Knittel Glass	100013	Support pour culture cellulaire adhérente et coloration.
Ligne cellulaire D17 d’ostéosarcome canin	Banco de células do Rio de Janeiro	276	Modèle cellulaire représentatif ; maintenu en DMEM supplémenté avec 10 % de SFB et antibiotique-antimycotique ; maintenir à 37 °C, 5 % de CO2.
(BCRJ)
Eau déionisée/distillée	Préparé en interne	—	Préparation des tampons.
DMEM (milieu de culture de Dulbecco modifié)	Gibco	12100-046	Milieu complet pour culture cellulaire.
Éthanol	Supelco	1.00983	Décontamination des lamelles/pincettes.
Sérum de veau fœtal	Sigma-Aldrich	F7524	Supplément dans le milieu de culture cellulaire.
(SVF)
Fibronectine	Gibco	33016015	Glycoprotéine de la matrice extracellulaire ; diluée à 0,0125 mg/mL dans le milieu de culture cellulaire ; appliquée à 100 µL/puits et incubée 1 h à température ambiante (≈25°C) avant l’ensemencement cellulaire.
Pincettes métalliques à pointe fine	Divers	—	Manipulation des lamelles.
Microscope à fluorescence	Leica Microsystems	DMi8	Microscope à fluorescence en champ large DMi8 (Leica Microsystems), objectif HC PL FLUOTAR 40×/0,80 DRY ; compatible avec les fluorophores du panel (AF488, AF555, AF647, Hoechst).
Lames de microscope en verre	Bioslide	—	Montage des lamelles colorées pour l’imagerie.
Boîte de Pétri en verre ou support de lamelles	Divers	—	Autoclavage/stockage des lamelles.
Glycine	Sigma-Aldrich	8.16E+09	Pour 10 mL de solution à 50 mM : 37,5 mg de glycine dissous dans 10 mL de TBS 1x ; pH 7,6. 5 min à 25 °C ; étape facultative de blocage des aldéhydes après la fixation, avant la perméabilisation ; préparer frais.
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Pour 10 mL de solution travail : diluer le stock 1:5000 dans du TBS. Contre-coloration nucléaire ; incuber à l’abri de la lumière ; préparer frais.
Chambre humide	Divers/Préparé en interne	—	Pour l’incubation des anticorps ; peut être assemblée à partir d’une boîte plastique scellée contenant du papier absorbant humidifié.
ImageJ	Open source (NIH)	—	Utilisé pour l’analyse d’images après acquisition.
Logiciel d’acquisition d’images	Leica Microsystems	LAS X 3.7.3	Utilisé pour l’acquisition d’images sur Leica DMi8.
Méthanol	Merck	1.06009	Fixation alternative (antigènes nucléaires/épitopes phospho) ; pré-refroidi à −20 °C, incubation de 5 min ; peut altérer la coloration de la phalloïdine/F-actine.
Milieu de montage	Sigma-Aldrich	G2289	Pour 10 mL : 8 mL de glycérine + 2 mL de PBS, pH 7,6, bien mélanger. N’a pas de propriétés antifade et ne durcit pas spontanément. Sceller les bords des lamelles avec du vernis à ongles pour éviter le dessèchement/déplacement, conserver les lames à 4 °C à l’abri de la lumière, et imager rapidement pour minimiser la photodégradation.
(à base de glycérine)
Milieu de montage (ProLongTM Glass)	Invitrogen	P36984	Contient des réactifs antifade et durcit (se solidifie) spontanément en environ 24 h à température ambiante, à l’abri de la lumière, formant un montage permanent (aucun scellement au vernis à ongles requis). Conserver les lames à 2–8 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à l’imagerie.
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Composant ionique du tampon TBS ; maintient l’osmolarité physiologique pour préserver la morphologie cellulaire et tissulaire lors des étapes de lavage et d’incubation avec les anticorps.
Aiguille (fine, par exemple 25–27G)	Divers	—	Utilisée comme levier pour soulever/détacher délicatement la lamelle du fond du puits sans endommager la monocouche cellulaire.
Paraformaldéhyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Pour 10 mL : 0,4 g de poudre de paraformaldéhyde dissous dans 8 mL de PBS, chauffé à 60–65 °C avec quelques gouttes de NaOH 1N jusqu’à clarification, refroidi, ajuster le pH à 7,4, puis compléter à 10 mL avec du PBS ; filtrer à travers un filtre de 0,2 µm avant utilisation. Préparer frais ou aliquoter et stocker à −20 °C, en évitant les cycles répétés de congélation-décongélation.
