Article de méthode

Dépistage in vivo parallèle de l’élimination et de l’activation du gène dans la glande mammaire de la souris

DOI :

10.3791/71115

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24 juillet 2026

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1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une approche de dépistage intraductale évolutive de CRISPR permettant des études parallèles d’élimination et d’activation du gène in vivo dans la glande mammaire de la souris.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les criblages génétiques avancés sont régulièrement utilisés pour perturber des milliers d’éléments génétiques de manière regroupée, dans le but de produire des cartes génotype à phénotype à grande échelle. Bien que souvent réalisés dans des systèmes de culture cellulaire, l’accumulation de preuves soutient que les criblages in vivo ont le pouvoir de révéler de nouvelles biologies qui ne peuvent pas être récapitulées in vitro. Cependant, l’application généralisée de cette approche a été limitée par deux défis majeurs : une focalisation prédominante sur les perturbations de perte de fonction plutôt que sur l’activation génique, et les obstacles techniques importants liés à la livraison de bibliothèques génétiques complexes à des tissus spécifiques in vivo. Pour surmonter ces défis, nous décrivons une stratégie d’injection intraductale simple et polyvalente qui permet un dépistage génomique fonctionnel efficace et rapide dans la glande mammaire de la souris, en générant des dizaines de milliers de clones épithéliaux discrets. De plus, nous fournissons tous les détails nécessaires pour la génération de bibliothèques, l’injection invectale, la déconvolution de l’écran et l’analyse des bibliothèques CRISPR-Knockout et Activation pour des écrans in vivo complets. Grâce à ces outils, que nous avons appelés CRISPR-KOALA (Knockout and Activation Linked Assay), nous avons identifié de nouveaux suppresseurs tumoraux et oncogènes au sein du génome codant et non codant dans des bibliothèques groupées allant de 46 loci à un cinquième du génome. Il est important de noter que cette approche et cette analyse peuvent être appliquées à d’autres organes pour étudier la fonction biologique de tout gène lors de l’homéostasie ou de la maladie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les criblages de génomique fonctionnelle fournissent un cadre puissant pour interroger la fonction génique àl’échelle 1. Le développement des technologies d’édition génétique CRISPR-Cas a permis la perturbation systématique de centaines voire des milliers de gènes en parallèle, et les criblages regroupés basés sur CRISPR dans des lignées cellulaires de mammifères sont devenus une pierre angulaire de la recherche moderne en biologiedu cancer. Ces approches in vitro ont identifié des gènesessentiels 3, des suppresseurstumoraux 4, et des interactions létalessynthétiques 5 dans divers contextes cancéreux. Cependant, une limitation centrale est l’incapacité à capturer les caractéristiques biologiques complexes des tumeurs in vivo, y compris les interactions avec le système immunitaire et le stroma, les gradients de nutriments et l’architecture tissulaire au sein dumicroenvironnement 2. Conformément à cette limitation, des études récentes ont démontré que de nombreux gènes conducteurs du cancer véritables n’exercent pas d’effets mesurables in vitro, en particulier lorsque leur fonction dépend de signaux microenvironnementaux absents dans la culturecellulaire 6,7,8,9,10.

La glande mammaire de la souris offre un contexte tissulaire particulièrement avantageux pour le dépistage de la génomique fonctionnelle in vivo. Les cellules épithéliales mammaires sont hautement régénératives, subissent des cycles d’expansion clonale lors du cycle œstral, et sont organisées en un réseau canalal ramifié facilement accessible et génétiquementmanipulé 11,12,13. Ces caractéristiques ont soutenu des décennies d’analyses génétiques mosaïques et d’expériences de traçage de lignées, et établissent la glande mammaire comme un système facile pour interroger la fonction des gènes intrinsèques cellulaires et dépendantes du microenvironnement lors de l’homéostasie tissulaire et des maladies 14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33. Il est important de noter que les perturbations génétiques peuvent être limitées au compartiment épithélial, permettant une étude directe des facteurs spécifiques de transformation épithéliale, de compétition cellulaire, de fidélité de la lignée et de progression tumorale dans un contexte tissulaire intact.

Bien que plusieurs stratégies aient été développées pour délivrer des perturbations génétiques directement à la glande mammaire adulte in situ, d’importants obstacles techniques subsistent pour des applications à haut débit. L’administration médiée par l’adénovirus de la recombinase Cre a été largement utilisée pour induire la recombinaison somatique d’allèles conditionnels dans la glande mammaireadulte 34,35,36,37, offrant un moyen efficace de manipuler la fonction des gènes sans la complexité de la génétique génétique nécessaire à la sélection germinale des modèles murins génétiquement modifiés traditionnels (GEMM). Bien que l’adénovirus à haut titre puisse également délivrer des composants CRISPR-Cas9 aux cellules résidentes dans les tissus, ces vecteurs ne s’intègrent pas dans le génome de l’hôte 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Cela limite fortement l’échelle des criblages à ~10–55 gènes, car chaque site cible d’ARNg doit être séquencé individuellement à l’aide des sondes d’inversionmoléculaire 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 . De plus, les méthodes actuelles d’administration intraductale permettent un accès direct au système ductal mammaire mais nécessitent soit une exposition chirurgicale invasive de la glandemammaire 50, soit l’utilisation de seringues Hamilton relativement grandeset encombrantes 51. Bien qu’efficaces pour la livraison localisée du virus, ces approches sont relativement invasives, techniquement complexes et non optimisées pour une livraison évolutive de bibliothèques lentivirales regroupées. Collectivement, ces études démontrent que des perturbations virales in situ sont réalisables, mais les outils actuels ne supportent pas les perturbations stables, regroupées et récupérables par séquence nécessaires au dépistage CRISPR in vivo à haut débit.

