Une plateforme web pour la quantification automatisée basée sur l’image des îlots pancréatiques isolés par humains et rongeurs

Résumé

Ce protocole décrit l’échantillonnage standardisé, la coloration, l’acquisition d’images et la quantification automatisée en ligne des îlots pancréatiques humains et de rongeurs isolés grâce à l’analyse d’images assistée par apprentissage profond et le contrôle qualité visuelle.

Résumé

Le but de cette publication est de fournir un protocole écrit et vidéo en prise de vues réelles, étape par étape, pour l’utilisation standardisée d’IsletNet, une plateforme web permettant la quantification automatisée des îlots pancréatiques isolés dans les images, depuis l’échantillonnage et l’acquisition d’images jusqu’au téléchargement des images, la validation visuelle et la génération automatique de rapports. La plateforme a été développée pour l’évaluation standardisée et automatisée d’images microscopiques bidimensionnelles d’îlots pancréatiques isolés afin de soutenir les flux de travail cliniques et expérimentaux d’isolement des îlots. La segmentation d’image basée sur l’apprentissage profond est utilisée pour identifier les îlots et tissus exocrines d’où les contours sont extraits pour l’analyse d’images. Les algorithmes computationnels quantifient ensuite le nombre d’îlots, le volume et la pureté. L’outil visuel de contrôle qualité permet la validation experte des analyses automatiques d’images en permettant aux utilisateurs d’accepter, de corriger manuellement ou d’exclure des images invalides. Le module Clinical Islet Isolation supporte l’analyse par lots par fractions de pureté et génère des rapports PDF automatiques ainsi que des fichiers d’images et de données tabulaires téléchargeables pour la tenue et l’analyse des registres. Le module Simple Comparison compare les estimations automatisées avec les résultats de référence obtenus localement soumis avec les images d’échantillon correspondantes afin d’évaluer la pertinence des images localement standardisées à une analyse automatisée. Le protocole propose également des recommandations pour la rééducation utilisant des images standardisées générées localement lorsque cela est nécessaire. Des données représentatives issues des isolements d’îlots de rongeurs et d’humains, y compris des exemples complexes, démontrent une amélioration des performances d’analyse automatisée après une formation appropriée.

Introduction

La transplantation d’îlots pancréatiques isolés dans des receveurs diabétiques réduit ou élimine le besoin d’administration externe^{d’insuline 1}. Le processus d’isolement des îlots par des donneurs cadavériques ou vivants est soumis à une hétérogénéité biologique et procédurale, reflétée par des variations de rendement et de qualité. Le volume total des îlots représente l’entrée principale pour la détermination de la dose et la prise de décision clinique concernant l’adéquation à la^{greffe 2}. L’histogramme de la taille des îlots et le numéro d’indice des îlots expliquent les différences d’efficacité liée à la^{taille 3}. Par conséquent, une attention est portée aux îlots individuels en plus du volume total, qui sert actuellement de marqueur substitutif au contenu des cellules bêta. Les îlots humains isolés sont moins denses que les îlots rongeurs et ne sont souvent pas bien séparés des tissus exocrines. Par conséquent, ils sont plus difficiles à distinguer sans être teintés. Une méthode de coloration au zinc rapide et simple utilisant la dithizone a été adoptée, dans laquelle une lumière rouge intense est réfléchie par des granules d’insuline enrichies^{en zinc 4}. Étant donné l’opacité du tissu, seule la lumière réfléchie par la surface est collectée, permettant l’utilisation d’instruments simples de stéréoscopie ou microscopie inversée équipés d’une source lumineuse et d’un appareil photo.

De nombreuses tentatives ont été faites pour réduire la variation interlaboratoire en utilisant les outils d’analyse d’images^numériques 5,6,7,8,9,10,11,12, cependant, ces approches présentent plusieurs limites. Dans ces méthodes, la segmentation des îlots et des tissus exocrines repose soit sur un seuil manuel, sujet à l’erreur^subjective 5,6,7,8,9,10, soit utilise des approches de segmentation entièrement ^{automatisées 11,12}. De plus, l’installation locale de logiciels est souvent requise 5,6,7,8,9,10,11 et peut être limitée à un matériel spécifique ^10,11, limitant ainsi l’accessibilité générale et la standardisation.

L’objectif global de la présente publication est de fournir un flux de travail standardisé pour la quantification automatisée des îlots pancréatiques isolés dans les images, à l’aide d’une plateforme d’apprentissage profond en ligne sous supervision d’experts humains. IsletNet répond aux limitations liées à la fois à la disponibilité et à la fiabilité de l’analyse d’images des îlots. Dans cet article, nous présentons des recommandations pour l’échantillonnage des greffes d’îlots, la génération d’images microscopiques appropriées et l’utilisation correcte des outils IsletNet . Le protocole introduit le concept de supervision humaine des résultats générés automatiquement et présente des flux de travail pour les utilisateurs potentiels et établis (Figure 1). L’outil Simple Comparison permet aux utilisateurs potentiels de comparer directement les résultats d’IsletNet avec des méthodes de référence obtenues localement (Figure 1A). Comme les images standardisées générées localement peuvent différer considérablement selon les centres, IsletNet peut nécessiter un réentraînement avant qu’une analyse fiable puisse être réalisée (Figure 1B). Pour faciliter ce processus, des recommandations pour une coloration standardisée et l’acquisition d’images sont fournies. Pour les utilisateurs établis, l’outil d’isolement des îlots cliniques est conçu pour soutenir le flux de travail d’isolement des îlots humains (Figure 1C). Des rapports téléchargeables ainsi que des tableaux et visualisations supplémentaires générés par IsletNet sont décrits dans le tableau 1, tandis que les paramètres clés calculés sont résumés dans le tableau 2.

