Ce protocole décrit une méthode d’enregistrement de données vidéo et audio synchronisées lors d’interactions sociales multi-souris. La méthode utilise un réseau de microphones et la localisation de la source sonore pour attribuer des vocalisations ultrasoniques (USV) à des souris individuelles, permettant une analyse quantitative du comportement vocal chez les animaux et les contextes sociaux.
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Article de méthode
Détection et attribution de vocalisations ultrasoniques à des souris individuelles lors d’interactions sociales
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les souris (Mus musculus) communiquent par vocalisations ultrasoniques (USV) lors des interactions sociales. Cependant, comme les VSV chez la souris ne sont pas associés à des indicateurs visuels clairs et se produisent à des fréquences en dehors de la plage auditive humaine, il reste difficile d’identifier des souris vocalisant individuellement au sein d’un groupe. Ce protocole décrit une méthode d’enregistrement de données vidéo synchronisées et audio ultrasonique lors d’interactions sociales entre plusieurs animaux, permettant la capture simultanée du comportement et de l’activité vocale. Un pipeline computationnel est défini qui intègre le suivi multi-animaux, la détection de vocalisation, la localisation des sources sonores et l’attribution de vocalisations à des animaux individuels. Les procédures de validation utilisées pour évaluer la précision du suivi, l’extraction vocalisée, la précision de localisation et la confiance de l’affectation à chaque étape du pipeline sont décrites plus en détail. L’application de ce protocole à un ensemble de données de démonstration de quatre animaux permet de suivre la vocalisation résolue individuellement, d’estimations spatialement précises des sources sonores, et de mesures quantitatives de la sortie vocale et des caractéristiques acoustiques. Ensemble, ces approches fournissent un cadre solide pour relier la communication vocale au comportement individuel et permettent des analyses en aval des différences entre les sexes, de la variabilité individuelle et de la communication sociale chez des souris en interaction libre.
Introduction
La communication sociale à travers le règne animal est un élément essentiel des dynamiques comportementales, favorisant des processus tels que la survie et la reproduction 1,2. Chez les mammifères, les souris communiquent acoustiquement via des USV, qui couvrent des fréquences allant de 35 à 110kHz 3. Les USV présentent des caractéristiques complexes, transmettant des informations selon le contextecomportemental 4. Les souris femelles présentent une préférence pour les USVsmâles 5,6, et les souris mâles et femelles interagissent vocalement lors des comportements de paradenuptiale 7, indiquant que les USV fonctionnent comme des signaux sociaux clés. Parce que des caractéristiques spécifiques du VSN sont liées à des états comportementaux distinctsde la souris 8, attribuer précisément des vocalisations aux individus est essentiel pour comprendre les interactions sociales.
Malgré de nombreux efforts pour élucider les fonctions des USV et leur relation avec le comportementsocial 8, un défi constant dans ce domaine a été d’attribuer des USV à des souris individuelles lors des interactions de groupe. Des difficultés surviennent à la fois en raison de l’absence de mouvements visibles de la bouche lors de la production4 de l’USV et de la plage de fréquences des USV inaudible pour l’oreillehumaine 3. En conséquence, les études antérieures sur la relation entre les VSU et le comportement social se sont limitées à des tests simplifiés ou à des environnements contraints qui limitent la gamme des comportements observables dugroupe, ne fournissant qu’un aperçu partiel de la manière dont le comportement vocal se déroule chez les animaux interagissant librement.
Pour affiner la compréhension de la relation entre la communication auditive et le comportement social, il est nécessaire de capturer toute la gamme des comportements de la souris et d’attribuer des vocalisations aux individus d’un groupe. Résoudre l’identité des vocaliseurs est essentiel pour déterminer les étendues vocales dépendantes du sexe et du contexte chezles individus 8, tester les hypothèses causales sur la manière dont des caractéristiques vocales spécifiques influencent le comportement conspécifique 10,11,12, et, le cas échéant, corréler la sortie vocale avec des signaux cérébraux mesurés simultanément (par exemple, l’électrophysiologie)13. Historiquement, on pensait que les souris mâles étaient les seules vocaliseuses ; cependant, la localisation de la source sonore a révélé que les souris femelles produisent également des USV dans des groupes7 ou lorsqu’elles sont associées à unmâle 14. Sans déterminer quel animal a émis un USV, le lien entre les caractéristiques vocales et le comportement individuel et les résultats sociaux dans les groupes interagissant librement reste limité. Par conséquent, il est essentiel d’utiliser un système de localisation permettant d’assigner des vocalisations à des animaux individuels tout en maintenant la dynamique d’interaction naturelle.
