Méthode colorimétrique Anthrone pour quantifier le glycogène dans le foie et le muscle squelettique de rat

Résumé

Ce protocole décrit une méthode colorimétrique anthrone pour quantifier le glycogène dans le foie et le muscle squelettique de rat à travers différents états métaboliques.

Résumé

Le glycogène est une réserve majeure de glucose intracellulaire dans le foie et le muscle squelettique et joue un rôle fondamental dans le métabolisme des glucides. Le glycogène hépatique est essentiel pour préserver l’homéostasie glycémique systémique, tandis que le glycogène musculaire squelettique soutient l’activité physique et la performance physique. La quantification précise du glycogène tissulaire est donc cruciale pour les études dans lesquelles le métabolisme du glycogène est régulé dynamiquement ou modifié pathologiquement. Ici, nous décrivons une méthode colorimétrique anthrone fiable et sensible pour quantifier la teneur en glycogène dans le foie et le muscle squelettique du rat. Le protocole comprend des étapes séquentielles, incluant la digestion alcaline, la déprotéinisation, la précipitation au glycogène, le lavage à l’alcool et le développement de la couleur à l’aide du réactif anthrone. L’applicabilité de cette méthode est démontrée chez des rats soumis à trois conditions physiologiquement pertinentes : l’alimentation ad libitum , le jeûne nocturne et la réalimentation à court terme. Ces paradigmes expérimentaux capturent des états métaboliques clés associés au stockage, à l’épuisement et à la resynthèse du glycogène. L’analyse par blot occidental orthogonal des enzymes clés, la glycogène synthase et la glycogène phosphorylase, fournit un soutien mécaniste aux changements métaboliques observés. L’applicabilité de cette méthode est également démontrée chez les animaux traités à l’épinéphrine pour modéliser la dégradation aiguë du glycogène induite par le stress. Collectivement, cette méthode offre une large plage dynamique et une sensibilité suffisante pour quantifier le glycogène tissulaire à travers des états physiologiques très différents. Il offre un outil fiable pour étudier le métabolisme du glycogène in vivo et peut également être appliqué à des modèles de culture cellulaire in vitro.

Introduction

Le glycogène est un polysaccharide très ramifié qui sert de réservoir d’énergie majeur dans les muscles squelettiques et le foie des mammifères, et dans une moindre mesure dans d’autres organes tels que le cerveau, les reins, le cœur et le tissu^{adipeux 1}. Pendant l’alimentation, le surplus de glucose subit une polymérisation ou une lipogenèse de novo , et est stocké sous forme de glycogène ou de lipides. Cependant, lors du jeûne ou de l’effort physique, le glycogène subit une dégradation enzymatique, assurant un apport constant et rapide en glucose pour répondre à ses besoins énergétiques. Cette capacité tampon du glycogène est essentielle pour maintenir l’homéostasie glycémique lors des cycles physiologiques de jeûne et de réalimentation².

La synthèse du glycogène est catalysée par la glycogène synthase (GYS), qui existe sous deux isoformes mammifères : GYS1 et GYS2. GYS1 est principalement exprimée dans le muscle squelettique, tandis que GYS2 est l’isoforme hépatique. L’activité catalytique de GYS est supprimée par phosphorylation à plusieurs sites, y compris Ser641, en conditions de jeûne, tandis que son activité est stimulée lors de la déphosphorylation en conditions d’alimentation. La dégradation du glycogène est catalysée par la glycophosphorylase. L’isoforme hépatique est PYGL, et l’isoforme musculaire est PYGM. Contrairement à GYS, leur activité catalytique est stimulée lors de la phosphorylation à Ser15 pendant le jeûne et est supprimée lors de la déphosphorylation après^{l’alimentation 3}.

Une régulation correcte du métabolisme du glycogène est fondamentale pour de nombreux processus biologiques, et un métabolisme dysrégulé du glycogène a été identifié comme un facteur causal dans de nombreuses maladies. Plus précisément, le métabolisme hépatique du glycogène modifié est associé à divers troubles métaboliques, notamment les maladies du stockage du^{glycogène 4}, le diabète^{de type 2 (type 5}), la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique^(6,7) et une réponse contre-régulatrice altérée à l’hypoglycémie⁽⁸). De plus, le glycogène cérébral est essentiel à la formation de la mémoire^{à long terme 9}, tandis que le glycogène musculaire squelettique est un régulateur clé de la capacité d’endurance¹⁰. Par conséquent, une quantification précise du glycogène tissulaire est essentielle pour les études dans lesquelles le métabolisme du glycogène est régulé dynamiquement ou modifié pathologiquement, permettant d’étudier les mécanismes de la maladie et d’évaluer les interventions modulant le glycogène.

Plusieurs méthodes de quantification du glycogène ont été rapportées, notamment la méthode^{Anthrone 11,12}, la méthode de l’amyloglucosidase¹³, la méthode de l’acide phénol-sulfurique¹⁴ et la méthode non invasive de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (^{MRS) 15}, chacune présentant certains avantages et limitations. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la méthode colorimétrique anthrone afin de quantifier le glycogène dans le foie et le muscle squelettique de rat (Figure 1). Ce protocole inclut des étapes séquentielles de digestion alcaline, de déprotéinisation, de précipitation au glycogène, de lavage à l’alcool et de développement de la couleur à l’aide d’un réactif anthrone. Cette méthode est simple, économique et nécessite un minimum d’instruments spécialisés. Pour démontrer sa sensibilité et sa reproductibilité, nous avons calculé la limite de détection (LOD), la limite de quantification (LOQ), ainsi que le coefficient de variation intra-essais et inter-essais (CV %), à l’aide d’une série d’étalons de glycogène. Pour démontrer son applicabilité, les niveaux de glycogène dans le foie et le muscle squelettique ont été évalués sous trois conditions physiologiquement pertinentes : l’alimentation ad libitum, le jeûne nocturne de 16 heures et la réalimentation à court terme. De plus, la méthode a été démontrée en utilisant des animaux traités à l’épinéphrine pour modéliser la dégradation aiguë du glycogène induite par le stress. Une analyse par blot occidental orthogonal des enzymes clés impliquées dans le métabolisme du glycogène a été réalisée pour corroborer les changements métaboliques observés.