Pour remédier à ces limites, nous et d’autres avons adopté l’intégration de vecteurs lentiviraux, qui permettent des modifications génétiques stables et héréditaires. Contrairement aux systèmes de culture cellulaire, les tissus in vivo imposent des contraintes strictes sur le nombre de cellules perturbées pouvant être générées dans un seul organe, rendant le criblage à l’échelle du génome impraticable. Par conséquent, les écrans CRISPR in vivo nécessitent la conception de bibliothèques ciblées et biologiquement informées qui équilibrent couverture et faisabilité. De plus, la plupart des tests CRISPR in vivo, examinésici 2, se sont concentrés presque exclusivement sur les perturbations de perte de fonction lentivirales, malgré des preuves croissantes que l’activation génique peut révéler des connaissances biologiques complémentaires etnon superposées 52,53,54,55. Nous et d’autres avons déjà démontré que l’intégration des perturbations lentivirales CRISPR dans l’épithélium mammaire adulte permet une modification génétique stable et héréditaire in situ, et qu’elles peuvent être récupérées et quantifiées à partir de l’ADNgénomique 36,55,56,57,58. En utilisant cette approche, nous avons réalisé des criblages CRISPR in vivo regroupés qui ont identifié de nouveaux facteurs de transformationoncogénique 36,55, établissant à la fois la faisabilité et la pertinence biologique de la délivrance lentivirale et du dépistage CRISPR. Cependant, ces études ont également mis en lumière la nécessité d’un protocole simple, standardisé et évolutif, qui pourrait être largement adopté et étendu pour inclure à la fois des modèles de dépistage de perte et de gain de fonction au sein d’une même glande.

Ici, nous décrivons une stratégie d’injection intraductale simple et polyvalente qui permet un dépistage in vivo parallèle des bibliothèques de knockout et d’activation de CRISPR, appelée CRISPR-KOALA, au sein de la glande mammaireadulte de souris 55. CRISPR-KOALA utilise soit un ARN « simple guide » (sg) conventionnel de 20 à 21 pb pour les capacités CRISPR-KO, soit un ARN « dead-guide » (dg) de 14 pb pour CRISPR-A. Le dgRNA guide efficacement Cas9 vers son site cible mais empêche l’activité des endonucléasesCas9 59,60,61, permettant ainsi l’utilisation d’une seule souris exprimant Cas9 actif pour les modalités de knockout et d’activation. L’introduction de deux épingles à cheveux PP7 dans le trcr de l’ARNDG permet le recrutement d’un transactivateurPP7 Coat Protein :P65 :HSF1 et conduit à une surexpression efficace des gènes in vivo55 (Figure 1). En combinant la conception ciblée de bibliothèques d’ARNg, une production lentivirale à haut titre et une administration intraductale non chirurgicale à l’aide de microcapillaires en verre, cette approche génère des dizaines de milliers de clones épithéliaux spatialement discrets tout en préservant l’architecture tissulaire et les interactions microenvironnementales. Il est important de noter que l’intégration lentivirale dans le génome de l’hôte permet la récupération et la quantification des gRNA via un séquençage à haut débit, permettant des criblages génomiques fonctionnels en commun in vivo. Ensemble, cela permet des perturbations CRISPR-KO et CRISPR-A parallèles ou simultanées (dans la même cellule) au sein de la même glande mammaire d’une souris exprimant Cas9.

Nous présentons un protocole détaillé, étape par étape, englobant la conception de bibliothèques d’ARNg, la production et la concentration de lentiviraux, la délivrance intraductale, la déconvolution des bibliothèques et l’analyse des données (Figure 1). Ensemble, cette méthode fournit un cadre pratique et évolutif pour le dépistage d’activation et/ou d’élimination in vivo de CRISPR dans la glande mammaire de la souris et peut être adaptée pour étudier la fonction génique lors de l’homéostasie tissulaire, différents contextes pathologiques, d’autres tissus et d’autres espèces comme le rat.

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Protocole

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Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives du Conseil canadien de la protection animale et ont été approuvées par le Comité de soins aux animaux du Centre de phénogénomique (protocole 26-0272H).

1. Clonage de la bibliothèque CRISPR

REMARQUE : Cette section décrit le clonage en commun des bibliothèques knockout et d’activation CRISPR à partir d’oligonucléotides synthétisés par réseau vers les colonnes vertébrales lentivirales. Nous générons régulièrement des bibliothèques contenant jusqu’à 4 000 gRNA, qui peuvent être criblées à une couverture de 400X-1 000X chez 8 à 20 souris. Le nombre d’ARNg et la couverture peuvent être ajustés selon les besoins, ce qui influencera le nombre de souris nécessaires pour maintenir la puissance statistique. Nous recommandons de maintenir une couverture minimale de 400X, ce qui peut être suffisant pour des phénotypes de gain de fonction forts.