Phalloïdine conjuguée à un fluorophore	Invitrogen	En fonction de la fluorescence choisie	Pour 10 mL de solution travail : diluer le stock 1:400 dans du TBS, pH 7,6, selon les instructions du fabricant. Alternative pour marquer le cytosquelette/la F-actine ; préparer frais, à l’abri de la lumière.
Solution saline tamponnée au phosphate	Sigma-Aldrich	P4474-1L	Tampon phosphate isotonique (pH 7,4) ; maintient l’osmolarité physiologique pour préserver la morphologie cellulaire lors des étapes de fixation et de lavage.
(PBS)
Poly-L-lysine (revêtement de lamelles, facultatif)	Sigma-Aldrich	P8920	Réactif de revêtement polycationique synthétique qui améliore l’adhésion cellulaire électrostatique ; utilisé à 0,1 mg/mL dans de l’eau distillée ; volume suffisant pour couvrir la surface de la lamelle ; incuber 30 min à 25 °C avant l’ensemencement cellulaire.
Anticorps primaire anti-actine (hôte chèvre)	Santa Cruz Biotechnology	SC-1615	Anticorps anti-actine ; polyclonal, non conjugué, détecté avec un anticorps secondaire anti-chèvre. Utilisé à une dilution travail de 1:200.
Anticorps primaire anti-IFN-β (hôte souris)	Aviva Systems Biology	OAPB00536	Anticorps anti-IFN-β ; polyclonal, non conjugué, détecté avec un anticorps secondaire anti-souris. Utilisé à une dilution travail de 1:200.
Anticorps primaire anti-p14ARF (hôte lapin)	Calbiochem	PC409	Anticorps anti-p14ARF ; polyclonal, non conjugué, détecté avec un anticorps secondaire anti-lapin. Ce produit a été discontinué, un nouvel anticorps devra être validé si des travaux sur cette cible sont prévus. Utilisé à une dilution travail de 1:200.
Anticorps secondaire anti-lapin, conjugué à Alexa Fluor 488	Thermo Fischer Scientific	A32731TR	Anticorps anti-lapin conjugué à AF488. Utilisé à une dilution travail de 1:500.
Anticorps secondaire anti-chèvre, conjugué à Alexa Fluor 555	Thermo Fischer Scientific	A-21432	Anticorps anti-chèvre conjugué à AF555. Utilisé à une dilution travail de 1:500.
Anticorps secondaire anti-souris, conjugué à Alexa Fluor 647	Thermo Fischer Scientific	A-21235	Anticorps anti-souris conjugué à AF647. Utilisé à une dilution travail de 1:500.
Solution tamponnée au Tris (TBS), stock 10x	Préparé en interne	—	Pour 100 mL : dissoudre 6,06 g de Tris base et 8,77 g de NaCl dans 80 mL d’eau distillée ; ajuster le pH à 7,6 avec du HCl concentré ; compléter à 100 mL ; stériliser à l’autoclave. Diluer 1:10 dans de l’eau distillée pour obtenir la solution travail (TBS 1x) (final : Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) ; conserver à température ambiante ou à 4 °C jusqu’à 3 mois.
TBST (TBS + 0,05 % de Tween-20)	Préparé en interne	—	Pour 10 mL : 1 mL de stock TBS 10x + 8,995 mL d’eau distillée + 5 µL de Tween-20 (0,05 % v/v) ; pH 7,6. Tampon de lavage entre les étapes de coloration ; préparer frais, utiliser dans les ~7 jours à 4 °C.
Tris base	Sigma-Aldrich	252859	Agent tampon utilisé pour préparer la solution stock TBS ; maintient la stabilité du pH dans la plage physiologique (pH 7,6) pour les tampons de lavage et de dilution en immunofluorescence.
Triton X-100 (détachant non ionique éthoxylé d’octylphénol)	Sigma-Aldrich	X100	Pour 10 mL : 10 µL de Triton X-100 dans 9,99 mL de TBS 1x pour du TX100 à 0,1 % ; 30 µL dans 9,97 mL de TBS 1x pour du TX100 à 0,3 % (dépend de la cible ; les cibles nucléaires nécessitent des concentrations plus élevées).
Trypsine-EDTA	Gibco	25200056	Utilisé pour le détachement cellulaire.
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	Utilisé dans le TBS comme tampon de lavage (TBST) et pour la dilution des anticorps (TBST-BSA à 1 %).