Figure 1 : Aperçu du flux de travail de quantification du glycogène. Représentation schématique du flux de travail expérimental pour la quantification du glycogène dans le foie et le muscle squelettique. La procédure comprend la collecte de tissus, la digestion alcaline, la précipitation des protéines, l’isolation du glycogène et la détection colorimétrique par anthrone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Protocole

Tous les protocoles animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC ; #1905019) de l’Université médicale de Nankin.

1. Préparation des réactifs

1. Consultez le tableau des matériaux pour tous les réactifs utilisés dans cette étude.
2. Préparez toutes les solutions avant le début des expériences.
3. Ajustez les volumes de solutions selon les besoins.
4. Préparez une solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) de 1 M
   1. Pèse 40 g de granulés NaOH.
   2. Ajoutez les granulés de NaOH à 800 mL d’eau distillée.
   3. Remuez la solution avec une tige de verre jusqu’à ce qu’aucune particule non dissoute ne reste à la base du récipient.
   4. Transférez la solution dans une fiole volumétrique de 1 L.
   5. Réduisez le volume à exactement 1 L avec de l’eau distillée.
   6. Conservez la solution dans une bouteille bien fermée à température ambiante (RT ; 18°C–23°C).
      ATTENTION : NaOH est corrosif. Portez des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Les granulés NaOH commerciaux ne sont pas 100 % purs et absorbent l’eau. Évitez une exposition prolongée des granulés à l’air.
5. Préparez une solution de type stock à 20 % de chlorure de lithium (LiCl)
   1. Pèse 20 g de poudre LiCl anhydre.
   2. Ajoutez la poudre de LiCl à 80 mL d’eau distillée.
   3. Remuez la solution jusqu’à ce qu’aucune particule non dissoute ne reste à la base du vaisseau.
   4. Transférez la solution dans un flasque volumique de 100 mL.
   5. Réduisez le volume à exactement 100 mL avec de l’eau distillée.
   6. Stockez la solution dans une bouteille bien fermée chez RT.
      REMARQUE : Le LiCl peut irriter la peau, les yeux et les voies respiratoires. Portez des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Le LiCl est très hygroscopique. Minimisez l’exposition à l’air pour éviter l’absorption de l’eau.
6. Préparez la solution de réaction anthrone
   1. Placez 28 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 L.
   2. Ajoutez 72 mL d’acide sulfurique concentré à haute pureté (98 %) (H₂SO₄) à l’eau.
   3. Laissez le mélange refroidir en RT.
   4. Ajoutez 50 mg d’anthrone à la solution.
   5. Remuez jusqu’à ce que l’anthrone soit dissous.
   6. Ajoutez 3 g de thiourée à la solution.
   7. Remuez jusqu’à ce que la thiourée soit dissoute.
   8. Transférez la solution dans une bouteille en verre ambrée ou enveloppée de papier aluminium.
   9. Conservez la solution au réfrigérateur (2°C–8°C) pendant une semaine maximum.
      ATTENTION : L’acide sulfurique est hautement corrosif, provoque de graves brûlures chimiques et réagit violemment avec l’eau. Portez une blouse de laboratoire, des gants résistants aux produits chimiques et une visière. Effectuez toutes les étapes dans une hotte chimique certifiée. La dilution génère une chaleur intense. Ajoutez toujours de l’acide à l’eau.
7. Préparez de l’éthanol à 95 % contenant 0,1 % de LiCl
   1. Ajoutez 95 mL d’éthanol absolu dans une bouteille en verre.
   2. Ajoutez 4,5 mL d’eau distillée.
   3. Ajoutez 0,5 mL de solution de stock LiCl à 20 %.
   4. Mélangez soigneusement.
8. Préparez du méthanol à 80 % contenant 0,1 % de LiCl
   1. Ajoutez 80 mL de méthanol absolu dans une bouteille en verre.
   2. Ajoutez 19,5 mL d’eau distillée.
   3. Ajoutez 0,5 mL de solution de stock LiCl à 20 %.
   4. Mélangez soigneusement.
9. Préparez une solution d’acide trichloroacétique (TCA) à 100 % (p/v)
   1. Pèse 100 g de poudre TCA.
   2. Ajoutez la poudre de TCA à 80 mL d’eau distillée.
   3. Remuez jusqu’à ce que ce soit dissous.
   4. Transférez la solution dans un flasque volumique de 100 mL.
   5. Réduisez le volume à exactement 100 mL avec de l’eau distillée.
   6. Conservez la solution dans une bouteille en verre bien fermée à RT.
10. Préparez une solution saturée d’acide benzoïque
    1. Ajoutez 0,5 g de cristaux d’acide benzoïque à 100 mL d’eau distillée dans un bécher en verre de 250 mL.
    2. Chauffez le mélange à 90°C sur une plaque chauffante avec un brassage magnétique continu.
    3. Continuez à chauffer jusqu’à ce qu’il ne reste plus de particules non dissoutes à la base du récipient.
    4. Laissez la solution refroidir vers le RT.
    5. Aspirez le surnageant transparent qui est exempt de particules visibles.
    6. Conservez la solution dans une bouteille en verre hermétiquement fermée à RT.
11. Préparez des standards de glucose
    1. Dissoudre 50 mg de poudre de glucose dans une solution saturée d’acide benzoïque de 50 mL pour préparer une solution de bouillon de 1 mg/mL.
    2. Préparez des étalons de glucose (0, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 et 1 mg/mL) dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL par dilution en série avec de l’acide benzoïque saturé comme suit.
       1. Ajoutez 500 μL de solution de 1 mg/mL de stock au tube 1 pour préparer la norme de 1 mg/mL.
       2. Ajoutez 250 μL de solution d’origine et 250 μL d’acide benzoïque saturé dans le tube 2 pour préparer la norme de 0,5 mg/mL.
       3. Ajoutez 200 μL de solution pour le tube 2 et 300 μL d’acide benzoïque saturé dans le tube 3 pour préparer la norme de 0,2 mg/mL.
       4. Ajoutez 250 μL de solution du tube 3 et 250 μL d’acide benzoïque saturé dans le tube 4 pour préparer la norme de 0,1 mg/mL.
       5. Ajoutez 250 μL de solution du tube 4 et 250 μL d’acide benzoïque saturé dans le tube 5 pour préparer la norme de 0,05 mg/mL.
       6. Ajoutez 200 μL de solution de tube 5 et 300 μL d’acide benzoïque saturé dans le tube 6 pour préparer la norme de 0,02 mg/mL.
       7. Ajoutez 250 μL de solution de tube 6 et 250 μL d’acide benzoïque saturé dans le tube 7 pour préparer la norme de 0,01 mg/mL.
       8. Ajoutez 500 μL d’acide benzoïque saturé dans un tube séparé pour préparer le blanc (0 mg/mL).
    3. Bouchez chaque tube et utilisez un vortex brièvement pendant 10 secondes pour bien mélanger.