Le système de localisation des sources sonores par réseau de microphones décrit ici, précédemment publiéle 7,15, estime l’origine spatiale des USV dans une arène et suit la position de tous les animaux présents au moment de la vocalisation, permettant d’attribuer les vocalisations à l’émetteur. Les estimations de sources sonores et les positions des animaux suivies sont ensuite intégrées à l’aide d’une métrique basée sur la probabilité pour soutenir l’attribution des USV à des animaux individuels. L’affectation vocalisée convertit des enregistrements vocaux de groupe auparavant ambigus en données vocales animalesétiquetées 7,15, permettant des analyses quantitatives qui relient le type et le moment de vocalisation au comportement et à l’action conspécifique qui en découlent. L’objectif du présent travail est de fournir un protocole détaillé pour la mise en œuvre de cette méthode, qui a déjà été quantifiée etvalidée 15. Le protocole suivant décrit la configuration, l’étalonnage et la mise en œuvre de ce système, incluant la géométrie des réseaux de microphones, la synchronisation audio-vidéo, la détection automatisée du son et l’estimation probabiliste des sources, le suivi de la position multi-animaux, ainsi que la procédure d’attribution des USV à l’animalémetteur 7,15.
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Protocole
Tous les protocoles impliquant les animaux ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Delaware (numéro de protocole : 1275) et menés conformément aux directives des National Institutes of Health. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Construction du rig de localisation de la source sonore
- Préparez la chambre d’enregistrement.
- Assemblez un cadre cuboïde (76,2 cm × 76,2 cm × 61 cm ; largeur × longueur × hauteur), qui sert d’arène d’enregistrement, et placez-le dans un boîtier atténuant le son.
- Utilisez un treillis en nylon pour créer les murs et tapissez l’extérieur de l’enceinte avec de la mousse acoustique pour réduire les réflexions sonores.
- Placez un thermomètre à l’extérieur, mais près de la chambre d’enregistrement, de l’enceinte pour surveiller la température ambiante pendant les enregistrements.
- Effectuez tous les enregistrements dans des conditions sombres.
REMARQUE : Maintenir des conditions environnementales stables lors des sessions d’enregistrement et enregistrer les paramètres environnementaux.
- Configurez les systèmes d’enregistrement vidéo et audio.
- Installez un éclairage infrarouge au-dessus de l’arène pour permettre l’enregistrement vidéo dans l’obscurité.
- Placez une caméra vidéo au-dessus de l’arène et configurez-la pour enregistrer en continu à 30 Hz.
- Configurez le système d’acquisition audio pour enregistrer des signaux ultrasoniques provenant d’un réseau de microphones à huit canaux à une fréquence d’échantillonnage de 250 kHz.
REMARQUE : Huit microphones ont été utilisés dans ce système, mais le nombre de microphones peut être ajusté selon les besoins expérimentaux. - Synchronisez les enregistrements vidéo et audio à l’aide d’un déclencheur externe partagé pour garantir l’alignement temporel.
- Vérifiez que les données vidéo et audio sont enregistrées simultanément et stockées pour chaque session.
REMARQUE : Le matériel et les logiciels d’acquisition sont listés respectivement dans le Tableau des Matériaux et le Tableau 1.
- Disposez les micros et l’arène.
- Placez uniformément les micros le long des murs de l’arène (deux par mur).
- Placez les centres du micro à 38,1 cm d’intervalle, 19,05 cm de chaque coin, et 10,8 cm au-dessus du sol de l’arène.
- Marquez visuellement l’emplacement des microphones pour faciliter l’étalonnage et la validation ultérieures.
REMARQUE : Des LED peuvent être utilisées pour marquer la position des microphones.
2. Préparatifs pour l’enregistrement du comportement social
- Installez les animaux expérimentaux.
- Sélectionnez les souris à enregistrer. Ici, des groupes de 2 souris mâles et 2 femelles C57BL/6J âgés de 8 à 12 semaines au moment de l’enregistrement ont été utilisés.