  1. Conception de bibliothèques ARN guides
    1. Compiler une liste de tous les gènes de souris à sélectionner dans une seule expérience pour la conception ultérieure de la bibliothèque CRISPR, en maintenant des listes de cibles séparées pour les bibliothèques CRISPR knockout (CRISPR-KO) et activation CRISPR (CRISPR-A).
      NOTE : LES BIBLIOTHÈQUES CRISPR-KO et CRISPR-A sont générées séparément et peuvent être combinées au stade de la transduction lentivirale pour un dépistage simultané.
    2. Pour les bibliothèques CRISPR-KO, sélectionnez quatre à cinq ARN guides simples (sgRNA) par gène à l’aide d’algorithmes de prédiction à haut score tels que CRISPick62,63, CHOPCHOP64 ou VBCScore 65.
      REMARQUE : Le score VBC offre une très grande efficacité et une activitéciblée de 66. Quel que soit l’outil, priorisez des guides avec une activité prédite élevée sur cible, un potentiel d’écart minimal et des exons codant le ciblage.
    3. Pour les bibliothèques CRISPR-A, sélectionnez huit à dix guides par gène en utilisant CRISPick62,63 ou CHOPCHOP64. Pour les outils permettant des longueurs de guide spécifiées par l’utilisateur (comme CHOPCHOP), fixez la longueur du guide à 14 pb avant la génération du guide. Si vous utilisez un outil qui ne génère que des guides de 20 pb, convertir ces séquences en ARN guides morts (dgARN) en conservant la séquence de 14 pb immédiatement à 5' du motif adjacent du proto-espaceur, qui cible les régions promoteurs des gènes.
      REMARQUE : les dgRNA sont des séquences guides tronquées conçues pour permettre une activation transcriptionnelle basée sur CRISPR à environ 50-85 % de l’efficacité des sgRNA de longueurcomplète 55 sans induire de clivagede l’ADN 59,60,61.
    4. Regroupez tous les sgRNA ou dgRNA correspondant à une seule expérience dans des listes séparées afin de permettre un clonage uniforme, une production virale et un dépistage in vivo .
      REMARQUE : les sgRNA et les dgARN à dépister ensemble seront mutualisés après la production virale.
    5. Générer des bibliothèques de contrôle négatifs regroupées pour les criblages CRISPR-KO et CRISPR-A, incluant les séquences non ciblées55,67 et les séquences d’ARNg nongéniques 68, comme décrit précédemment, afin de contrôler les effets de fond indépendants de la perturbation ou de l’activation génique.
      REMARQUE : Si désiré, des bibliothèques séparées de gRNA non cibles et non géniques peuvent être créées pour créer deux bibliothèques de contrôle négatif indépendantes.
  2. Conception et amplification des pools d’oligonucléotides
    1. Concevoir des oligonucléotides regroupés de manière à ce que chaque gRNA contienne la séquence de ciblage, des surplombs enzymatiques de restriction compatibles avec la colonne vertébrale lentivirale de destination, ainsi que des séquences d’amorce spécifiques à la bibliothèque pour permettre une amplification sélective à partir d’un pool complexe d’oligonucléotidiques (Figure 1, Tableau 1).
    2. Attribuer une paire d’amorces unique à chaque bibliothèque d’ARNg afin de permettre une amplification indépendante de bibliothèques individuelles à partir d’un pool d’oligonucléotides partagé. Les paires d’amorces uniques sont listées dans le tableau 1.
    3. Commander des bibliothèques d’oligonucléotides regroupées à partir d’une plateforme commerciale de synthèse de tables, assurant ainsi une représentation équimolaire de tous les gRNA de chaque pool.
    4. Amplifiez les bibliothèques individuelles d’ARNg à partir du modèle d’oligonucléotides regroupés à l’aide d’amorces spécifiques à la bibliothèque dans le mélange de réactions suivant. La réaction peut être modifiée pour respecter la composition recommandée de la polymérase spécifique. Préparez trois réactions avec un modèle d’oligonucléotide en pool et une réaction témoin négative sans modèle.
      Modèle d’oligonucléotides poolés de 4 ng
      2,5 μL 10 μM amorce spécifique à la bibliothèque avant
      2,5 μL 10 μM amorce spécifique à la bibliothèque inversée
      10 μL 5x Tampon de réaction
      ADN polymérase haute fidélité de 0,5 μL
      X μL Eau sans nucléase
      50 μL Volume total
    5. Effectuer une amplification PCR en utilisant les conditions de cycle suivantes, en ajustant la température de recuit en fonction de la température de fusion de la base spécifique à la bibliothèque :
      1 cycle à 98 °C pendant 30 s
      18 cycles de 98 °C pendant 10 s, 62–65 °C pendant 20 s, et 72 °C pendant 3 s
      1 cycle à 72 °C pendant 5 minutes
      REMARQUE : Ne dépassez pas 18 à 19 cycles d’amplification pour préserver une représentation égale du gRNA dans la bibliothèque.
    6. Résoudre les produits PCR sur un gel d’agarose à 2,5 % à 120 V pendant environ 45 minutes et exciser la bande correspondant à la taille attendue de l’insert gRNA (environ 100 pb, selon la conception de l’amorce ; Figure 2A).
    7. Purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit d’extraction gel et éluez dans 20 μL d’eau ultrapure lors de la dernière étape d’élution.
      NOTE : (POINT DE PAUSE) Les inserts d’ARNg purifiés peuvent être stockés à -20 °C avant le clonage.
  3. Préparation et digestion des colonnes vertébrales lentivirales
    1. Préparez des plasmides lentiviraux contenant une séquence de stuffer amovible pour cloner les inserts d’ARNg. Pour les bibliothèques in vivo CRISPR-KO et CRISPR-A, on utilise respectivement pLKO-Cre (plasmide Addgène #158032 ou 256774) et pXPR502-PPH-Cre (Plasmide Addgène #256776).
    2. Digérer 5 à 10 μg d’ADN lentiviral de la colonne vertébrale dans un volume total de réaction de 200 μL en utilisant l’enzyme de restriction et le tampon appropriés. Utilisez Esp3I pour la colonne vertébrale pLKO-Cre CRISPR-KO et SapI pour la dorsale pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A.
      Plasmide de la colonne vertébrale de 5 à 10 μg
      Tampon enzymatique 20 μL 10x
      Enzyme de restriction de 5 μL
      X μL Eau sans nucléase
      200 μL Volume total
    3. Incuber les réactions digestives pendant 2 à 3 heures à 37 °C.