2. Traitement des animaux

1. Élevage général
   1. Mâles domestiques de Sprague–Dawley (230–270 g) dans une installation animale sous des conditions spécifiques sans pathogènes (état de santé VAF/Plus, Charles River Laboratories), certifiés exempts de pathogènes courants chez les rongeurs, notamment le virus Sendai, le Mycoplasma pulmonis et les parvovirus de rat.
   2. Adoptez un régime alimentaire standard et laissez libre accès à l’eau.
   3. Maintenez les animaux sur un cycle lumineux/sombre de 12 heures (lumières allumées à 8h00 et lumières éteintes à 20h00).
   4. Maintenez la température de rétention à 22°C–23°C.
   5. Maintenez une humidité relative entre 30 % et 70 %.
2. Jeûne nocturne
   1. Transférez les rats dans des cages de logement classiques.
   2. Retirez la nourriture et offrez un accès libre à l’eau.
   3. Maintenir le jeûne pendant 16 heures de 16h30 à 08h30 le lendemain matin.
3. Réalimentation
   1. Fournissez de la nourriture alimentaire régulière (200 g) aux rats à jeûne nocturne.
   2. Laissez les animaux se nourrir à volonté pendant 2 heures.
4. Défi de l’épinéphrine
   1. Préparez une solution d’épinéphrine chlorhydrate.
      1. Pèser 5 mg de poudre d’épinéphrine chlorhydrate à l’aide d’une balance analytique calibrée.
      2. Transférez la poudre dans un tube centrifugeuse de 15 mL et ajoutez 10 mL de solution saline.
      3. Bouchez le tube et inversez 10 fois pour préparer une solution de type stock à 0,5 mg/mL.
   2. Injecter par voie intrapéritonéale des rats non à jeun une solution d’épinéphrine chlorhydrate à un volume de 1 mL/kg de poids corporel (0,5 mg/kg de poids corporel)³.
      1. Maintenez l’animal en position tête baissée pour permettre au contenu abdominal de se déplacer crâniquement.
      2. Insérez une aiguille calibre 25 dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen à un angle de 45°.
      3. Aspirez pour confirmer l’absence de sang ou de contenu entérique avant l’injection.
   3. Injecter des animaux témoins par voie intrapéritonéale avec du sérum physiologique à un volume de 1 mL/kg.
   4. Prélève des échantillons de sang des veines de la queue.
      1. Tiens le rat pour exposer la queue.
      2. Compressez et réchauffez la queue pendant 10 secondes pour faciliter la circulation sanguine.
      3. Piquez la veine latérale de la queue à 3 cm de la pointe à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 25.
      4. Jetez la première goutte de sang à l’aide de gaze propre pour éviter la contamination du liquide tissulaire.
      5. Prélève la deuxième goutte de sang pour la mesure de la glycémie.
   5. Mesurez la glycémie à l’aide d’un glucomètre toutes les 15 minutes pendant 60 minutes.
      1. Calibrez le glucomètre selon les instructions du fabricant.
      2. Vérifiez la précision du glucomètre chaque mois à l’aide de solutions de contrôle.
      3. Conservez les bandelettes de test dans leur contenant d’origine pour éviter toute exposition à l’humidité.
      4. Utilisez des bandelettes de test immédiatement après le retrait du récipient.
      5. Insérez une bandelette de test dans le glucomètre pour activer automatiquement le glucomètre.
      6. Laissez l’échantillon de sang pénétrer dans la bande par action capillaire.
      7. Notez la valeur de glucose dans le sang affichée.