REMARQUE : La souche, le ratio hommes, la tranche d’âge des souris et le nombre de jours d’enregistrement dans le paradigme expérimental actuel sont ajustables selon les objectifs expérimentaux. Pour la démonstration de cette méthode, un sous-ensemble de souris expérimentales a été réutilisé sur deux jours d’enregistrement. Les souris C57BL/6J âgées de plus de 12 semaines peuvent présenter une sensibilité réduite aux sons de hautefréquence 16.
- Sélectionnez les souris à enregistrer. Ici, des groupes de 2 souris mâles et 2 femelles C57BL/6J âgés de 8 à 12 semaines au moment de l’enregistrement ont été utilisés.
- Héberger les animaux.
- Hébergez chaque souris individuellement pendant 14 jours avant l’enregistrement.
REMARQUE : Le logement individuel minimise l’influence de l’expérience sociale antérieure sur les interactions de groupe. - Fournir à chaque cage de la litière, de l’enrichissement et un accès à la nourriture et à l’eau à l’improviste .
- Hébergez chaque souris individuellement pendant 14 jours avant l’enregistrement.
- Marquez les animaux pour une identification visuelle.
- Deux jours avant l’enregistrement, anesthésiez chaque souris à l’aide d’isoflurane à 2,5 % dans l’oxygène à un débit de 1 L/min via un vaporisateur de précision dans une chambre hermétique. Une fois que chaque souris est anesthésée, transférez-la hors de la chambre, allongée à plat avec le dos accessible, recevant l’anesthésie d’un cône de nez pendant toute la durée de la procédure de marquage.
REMARQUE : Le protocole d’anesthésie décrit dans le paradigme expérimental actuel est approuvé dans notre protocole animal et a été appliqué à chaque souris en série, mais il est ajustable selon les animaux ou les objectifs expérimentaux. - Pendant que chaque souris est sous anesthésie, appliquez un motif unique sur son dos avec une teinture non toxique pour les cheveux afin de permettre une identification visuelle lors du suivi.
- Surveillez chaque animal en continu pendant que le colorant prend prise, en maintenant l’anesthésie pendant environ 15 minutes, et notez la durée de l’anesthésie.
- Rincez et placez chaque souris dans une cage de récupération chauffée jusqu’à ce qu’elle soit complètement déambulante.
- Remet chaque souris dans une cage propre individuelle avec litière, enrichissement et accès à nourriture et eau.
REMARQUE : Appliquez des marques aux souris femelles avant les mâles afin de minimiser le transfert des signaux olfactifs masculins qui pourraient influencer leur comportement ultérieur.
- Deux jours avant l’enregistrement, anesthésiez chaque souris à l’aide d’isoflurane à 2,5 % dans l’oxygène à un débit de 1 L/min via un vaporisateur de précision dans une chambre hermétique. Une fois que chaque souris est anesthésée, transférez-la hors de la chambre, allongée à plat avec le dos accessible, recevant l’anesthésie d’un cône de nez pendant toute la durée de la procédure de marquage.
- Pratiquez une exposition à des personnes de sexe opposé.
- Un jour avant l’enregistrement, préparez des cages propres sans litière.
- Pour chaque souris expérimentale, placez l’animal dans une cage suivie d’une nouvelle souris du sexe opposé.
- Laissez les animaux interagir pendant 10 minutes.
- Observez les interactions et enregistrez manuellement les événements comportementaux.
- Après exposition, ramener les animaux expérimentaux dans un logement individuel après exposition.
REMARQUE : L’exposition aux sexes opposés est spécifique au paradigme expérimental actuel, car elle augmente la probabilité de comportements vocaux lors des enregistrements de groupe suivants17 ; cependant, ce n’est pas un élément obligatoire des méthodes décrites. Séparer les animaux si un comportement copulatoire est observé.
- Déterminez l’état œstral des souris femelles.
- Environ 2 heures avant l’enregistrement, évaluez l’état œstral de chaque souris femelle (si elle utilise des sujets femelles).
- Effectuer un lavage vaginal avec 30 μL de solution saline tamponnée phosphate.
- Transférez l’échantillon de lavage sur une lame de microscope propre, et étalez-les uniformément.
- Laissez les lames sécher complètement.
- Appliquez une teinture violette cristalline sur chaque lame, puis utilisez une pipette pour rincer doucement à l’eau.
- Examinez les lames au microscope optique.