Figure 1 : Flux de travail pour les utilisateurs potentiels et établis de la plateforme. (A) Flux de travail de validation locale utilisant le module Simple Comparison. (B) Le réentraînement nécessite un ensemble représentant des images localement standardisées. (C) Flux de travail d’utilisation routinière utilisant le module d’isolement des îlots cliniques. Les étapes clés du flux de travail sont résumées pour le téléchargement d’images, l’analyse, le contrôle qualité visuel (vQC) et la génération de rapports. Les barres d’échelle ne sont pas applicables. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Fichiers de résultats téléchargeables générés par la plateforme. Liste des fichiers de sortie téléchargeables générés par les outils Clinical Islet Isolation et Simple Comparison, regroupés par format de fichier et catégorie de sortie. Le tableau comprend les fichiers de rapport, les sorties d’images segmentées, les fichiers de visualisation et les exportations de feuilles de calcul pour le nombre d’îlots, le volume, la pureté et les analyses d’histogrammes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Paramètres clés inclus dans les rapports téléchargeables et les résultats des tableurs. Liste détaillée des métadonnées, des paramètres définis par l’utilisateur et des paramètres d’analyse quantitative inclus dans les fichiers XLSX et CSV téléchargeables générés par les outils Clinical Islet Isolation et Simple Comparison. Les paramètres incluent les métadonnées de session, les paramètres d’acquisition d’images et les métriques de quantification des îlots pour les images et les îlots individuels. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Protocole

Les procédures animales ont été approuvées par le ministère de la Santé de la République tchèque (Approbation n° 49/2023) conformément à la directive 86/609/CEE du Conseil des Communautés européennes. Les procédures d’isolement et d’utilisation des îlots humains ont été approuvés par l’Institut d’État pour le contrôle des drogues (n° d’approbation sukls111286/2023). Des images microscopiques standardisées de préparations d’îlots de rats et d’îlots humains ont été analysées à l’aide des outils Simple Comparison et Clinical Islet Isolation afin de comparer l’analyse automatisée au comptage manuel. La table de conversion standard (courte^{) 13} était utilisée aussi bien pour les calculs manuels que pour les équivalents automatisés des îlots.

1. Supervision humaine

1. Vue initiale des résultats primaires (Figure 2)
   1. Attendez que les valeurs générées automatiquement pour le nombre d’îlots, le volume et la pureté, ainsi que la visualisation graphique des annotations automatiques correspondantes (par exemple, contours ou segmentations), apparaissent dans la fenêtre des résultats par lots.
   2. Consultez les résultats résumés de l’image d’échantillon actuelle dans le panneau d’information de gauche (Figure 2A).
   3. Consultez les valeurs de réplication (Figure 2B) et les moyennes de lots (Figure 2C) dans le tableau de droite.
   4. Parcourez l’aperçu de l’image (Figure 2D, E) en utilisant les liens (Figure 2F). Faites un clic droit sur l’aperçu de l’image et suivez le menu contextuel pour télécharger une seule image si nécessaire.
   5. Parcourez les images d’exemple à l’aide des flèches de navigation (Figure 2G) ou sélectionnez directement dans le tableau.
   6. Ouvrez la fenêtre d’inspection en cliquant dans l’aperçu actuel de l’image (Figure 2D) pour évaluer la qualité des contours générés automatiquement et valider les résultats.
2. Contrôle de qualité visuelle
   1. Déplacez-vous autour de l’image et zoomez (Figure 3A) vers ou vers l’arrière pour inspecter les contours à la recherche d’erreurs potentielles.
   2. Basculez entre les vues Contour (seules les îlots comptés l’ont), image originale et visualisation supplémentaire.
      REMARQUE : Les vues disponibles sont listées dans la Légende à droite de la fenêtre (Figure 3B) et peuvent être accessibles via les raccourcis clavier ou les liens dans la barre de navigation supérieure (Figure 3C ; Tableau 3).
   3. Passez à l’image suivante en appuyant sur la flèche vers le bas si les contours sont acceptables (Tableau 3).
   4. Corrigez manuellement les erreurs de contouring quand c’est possible. Si des îlots non détectés, partiellement détectés ou des parasites restent présents, classez l’image comme invalide et excluez-la de l’analyse.
      REMARQUE : Les images exclues sont indiquées dans la fenêtre des résultats par lot (Figure 2J) et dans tous les fichiers téléchargés.
3. Erreurs corrigibles : îlots adjacents non séparés
   1. Séparez manuellement les îlots adjacents si nécessaire.
   2. Cliquez du bouton gauche à l’extérieur des îlots pour initier une ligne de séparation (Figure 3D).
   3. Ajoutez des clics gauches intermédiaires pour guider la ligne de séparation entre les îlots adjacents (Figure 3E).
   4. Faites un clic droit à l’extérieur des îlots pour compléter la ligne de séparation (Figure 3F).
   5. Soumettez la ligne de séparation pour mettre à jour le résultat (Figure 3G).
      REMARQUE : Activez ou désactivez la visualisation des lignes de séparation ajoutées selon les besoins (Figure 3H).
4. Erreurs corrigables : îlots fallacieux
   1. Utilisez l’outil de séparation pour diviser un îlot spurie en plusieurs objets plus petits que le seuil de taille des îlots.
   2. Évitez de compter les petits fragments d’îlots en fixant le seuil minimal prédéfini de taille d’îlot (conventionnellement 50 μm). Ajustez le seuil selon les pratiques locales du laboratoire si nécessaire.
   3. Faites un clic droit sur n’importe quel point de la ligne et sélectionnez l’option appropriée dans le menu contextuel pour supprimer une ou toutes les lignes de séparation ajoutées manuellement (Figure 3I).
5. Erreurs irréparables : îlots manquants, partiellement segmentés ou spuries
   1. Basculez la vue Segmentation pour vérifier si les îlots ont été détectés.
   2. Excluez du calcul de la moyenne par lots toute image invalide contenant des îlots non détectés, partiellement détectés ou multiples (Figure 3J).
6. Erreurs irrémédiables : objets mal classés
   1. Excluez l’image de l’évaluation si des tissus exocrines, des artefacts de fond ou des bulles sont mal classés comme îlots (Figure 3J).