3. Prélèvement des tissus

1. Euthanasie et préparation
   1. Euthanasier les animaux par overdose d’isoflurane. Placez les animaux dans une chambre d’induction et exposez-les à 5 % d’isoflurane délivré à 100 % d’oxygène à 2 L/min pendant au moins 3 minutes.
   2. Vérifiez la mort en confirmant l’arrêt de la respiration.
   3. Confirmez la perte du réflexe cornéen et du pincement de l’orteil.
      1. Touchez doucement la cornée à l’aide d’un applicateur stérile à extrémité de coton pour confirmer l’absence de réponse de clignement.
      2. Appliquez une pression ferme sur la membrane entre les orteils d’une patte arrière à l’aide de pinces émoussées pour confirmer l’absence de réponse motrice.
   4. Placez le côté ventral du rat vers le haut sur un plateau de dissection.
   5. Humidifier la peau abdominale avec 75 % d’éthanol à l’aide d’un vaporisateur.
      REMARQUE : Minimisez le temps entre l’euthanasie et la préservation des tissus afin de diminuer la dégradation du glycogène causée par l’ischémie post-mortem.
2. Dissection hépatique
   1. Réalisez une petite incision dans la peau d’environ 1 cm de caudal par rapport au processus xiphoïde.
   2. Étendez l’incision vers le sternum.
   3. Séparez la peau du muscle sous-jacent.
   4. Réalisez une laparotomie transversale bilatérale en réalisant une incision horizontale de 4 cm d’environ 1 cm caudale jusqu’au processus xiphoïde, s’étendant latéralement vers les marges subcostales gauche et droite pour exposer entièrement la cavité abdominale.
   5. Identifiez le foie.
   6. Retirer le lobe médian droit (Figure 2A).
   7. Peser le tissu dans la minute qui vient.
   8. Placez le mouchoir dans un récipient en plastique en polypropylène.
   9. Congelez le tissu dans de la glace sèche.
3. Dissection du muscle squelettique
   1. Utilisez le muscle gastrocnémien comme spécimen représentatif car il contient une population mixte de fibres à contractions rapides et lentes qui reflètent les caractéristiques métaboliques et contractiles du membre^{postérieur 16}.
   2. Placez le rat sur le ventre.
   3. Effectuer une incision longitudinale cutanée le long de la face postérieure du membre postérieur, de la fosse poplitée à la tubérosité calcanée.
   4. Sépare la peau.
   5. Identifier et refléter les muscles biceps fémoris et semitendineux.
      1. Identifiez le biceps fémoral comme le grand muscle positionné latéralement couvrant la moitié supérieure de la cuisse postérieure.
      2. Identifier le semitendineux comme le muscle étroit en forme de sangle qui longe médialement la cuisse postérieure et s’insère près du genou.
   6. Exposez le muscle gastrocnémien.
   7. Tranchez le tendon d’Achille à son insertion distale sur le calcâne à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins.
   8. Sépare le muscle solère.
   9. Libérer l’attache proximale du muscle gastrocnémien au niveau des épicondyles médiaux et latéraux du fémur.
   10. Retirez tout le muscle gastrocnémien (Figure 2B).
   11. Peser le tissu dans la minute qui vient.
   12. Placez le mouchoir dans un récipient en plastique en polypropylène.
   13. Congelez le tissu dans de la glace sèche.

Figure 2 : Procédures de dissection tissulaire pour le foie et le muscle squelettique. (A) Étapes séquentielles pour exposer la cavité abdominale et prélever le tissu hépatique, incluant l’incision cutanée, l’extension de l’incision, la séparation de la peau du muscle sous-jacent et la laparotomie transversale. (B) Étapes séquentielles pour isoler le muscle gastrocnémien, incluant l’incision longitudinale, la réflexion des muscles supérieurs, l’identification des structures anatomiques et l’excision du muscle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Dosage colorimétrique du glycogène

1. Jour 1 : Digestion alcaline
   1. Ajoutez 0,4 g de tissu dans un tube centrifugeuse de 50 mL. Une tolérance de ± 0,1 g est autorisée pour assurer un traitement rapide et minimiser la dégradation tissulaire.
   2. Ajoutez 10 mL de solution de NaOH de 1 M au tube.
   3. Réduisez le tissu à l’aide de lames ou de ciseaux stériles jusqu’à ce que les fragments atteignent environ 1 à 2 mm de taille.
   4. Placez le tube dans un bain marié à 95°C ± 5°C.
   5. Incuber pendant 30 minutes.
   6. Faites un vortex sur l’échantillon à 2 500 tr/min pendant 10 secondes toutes les 10 minutes pendant l’incubation.
   7. Retirez le tube du bain-marie.
   8. Laissez l’échantillon refroidir en RT.
2. Préparation du lysat pour un test protéique
   1. Transférez 1 mL de lysat alcalin dans un tube de microcentrifuge à l’aide d’un pipette calibré P1000.
   2. Centrifugez à 8 000 × g pendant 10 minutes.
   3. Récupérez le surnageant.
   4. Réservez le surnageant pour le test sur la protéine BCA.
3. Déproténicalisation médiée par l’ACT
   1. Transférez 3 mL de lysat alcalin dans un tube centrifuge de 15 mL.
   2. Ajoutez 1 mL de solution TCA à 100 % (en v).
   3. Ajoutez 6 mL d’eau distillée pour porter le volume total à 10 mL.
   4. Faites un vortex du mélange à 2 500 tr/min pendant 10 secondes.
   5. Placez le tube sur de la glace (0°C–4°C).
   6. Incubez pendant 1 h pour précipiter les protéines.
4. Collection de surnageants déprotéinisés
   1. Transférez 1 mL du mélange dans un tube microcentrifuge.
   2. Centrifugez à 8 000 × g pendant 10 minutes en RT.
   3. Réservez le surnageant.
5. Précipitations au glycogène
   1. Transférez 0,4 mL de surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge.
   2. Ajoutez 0,8 mL d’éthanol à 95 % contenant 0,1 % de LiCl.
   3. Manipulez soigneusement le mélange.
   4. Incuber à la RT pendant 16 heures.
6. Jour 2 : Granulation au glycogène
   1. Centrifugez l’échantillon à 1 000 × g pendant 15 minutes à la RT pour obtenir une pellete blanche ferme et semi-translucide (figures 3A et 3B).
   2. Jetez le surnageant.
7. Premier lavage au glycogène
   1. Ajoutez 1,5 mL de méthanol à 80 % contenant 0,1 % de LiCl à la pellete.
   2. Faites un vortex de l’échantillon à 2 500 tr/min pendant 10 secondes.
8. Centrifugation après lavage
   1. Centrifugeuse à 1 000 × g pendant 5 minutes en temps rétractionnel.
   2. Jetez le surnageant.
9. Deuxième lavage au glycogène
   1. Répétez l’étape de lavage une fois.
   2. Éliminez tout liquide résiduel en aspirant soigneusement à l’aide d’une pipettrice P200 à pointe fine pour que la pellete de glycogène reste intacte.
10. Dissolution du glycogène
    1. Ajoutez 0,8 mL d’eau distillée au pellet.
    2. Vortex à 2 500 tr/min jusqu’à obtenir une solution claire et homogène sans particules visibles.
11. Préparation des standards et des échantillons
    1. Préparez des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL pour les standards de glucose, les échantillons vierges et inconnus en triple exemplaire.
       REMARQUE : Ajoutez des réactifs à chaque tube selon le tableau 1.
    2. Ajoutez 50 μL de chaque standard de glucose dans les tubes désignés.
    3. Ajoutez 50 μL d’eau distillée dans le tube blanc.
    4. Ajoutez un échantillon de glycogène de 50 μL à chaque tube d’échantillon inconnu.
    5. Ajoutez 200 μL de solution de réaction anthrone à chaque tube.
12. Développement de la couleur Anthrone et mesure de l’absorbance
    1. Faites un vortex complet sur tous les tubes.
    2. Placez les tubes dans un bain-marie à 95°C ± 5°C.
    3. Incubez pendant 15 minutes.
    4. Retirez les tubes et laissez-les refroidir en RT.
    5. Transférez 200 μL de chaque tube vers une plaque à 96 puits.
    6. Mesurez l’absorbance à 620 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (mode terminal, 25°C) avec correction automatique de la longueur de chemin jusqu’à 1 cm.
    7. La courbe standard doit avoir un coefficient de détermination (R²) de ≥0,995, tel que déterminé par la régression linéaire, pour être considérée comme acceptable.
    8. Tout standard ou échantillon individuel reproduit avec un taux de CV de >20 % parmi les mesures tripliquées doit être considéré comme peu fiable et rejoué.

