Modèles tumoraux transplantables cliniquement pertinents pour l’étude du cancer métastatique de l’ovaire et de la réponse thérapeutique chez la souris

Résumé

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour établir les modèles de tumeurs intrapéritonéales et intrabursales afin d’étudier la progression, la métasatisation et la réponse thérapeutique du cancer de l’ovaire. De plus, nous décrivons comment utiliser l’imagerie in vivo non invasive à base de luciférase dans ces modèles pour surveiller la progression tumorale chez la souris.

Résumé

Le cancer de l’ovaire métastatique est une malignité gynécologique extrêmement mortelle qui manque d’options de traitement efficaces. Le développement d’approches thérapeutiques cliniquement transférables pour les patients atteints de cancer de l’ovaire dépend de la compréhension des facteurs qui favorisent la métastase du cancer de l’ovaire. Alors que la plupart des tumeurs solides présentent des métastases hématogènes, les cellules cancéreuses de l’ovaire se propagent principalement par la voie intrapéritonéale. Ce processus implique le décollement et la libération des cellules cancéreuses de la tumeur primaire vers la cavité péritonéale, qui acquièrent alors des propriétés leur permettant de résister à l’anoikis et de former des agrégats multicellulaires. Ces agrégats cellulaires s’attachent ensuite à la muqueuse mésothéliale du péritoine et la envahissent, formant des lésions métastatiques. Les modèles in vivo cliniquement pertinents sont essentiels pour comprendre comment les facteurs cellulaires et le microenvironnement tumoral influencent les différentes étapes du processus métastatique et pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Deux modèles de tumeurs de souris transplantables largement utilisés pour étudier la métastase du cancer de l’ovaire et la réponse thérapeutique sont les modèles intrapéritonéal et intrabursaire. Dans ce rapport, nous décrivons étape par étape la méthodologie pour établir ces modèles et mettons en lumière leurs avantages et leurs limites. De plus, nous expliquons comment utiliser l’imagerie bioluminescente pour surveiller de manière non invasive la progression tumorale à l’aide de ces modèles.

Introduction

Malgré des progrès significatifs dans notre compréhension des facteurs qui favorisent la progression du cancer de l’ovaire, le cancer de l’ovaire reste la deuxième malignité gynécologique la plus mortelle aux^{États-Unis 1}. En raison de l’absence de symptômes évidents et de l’absence de marqueurs diagnostiques précoces fiables, plus de 70 % des patients atteints de cancer de l’ovaire présentent une maladie métastatique avancée au diagnostic ^2,3. Les traitements actuels ne sont pas efficaces pour traiter le cancer de l’ovaire métastatique et, par conséquent, les taux de survie à 5 ans pour les patients atteints de maladie à un stade avancé restent inférieurs à^{30 % 4.} Une cause majeure du manque de succès thérapeutique est l’apparition de la chimiorésistance⁵. Il est donc urgent d’identifier les facteurs qui favorisent la métastase du cancer de l’ovaire et la chimiorésistance. Combler cette lacune de connaissances sera essentiel pour développer des stratégies thérapeutiques plus efficaces visant cette maladie. Pour atteindre ces objectifs, nous avons besoin de modèles in vivo qui imitent fidèlement les étapes clés de la progression du cancer de l’ovaire.

Bien que les lignées cellulaires du cancer de l’ovaire et les modèles in vitro tridimensionnels aient grandement contribué à notre compréhension des facteurs influençant la métastase et la réponse thérapeutique, ces modèles présentent plusieurs limites ^6,7,8. Par exemple, ces modèles ne prennent pas en compte les différentes cellules non cancéreuses qui font partie du microenvironnement tumoral, ni ne capturent les interactions complexes qui se produisent dans le microenvironnement ^{tumoral 6,7,8}. De plus, il est extrêmement difficile d’étudier les facteurs systémiques et leur impact sur la progression tumorale et la réponse aux médicaments en utilisant les modèles in^{vitro 6,7,8}. Ces limites des modèles in vitro soulignent la nécessité de modèles in vivo qui imitent fidèlement les différentes étapes de la métastase du cancer de l’ovaire, incluant des interactions complexes avec d’autres types cellulaires et facteurs dans son microenvironnement.