Figure 2. Fenêtre des résultats du lot. (A) Résumé actuel des résultats d’échantillon. (B) Résultats pour des images d’échantillons répliquées. (C) Seules les valeurs moyennes par lots provenant d’images acceptées. (Ré, Mi, Fa) Aperçu graphique des résultats avec liens. (G) Exemples de flèches de navigation. (H, I, J) Images modifiées, acceptées et exclues. (K) Barre de navigation supérieure d’IsletNet . (L, M) En-tête et pied de page de la fenêtre des résultats de lot. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3. Fenêtre d’inspection pour la vQC et la correction manuelle des contours. (A) Affichage zoom de l’image. (B) Légende et conseils de navigation. (C) Barre de navigation supérieure de la fenêtre d’inspection. (Ré–Sol) Construction et mise en place d’une ligne de séparation manuelle pour les îlots adjacents. (H) Bascule pour afficher ou cacher les lignes de séparation manuelles. (I) Retrait des lignes de séparation manuelles. (J) Bascule pour exclure une image des statistiques. Les barres d’échelle ne sont pas affichées dans cette vue d’interface. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 3 : Modes de vue, raccourcis clavier et contrôles de navigation disponibles dans la fenêtre d’Inspection. Résumé des modes de visualisation d’image, raccourcis clavier et fonctions de navigation disponibles lors de la vQC et de la révision manuelle des résultats de segmentation dans la fenêtre d’inspection. Le tableau inclut les superpositions de contours, les affichages de segmentation, la visualisation des histogrammes et les contrôles de navigation d’image utilisés dans les outils Clinical Islet Isolation et Simple Comparison. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

2. Navigation sur la plateforme

1. Version de visionnage et informations techniques
   1. Examinez la version actuelle du logiciel et la date d’entraînement la plus récente affichée dans la barre de navigation supérieure (Figure 2K).
   2. Ouvrez la section Accueil pour accéder à la description technique et aux informations de référence associées.
2. Évaluation préliminaire des images locales
   1. Déterminer si les images standardisées générées localement peuvent déjà être correctement analysées par la plateforme, sur la base des critères d’erreur décrits aux étapes 1.2.4 et 1.5.2, ou si une rééducation est nécessaire pour les images normalisées locales (Figures 1A et 1B).

3. Comparaison simple et formation externe avec des images locales

1. Comparaison simple
   REMARQUE : Utilisez l’outil Simple Comparison pour comparer les résultats d’analyses automatisées avec une méthode de référence établie localement, généralement le comptage manuel^{standard 13}, les tableaux^{alternatifs 7,11,18} ou^{les modèles 5,6}. Téléchargez des images standardisées générées localement avec les valeurs de référence et le type de méthode de référence correspondants. Le résultat comprend des tableaux téléchargeables, des images et des rapports PDF (Tableau 1).
   1. Ouvrez le tableau de bord Simple Comparison depuis la barre de navigation supérieure (figures 4A et 4B).
   2. Consultez la section Indices pour les propriétés d’image requises (Figure 4C).
   3. Téléchargez le modèle form.xlsx (Figure 4D).
   4. Compter les îlots dans plusieurs échantillons en utilisant une méthode de référence localement établie.
   5. Acquérir des images microscopiques standardisées correspondant aux échantillons comptés.
   6. Assurez-vous que tous les îlots comptés sont entièrement inclus dans le cadre de l’image.
   7. Entrez les noms exacts des fichiers image et les valeurs des paramètres correspondants dans le modèle form.xlsx en utilisant les points décimaux anglais (Figure 4E).
   8. Téléchargez le tableau complété et les fichiers image correspondants en glisser-déposer ou en utilisant les boutons de téléversement (Figure 4F).
   9. Sélectionnez la table de conversion ou le modèle utilisé pour l’estimation du volume des îlots (Figure 4G).
   10. Cliquez sur Envoyer le lot pour générer la comparaison côte à côte.
   11. Attendez que les résultats de l’analyse apparaissent.
   12. Ouvrez la fenêtre d’inspection pour effectuer la validation visuelle des courbes de niveau.
   13. Excluez les images de l’analyse si les contours sont incorrects (Figure 3J).
       REMARQUE : L’édition manuelle des contours n’est pas disponible dans l’outil Simple Comparison.
   14. Téléchargez les résultats sous forme de tableaux, d’images et de rapports PDF (Tableau 1).
2. Formation IsletNet pour des images localement standardisées
   1. Contactez l’équipe de développement de l’Institut de médecine expérimentale (IKEM) à info@isletnet.com.
   2. Partagez des images représentatives couvrant la gamme de qualité d’image actuellement obtenue localement.
   3. Discutez des exigences en qualité d’image avec l’équipe de développement.
      REMARQUE : Les paramètres clés de qualité d’image incluent un contraste suffisant, l’inclusion complète des îlots dans le cadre de l’image, et un chevauchement minimal entre les îlots adjacents. La coloration des îlots peut varier du rouge au rose ou au violet, à condition que la distinction avec le tissu exocrine reste claire.
   4. Créez un ensemble d’images d’entraînement couvrant la plage attendue de purités d’îlots, de grossissements et de variations de couleur.

Figure 4. Outil simple de comparaison, tableau de bord et flux de travail. (A) Barre de navigation supérieure. (B) tableau de bord simple de comparaison. (C) Téléchargez des indices et instructions. (D, E) form.xlsx téléchargement et visualisation des paramètres téléchargés. (F) Espace de téléchargement par glisser-déposer pour les images et les tableaux Excel. (G) Sélection de la conversion taille en volume des îlots. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Échantillonnage

REMARQUE : Les îlots sédimentent rapidement et différemment selon leur taille et leur forme, ce qui peut biaiser les résultats d’échantillonnage.