Figure 3 : Isolation et quantification du glycogène sous différents états nutritionnels. (A) Image représentative des granules de glycogène précipité à partir d’échantillons de foie dans des conditions d’alimentation, à jeun et de refed. (B) Image représentative des granules de glycogène précipité à partir d’échantillons de muscles squelettiques dans des conditions nourries, à jeun et en réfétation. (C) Courbe standard générée à partir d’étalons de glucose montrant la relation linéaire entre l’absorbance à 620 nm et la concentration de glucose. (D) Taux de glucose sanguin sous conditions nourries, à jeun et en état de refétation. (E) Teneur en glycogène hépatique en conditions d’alimentation, à jeun et de refed. (F) Teneur en glycogène musculaire squelettique dans des conditions nourries, à jeun et en état de refétation. Les données sont présentées en moyenne ± SEM (n = 6 par groupe). L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’une analyse classique unidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec des comparaisons multiples corrigées par la méthode de Benjamini–Hochberg. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns : non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Réactifs	0 mg/mL	0,01 mg/mL	0,02 mg/mL	0,05 mg/mL	0,1 mg/mL	0,2 mg/mL	0,5 mg/mL	1 mg/mL	Blank	Échantillon inconnu
Solution standard du glucose	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	–	–
Eau distillée (H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL	–
Échantillon de glycogène	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL
Solution de réaction d’Anthrone	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL

Tableau 1 : Configuration de la réaction pour le test colorimétrique au glycogène. Configuration de la réaction pour les standards de glucose, les échantillons blancs et inconnus de glycogène utilisés dans le test colorimétrique d’Anthrone. Des volumes définis d’étalons de glucose, d’eau distillée ou d’échantillons de glycogène ont été combinés avec une solution de réaction anthrone avant l’incubation et la mesure de l’absorbance.

5. Calcul de la teneur en glycogène tissulaire

REMARQUE : Normaliser le glycogène mesuré en poids humide des tissus ou en masse protéique totale.

1. Détermination de la courbe standard et de la concentration
   1. Utilisez les relevés d’absorption des huit tubes standards de glucose.
   2. Soustrayez les valeurs vierges des lectures d’absorbance avant de les tracer par rapport aux concentrations de glucose.
   3. Ajustez une courbe de régression linéaire en utilisant la régression des moindres carrés ordinaires dans Excel (Figure 3C).
   4. Calculez la concentration de glucose dans chaque échantillon de glycogène inconnu (C_inconnue) en interpolant son absorbance soustraite à blanc sur la courbe linéaire standard à l’aide de l’équation de régression obtenue à l’étape 5.1.3.
2. Normalisation au poids humide des tissus
   1. Calculez la teneur en glycogène à l’aide de l’équation suivante :
      
   2. Définissez C_inconnu comme la concentration de glucose (mg/mL) dans l’échantillon de glycogène inconnu déterminée à l’étape 5.1.4.
   3. Définissez 0,8 comme le volume de l’échantillon de glycogène dissous (mL) à l’étape 4.10.1.
   4. Définissez 0,9 comme le facteur utilisé pour convertir la valeur du glucose en valeur de glycogène.
   5. Définissez 2,5 comme le facteur de dilution introduit lors de la précipitation au glycogène à l’étape 4.5.
   6. Définissez 10 comme le facteur de dilution tenant compte de l’aliquote de 1 mL analysée à partir du mélange total de 10 mL préparé à l’étape 4.3.3.
   7. Définissez 10/3 comme le facteur de dilution tenant compte des 3 mL d’aliquote utilisés sur les 10 mL de digestion alcaline préparée à l’étape 4.1.2.
3. Normalisation à la masse totale des protéines
   1. Calculez la teneur en glycogène à l’aide de l’équation suivante :
      
   2. Définissez C_inconnu comme la concentration de glucose (mg/mL) dans l’échantillon de glycogène inconnu déterminée à l’étape 5.1.4.
   3. Définissez 0,8 comme le volume de l’échantillon de glycogène dissous (mL) à l’étape 4.10.1.
   4. Définissez 0,9 comme le facteur utilisé pour convertir la valeur du glucose en valeur de glycogène.
   5. Définissez 2,5 comme le facteur de dilution introduit lors de la précipitation au glycogène à l’étape 4.5.
   6. Définissez 10 comme le facteur de dilution tenant compte de l’aliquote de 1 mL analysée à partir du mélange total de 10 mL préparé à l’étape 4.3.3.
   7. Définissez 1/3 comme facteur de correction tenant compte des 3 mL d’aliquote utilisés à partir de la digestion alcaline à l’étape 4.3.1.
   8. Définissez la concentration de protéines comme la concentration totale de protéines (mg/mL) dans la digestion alcaline déterminée par le test BCA à l’étape 4.2.4.