Les modèles murins génétiquement modifiés (GEMM) offrent une plateforme in vivo où les tumeurs apparaissent spontanément dans un microenvironnement naturel avec un système immunitaire intact⁹. Cependant, ils sont longs, exigeants et coûteux à produire et à^{entretenir 10}. La plupart des GEMMs du cancer de l’ovaire ont également une longue latence pour le développement tumoral, ce qui rend le travail long et coûteux, même après leur production^{de 10} ans. Les modèles transplantables, tels que les modèles xénogreffe et allogreffe, offrent un bon équilibre entre pertinence biologique et facilité expérimentale, et sont souvent beaucoup moins coûteux à produire que les^{GEMMs 11}. En plus d’avoir une latence inférieure à celle des GEMM, la facilité avec laquelle les cellules tumorales peuvent être génétiquement modifiées in vitro rend ces modèles pratiques et adaptés pour étudier comment différents facteurs génétiques influencent la progression^{tumorale 10}. Grâce à ces avantages, les modèles de tumeurs transplantables se sont imposés comme des outils précieux tant pour la recherche fondamentale que pour la recherche translationnelle dans le cancer de l’ovaire.

Dans ce rapport, nous décrivons le protocole pour établir deux modèles différents de tumeurs de souris transplantables largement utilisés pour étudier le cancer de l’ovaire métastatique : (1) le modèle intrapéritonéal et (2) le modèle orthotopique ou intrabursaire. Les deux modèles peuvent être établis comme des modèles de xénogreffe ou d’allogreffe. Dans le modèle intrapéritonéal, les cellules cancéreuses sont injectées dans la cavité péritonéale des souris. L’introduction des cellules du cancer de l’ovaire dans l’espace intrapéritonéal reflète le stade de la métastase du cancer de l’ovaire où les cellules métastatiques du cancer de l’ovaire sont libérées de la tumeur primaire vers la cavité péritonéale. À l’instar du processus métastatique chez l’humain, ces cellules cancéreuses de l’ovaire transplantées devront s’adapter au microenvironnement péritonéal hostile, s’attacher et envahir la couche mésothéliale qui tapisse la cavité péritonéale, et former des lésions métastatiques sur les organes et tissus intrapéritonéaux tels que l’omentum, le mésentère, le foie et le diaphragme. Selon la lignée cellulaire cancéreuse utilisée pour générer le modèle intrapéritonéal, les tumeurs métastatiques peuvent être accompagnées d’ascite, comme on l’observe dans les maladies à stade avancé chez l’humain. Ainsi, le modèle intrapéritonéal a été largement utilisé pour comprendre les facteurs qui entraînent la métastase du cancer de l’ovaire et leur progression vers la maladie à un stade^{avancé 12}. Ces modèles sont également utiles pour déterminer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le cancer de l’ovaire^{métastatique 12}. Dans le modèle intrabursal ou orthotopique, les cellules cancéreuses sont implantées dans la bourse, une structure membraneuse qui entoure l’ovaire de la souris. Ce modèle imite les premiers stades de la tumorigenèse et des métastases ovariennes. À ce stade, les cellules cancéreuses sont encore confinées à la trompe de Fallope et à l’ovaire. C’est à partir de ces sites que les cellules cancéreuses sont libérées dans la cavité péritonéale, pour finalement métastaser vers d’autres organes. Par conséquent, le modèle intraboursal est utile pour étudier à la fois les premiers stades de la tumorigenèse ovarienne ainsi que les événements conduisant à leur métastase transcoélomique ultérieure à travers la cavité^{péritonéale 12}.