ATTENTION : Effectuez toutes les procédures de manipulation des îlots à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.

1. Utilisez des tubes de 50 mL ou 250 mL pour la suspension des îlots.
2. Déterminer la fraction d’échantillonnage requise selon le volume et la pureté observés des granules en utilisant les procédures opérationnelles standard locales.
3. Mélangez soigneusement la suspension à îlots en inversant doucement le tube cinq fois juste avant la collecte de l’échantillon.
4. Prélevez immédiatement l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette à gros calibre pour éviter les blocages par le tissu exocrine et minimiser les dommages aux îlots.

5. Optimisation de l’acquisition d’images d’îlots

1. Préparation de la dithizone
   REMARQUE : Une coloration constante de dithizone est nécessaire pour garantir un contraste suffisant entre les îlots et les tissus exocrines. Deux méthodes de préparation couramment utilisées sont décrites ci-dessous.
   ATTENTION : La dithizone est une toxine reproductrice suspectée. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) est toxique et pénétrant la peau. L’hydroxyde de sodium est hautement corrosif et peut provoquer de graves brûlures chimiques. Manipulez tous les produits chimiques en portant un équipement de protection individuelle approprié, évitez le contact avec la peau et jetez les déchets conformément aux procédures institutionnelles de gestion des déchets dangereux.
   1. Resuspension dans DMSO¹³
      1. Pèse 50 mg de poudre de dithizone.
      2. Dissouds la dithizone dans 5 mL de DMSO.
      3. Incubez la solution à 37°C et faites un vortex vigoureux pendant 1 minute toutes les 5 minutes jusqu’à la fin de la dissolution.
      4. Diluez 1 mL de la solution base avec 20 mL de Hank’s Balanced Salt Solution contenant 2 % de sérum fœtal bovin pour préparer la solution de travail.
      5. Filtrez la solution à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
      6. Enveloppez le tube dans du papier aluminium pour protéger la solution de la lumière.
         REMARQUE : Utilisez la solution de travail dans environ 12 heures.
   2. Resuspension dans une solution alcoolique alcaline (alternative à la Réf. 8)
      1. Pèse 50 mg de poudre de dithizone.
         REMARQUE : Préparez les aliquotes à l’avance si désiré.
      2. Ajoutez 800 μL d’éthanol à 70 % dans la dithizone.
      3. Ajoutez 400 μL de solution d’hydroxyde de sodium de 1 M et formez un vortex jusqu’à la fin de la dissolution.
      4. Diluez la solution avec du sérum physiologique tamponné de phosphate contenant 0,2 mg/mL d’albumine humaine pour un volume final de 20 mL.
      5. Filtrez la solution à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
      6. Enveloppez le tube dans du papier aluminium pour protéger la solution de la lumière.
         REMARQUE : Utilisez la solution de travail dans environ 12 heures.
2. Coloration des îlots
   1. Ajoutez 25 μL de solution de travail dithizone au centre d’un plat de 35 mm.
   2. Ajoutez 50 μL d’îlots suspendus dans la solution salée équilibrée de Hank contenant de l’albumine, un milieu de culture complet ou un milieu de transplantation.
      REMARQUE : Le volume réel de l’échantillon varie entre 20 et 50 μL selon la granule de pureté-fraction, avec une concentration finale de dithizone de 0,85 mg/mL à 1,37 mg/mL.
   3. Pipettez la suspension trois fois en utilisant lentement la première butée pour mélanger doucement les solutions tout en évitant la formation de bulles.
   4. Incubez l’échantillon à 20°C–25°C pendant 1 à 2 minutes tout en surveillant visuellement la coloration au microscope jusqu’à ce que les îlots paraissent d’un rouge vif. Certaines préparations peuvent contenir des îlots mal colorés, pour lesquels IsletNet est également formé.
   5. Utilisez une seringue de 10 mL pour injecter rapidement 4 mL de solution physiologique tamponnée phosphate, complétée directement avec 0,2 mg/mL d’albumine dans l’échantillon coloré, tout en évitant à la fois les bulles et les éclaboussures.
   6. Faites immédiatement tourner vigoureusement le plat en cercle pour mélanger les solutions, déplacez les îlots vers le centre avant de se stabiliser.
      OPTION 1 : Ajouter soigneusement 4 mL de PBS/albumine, en laissant les îlots en dithizone intacts. Ensuite, faites doucement tourner le plat en cercle pour mélanger les solutions qui maintiennent les îlots au centre. Attendez que la dithizone se disperse dans le plat.
      OPTION 2 (adaptée au stéréomicroscope) : Au lieu de diluer les îlots, étalez la goutte de dithizone en une fine couche à l’aide d’une pointe de pipette ou d’une aiguille au lieu de diluer pour réduire les réflexions.
   7. Inspectez l’échantillon au microscope et ramenez immédiatement les îlots déplacés dans le champ de la caméra en faisant tourner doucement la solution environnante avec une pointe de pipette.
   8. Commencez immédiatement l’acquisition d’images pour minimiser la cytotoxicité et les variations de volume des îlots.
3. Acquisition d’images
   REMARQUE : Utilisez un microscope stétéo ou inversé équipé d’un objectif à faible grossissement et d’une source lumineuse stable. Protège l’antenne contre d’autres sources lumineuses, comme l’éclairage de la pièce.
   1. Allumez la source lumineuse et laissez chauffer l’ampoule halogène pendant 5 minutes.
   2. Réglez une intensité lumineuse standardisée pour éviter l’éblouissement et la sous-exposition. La portée exacte dépend du matériel d’imagerie utilisé.
      REMARQUE : L’intensité lumineuse optimale peut varier selon le grossissement et la pureté de l’échantillon.
   3. Sélectionnez l’objectif et le zoom qui permettent à tous les îlots de rester dans le champ de vision de la caméra.
   4. Maintenez le même grossissement pour tous les échantillons d’un lot et de préférence pour tous les lots de pureté.
   5. Calibrez la balance des blancs à l’aide d’une culasse blanche normalisée si nécessaire. Si la qualité d’image reste insatisfaisante en raison des caractéristiques uniques de la préparation des îlots, ajustez les valeurs RVB et/ou les réglages gamma.
   6. Ajustez le temps d’exposition et, si nécessaire, l’intensité ou le gain d’éclairage en utilisant l’histogramme couleur afin d’éviter la surexposition.
      REMARQUE : Les échantillons contenant une abondance de tissu exocrine peuvent nécessiter des réglages de caméra ou d’éclairage différents en raison de la lumière réfléchie provenant des tissus non islots. Pour garantir la reproductibilité, enregistrez ces paramètres comme un fichier de configuration séparé pour référence future.
   7. Capturez l’image et enregistrez le fichier dans un format supporté, incluant JPG, PNG, TIFF ou BMP.
      REMARQUE : Inclure la date, la fraction de pureté, le grossissement ou la taille des pixels, ainsi que la dilution dans le nom du fichier pour faciliter une réanalyse future (par exemple, iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg).
   8. Acquérez une image du micromètre de scène en utilisant les mêmes réglages de grossissement et de zoom que pour l’imagerie d’échantillon.