- Classifier l’état œstral en fonction des proportions relatives des cellules épithéliales nucléées, des cellules épithéliales cornifiées et desleucocytes 18.
- Notez l’état œstral de chaque femelle.
REMARQUE : Comme les USV peuvent impacter la réceptivité féminine pendantl’œstrus 19,20, déterminer l’état œstral est spécifique au paradigme expérimental actuel ; cependant, ce n’est pas un élément obligatoire des méthodes décrites.
3. Enregistrements d’interactions sociales
- Préparez l’arène d’enregistrement.
- Ajoutez une literie blanche à base de papier sur le sol de l’arène à une profondeur uniforme d’environ 1,25 cm.
- Assurez-vous que la literie couvre tous les coins de façon uniforme.
- Vérifiez que tous les microphones sont alignés, dégagés et orientés vers l’arène.
- Avant les enregistrements expérimentaux, placez une règle et un objet à fort contraste au centre de l’arène pour vérifier la mise au point de la caméra et établir l’échelle spatiale.
- Retirez les objets de calibration avant le début des enregistrements comportementaux.
REMARQUE : La literie à base de papier blanc offre un contraste pour les animaux à fourrure plus foncée, facilitant le suivi. Si des animaux à fourrure plus claire sont utilisés, une litière noire à base de papier aiderait à le suivi. Si la durée des enregistrements est prolongée, ajoutez de la nourriture et de l’eau dans l’arène. L’ajout de marqueurs directionnels Nord/Sud et Est/Ouest à la règle facilite l’identification des huit microphones.
- Effectuer des enregistrements pré-comportement.
- Juste avant les enregistrements comportementaux, enregistrez 15 secondes de bruit de fond avec des lumières infrarouges allumées.
- Enregistrement de 15 secondes d’un test de localisation du microphone avec les lumières infrarouges éteintes et les voyants indicateurs du micro allumés.
- Sauvegardez tous les enregistrements pré-comportements pour une vérification ultérieure des performances du système.
REMARQUE : Ces enregistrements servent à vérifier la fonction du microphone et les niveaux de bruit de base. Les scripts utilisés pour l’enregistrement sont disponibles dans le dépôt de code associé.
- Enregistrez le comportement social du groupe.
- Préparez tous les paramètres d’enregistrement à l’avance pour minimiser l’interaction des animaux avant la collecte des données.
- Placez les souris femelles dans l’arène.
- Placez les souris mâles dans l’arène.
REMARQUE : Si vous enregistrez plusieurs animaux du même sexe, placez les deux animaux simultanément. - Fermez l’enceinte et commencez à enregistrer.
- Enregistrez le comportement social du groupe en continu pendant 10 minutes.
REMARQUE : La durée d’enregistrement est ajustable. - Vérifiez que les fichiers vidéo et audio sont lisibles et exempts de corruption avant le prétraitement.
- À la fin de l’enregistrement, retirez tous les animaux sauf un.
- Enregistrez des animaux individuels.
- Enregistrez la souris restante seule dans l’arène pendant 10 minutes.
- Répétez les enregistrements individuels pour chacune des souris restantes.
- Peser chaque souris immédiatement après les enregistrements individuels.
REMARQUE : Les enregistrements individuels sont utilisés pour entraîner et valider le suivi multi-animaux. Documentez la température à l’intérieur de l’installation avant chaque session d’enregistrement, car la température influence la propagation du son. Répétez la session d’enregistrement si les fichiers vidéo ou audio sont corrompus ou incomplets.
4. Prétraitement vidéo
- Préparez les fichiers vidéo.
- Vérifiez que tous les enregistrements vidéo sont stockés dans un seul dossier associé à l’expérience.
- Ajustez l’intensité vidéo pour le suivi.
- Si nécessaire, appliquer un réglage uniforme de la luminosité à toutes les images vidéo en ajoutant une valeur constante (brightness_adjustment x 255) à chaque pixel, où brightness_adjustment est un scalaire généralement allant de 0,1 à 0,6 selon les conditions d’éclairage.
- Si nécessaire, appliquez un ajustement global du contraste en utilisant le remappage d’intensité (par exemple, la fonction d’ajustement de MATLAB) avec une plage d’entrée définie (par exemple, [0,2, 0,8]), qui mappe les intensités des pixels à 20 % du maximum vers le noir et 80 % du maximum vers le blanc, et des valeurs intermédiaires à l’échelle linéaire. Cette étape vise à augmenter la séparation entre les marques d’identification claires et l’arrière-plan.