    4. Ajoutez 2 μL de phosphatase alcaline recombinante à chaque réaction de digestion et incubez pendant 1 h à 37 °C pour déphosphoryler la colonne vertébrale digérée.
    5. Résoudre les produits digérés sur un gel d’agarose à 1 % et exciser la bande correspondant à la colonne vertébrale linéarisée (Figure 2B,C)
      REMARQUE : Pour les deux colonnes vertébrales, le fragment de bourrage est visible comme une bande distincte à environ 2000-2500 pb, selon le vecteur.
    6. Purifiez l’ADN de la colonne vertébrale excisée à l’aide d’un kit d’extraction en gel et éluez dans un volume minimal d’eau ultrapure pour maintenir une forte concentration d’ADN (généralement 20 μL).
      NOTE : (POINT DE PAUSE) Les colonnes vertébrales digérées purifiées peuvent être stockées à -20 °C avant la ligatura.
  4. Digestion et ligature des bibliothèques d’ARNg
    1. Mettez en place des réactions digestives-ligature tout-en-un en utilisant 750 ng d’ADN lentiviral purifié, 43 ng d’ADN inséré par bibliothèque d’ARNg, 3 μL d’enzyme de restriction, 7,5 μL de ligase T4, 15 μL d’ATP 10 mM, ainsi que la quantité appropriée de tampon de réaction et d’eau distillée stérile pour atteindre un volume total de réaction de 150 μL.
      REMARQUE : Utilisez la même enzyme de restriction initialement utilisée lors de la digestion de la colonne vertébrale plasmidique. Un rapport de 750 ng de colonne vertébrale lentivirale purifiée pour 43 ng d’ADN inséré de bibliothèque donne un rapport vecteur-insertion molaire approximatif de 1:7 lorsque les colonnes dorsales recommandées sont utilisées.
    2. Divisez chaque mélange de ligation en trois aliquotes égales pour augmenter l’efficacité de la transformation et la complexité de la bibliothèque.
    3. Préparez une seule réaction témoin négative contenant de l’ADN dorsale mais sans inserts d’ARNg pour évaluer la ligature de fond.
    4. Incuber les réactions de ligature digestive toute la nuit à 30 °C.
    5. Le lendemain matin, ajoutez 1 μL de l’enzyme de restriction appropriée à chaque aliquote de réaction et incubez pendant 1 heure à 37 °C pour compléter la digestion de la colonne vertébrale.
    6. Ajoutez 2 μL d’ATP de 10 mM et 2 μL de ligase d’ADN T4 à chaque réaction et incubez à 25 °C pendant 2 à 3 heures pour compléter la ligatura.
    7. Regroupez les trois réactions digestion-ligature individuelles par bibliothèque, purifiez les réactions à l’aide d’une méthode de nettoyage des oligonucléotidiques en colonne, et éluvez chacune dans 21 μL d’eau distillée ultrapure et stérile. Éluez la réaction de contrôle négative purifiée unique dans 7 μL d’eau distillée ultrapure et stérile.
      REMARQUE : Ne rejetez pas les produits de ligature dans des tampons contenant du sel ou de l’EDTA, car ils réduisent significativement l’efficacité d’électroporation bactérienne. (POINT DE PAUSE) Les produits de ligature purifiés peuvent être stockés à -20 °C avant l’électroporation.
  5. Électroporation et expansion de la bibliothèque
    1. Pré-refroidissement des cuvettes d’électroporation de 0,1 cm, des tubes de microcentrifuge contenant 2 μL d’aliquotes de produits de ligature purifiés, et des tubes de culture en polypropylène à fond rond de 14 mL sur glace pendant au moins 20 minutes avant l’électroporation.
    2. Décongelez les cellules bactériennes électrocompétentes sur de la glace et mélangez doucement 25 μL de cellules avec 2 μL de produit de ligature purifié dans le tube de microcentrifuge pré-refroidi par pipettette.
    3. Transférer le mélange cellule-ADN dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie de 0,1 cm et électroporer à 1,8 kV, 25 μF et 200–600 Ω.
      REMARQUE : Une électroporation réussie donne généralement une constante de temps comprise entre 4,6 ms et 4,9 ms.
    4. Ajoutez immédiatement 1 mL de milieu de récupération préchauffé à 37 °C fourni avec les cellules électrocompétentes à la cuvette, resuspendez doucement les cellules, puis transférez la suspension dans un tube polypropylène à fond rond de 14 mL.
    5. Incubez les cellules récupérées à 30 °C tout en secouant à 180 tr/min pendant 90 minutes.
    6. La plaque 10 μL des cellules récupérées a été diluée dans 90 μL de bouillon LB sur des plaques LB-agar contenant de l’ampicilline et incubée toute la nuit à 30 °C pour évaluer l’efficacité de la transformation et la ligature de fond.
      REMARQUE : Un clonage réussi devrait aboutir à des centaines de colonies sur la plaque avec insertion et à quelques (> 30) colonies sur la plaque de contrôle négative uniquement à la colonne vertébrale (Figure 3).
    7. Validez davantage la bibliothèque en choisissant ~10 colonies pour miniprep et séquençage Sanger depuis le promoteur U6. Les bibliothèques clonées avec succès auront < 90 % des minipreps contenant un séquençage clair d’un gRNA, sans guides répétés sur les 10 minipreps. De plus, l’enzyme de restriction digère les minipreps et la bibliothèque de plasmidiques regroupés (étape 1.5.10) et fonctionne sur un gel d’agarose pour vérifier la taille des bandes et s’assurer que les constructions lentivirales n’ont pas subi de recombinaison aberrante.
      REMARQUE : La représentation de la bibliothèque peut être évaluée en comparant le nombre de colonies provenant des plaques de dilution au nombre total de gRNA dans la bibliothèque, visant une couverture multipliée par 1 000. Plusieurs dilutions sérielles peuvent être utilisées pour faciliter ce calcul.
    8. Si l’efficacité de transformation est suffisante, placez les cellules récupérées restantes sur des plaques LB-agar de 15 cm contenant l’antibiotique approprié et incubez toute la nuit à 30 °C pour générer une pelouse dense de colonies.
      REMARQUE : Placez 100 μL de cellules récupérées sur chacune des dix plaques d’agar de 15 cm LB pour récupérer suffisamment de colonies.
    9. Le lendemain, utilisez un grattoir cellulaire pour gratter les colonies bactériennes dans 500 mL de bouillon LB avec ampicilline afin de générer une culture bactérienne unique représentant la bibliothèque d’ARNg cloné.
    10. Développez la culture bactérienne regroupée à 30 °C en secouant pendant environ 3 h et isolez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit maxiprep.