6. Outil d’isolement clinique des îlots

REMARQUE : Les étapes clés du flux de travail sont résumées dans la Figure 1C. Analysez les images en lots fractions de pureté au fur et à mesure que les échantillons deviennent disponibles.

1. Définir la taille du pixel
   REMARQUE : La taille calculée du pixel reste valable uniquement lorsque l’image du micromètre de scène est acquise en utilisant les mêmes réglages de grossissement et de zoom que les échantillons analysés.
   1. Ouvrez le tableau de bord de l’isolement des îlots cliniques .
   2. Cliquez sur Uploader Micromètre de Scène et sélectionnez l’image du Micromètre de Scène.
   3. Tracez les extrémités de la ligne de mesure rouge sur une distance connue sur la règle numérique.
      REMARQUE : Utilisez une distance d’étalonnage plus longue lorsque possible pour améliorer la précision des mesures.
   4. Entrez la distance connue en micromètres (μm).
   5. Soumettez la taille calculée des pixels.
      REMARQUE : La plateforme conserve la taille calculée des pixels jusqu’à modification manuelle.
2. Téléchargement par lots d’images en fractions de pureté
   REMARQUE : Utilisez 3 à 4 échantillons réplicés pour garantir un calcul fiable de la moyenne par lots et des valeurs d’écart-type. Utilisez la même dilution pour tous les échantillons d’un lot.
   1. Des images à glisser-déposer représentant des échantillons de la même fraction de pureté dans la zone de téléchargement.
      REMARQUE : La plateforme empêche l’utilisation répétée de la même image basée sur la reconnaissance des noms de fichiers.
   2. Modifiez la taille des pixels si nécessaire.
   3. Entrez le seuil de taille minimale des îlots.
   4. Entrez la valeur de dilution de l’échantillon (par exemple, 1000).
   5. Entrez le volume de la pastille en millilitres enregistrés à partir de la fiole d’origine.
   6. Entrez les initiales de l’opérateur.
      REMARQUE : Les initiales de l’opérateur apparaissent dans le rapport généré.
   7. Veuillez entrer l’ID de session représentant la procédure d’isolation actuelle.
   8. Saisissez l’identifiant du lot (par exemple, 1 Haute Pureté).
      REMARQUE : La plateforme ordonne les fractions de façon alphanumérique selon l’identifiant de lot.
   9. Cliquez sur Envoyer le lot pour commencer l’analyse.
3. Examiner et finaliser les résultats du lot
   REMARQUE : Fermez la fenêtre précédente des résultats du lot en cliquant sur l’en-tête si nécessaire (Figure 2L).
   1. Attendez que les résultats numériques et graphiques apparaissent dans la fenêtre des résultats par lot.
   2. Ouvrez la fenêtre d’inspection en double-cliquant sur l’aperçu de l’image dans la fenêtre des résultats du lot.
   3. Examinez et, si nécessaire, corrigez les contours comme décrit à l’étape 1.
   4. Passez à l’image suivante en utilisant la flèche inférieure si les contours sont acceptables.
   5. Ajoutez un autre lot ou allez au résumé de la session en utilisant les boutons situés en bas de la fenêtre (Figure 2M).
4. Montage par lots
   REMARQUE : La plateforme stocke les noms de fichiers images tout au long de la session afin d’éviter toute utilisation répétée involontaire de la même image. Cela inclut les images supprimées. Renommer les images avant de les réutiliser si nécessaire.
   1. Cliquez sur Modifier le lot pour ajouter ou retirer des images, corriger les spécifications des échantillons ou renommer le lot (Figure 2L).
      REMARQUE : Enregistrez les noms des fichiers image avant de modifier le lot si la réutilisation de l’image est prévue.
   2. Cliquez sur Supprimer le lot pour supprimer complètement le lot (Figure 2L).
5. Consultation du résumé et génération des rapports
   1. Cliquez sur Afficher Résumé pour afficher l’aperçu de la session (Figure 2M).
      REMARQUE : Revenez aux lots précédents et modifiez-les si nécessaire.
   2. Consultez le nombre total d’îlots, le volume et les valeurs de volume de pellets pour la session, ainsi que les valeurs moyennes correspondantes des lots.
6. Téléchargez le rapport.
   REMARQUE : Le court rapport comprend le nombre total d’îlots, le volume, la pureté, les valeurs des granules, les histogrammes et les résumés pureté-fraction. Le rapport complet inclut également des informations graphiques pour chaque image d’échantillon, avec les valeurs acceptées affichées en rouge et les valeurs exclues en noir.