6. Western Blot des enzymes clés catalysant le métabolisme du glycogène

1. Considérations générales
   1. Voir les protocoles précédemment décrits pour les procédures standard du western^{blot 17,18}.
2. Extraction des protéines
   1. Pèse 75 mg de tissu congelé instantanément. Une tolérance de ± 25 mg est autorisée pour assurer un traitement rapide et minimiser le dégel des tissus.
   2. Ajouter 1 mL de tampon de lyse RIPA glacé (50 mM Tris-HCl, pH 7,4 ; 150 mM NaCl ; 1 % Triton X-100 ; 0,5 % de désoxycholate de sodium ; 0,1 % SDS ; et 1 mM d’EDTA) complété avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase.
   3. Homogénéisez le tissu à l’aide d’un homogénéiseur rotor-stator portatifs.
3. Préparation du lysat
   1. Incubez les homogénés sur glace pendant 30 minutes.
   2. Faites un vortex sur les échantillons à 2 500 tr/min pendant 10 secondes toutes les 10 minutes pendant l’incubation.
   3. Centrifugez à 10 000 × g en utilisant un rotor à angle fixe pendant 5 minutes à 4°C.
4. Quantification des protéines
   1. Collectez le surnageant sous forme de lysat protéique total.
   2. Effectuer un test BCA pour déterminer la concentration en protéines.
   3. Préparez les normes BSA de 0, 0,025, 0,125, 0,25, 0,5, 0,75 et 1 mg/mL diluées dans un tampon de lyse RIPA.
   4. Dans une microplaque à 96 puits, chargez 20 μL de chaque échantillon standard ou inconnu dans des puits individuels.
   5. Ajoutez 200 μL de réactif de travail BCA (préparé en mélangeant 50 parties de réactif A avec 1 partie de réactif B) dans chaque puits.
   6. Incubez la plaque de réaction à 37°C pendant 30 minutes.
   7. Après refroidissement à RT (18°C–23°C), mesurez l’absorbance à 562 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (mode terminal, 25°C) avec correction automatique de la longueur de chemin à 1 cm.
5. SDS-PAGE
   1. Mélangez 15 μg de protéines avec le tampon de chargement SDS-PAGE.
   2. Chauffez les échantillons à 95°C pendant 5 minutes.
   3. Refroidissez les échantillons sur de la glace.
   4. Chargez les échantillons sur un gel SDS-PAGE à 10 %.
   5. Résoudre les protéines par électrophorèse dans un tampon courant (25 mM de Tris, 192 mM de glycine et 0,1 % de SDS).
   6. Faites tourner le gel à 100 V constants jusqu’à ce que le front de colorant bleu bromophénol atteigne le fond du gel.
6. Transfert et blocage des protéines
   1. Transférer les protéines vers une membrane de nitrocellulose ou PVDF.
   2. Pour les membranes de nitrocellulose, équilibrez la membrane dans un tampon de transfert (25 mM Tris, 192 mM de glycine, 20 % de méthanol, pH 8,3) pendant 10 minutes.
   3. Pour les membranes PVDF, activez la membrane par immersion dans 100 % de méthanol pendant 30 secondes, puis équilibrez dans le tampon de transfert pendant 10 minutes.
   4. Assemblez le sandwich de transfert dans l’ordre suivant : éponge, papier filtre, gel, membrane, papier filtrant, éponge.
   5. Effectuez un transfert de protéines à un courant constant de 200 mA pendant 90 minutes à 4°C.
   6. Préparez 3 % (p/v) de BSA en TBST (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 ; 150 mM de NaCl ; et 0,1 % Tween-20).
   7. Bloquez la membrane à RT pendant 1 heure avec un balancement constant.
      REMARQUE : Utilisez des BSA au lieu du lait écrémé lors de la détection de protéines phosphorylées.
7. Incubation primaire des anticorps
   1. Préparez une solution primaire d’anticorps dans un tampon de blocage à une dilution de 1:1 000.
   2. Incubez la membrane avec un anticorps primaire à 4°C pendant la nuit avec un balancement constant.
8. Lavage
   1. Lavez la membrane avec TBST.
   2. Répétez le lavage trois fois pendant 10 minutes chacun.
9. Incubation secondaire des anticorps
   1. Préparez un anticorps secondaire conjugué à HRP dans un tampon bloquant à une dilution de 1:10 000.
   2. Incubez la membrane à la RT pendant 1 heure avec un balancement constant.
10. Lavage
    1. Lavez la membrane avec TBST.
    2. Répétez le lavage trois fois pendant 10 minutes chacun.
11. Détection chimiluminescente
    1. Préparez le substrat chimiluminescent en mélangeant des volumes égaux de luminol/améliorant et de solutions de peroxyde stables.
    2. Appliquez le substrat à un volume de 0,1 mL/cm de surface de^{membrane 2} et incubez pendant 2 minutes à la RT sur un vibrateur orbital (100 tr/min).
    3. Capturez les signaux à l’aide d’un imageur chimiluminescent.
    4. Tester les temps d’exposition allant de 10 à 300 s et sélectionner une exposition dans la plage de détection linéaire pour chaque blot.
    5. Vérifiez la linéarité du signal en confirmant l’absence de saturation des pixels à l’aide du logiciel intégré à l’instrument.
12. Analyse d’images
    1. Analysez l’intensité des bandes à l’aide du logiciel ImageJ (version 1.51, NIH).
    2. Convertir les images en niveaux de gris de 8 bits et appliquer une soustraction de fond à boule roulante avec un rayon de 50 pixels.
    3. Définissez chaque bande à l’aide d’une région rectangulaire d’intérêt de dimensions identiques et soustrayez le fond local d’une zone vierge adjacente pour obtenir des valeurs brutes de densité intégrées.
13. Coloration totale des protéines
    1. Incubez la membrane dans une solution d’encre d’Inde à 0,1 % dans TBST à RT pendant 1 heure avec un balancement constant.
    2. Lavez la membrane trois fois pendant 10 minutes chacune avec TBST.
    3. Quantifier plusieurs bandes colorées comme témoins de charge pour normaliser les signaux d’immunoblotting.
       REMARQUE : Utilisez la coloration totale des protéines au lieu des gènes de ménage (HKG), car l’expression des HKG peut varier selon les conditions^{expérimentales 19}.