2. Production de lentiviraux pour le dépistage in vivo

REMARQUE : Pour l’accouchement intraductal et le dépistage commun in vivo , les préparations lentivirales doivent être concentrées afin d’obtenir des titres élevés (idéalement entre 1 x 108 pfu/mL et 1 x 109 pfu/mL) afin d’assurer une transduction efficace des cellules épithéliales mammaires. Le protocole suivant décrit la production de lentiviraux à haut titre, optimisée pour une utilisation in vivo .

  1. Préparation des cellules productrices de lentiviraux
    1. Maintenir HEK293TN cellules dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline-streptycine, et cultiver les cellules à 37 °C avec 5 % deCO-2.
    2. Des cellules de passage tous les 2 à 3 jours pour maintenir la croissance logarithmique et s’assurer que les cellules ne dépassent pas 90 % de confluence. Utilisez des cellules aux passages <20 pour une production virale optimale.
    3. Un jour avant la transfection, enduire 15 cm de plaques de culture tissulaire avec de la poly-L-lysine (0,02 mg/mL) pendant 1 h à température ambiante. Préparez neuf assiettes pour une fournée de préparation virale.
    4. Retirez la solution de poly-L-lysine et lavez les plaques deux fois avec du sérum sérum tamponné phosphate.
    5. Semez 1,1 x 107 cellules HEK293TN sur chacune des neuf plaques de culture tissulaire de 15 cm recouvertes de poly-L-lysine, afin d’assurer que les cellules atteignent une confluence de ~90 % au moment de la transfection.
      REMARQUE : Pour les applications ne nécessitant pas de titres viraux maximaux, la production lentivirale peut être réduite à moins de plaques (par exemple, trois ou six plaques) avec des rendements proportionnellement réduits. Réduisez en conséquence les réactifs (ADN plasmidique, PEI et DMEM) pour la transfection.
  2. Transfection lentivirale à base de PEI
    1. Préparer l’ADN plasmidique pour la production lentivirale à l’aide d’un système à trois plasmides composé de 95 μg du plasmide de la bibliothèque d’ARNg, 95 μg du plasmide d’emballage psPAX2 (plasmide Addgène #12260), et 65 μg du plasmide enveloppe VSV-G pMD2.G (plasmide Addgène #12259).
    2. Combinez les trois plasmides pour la production lentivirale dans 10,8 mL de DMEM sans sérum et mélangez soigneusement en vortexant pendant environ 10 s.
    3. Ajouter 366 μL de 1 mg/mL de polyéthylenimine (PEI) goutte à goutte dans la solution d’ADN diluée, mélanger soigneusement en vortex pendant environ 10 s, puis incuber les complexes ADN-PEI à température ambiante pendant 10 à 30 minutes.
    4. Lors de la formation du complexe, aspirez le milieu de culture des plaques HEK293TN et ajoutez 14 mL de DMEM sans sérum.
      REMARQUE : Le sérum fœtal bovin peut inhiber l’absorption des plasmides par les cellules.
    5. Répartir 1,2 mL du complexe ADN-PEI goutte par goutte sur toute la plaque, et faire la pierre pour assurer une distribution uniforme.
    6. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % deCO-2 pendant 6 à 8 heures.
    7. Remplacer le milieu de chaque plaque par 20 mL de DMEM préchauffé, complété avec un sérum bovin fœtal à 10 % (sans 1 % de pénicilline-streptomycine) et continuer à cultiver les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : La transfection nocturne n’est pas recommandée, car une exposition prolongée à l’IPP et un manque de sérum réduisent le rendement viral.
  3. Récolte virale et ultracentrifugation
    1. Préparez 200 mL d’une solution coussin de saccharose en combinant 40 g de saccharose, 11,7 g de chlorure de sodium, 4 mL de 1 M HEPES (pH 7,4) et 1 mL de 0,5 M EDTA (pH 7,9) dans un volume approprié d’eau distillée stérile et filtrez-stérilisez via une unité de filtration polyéthérothersulfone à faible liaison aux protéines de 0,45 μm. Cette solution peut être stockée à 4 °C pendant plusieurs mois.
    2. Prélever le surnageant lentiviral 48 à 72 heures après la transfection.
    3. Laissez passer 10 mL de DMEM complétés avec un sérum bovin fœtal à 10 % via l’unité de filtration polyéthérsulfone à faible liaison protéique à 0,45 μm. Écartez le flux à travers. Chargez le surnageant sur le filtre et mettez le vide.
      REMARQUE : Si la concentration ne peut pas être effectuée immédiatement, conservez le surnageant viral clarifié à 4 °C pendant la nuit.
    4. Ajoutez 30 mL de surnageant viral clarifié dans un tube ultracentrifuge.
    5. Posez lentement le surnageant viral clarifié avec 4 mL de solution de coussin de saccharose.
    6. Placez le tube de l’ultracentrifuge dans un adaptateur compatible pour un rotor de seau pivotant et équilibrez précisément les tubes.
    7. Centrifugez les tubes à 104 000 × g pendant au moins 2 heures à 4 °C.
      REMARQUE : Un rotor à seau pivotant, tel que le rotor Beckman JS24.38, est nécessaire pour pelleter correctement le virus à travers le coussin de saccharose.
    8. Décantez soigneusement le surnageant sans déranger la granule virale, qui peut apparaître sous la forme d’un film blanc pâle ou translucide au fond du tube.
    9. Laissez les tubes sécher à l’air libre pendant au moins 10 minutes et utilisez une lingette de laboratoire pour enlever autant de liquide résiduel que possible à l’intérieur du tube sans déranger le granule.
      REMARQUE : Un séchage correct du tube est essentiel pour atteindre des concentrations virales élevées, car cela réduit le volume final de récupération.
    10. Resuspendez les granulés viraux dans 20 μL de solution saline tamponnée au phosphate froid et pipetez soigneusement de haut en bas, en veillant à éviter les bulles d’air.
    11. Incubez les tubes sur de la glace pendant 2 heures avec une légère agitation pour resuspendre complètement les granulés viraux.
    12. Transférez le virus concentré dans un tube de microfuge propre et clarifiez la solution par centrifugation à 2 000 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
      REMARQUE : Cette rotation élimine les débris et particules résiduelles qui obstruent l’aiguille d’injection lors de l’opération.
    13. Aliquote le virus concentré en volumes à usage unique pour éviter les gels-dégel répétés et le stocker à -80 °C.
  4. Titrage lentivirale utilisant LSL-tdFibroblastes embryonnaires de souris (MEF)
    1. Placez 100 000 MEFs LSL-tdTomato (dérivés de Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]) dans une plaque à 6 puits un jour avant l’infection dans le DMEM, complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline-streptycine, et cultivez les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2. Placez un puits supplémentaire pour compter les cellules.
      REMARQUE : LSL-tdTomato MEFs servent de rapporteur pour Cre au sein du lentivirus. Tout système de rapporteur adapté pour le titrage viral d’autres colonnes vertébrales peut être utilisé.
    2. Le lendemain, comptez le nombre de MEFs LSL-tdTomato provenant d’un puits supplémentaire pour quantifier le nombre de cellules présentes au moment de l’infection.
    3. Préparez des dilutions en série de lentivirus concentré codant pour la Cre recombinase sur un total de 2 mL du milieu Eagle modifié de Dulbecco, complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal. En général, 0,4 μL, 0,1 μL et 0,025 μL de virus concentré fournissent une plage linéaire dynamique propre (Figure 4A–D).
    4. Ajoutez 2 mL de dilutions virales à chaque puits de MEFs LSL-tdTomato et ajoutez 2 μL de polybrene à 10 mg/mL à chacun.
    5. Infectez les MEF en les faisant tourner à 400 × g pendant 90 minutes à 37 °C.
    6. Remplacer le milieu viral par 2 mL de DMEM complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline-streptycine, et cultiver les cellules à 37 °C avec 5 % deCO2 pendant 48 à 72 heures.
    7. Quantifiez les cellules td-totomato positives par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux afin de déterminer la fraction de cellules infectées à chaque dilution.
    8. Calculez le titre fonctionnel en fonction de la fraction de cellules infectées et du nombre de cellules présentes au moment de l’infection.
      NOTE : LES VIRUS CRISPR-KO et CRISPR-A sont produits, concentrés et titrés séparément. Des titres fonctionnels déterminés à l’aide de MEF LSL-tdTomato sont utilisés pour mélanger les virus CRISPR-KO et CRISPR-A à un ratio défini avant l’injection intraductale.
  5. Évaluation de la qualité des bibliothèques de plasmides et de lentivirus
    1. Pour s’assurer que les bibliothèques d’ARNg sont clonées avec une profondeur et une couverture suffisantes et que tous les gRNA sont maintenus pendant le clonage et la production du virus, il est fortement recommandé de séquencer le pool de plasmides ainsi que les MEF transduits.
    2. Pour évaluer la couverture lentivirale, transfecter les MEFs avec un lentivirus à >1000× de couverture basée sur le titret viral calculé. Il n’est pas nécessaire d’assurer une infection unique des cellules durant cette étape.
    3. Après 48 à 72 heures, détacher les cellules à l’aide de la trypsine ou d’un grattoir cellulaire et de les granuler. Extraire l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction d’ADNg commercial.
    4. Séquence de 1 μg de plasmide et 3 μg d’ADN MEF extrait en utilisant le protocole décrit à la Section 5. Un séquençage profond de 5 millions de lectures suffit pour la plupart des bibliothèques personnalisées avec <5000 gRNA.
      REMARQUE : Une forte corrélation (R2> 0,6) entre les lectures du pool de plasmides et une représentation relativement égale des guides (>70 % des guides sur 1 décennie logarithmique) sans nombre de guides individuels dominant les bibliothèques indique une bonne qualité (Figure 4E).