Résultats

Îlots de rats purs

Lors de la première expérience, 36 images représentant 12 échantillons contenant un total de 249 îlots de rats purifiés ont été acquises lors de quatre séances d’imagerie indépendantes. Les images étaient générées à l’aide d’un stéréomicroscope sous trois conditions d’éclairage standardisées mais distinctes, utilisant des sources lumineuses halogènes et des diodes électrolumineuses (LED), ainsi que différents réglages de la caméra. Des segmentations de terrain (GT) ont été générées manuellement pour trois images représentatives par un expert en formation IsletNet .

Lorsque les images ont été analysées à l’aide de la version publique de l’outil de comparaison simple, aucun des contours générés automatiquement ne passait le contrôle qualité visuelle (vQC, Figure 5F). La plateforme a ensuite été réentraînée à l’aide d’images locales représentatives, et tous les contours générés par la version expérimentale réentraînée ont été passés par vQC (Figure 5C).

Le ratio entre les estimations automatisées et manuelles du volume des îlots a démontré une performance constante sur les trois conditions d’imagerie après réentraînement, avec des valeurs médianes de 1,03, 0,98 et 0,94 pour les conditions d’éclairage A, B et C respectivement (Figure 5A). Ces résultats représentaient une amélioration substantielle par rapport au modèle d’entraînement initial (Figure 5B).

La comparaison pixel par pixel avec les segmentations GT a démontré une étroite concordance entre les contours automatisés et générés manuellement après réentraînement (Figure 5D), correspondant à un placement précis des contours dans des images représentatives (Figure 5C). En revanche, le modèle d’entraînement original montrait une proportion accrue de faux négatifs (Figure 5G) et de mauvais déplacements des contours (Figure 5F), ce qui entraînait un déplacement vers des catégories d’îlots plus petites dans les histogrammes correspondants de taille des îlots (Figure 5E vs 5H).

Figure 5. Évaluation de la rééducation des plateformes à l’aide de trois systèmes d’imagerie et de la préparation des îlots rats. (A) Comparaison des estimations d’IsletNet et de l’équivalent manuel des îlots (IEQ) après réentraînement à l’aide de trois configurations d’imagerie. (B) Comparaison des estimations IEQ d’IsletNet et manuelles à l’aide du modèle public d’entraînement original. (C, F) Placement représentatif des contours à l’aide de l’outil vQC après et avant le réentraînement du modèle, respectivement. Les pointes blanches indiquent un placement correct des contours et les pointes magenta un mauvais placement des contours. (Ré, Sol) Comparaison pixel par pixel avec la vérité terrestre après réentraînement et avec le modèle d’entraînement original, respectivement. Les régions vrai positif, faux positif, faux négatif et vrai négatif sont indiquées dans la légende. (E, H) Histogrammes de taille représentative des îlots après réentraînement et avec le modèle d’entraînement original, respectivement, comparés au comptage manuel. Installation d’imagerie 1 = éclairage LED ; installation d’imagerie 2 = éclairage halogène ; installation d’imagerie 3 = éclairage en champ sombre LED. Barres d’échelle = 100 μm. Les boîtes sont montrées selon la convention de Tukey ; les moustaches s’étendent à des points de données situés dans une plage interquartile de 1,5 × des premier et troisième quartiles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Préparations cliniques des îlots humains

Dans la deuxième expérience, 17 images représentant une procédure d’isolation d’îlots humains avec trois paires pureté-fraction ont été analysées à l’aide de la version publique de la plateforme. Un échantillon a été perdu. Après la vQC, toutes les images représentant des fractions de pureté moyenne et basse ont été exclues en raison de la détection d’îlots fallacieux (données non montrées). La plateforme a ensuite été re-entraînée à l’aide d’images locales représentatives.

Après réentraînement, toutes les images ont passé la vQC après l’ajout de trois lignes de séparation manuelles. La comparaison par lots avec le comptage manuel a montré une sous-estimation globale de ≤5 % pour le nombre total d’îlots et les estimations de volume. Les échantillons dilués entre 2 000 et 4 000 fois contenaient entre 80 et 4 îlots selon la fraction de pureté. La contribution relative des fractions individuelles de pureté à la préparation finale est illustrée à la Figure 6A. La fraction de haute pureté 1VC2 a contribué principalement à des îlots plus petits comparés à la fraction de pureté moyenne 2SC1. L’histogramme de taille globale des îlots généré automatiquement par la plateforme est représentée à la Figure 6B.

Figure 6. Quantification et analyse d’échantillons d’isolement d’îlots humains. (A) Nombre d’îlots et estimations du volume équivalent des îlots à l’aide d’IsletNet et des méthodes de comptage manuelles sur les fractions de pureté du greffon complet. (B) Histogramme de taille finale des îlots généré par IsletNet à l’aide des valeurs moyennes par lot. (C) Comparaison des estimations IsletNet et manuelles pour le nombre et le volume sur 17 images individuelles. (D) Détail représentatif de l’image de l’échantillon 3NC1 montrant l’image originale et le placement des contours générés par IsletNet réentraîné. (E) Comparaison pixel par pixel de la segmentation IsletNet avec la vérité sur le terrain générée par l’expert comptant manuellement vs. l’expert formé par IsletNet (GT1 vs. GT2). Les régions vrai positif, faux positif, faux négatif et vrai négatif sont indiquées dans la légende. (F) Histogramme de taille représentative des îlots pour la même image comparant les résultats d’IsletNet et du manuel. Les pointes de flèches magenta indiquent le contour et le décalage de la taille des îlots. Barres d’échelle = 100 μm. Les boîtes sont montrées selon la convention de Tukey ; les moustaches s’étendent à des points de données situés dans une plage interquartile de 1,5 × des premier et troisième quartiles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Des estimations automatisées et manuelles ont ensuite été comparées pour toutes les images individuelles (Figure 6C). Les ratios médians entre les estimations automatisées et manuelles étaient de 1,00 pour le nombre d’îlots et de 0,93 pour le volume des îlots, avec plusieurs valeurs aberrantes observées. Dans un échantillon représentatif de faible pureté (3NC1), la plateforme a identifié le même nombre d’îlots que le comptage manuel (cinq îlots) mais a estimé un volume d’îlots inférieur de 29 %. Ces points de données sont indiqués par des pointes de flèches dans la Figure 6C.