- Coupez les intensités des pixels dans la plage valide pour la profondeur de bits vidéo (c’est-à-dire de 0 à 255 pour la vidéo 8 bits).
REMARQUE : Des paramètres de prétraitement identiques doivent être appliqués à toutes les trames au sein d’un enregistrement et entre les enregistrements afin d’assurer la cohérence. Ces réglages sont optionnels et dépendent des conditions d’enregistrement. Pour les données représentatives présentées ici, aucun ajustement de luminosité ou de contraste n’a été appliqué. Lorsque des ajustements sont nécessaires, les utilisateurs doivent prévisualiser la première image traitée afin de confirmer un contraste adéquat entre les animaux et l’arène avant de traiter l’ensemble de la vidéo.
- Exportez les vidéos prétraitées.
- Enregistrez les fichiers vidéo prétraités en utilisant la même fréquence d’images et le même alignement temporel que les enregistrements originaux.
- Conservez les fichiers vidéo originaux pour référence et vérification.
REMARQUE : Les scripts utilisés pour le prétraitement vidéo et les valeurs spécifiques des paramètres appliqués sont disponibles dans le dépôt de code associé.
5. Pistage multi-animaux
- Préparez le logiciel de suivi et les données.
- Installez un logiciel de suivi multi-animaux et toutes les dépendances nécessaires. Cette étude a utilisé MOuse TRacker (MoTR ; Tableau 1) car le format de sortie est compatible avec Muse (Tableau 1), un autre logiciel de notre pipeline utilisé pour les calculs de localisation de la sourcesonore 21.
REMARQUE : D’autres logiciels automatisés de suivi, tels que Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP)22 ouDeepLabCut 23, pourraient être utilisés pour suivre les animaux, à condition que la position de l’animal, la direction de la direction et la position du nez soient générées. - Organisez les fichiers vidéo prétraités de manière à ce que les enregistrements d’un seul animal et de ceux de plusieurs animaux soient clairement séparés.
- Vérifiez que tous les fichiers vidéo ont des fréquences d’images et des résolutions spatiales cohérentes.
REMARQUE : Les instructions d’installation du logiciel et les exigences de dépendance sont fournies dans le dépôt de code associé.
- Installez un logiciel de suivi multi-animaux et toutes les dépendances nécessaires. Cette étude a utilisé MOuse TRacker (MoTR ; Tableau 1) car le format de sortie est compatible avec Muse (Tableau 1), un autre logiciel de notre pipeline utilisé pour les calculs de localisation de la sourcesonore 21.
- Entraînez les modèles à un seul animal.
- Sélectionnez des enregistrements sur un seul animal correspondant à chaque sujet expérimental.
- Entraînez un classificateur d’identité séparé pour chaque animal en utilisant des caractéristiques extraites de l’enregistrement d’un seul animal de cet animal. Lors des enregistrements de groupe, ces sorties par groupe de classificateurs sont combinées avec des informations de trajectoire entre les trames pour maintenir l’identité animale.
- Vérifiez que la formation s’est terminée avec succès avant de poursuivre.
REMARQUE : Les enregistrements sur un seul animal sont utilisés pour initialiser le suivi spécifique à l’identité dans les sessions multi-animaux.
- Enregistrez des enregistrements multi-animaux.
- Appliquez le modèle de suivi entraîné aux enregistrements d’interactions sociales multi-animaux.
- Générez des estimations image par image de la position, de l’orientation et de la forme corporelle des animaux pour chaque sujet.
- Gardez les sorties de suivi pour les analyses en aval.
6. Segmentation acoustique
- Préparez les données audio.
- Vérifiez que tous les enregistrements audio provenant des canaux micro individuels sont présents et accessibles.
- Détectez les vocalisations.
- Exécutez le logiciel de segmentation acoustique, Ax (Tableau 1), sur chaque enregistrement pour détecter les USV.
- Configurez les paramètres temps-fréquence définis dans un fichier d’entrée considéré par Ax. La fréquence d’échantillonnage du microphone était réglée à 250 kHz.