3. Injection intraductale de lentiviral dans la glande mammaire de la souris

  1. Dilution par aiguille et virus
    1. Retirez les aiguilles microcapillaires en verre à l’aide d’un extracteur à micropipette pour générer des capillaires à pointe fine, adaptés à l’injection intraductale de volumes de 9 à 10 μL. Utilisez une pince fine pour casser la pointe même de l’aiguille.
      REMARQUE : L’emplacement optimal crée une taille d’aiguille suffisamment grande pour être chargée de liquide mais assez fine pour tenir facilement dans l’ouverture de la tétine.
    2. Diluez les préparations lentivirales à une concentration finale de 1 × 107 pfu/mL dans une solution stérile tamponnée phosphate, complétée par 0,05 % (p/v) de colorant Fast Green FCF.
    3. Si vous mélangez les virus CRISPR-KO et CRISPR-A pour les dépister dans le même pool complexe, ajustez les deux bibliothèques pour obtenir un titre viral égal avec du sérum stérile tamponné phosphate et mélangez-les à un ratio pour assurer une représentation égale des gRNA dans les deux bibliothèques.
  2. Préparation des souris à l’injection intraductale
    1. Anesthésiez une souris adulte (8–20 semaines) sous 4 % d’isoflurane avec 1 L/min d’oxygène et appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile sur les deux yeux pour éviter le dessèchement cornéen pendant la procédure.
      REMARQUE : L’injection intraductale est une procédure non invasive et ne nécessite pas d’analgésie. Utilisez des souris Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9 ou Rosa-LSL-tdTomato pour ces expériences.
    2. Fixez la souris en position couchée sur une bouillotte recouverte réglée sur basse pour maintenir la température corporelle et maintenez l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 2 % avec 1 L/min d’oxygène via le nez pendant toute la procédure.
    3. Retirez les poils entourant le troisième mamelon thoracique et le quatrième mamelon abdominal à l’aide d’une crème dépilatoire appliquée avec un coton tige-tige stérile dans une zone circulaire d’environ 0,5 cm de rayon pendant 10 à 15 s. Retirez immédiatement la crème avec de la gaze stérile et de l’eau stérile pour éviter l’irritation cutanée.
      REMARQUE : Les troisième et quatrième glandes mammaires sont généralement les plus faciles à injecter. Alternativement, les deuxième et cinquième glandes peuvent être préparées pour l’injection de la même manière.
    4. Désinfectez la peau entourant chaque mamelon en prévoyant séquentiellement de l’alcool isopropylique à 70 % et de l’iode à l’aide de gaze stérile.
    5. Placez la souris sous un microscope disséquant dans un cabinet de biosécurité pour permettre une visualisation claire des mamelons.
    6. À l’aide de pinces fines nettoyées à 70 % d’éthanol, retirez doucement toute peau morte recouvrant la tétine pour exposer l’ouverture canalaire.
      REMARQUE : Cette couche morte et kératinisée est légèrement attachée et peut obstruer l’entrée de l’aiguille. L’ablation ne doit pas endommager la peau viable ni les tissus sous-jacents.
  3. Injection intraductale
    1. Chargez 8 μL du virus dilué dans un microcapillaire en verre tiré.
    2. Tenez la zone du téton avec une pince fine, puis insérez doucement la pointe de l’aiguille dans l’ouverture du téton (Figure 5A). Une aiguille placée de manière appropriée pénètre dans le conduit avec une résistance minimale. Libérez lentement la suspension virale dans le canal mammaire sur une période de 5 à 10 secondes.
      REMARQUE : 8 μL d’un lentivirus 1 × 10pfu /mL fourniront environ 30 % d’infectivité des cellules épithéliales mammaires luminales et 5 % d’infectivité des cellules épithéliales mammaires de la base, avec une infection négligeable (< 0,5 %) dustroma 36. Le titre viral peut être ajusté pour atteindre une infectiosité plus élevée ou plus faible.
    3. Surveillez la propagation du colorant Fast Green pendant l’injection au microscope disséquant. Confirmez la réussite de l’administration intraductale en observant la dispersion du colorant dans tout le réseau canalal sous la peau (Figure 5B).
    4. Identifier les injections ratées en regroupant le colorant dans le coussinet graisseux mammaire adjacent au mamelon plutôt que le long de l’arbre ductal (Figure 5C).
    5. Répétez la procédure d’injection pour la troisième glande thoracique et la quatrième glande mammaire abdominale de chaque côté, en injectant un total de quatre glandes par souris.
      REMARQUE : Avec l’expérience, une livraison intraductale réussie est obtenue dans >95 % des injections. Les injections ratées confinées au coussin adipeux ne sont pas associées à des effets indésirables, et les glandes restantes peuvent encore être utilisées. Une validation supplémentaire des injections peut être réalisée par immunohistochimie et cytométrie en flux (Figure 5D,E).
    6. Arrêtez l’anesthésie et transférez la souris dans une cage de récupération propre.
    7. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement déambulante et ramenez-la dans le logement de biosécurité désigné une fois que le comportement normal est observé.
    8. Trois jours après l’injection, effectuez un changement complet de cage, en jetant tout logement et litière comme déchets viraux, puis transférez la souris dans une cage propre pouvant être remise dans un logement standard.