Le plus grand îlot, partiellement piégé dans des tissus exocrines, à partir de cette image représentative, est montré à la Figure 6D, incluant l’image originale et la superposition de contour générée automatiquement. La comparaison pixel par pixel avec les segmentations GT générées indépendamment par deux experts est présentée à la Figure 6E. Les histogrammes correspondants de taille des îlots ont démontré un décalage de la répartition de la taille entre segmentations manuelles et automatisées (Figure 6F).

Performance opérationnelle de l’analyse automatisée

La performance opérationnelle des outils Simple Comparison et Clinical Islet Isolation a été évaluée dans des conditions internet standard avec des vitesses moyennes de téléchargement et d’envoi de 50 Mbps et 30 Mbps, respectivement. Cinq lots d’images contenant 12 images chacun ont été analysés en utilisant des tailles d’image allant de 0,5 Mo de fichiers JPEG à 20 Mo de fichiers TIFF. La durée de téléchargement a été mesurée pour les packages complets de résultats ZIP.

Les temps de visualisation et les durées de téléchargement de l’analyse ont augmenté progressivement avec la taille de l’image pour les deux outils (Tableau 4). L’outil d’isolation des îlots cliniques nécessitait des temps de traitement plus longs que l’outil de comparaison simple pour des ensembles d’images équivalents. Ces résultats démontrent la relation pratique entre la résolution d’image, le format de fichier et le débit d’analyse lors de l’opération de routine.

Tableau 4 : Temps de visualisation d’analyse et durées de téléchargement pour les outils d’isolement d’îlots cliniques et de comparaison simple. Comparaison des temps de traitement nécessaires pour la visualisation des résultats et le téléchargement des fichiers à l’aide de lots d’images de différentes tailles et formats de fichiers. Les mesures ont été obtenues à l’aide de lots contenant 12 images et sont rapportées comme le temps écoulé entre la soumission du lot et la visualisation des résultats ou la complétion du téléchargement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Le protocole présenté ici décrit le flux de travail pratique pour les utilisateurs potentiels et établis d’IsletNet, en mettant l’accent sur deux caractéristiques essentielles de la plateforme : la vQC experte et la rééducation des réseaux neuronaux. Les résultats représentatifs démontrent que la quantification automatisée précise dépend non seulement de la performance de segmentation d’image, mais aussi de la capacité de l’utilisateur à évaluer de manière critique le placement des contours et la pertinence de l’image avant d’accepter les résultats. Deux outils avancés supplémentaires, Comparaison Pixel-à-Pixel et Mes Segmentations, ont été utilisés pour générer des résultats de validation sélectionnés ; cependant, ces outils sont principalement destinés au support de l’entraînement des réseaux neuronaux et ne sont donc pas inclus dans le flux de travail du protocole.

IsletNet a été développé comme un outil de référence collaboratif et largement accessible pour l’analyse standardisée des images d’îlots à travers les laboratoires. Le réseau de neurones a été entraîné et validé à l’aide de segmentations GT annotées manuellement d’images microscopiques bidimensionnelles originales des îlots humains et de rats^{isolés 14, 15, 16}. Deux modèles distincts pour des préparations colorées à la dithizone, ainsi qu’un modèle de recherche supplémentaire pour des îlots de rats non colorés, ont été générés, avec un accès disponible sur demande. La version de la plateforme et la date de formation sont affichées dans l’interface utilisateur. IsletNet segmente automatiquement les îlots et les tissus exocrines et calcule ensuite le nombre, le volume et la pureté des îlots en utilisant la taille des pixels définie par l’utilisateur et le seuil minimal des îlots. Le choix du seuil de taille des îlots dépend de la qualité de l’image et de l’objectif de l’analyse (comparaison côte à côte avec le comptage manuel versus l’étude des petits îlots) plutôt que de l’espèce. Étant donné la résolution de la microscopie conventionnelle, la taille minimale significative de l’îlot est de 50 μm 7,8,9,12, mais elle peut être réduite jusqu’à 10 μm pour les images obtenues avec un instrument ^{approprié 10}. Les estimations du volume des îlots sont générées à l’aide de la table de conversion standard basée sur la sphère¹³ ainsi que des tables de conversion^{alternatives 7, 18, 19}, incluant les approximations ajustées de l’ellipse^{5, 6} et les modèles de Spinacle et Sphiracle^{basés sur les contours 17}. Les valeurs résultantes sont rapportées en équivalents d’îlots et en nanolitres, tandis que la pureté est calculée à partir soit de la surface tissulaire soit du volume tissulaire estimé. Une étape cruciale du protocole est l’acquisition d’images microscopiques standardisées adaptées à la segmentation automatisée. IsletNet a été entraîné à partir d’images acquises avec des microscopes stéréo et inversés équipés d’une gamme de caméras semi-conductrices à oxyde métallique complémentaires et de systèmes d’illumination. Les objectifs à faible grossissement (1–2×) sont avantageux car ils permettent à l’échantillon complet de rester dans le champ de vision tout en maintenant une taille de pixel compatible avec une détection fiable de petits îlots. Un éclairage constant, une balance des blancs stable et l’évitement de la surexposition de l’image sont essentiels pour une génération fiable des contours. Les résultats représentatifs démontrent que le réentraînement à l’aide d’images locales représentatives peut améliorer considérablement la performance de segmentation à travers des conditions d’imagerie hétérogènes. À titre de recommandation pratique, les images conviennent généralement à l’entraînement IsletNet lorsque les limites des îlots et des tissus exocrines sont clairement discernables pour un observateur expérimenté. Les images contenant des îlots regroupés ou fortement superposés doivent être évitées autant que possible.