REMARQUE : Trois tailles de fenêtre pour la transformée de Fourier rapide non uniforme ont été envisagées, incluant 64, 128 et 256 échantillons. Un produit temporel-bande passante multi-taper de 3 avec 5 coniques a été appliqué, avec un seuil de signification de 0,05. Une durée minimale de 0 échantillons a été utilisée, avec une coupure basse fréquence de 30 kHz et une coupure haute fréquence de 110 kHz. La taille de la convolution était réglée pour couvrir 1001 Hz par 0,001 s. Un drapeau a été inclus pour fusionner les signaux harmoniquement apparentés. Pour des détails précis, voir Neunuebel et al.7. - Extraire les USV candidats en fonction de ces caractéristiques temps-fréquence.
- Enregistrez les sorties segmentées sous forme de tableau pour chaque enregistrement.
REMARQUE : Les instructions d’installation logicielle, les scripts et les paramètres de paramètres sont fournis dans le dépôt de codeassocié 7.
- Compile les sorties de segmentation.
- Générez une liste consolidée des événements de vocalisation détectés contenant les temps d’apparition, les temps de décalage et les limites de fréquence.
- Sauvegardez les fichiers de vocalisation consolidés pour les analyses de localisation en aval.
7. Localisation de la source sonore
- Préparez les entrées pour la localisation.
- Confirmez que les sorties de segmentation acoustique et les résultats de suivi multi-animaux sont disponibles pour chaque enregistrement.
- Organiser les entrées de localisation afin que les données audio, les données de suivi et les informations sur la géométrie de l’arène soient accessibles au logiciel de localisation.
REMARQUE : Les scripts utilisés pour organiser les fichiers d’entrée, définir les structures de répertoires requises et recueillir les informations géométriques de l’arène sont fournis dans le dépôt de code associé.
- Estimez l’emplacement des sources sonores.
- Appliquer l’algorithme de localisation de la source sonore, MUSE (Tableau 1), à chaque vocalisationdétectée 7.
- À l’aide d’enregistrements de micros, estimez l’origine spatiale de chaque vocalisation dans l’arène.
- Pour chaque vocalisation, estimez la localisation de la source sonore en utilisant le rééchantillonnage par couteau en répétant la procédure de localisation huit fois, en omettant à chaque fois un microphone afin que chaque estimation soit basée sur les sept microphones restants. Cela donne huit estimations par vocalisation.
REMARQUE : Les différences de temps d’arrivée entre les microphones sont cruciales pour estimer la localisation de la source sonore. Le rééchantillonnage par Jackknife est utilisé pour évaluer la fiabilité de la localisation et réduire la sensibilité aux canaux microfoniques individuels. Les scripts utilisés pour estimer la localisation de la source sonore sont fournis dans le dépôt de codeassocié 7.
- Calculez les distributions de probabilité de localisation de la source sonore.
- Pour chaque vocalisation, calculez une matrice decovariance 24, et utilisez cette matrice ainsi que les estimations moyennes des points jackknife pour calculer la densité de probabilité sur le sol de l’arène.
- Intégrez la localisation avec les positions des animaux.
- Extraire les positions de la tête ou du nez de tous les animaux au moment de chaque vocalisation.
- Pour chaque vocalisation, évaluez la densité de probabilité de localisation à l’emplacement du nez de chaque animal.
- Pour chaque vocalisation, calculez une métrique de confiance d’assignation pour chaque animal basée sur les valeurs de probabilité. La métrique de confiance de l’affectation est calculée pour chaque animal comme la valeur de densité au nez de cet animal divisée par la somme des valeurs de densité de tous les animaux. Nous appelons cette métrique l’indice de probabilité de la souris (MPI)15.
- Attribuez des vocalisations.
- Si la métrique de confiance d’affectation pour une seule souris dépasse 0,95, le signal est attribué à cettesouris 7,15.
- Étiquetez les vocalisations qui ne répondent pas aux critères d’attribution comme non assignées.
- Sauvegardez les sorties de localisation et d’attribution pour la validation et l’analyse en aval.
REMARQUE : Les seuils d’attribution, les critères de confiance et le code sont fournis dans les scripts d’analyse associés.
8. Validation des résultats
- Validez le suivi multi-animaux.
- Chargez les sorties de suivi définies pour chaque enregistrement.
- Superposez les positions des animaux et la forme du corps sur les images vidéo correspondantes.