4. Isolation de l’ADN génomique à partir des glandes mammaires et des tumeurs

REMARQUE : Euthanasiez les souris par exposition auCO2 ou par overdose d’anesthésiants suivie d’une luxation cervicale, conformément aux directives de soins aux animaux. Prélèver les glandes mammaires ou les tumeurs mammaires aux moments désirés ou à l’extrémité humaine selon les directives réglementaires. Les cellules infectées ont été prélevées dès 48 h après l’infectionlentivirale 36,55 ou aussi tard que 5+ mois après l’injection chez des sourissauvages 36, ou >24 mois dans des fonds oncogéniques55. Les étapes suivantes doivent être effectuées dans un espace nettoyé à l’aide d’ADN Erase et avec un équipement exempt de plasmides contenant des cassettes sgRNA/dgRNA. Même de traces d’ADN plasmidique suffisent à contaminer les échantillons de tissus, et des PCR par séquençage profond et des contrôles négatifs (sans tissu) doivent être effectués pour garantir des préparations propres.

  1. Dissociation tissulaire
    1. Pour les glandes mammaires, digère chaque glande mammaire dans 2 mL de milieu complet Epicult-B (souris) complété avec 0,2 mL de collagénase/hyaluronidase douce dans un tube conique de 15 mL, puis couver toute la nuit à 37 °C.
    2. Le pellet dissociait les cellules à 450 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
    3. Transférez soigneusement la couche grasse supérieure à l’aide d’une pointe de pipette sérique bovine enrobée d’albumine dans un nouveau tube conique de 15 mL et jetez le surnageant restant.
      REMARQUE : La couche graisseuse supérieure à cette étape contient souvent des organoïdes épithéliaux résiduels qui n’ont pas été séparés et restent associés au tissu adipeux. Le traitement de cette fraction dans un tube séparé augmente considérablement la récupération des cellules épithéliales.
    4. Lavez à la fois la fraction grasse et la pellete cellulaire une fois avec 5 mL de solution séline tamponnée au phosphate, centrifugez à 450 × g pendant 5 minutes à température ambiante, puis jetez les surnatants.
    5. Combinez la fraction graisseuse lavée et la granule cellulaire de la même glande mammaire dans un tube conique unique de 15 mL contenant 5 mL de solution séline tamponnée phosphate.
    6. Faites des granules sur le matériau combiné à 450 × g pendant 5 minutes et jetez le surnageant.
    7. Pour les tumeurs mammaires, réduisez le tissu en petits morceaux à l’aide de ciseaux stériles ou d’un scalpel et transférez directement dans un tube microfuge de 2 mL.
  2. Isolement de l’ADN génomique
    REMARQUE : L’extraction d’ADN génomique peut être réalisée à l’aide du kit Qiagen DNEasy Blood and Tissue en suivant les instructions du fabricant ou en suivant le protocole phénol-chloroforme suivant.
    1. Préparez le tampon de lyse de l’ADN en combinant 5 mL de 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 mL d’EDTA (pH 8,0), 25 mL de 5 M NaCl et 50 mL de 10 % de SDS, puis portez le volume final à 500 mL avec de l’eau distillée stérile.
    2. Ajoutez 1 mL de tampon de lyse ADN et 10 μL de protéinase K (20 mg/mL) à chaque échantillon et mélangez soigneusement par inversion.
    3. Incubez les échantillons à 56 °C toute la nuit pour permettre une lyse complète.
    4. La centrifugeuse lyse à 16 000 × g pendant 5 minutes à température ambiante pour pelleter les débris insolubles.
    5. Transférez le surnageant clarifié dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 mL.
      ATTENTION : Le phénol :chloroforme :isoamyle est toxique et corrosif. Effectuez toutes les étapes impliquant des solvants organiques dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
    6. Ajoutez un volume égal de phénol :chloroforme :isoamyle d’alcool et mélangez vigoureusement en vortexant pendant environ 15 secondes jusqu’à ce qu’un mélange homogène se forme.
    7. Centrifugez à 16 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour séparer les phases organique et inorganique.
    8. Transférez soigneusement la phase aqueuse supérieure vers un nouveau tube sans perturber l’interphase.
      REMARQUE : Évitez d’aspirer le matériel provenant de l’interphase blanche afin de minimiser la contamination par les protéines et l’ARN.
    9. Ajoutez 0,7 volume d’isopropanol à la phase aqueuse récupérée et mélangez vigoureusement en vortexant pendant environ 15 secondes.
    10. Centrifugez à 16 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C.
    11. Jetez soigneusement le surnageant et rincez la pellete d’ADN avec 500 μL d’éthanol à 70 %.
    12. Centrifugez à 16 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C et retirez complètement l’éthanol.
    13. Faites sécher la granule d’ADN à température ambiante à l’air pendant 10 minutes.
    14. Resuspendez la pellete d’ADN dans 50 μL d’eau distillée stérile.
    15. Incuber des échantillons à 37 °C pendant 1 heure ou à 4 °C pendant la nuit pour faciliter la resuspension complète de l’ADN génomique.
    16. Mesurez la concentration et la pureté de l’ADN par nanodrop ou quantification fluorométrique.

5. Séquençage de nouvelle génération des bibliothèques CRISPR


REMARQUE : Générez un échantillon de référence pour permettre le calcul des changements de repliement des gRNA au fil du temps. Les MEFs transduits (Section 2) ou les glandes mammaires (Section 4) prélevés 3 jours après l’infection, ainsi que le maxiprep plasmidique original, peuvent être utilisés pour déterminer la représentation des guides dans la bibliothèque de départ et le stock viral.