Le protocole met également en lumière plusieurs limitations et considérations de dépannage associées à l’analyse automatisée d’images. Bien qu’IsletNet augmente considérablement le débit, l’objectivité et la reproductibilité par rapport au comptage entièrement manuel, la méthode reste sensible à la qualité de l’image. Un mauvais placement des contours (détection fallacieuse des îlots et manque de séparation des îlots adjacents) peut parfois survenir et affecter la quantification en aval. Une vQC de routine reste essentielle avant d’accepter des résultats automatisés. L’application immédiate sur site à IsletNet est avantageuse car des images inadaptées peuvent être reacquises avec des paramètres d’imagerie ajustés. La correction manuelle des contours automatiques est possible dans la fenêtre d’inspection, sauf pour les îlots manquants ou plusieurs îlots parasites. De plus, l’algorithme de séparation automatisée est basé sur la géométrie des contours et les statistiques de distribution de la taille des îlots, et peut donc différer de l’interprétation initiale d’un expert individuel tout en restant analytiquement acceptable.

La fiabilité d’IsletNet est principalement déterminée par la cohérence entre la qualité locale de l’image et le jeu de données d’entraînement, plutôt que par les espèces seules. Bien que l’ensemble d’entraînement actuel contienne des îlots humains de purités variées et des îlots de rats de haute pureté, la plateforme peut être étendue à d’autres espèces à condition que les caractéristiques de l’image restent cohérentes avec les données d’entraînement. Par exemple, les îlots porcins purifiés par culture peuvent ressembler à des îlots humains intégrés présents dans l’ensemble de données d’entraînement. En revanche, les îlots largement cultivés avec une faible coloration de dithizone n’étaient pas représentés lors de l’entraînement et pouvaient nécessiter un entraînement supplémentaire. L’outil Simple Comparison prend donc en charge une étape importante de validation pour les nouveaux utilisateurs ou les nouvelles configurations d’imagerie. Les résultats présentés ici soulignent comment différentes interprétations d’experts des îlots intégrés peuvent influencer la génération de GT et l’estimation du volume en aval. Pour pallier l’absence de consensus large d’experts dans les futures études multicentriques, l’application^{IsletSwipe 20} a été développée pour faciliter l’annotation d’images basée sur le consensus.

Comparé au comptage manuel conventionnel au microscope, IsletNet offre un débit nettement supérieur, une documentation numérique permanente et des résultats quantitatifs standardisés tout en réduisant la variabilité dépendante de l’opérateur. Le comptage manuel peut encore offrir une plus grande confiance dans l’identification des tissus dans les cas limites, mais il est limité par une estimation subjective de la taille, une réduction de l’échelle et des exigences de formation du personnel étendues. En tant que service web, IsletNet permet la comparabilité inter-laboratoires grâce à une analyse centralisée mais anonyme. La vitesse d’analyse reste dépendante de la bande passante internet locale, de la taille du fichier image et de la complexité de l’image. Les fichiers TIFF plus volumineux peuvent améliorer la fidélité de l’image mais nécessitent des temps de téléchargement et de téléversement plus longs comparés aux images JPEG compressées.

Dans l’ensemble, les résultats présentés ici démontrent qu’une quantification automatisée fiable peut être obtenue lorsque l’acquisition locale d’images reste reproductible et cohérente avec l’ensemble d’entraînement. Les utilisateurs sont encouragés à intégrer la vQC dans leur routine et à envisager une rééducation dès que des changements importants dans les conditions d’imagerie locale sont introduits.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
35 mm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481	Non stérile
200 µL pipette tips, wide-bore	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	Pour le dosage de la suspension d'îlots avant la coloration
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Grade GC ou grade culture cellulaire
Dithizone (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	Poudre
Ethanol, 70%	Fournisseur local	N/A	(v/v) en H2O; pour la préparation DTZ
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270106	Inactivé par la chaleur, qualifié
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Avec ou sans rouge phénol (spécifier selon l'essai)
Human albumin	Grifols	61953-0001-2	Solution à haute concentration (200 g/L)
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS, 3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	Logiciel standard d'acquisition d'image
Inverted microscope CKX41	Olympus	N/A	Objectifs 1,25x et 2x
LED-High-Power-Spots (2-arm)	Photonics	10068	Source lumineuse LED; guide à col de cygne double
Light source Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	Source lumineuse halogène (14,5 V, 90 W); contrôle manuel de l'intensité; guide à col de cygne double
Laboratory essentials	Various	N/A	Pipettes, tubes, aiguilles, seringues, minuteries de laboratoire, EPI standard
MicroCam software	Bresser	N/A	Logiciel standard d'acquisition d'image
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS, caméra 3,1 MP
Millex-MP filter unit	MilliporeSigma	SLMP025SS	Taille de pore de 0,22 µm, membrane en PES
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010023	pH 7,4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS, caméra 5 MP à haute gamme dynamique
QuickPHOTO	Promicra	N/A	Logiciel standard d'acquisition d'image
Sodium hydroxide (1 M NaOH)	Fournisseur local	N/A	Pour l'ajustement du pH et la solubilisation pendant la préparation DTZ
Stage micrometer	Thorlabs	R1L3S1P	Longueur de 10 mm; divisions de 50 µm pour l'étalonnage
Stereo microscope SZH10	Olympus	N/A	Objectif apochromatique 1x