- Inspectez visuellement les résultats de suivi pour confirmer la position exacte de la souris et l’attribution cohérente de l’identité entre les trames.
REMARQUE : Les résultats de suivi incluent des ellipses codées par couleur indiquant la direction de la tête superposées sur chaque souris dans chaque image vidéo. La taille de l’ellipse et l’orientation du corps doivent correspondre respectivement à la taille et à l’orientation de la souris dans chaque image. La couleur de l’ellipse doit être cohérente pour chaque souris tout au long de l’enregistrement. - Identifier et corriger les erreurs de suivi.
Sauvegardez les sorties de suivi corrigées pour les analyses en aval.
REMARQUE : Des erreurs de suivi fréquentes surviennent lors d’interactions sociales rapprochées ou près des limites de l’arène. Corrigez tous les cas de retournements tête-queue, d’interrupteurs d’identité, de sauts et de dérapages sur l’ellipsa.
REMARQUE : Des programmes pour visualiser les sorties de suivi et corriger les erreurs sont fournis dans le dépôt de code.
- Validez l’extraction vocale.
- Chargez les sorties de segmentation acoustique pour chaque enregistrement.
- Générez des spectrogrammes à partir de données audio brutes pour des fenêtres temporelles représentatives.
- Superpose les événements de vocalisation détectés, y compris les plages de temps et de fréquences individuelles de vocalisation, sur des spectrogrammes.
- Confirmez visuellement la correspondance entre les événements détectés et les vocalisations observées dans les spectrogrammes.
- Si des erreurs systématiques sont observées, ajustez les paramètres de segmentation avant de relancer les étapes d’extraction et de localisation, ou ajustez manuellement tout cas d’erreur de segmentation (c’est-à-dire une erreur d’identification du temps de vocalisation ou de la plage de fréquences).
- Validez l’attribution de vocalisation.
- Chargez la localisation et les sorties d’attribution des sources sonores.
- Pour chaque vocalisation, visualisez les estimations de localisation, les distributions de probabilité spatiales et les positions des animaux superposées sur les images vidéo.
- Confirmez que les densités de probabilité de localisation sont centrées près de la tête de l’animal assigné et sont clairement séparées des autres animaux.
- Vérifiez que les vocalisations qui échouent aux critères de devoir sont indiquées comme non assignées.
REMARQUE : Les vérifications des sorties d’assignation incluent la vérification que toutes les sorties attendues ont été générées et que la carte de probabilité pour chaque vocalisation est située dans les limites de l’arène et entoure la souris assignée à la vocalisation. - Sauvegardez les résultats validés de l’affectation pour les analyses en aval.
REMARQUE : Les seuils de confiance de l’affectation et les critères de validation sont définis dans les scripts d’analyse associés.
9. Analyses de données
- Visualisez la localisation de la source sonore.
- Pour les sessions d’enregistrement avec un ou plusieurs animaux, sélectionnez des images vidéo durant lesquelles des vocalisations ont été détectées.
- Générez des représentations schématisées des images vidéo sélectionnées.
- Générez un schéma spatial à partir de la sortie MUSE en traçant les positions de tous les microphones, les estimations individuelles des points de source sonore, la localisation estimée de la source sonore, la distribution spatiale de probabilité, la ou les positions de la souris, l’identité inférée du vocaliseur et une barre d’échelle.
- Générez des spectrogrammes de la vocalisation correspondante telle qu’enregistrée par chaque canal de microphone.
REMARQUE : Ces visualisations sont utiles pour évaluer qualitativement la performance de localisation dans des contextes individuels et de groupe.
- Quantifiez l’erreur de localisation et la précision.
- Calculez la distance entre l’emplacement estimé de la source sonore et la position de l’animal enregistré afin de quantifier l’erreur de localisation. Utilisez des enregistrements à la souris unique pour ces calculs, car il n’y a qu’un seul émetteur et la source est connue.
- Pour évaluer la précision du devoir, transformez les estimations de la source sonore et les positions des animaux correspondantes en un référentiel centré sur l’animal vocalisant.
- Visualisez la distribution spatiale des estimations de la source sonore par rapport à la position de l’animal centrée.
- Générez des spectrogrammes pour visualiser les vocalisations.
- Identifiez les épisodes de vocalisation d’intérêt en utilisant les sorties d’extraction vocale contenant l’identité du vocaliseur, les temps d’apparition et de décalage de la vocalisation, ainsi que les limites de fréquence haute et basse.