7. Sensibilité et reproductibilité de la méthode

1. Préparation des standards de glycogène
   1. Préparez une solution de bouillon de 20 mg/mL de glycogène dans 1 M de NaOH.
   2. Préparez une série d’étalons de glycogène (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 et 1 mg/mL) dans des tubes centrifugeuses de 15 mL par dilution progressive avec 1 M de NaOH comme décrit ci-dessous.
      1. Préparez le tube 1 (1 mg/mL) en mélangeant une solution de stock de glycogène de 500 μL avec 9,5 mL de 1 M de NaOH.
      2. Préparez le tube 2 (0,5 mg/mL) en mélangeant une solution de stock de glycogène de 250 μL avec 9,75 mL de 1 M de NaOH.
      3. Préparez le tube 3 (0,2 mg/mL) en mélangeant une solution de stock de glycogène de 100 μL avec 9,9 mL de 1 M NaOH.
      4. Préparez le tube 4 (0,1 mg/mL) en mélangeant une solution de stock de glycogène de 50 μL avec 9,95 mL de 1 M de NaOH.
      5. Préparez le tube 5 (0,05 mg/mL) en mélangeant une solution de 25 μL de stock de glycogène avec 9,975 mL de 1 M NaOH.
      6. Préparez le tube 6 (0,02 mg/mL) en mélangeant une solution de stock de glycogène de 10 μL avec 9,99 mL de 1 M de NaOH.
      7. Préparez le tube 7 (0,01 mg/mL) en mélangeant 100 μL de solution du tube 1 avec 9,9 mL de 1 M NaOH.
      8. Préparez le tube 8 (0,005 mg/mL) en mélangeant 50 μL de solution du tube 1 avec 9,95 mL de 1 M NaOH.
      9. Préparez le blank (0 mg/mL) en ajoutant 10 mL de 1 M NaOH à un tube centrifugeuse de 15 mL.
   3. Bouchez chaque tube et chaque vortex à 2 500 tr/min pendant 10 secondes pour mélanger.
2. Essai colorimétrique anthronique
   1. Extraire le glycogène et effectuer le test colorimétrique anthrone selon les étapes 4.1.4–4.12.6.
   2. Enregistrer les relevés d’absorbance à 620 nm (A₆₂₀).
3. Calcul de la concentration en glycogène
   1. Générez la courbe standard du glucose et calculez la concentration de glucose dans chaque échantillon standard (_standard C) comme spécifié à l’étape 5.1.
   2. Calculez la concentration de glycogène dans chaque tube standard à l’aide de l’équation suivante :
      
   3. Définissez_{la norme} C comme la concentration de glucose (mg/mL) déterminée dans chaque échantillon standard.
   4. Définissez 0,8 comme le volume de l’échantillon de glycogène (mL).
   5. Définissez 0,9 comme facteur de conversion de la valeur du glucose en valeur de glycogène.
   6. Définissez 2,5 comme facteur de dilution.
   7. Définissez 10 comme le facteur de dilution tenant compte de l’aliquote de 1 mL analysée à partir du mélange total de 10 mL préparé à l’étape 4.3.3.
   8. Définissez 1/3 comme facteur de correction tenant compte des 3 mL d’aliquote utilisés à partir de la digestion alcaline à l’étape 4.3.1.
   9. Répétez la procédure complète trois fois supplémentaires en une journée, pour un total de quatre passages.
   10. Répétez les quatre courses sur quatre jours, pour un total de 16 essais.
4. Calcul du LOD et du LOQ
   1. Tracez les 16 lectures d’absorbance sur l’axe y par rapport à chaque concentration standard de glycogène sur l’axe x.
   2. Calculez la courbe de régression linéaire et R². Une régression linéaire avec^{R 2} de ≥0,995 est considérée comme acceptable.
   3. Calculez le LOD et le LOQ à l’aide des équations suivantes :
      
      
   4. Définissons σ comme l’erreur standard de la réponse (y-intercept).
   5. Définissons S comme la pente de la courbe de régression linéaire.
5. Calcul du CV % intra-essais et inter-essais
   1. Pour chaque standard de glycogène, calculez le pourcentage de CV intra-test des valeurs calculées des quatre essais du premier jour à l’aide de l’équation suivante :
      
   2. Définissons s₁ comme l’écart-type des valeurs par rapport aux quatre courses du jour 1.
   3. Définissons comme la valeur moyenne des quatre courses du premier jour.
   4. Répétez ce calcul pour les jours 2, jour 3 et jour 4 pour obtenir CV₂,_{CV 3} et_{CV 4}.
   5. Calculez le pourcentage final de CV intra-test à l’aide de l’équation suivante :
      
   6. Calculez le pourcentage de CV inter-essais à l’aide de l’équation suivante :
      
   7. Définissons s_inter comme l’écart-type de CV₁, CV₂,_{CV 3} et CV₄.
   8. Définissons comme la valeur moyenne de CV₁, CV₂,_{CV 3} et_{CV 4}.