  1. Amplification PCR de cassettes d’ARNg à partir d’ADN génomique
    1. Utilisez des paires d’amorces listées dans le tableau 2 pour indexer les échantillons de manière unique, permettant le multiplexage et le démultiplexage de jusqu’à 306 échantillons après séquençage.
    2. Préparez les réactions PCR en utilisant 1 μg d’ADN génomique comme gabarit dans un volume total de réaction de 50 μL contenant 25 μL de 2x Master Mix Q5, 2,5 μL d’amorce avant 10 μM et 2,5 μL d’amorce inverse 10 μM.
    3. Inclure une réaction de contrôle sans gabarit en parallèle pour surveiller la contamination.
    4. Effectuer une amplification PCR en utilisant les conditions de cycle suivantes, en ajustant la température de recuit en fonction de la température de fusion de la base spécifique à la bibliothèque :
      1 cycle à 98 °C pendant 30 s
      5 cycles à 98 °C pendant 10 s, 68 °C (-1 °C/cycle) pendant 10 s, et 72 °C pendant 15 s
      20 cycles à 98 °C pendant 10 s, 63 °C pendant 30 s, et 72 °C pendant 15 s
      1 cycle à 72 °C pendant 2 minutes
    5. Résoudre les produits PCR sur un gel d’agarose à 2,5 % pour vérifier la taille correcte de l’amplicon.
    6. Confirmez la présence de bandes à environ 306 pb pour les bibliothèques sgRNA basées sur pLKO et 430 pb pour les bibliothèques dgRNA basées sur pXPR502 (Figure 6).
      REMARQUE : Un contrôle clair sans gabarit garantit la pureté des réactifs et confirme que le test est exempt de contamination croisée.
    7. Purifiez les produits PCR en utilisant une méthode adaptée de purification de l’ADN et quantifiez la concentration d’ADN par la quantification fluorométrique.
  2. Séquençage de nouvelle génération
    1. Déterminer la profondeur de séquençage requise en fonction de la complexité attendue de la bibliothèque et de la clonalité de l’échantillon.
      REMARQUE : Pour les tumeurs suspectées d’être clonales, environ 1 million de lectures par échantillon suffisent à quantifier avec précision la représentation des guides. Pour calculer la profondeur de séquençage à partir des glandes mammaires, multipliez le nombre de guides dans la bibliothèque par la couverture par 1 000 fois, puis multipliez par 6 pg d’ADN/cellule génomique pour calculer la masse totale d’ADN génomique par échantillon qui doit être amplifié par PCR. Le nombre total de lectures nécessaires pour le séquençage est égal au nombre de guides dans la bibliothèque multiplié par 1 000.
    2. Poolez des bibliothèques purifiées à partir de différents échantillons à des concentrations équimolaires.
    3. Bibliothèques groupées de séquences utilisant une plateforme de séquençage Illumina à lecture courte.
  3. Analyse des données
    1. Démultiplexer des fichiers FASTQ de séquençage brut en utilisant des indices spécifiques à chaque échantillon.
    2. Trim lit la séquence du protospaceur gRNA à l’aide de Trimmomatic69. Pour les échantillons CRISPR-A, les lectures de trim sont à 14 pb, et pour CRISPR-KO, les lectures de trim sont à 20 pb à partir de l’extrémité de l’amorçage avant.
    3. Alignez les lectures trimmed vers la bibliothèque de référence gRNA correspondante en utilisant Bowtie70. Utilisez les paramètres d’alignement -v 2 et -m 1 pour CRISPR-KO et -v 2 et -m 2 pour CRISPR-A et les pools mixtes.
      REMARQUE : En général, plus de 90 % des lectures sont alignées avec succès. Un faible alignement résulte généralement d’erreurs de découpage, d’une mise en forme incorrecte des fichiers d’entrée ou d’une contamination d’échantillon lors de la PCR.
    4. Quantifiez les lectures alignées pour chaque gRNA à l’aide de la fonction de comptage dansMAGeCK 72 afin de générer les tables finales de comptage des gRNA pour l’analyse en aval.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous proposons un protocole pour le dépistage CRISPR in vivo regroupé dans la glande mammaire de la souris. Ce pipeline peut être utilisé de bout en bout pour concevoir et amplifier des bibliothèques d’ARNg communéfiées à partir de réseaux d’oligonucléotidiques, cloner les bibliothèques d’ARNg en colonnes vertébrales lentivirales, produire un lentivirus à haut titre, effectuer la livraison intraductale de bibliothèques lentivirales regroupées dans la glande mammaire adulte,...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un point clé pour le dépistage CRISPR in vivo regroupé est d’obtenir une couverture suffisante de la bibliothèque tout en maintenant une transduction unicellulaire clairsemée afin de préserver la résolutionclonale 2. Dans la glande mammaire de la souris, le compartiment épithélial se compose conservativement d’environ 3,5 × 105 cellules parglande 36. Avec un taux moyen de transduction lentivirale de 15 %, ce qui minimise...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. est consultant et fondateur de ViVerita Therapeutics, et son laboratoire a parrainé des accords de recherche et de services avec ViVerita Therapeutics.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions tous les membres de nos laboratoires pour leurs commentaires utiles et leurs discussions liés à ce travail. Nous remercions également et saluons le Centre de phénogénomique pour toute l’aide et l’expertise apportées au travail sur la souris à l’Institut de recherche Lunenfeld-Tanenbaum (LTRI), Toronto, Canada. Cette étude a été soutenue par une subvention de projet des Instituts canadiens de recherche en santé (PJT462506) et une subvention du programme Terry Fox de l’Institut de recherche pour le programme à D.S. (TFRI Project #1107) à D.S. et par la Nicol Family Foundation. L’E.R.L. a été soutenue par le Prix de formation à la recherche de la Société canadienne du cancer et le Fonds commémoratif Frank Fletcher. K.N.A. a été soutenue par une bourse postdoctorale H.L. Holmes et des subventions 1318698 et 26089 de la Cancer Research Society. J.N. a bénéficié d’une bourse d’études supérieures – maîtrise des Instituts canadiens de recherche en santé et d’une bourse doctorale des Instituts canadiens de recherche en santé (#193389). Y.L a été soutenu par la bourse d’excellence en recherche, diversité et indépendance des Instituts canadiens de recherche en santé (#ED6-190718).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0.45 micron filterSigmaS2HVU02RE
12k or 92k oligo chipCustomarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture platesCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Alkaline phosphataseNEBM0290L
AmplicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart bufferNEBB6004S
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)Illumina
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kitQiagen69506
Dulbecco’s modified Eagle mediumWisent319-015-CL
Endura electrocompetent cellsLucigen60242-1
EpiCult-B Mouse Medium KitStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
Fetal Bovine SerumWisent090-150
Gel DNA-cleanup kitZymo ResearchD4008
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation CuvettesBioRad1652089
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
High-Speed CentrifugeBeckman CoulterMLS-50
Kim-wipeKimberly-Clark34155
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
Micropipette pullerSutter InstrumentP97
Mini-prep plasmid KitFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)NEBR0580L
Oligo Clean and ConcentratorZymo ResearchD4061
Oligo cleanup kitZymo researchD4060
PAGE purified illumina sequencing primerIDT DNA
PCR MicropipettesDrummond5-000-1001-X10
PEI (polyethyleneimine)Sigma408727-100ML
Penicillin and StreptinomycinWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poly-L-LysineSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 Polymerase 2x Master mixNEBM0494L
Qubit Fluorometric QuantificationInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato miceJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA ligaseNEBM0202L
Ultra-centrifuge tubesBeckman Coulter344058
Vacuum Filter UnitsFisher ScientificSCHVU02RE

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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