- Sélectionnez des fenêtres temporelles allant d’avant le début de la première vocalisation à après le décalage de la dernière vocalisation de chaque séquence.
- Extraire les traces de tension des fichiers de canaux audio pour les fenêtres temporelles sélectionnées.
- Générez des spectrogrammes en transformant les traces de tension extraites du domaine temporel vers le domaine fréquentiel.
- Marquez les points temporels correspondant aux vocalisations assignées et non assignées en utilisant des couleurs distinctes sur le spectrogramme.
- Pour les séances d’interaction sociale, identifiez les épisodes de vocalisation produits par différents individus et générez des spectrogrammes avec les identités des vocaliseurs indiquées à l’aide de couleurs spécifiques à chaque identité.
- Quantifiez la sortie vocale par individu.
- Utilisez la sortie du code de localisation de la source sonore pour attribuer à chaque vocalisation une étiquette d’identité, de sorte que les identités animales non localisées, localisées mais non attribuées et individuelles soient codées numériquement.
- Additionnez le nombre de vocalisations produites par chaque animal individuel.
- Comparez les décomptes de vocalisation entre individus et entre sexes.
- Analysez les caractéristiques vocales.
- Extraire les contours de fréquence pour chaque vocalisation.
- Quantifiez les paramètres vocaux tels que la fréquence maximale, la fréquence minimale, la fréquence moyenne, la bande passante et la durée de vocalisation.
- Comparez les paramètres vocaux entre les sexes.
- Effectuer des analyses statistiques appropriées basées sur les propriétés de distribution des données.
REMARQUE : Sélectionnez des méthodes statistiques pour correspondre aux propriétés paramétriques des variables mesurées. Ici, le nombre de sujets est trop faible pour des comparaisons statistiques.
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Résultats
Les résultats présentés dans cet article proviennent d’enregistrements réalisés sur 2 jours et visent à illustrer les résultats du protocole, initialement publié dans Warren et al.15. Ces données ne visent pas à soutenir l’inférence statistique ou des conclusions généralisées.
Extraction et affectation des USV
Les USV étaient enregistrés lors de sessions d’interaction sociale individuelles et collectives à l’aide du ...
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Discussion
L’attribution fiable des VSU à des animaux individuels lors des interactions de groupe a constitué une limitation technique majeure dans l’étude de la communication vocale chez la souris. Bien que les souris soient largement utilisées pour étudier la communication sociale, l’incapacité à attribuer des vocalisations à des individus spécifiques a limité l’analyse quantitative du comportement vocal dans des contextes sociaux naturalistes. Une méthode permettant le suivi vocal spécifique à l...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions le personnel du centre de recherche Life and Science de l’Université du Delaware pour les soins aux animaux, Jim Farmer et Jamie Quesenberry pour leur aide à la construction du matériel de laboratoire, ainsi que le groupe de calcul haute performance de l’Université du Delaware pour leur soutien à la maintenance du cluster informatique. Nous remercions Andre Yichong Ma pour son aide dans la collecte des données. Le travail a été financé par les NIH, les subventions numérotées R01MH122752 et T32GM142603.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Alpha-Dri Bedding | Shepherd Specialty Papers | ALPHA-dri | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| Extrusion d'aluminium | 8020 | Fabriqué sur mesure pour correspondre à l'arène d'enregistrement | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| BNC-2110 | National Instruments | 777643-01 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| Panneau acrylique transparent | Home Depot | MC-24 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| CM16/CMPA40-5V | Avisoft | 40014 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| Ordinateur | Hewlett–Packard | Z620 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| Grasshopper 3 | FLIR | GS3-U3-41C6M-C | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| Luminaires IR | GANZ | IR-LT30 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| NI PXIe-1073 | National Instruments | 781161-01 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| NI PXIe-6356 | National Instruments | 781053-01 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| Nice ‘N Easy, Born Blonde Maxi | Clairol | 2523721 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| Maille en nylon pour parois de cage | McMaster-Carr | 9318T25 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| Cordon d'alimentation | National Instruments | 763000-01 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| SCHC68-68-EPM | National Instruments | 192061-02 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
| Mousse Sonex | Pinta Acoustic | VLW-35 | Nécessaire pour le système de localisation des sources sonores |
Références
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