Résultats

Niveaux de glycogène des muscles hépatiques et squelettiques selon différents états nutritionnels

Le jeûne nocturne a significativement réduit les niveaux de glucose sanguin (moyenne ± erreur standard de la moyenne [MEB]) passant de 7,9 ± 0,4 mM chez les rats nourris ad libitum à 5,4 ± 0,3 mM. Les niveaux de glucose sanguin ont été rétablis à 8,3 ± 0,1 mM après 2 heures de refeeding (Figure 3D). Conformément à ces changements, les niveaux...

Discussion

Dans cet article, nous décrivons une méthode colorimétrique anthrone modifiée pour quantifier le glycogène dans les tissus animaux. En plus des étapes séquentielles conventionnelles de prélèvement des tissus, de digestion alcaline, de précipitation au glycogène, de lavage à l’alcool et de développement de la couleur par anthrone, nous avons intégré une étape de dédéprotéinisation pour réduire les interférences de fond (Figure 1). Nous avons ensuite appliqué ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1.5 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-15-M	Utilisé pour le traitement des échantillons et la configuration des réactions
15 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-150-M-S	Utilisé pour la manipulation des lysats et les étapes de précipitation
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Tampon pour le lavage des membranes en western blot
37 oC Incubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	Incubation de la plaque d'essai BCA
50 mL centrifuge tubes	LABGIC	CT-112-50A	Utilisé pour la digestion des tissus et l'extraction
96-well plate	LABGIC	BS-MP-96W-CL	Mesure d'absorbance basée sur la plaque
Analytical balance	Changzhou Xingyun	FA2204N	Peser les poudres chimiques
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	Réactif pour la détection colorimétrique du glycogène
Anti-GYS1 antibody	Proteintech	10566-1-AP	Détection de la glycogène synthase 1
Anti-GYS2 antibody	Proteintech	22371-1-AP	Détection de la glycogène synthase 2
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641) antibody	Cell Signaling Technology	47043S	Détection de la GYS phosphorylée
Anti-phospho-PYGL (Ser15) antibody	Abcam	ab227043	Détection de la glycogène phosphorylase phosphorylée
Anti-PYGL antibody	Proteintech	15851-1-AP	Détection de la glycogène phosphorylase du foie
Anti-PYGM antibody	Novus Biologicals	NBP2-16689	Détection de la glycogène phosphorylase du muscle
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Quantification des protéines
Benzoic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	Préparation de la solution saturée pour les standards
Blunt forcepts	Shanghai Jinzhong	J42010	Pincement des orteils ; dissection des tissus
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	Agent de blocage en western blot
Chemiluminescent imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	Détection des signaux western blot
Chemiluminescent substrate (ECL)	Beyotime	P0018S	Développement du signal en western blot
Distilled water	Beyotime	ST872	Solvant pour la préparation des réactifs
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642	Induction de la dégradation du glycogène in vivo
Ethanol	Macklin	E809065	Précipitation et lavage du glycogène
Fine surgical scissors	Shanghai Jinzhong	JA2601	Dissection des tissus
Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Centrifugation des échantillons
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Mesure de la glycémie
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Mesure du taux de glucose dans la veine caudale
Glucometer strips	i-SENS	CareSens N Strips	Mesure du taux de glucose dans la veine caudale
Glucose	Macklin	G6172	Préparation de la courbe standard
Glycogen stock	Beyotime	D0812	Préparation d'une série de standards de glycogène
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31462	Détection des anticorps primaires
Handheld homogenizer	GreenPrima	PB100	Homogénéisation des tissus
India ink	Sigma-Aldrich	198285	Coloration des protéines totales pour la normalisation
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	Euthanasie animale
Laboratory heating block	Changzhou Guowang	GWJ300-1	Chauffage des échantillons pendant les essais
Lithium chloride	Macklin	767397	Améliore la précipitation du glycogène
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	Étape de lavage du glycogène
Microplate reader	BioTek	ELx800	Mesure de l'absorbance à 620 nm
Nitrocellulose membrane	Millipore	HATF04700	Membrane de transfert des protéines
Orbital shaker	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	Incubation du substrat chimiluminescent
P1000 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641100N	Transfert de solution
P200 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641080N	Élimination des liquides résiduels
Phosphatase inhibitors (PhosSTOP)	Roche	4906845001	Préservation de la phosphorylation des protéines
Plastic containers (for tissue storage)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	Stockage des tissus récoltés
Protease inhibitors cocktail	MCE	HY-K0011	Prévention de la dégradation des protéines
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013B	Extraction des protéines
SDS-PAGE gel kit	Beyotime	P0012A	Séparation des protéines
SDS-PAGE loading buffer (6X)	Beyotime	P0015F	Mélange avec les échantillons protéiques avant le chargement dans les puits de gel SDS-PAGE
SDS-PAGE running buffer (5x)	Beyotime	P0014D	Électrophorèse SDS-PAGE
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500	Euthanasie animale
Sodium hydroxide	Macklin	S817977	Digestion des tissus et extraction du glycogène
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Crl: CD(SD)	Modèle animal expérimental
Spray bottle	Beyotime	TB6310	Application de l'éthanol à 75% sur le pelage des animaux pour l'humidification et la désinfection
Standard chow diet	Jiangsu-Xietong, Inc.	XTI01ZJ-009	Alimentation d'entretien des rongeurs
Surgical scissors	Shanghai Jinzhong	J22010	Dissection des tissus
Syringe (sterile) with 25-gauge needle	Beyotime	FS801	Injection intrapéritonéale