Ainsi, bien que les modèles intrapéritonéal et intrabursal soient d’excellents outils pour étudier la métastase du cancer de l’ovaire et la réponse thérapeutique, ils diffèrent par le stade spécifique du processus métastatique qu’ils imitent. Bien que les modèles intrabursaux puissent imiter la progression du cancer de l’ovaire des stades précoces aux stades avancés du processus métastastique, en raison de la latence associée à ce processus, ils sont généralement utilisés pour étudier les événements précoces dans la métastase du cancer de l’ovaire. Pour les études portant sur les stades avancés de la métastase du cancer de l’ovaire, le modèle intrapéritonéal est plus adapté. De plus, le modèle intrabursal est également techniquement plus difficile à établir que le modèle^{intrapéritonéal 12}. La mise en place du modèle intrabursal nécessite l’accès à une salle d’opération équipée d’équipements microchirurgicaux permettant une injection précise de cellules cancéreuses dans la bourse ovarienne. La capacité des cellules cancéreuses à établir des tumeurs (« taux de prise » ou « taux d’engretiam ») est également généralement plus faible dans les modèles intrabursaux que dans les modèles intrapéritonéaux. De plus, comme les tumeurs ne peuvent pas être facilement observées après des injections orthotopiques ou intrapéritonéales, une technique d’imagerie bioluminescente non invasive est généralement employée pour surveiller la progression tumorale. Par conséquent, les modèles intrapéritonéaux et intrabursaux nécessitent un équipement supplémentaire permettant l’imagerie non invasive des^{tumeurs 12}. En fin de compte, les objectifs expérimentaux, la disponibilité des ressources et les compétences techniques détermineront le choix du modèle pour chaque étude.

Ce rapport décrit le protocole étape par étape pour établir des modèles de xénogreffes de souris intraperitonéales et intrabursales à partir de lignées cellulaires de cancer de l’ovaire humain. Ces modèles peuvent être établis en transplantant les cellules dans des souches de souris immunodéprimées telles que NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) ou la Foxn1 nude (B6. Cg-Foxn1 nu/J). La même méthode peut être adaptée pour générer des modèles d’allogreffe (syngénique). Lors de l’établissement de modèles d’allogreffes, des cellules cancéreuses de l’ovaire de souris sont implantées dans des souris immunocompétentes ayant le même bagage génétique. Comme les modèles d’allogreffes sont développés à partir de souris immunocompétentes, ils sont utiles pour étudier comment différents facteurs régulent le microenvironnement tumoral ovarien, le rôle du système immunitaire dans la progression du cancer ovarien, et l’efficacité de l’immunothérapie. En plus d’établir les modèles murins de xénogreffe intrapéritonéale et intrabursale, ce rapport explique également comment utiliser l’imagerie bioluminescente pour surveiller de manière non invasive la progression tumorale dans ces modèles.

Protocole

Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Maryland, comté de Baltimore (Chercheur principal - Achuth Padmanabhan ; Numéro de protocole - 1947).  La liste complète des matériaux et équipements utilisés dans ce protocole ainsi que leurs numéros de catalogue sont fournis dans le Tableau des matériaux.

1. Préparation de lignées cellulaires de cancer de l’ovaire pour la greffe chez la souris

Note : Pour tous les modèles in vivo décrits dans ce protocole, les cellules cancéreuses de l’ovaire doivent être préparées pour une transplantation chez la souris. Les cellules du cancer de l’ovaire doivent être préparées dans une cagoule de culture tissulaire à flux laminaire comme décrit ci-dessous, à température ambiante, sauf indication contraire :

1. Cultivez des cellules cancéreuses de l’ovaire à 37 ^°C dans un incubateur de_CO2 enveloppé d’eau maintenu à 5 % de CO₂ à l’aide de milieux standards recommandés dans la littérature. Si l’on souhaite une imagerie in vivo non invasive de la tumeur, les cellules cancéreuses de l’ovaire doivent être modifiées pour exprimer de manière stable la luciférase avant la transplantation.
2. Lorsque les cellules atteignent environ 80 % à 85 % de confluence, elles sont prélevées dans des conditions stériles, comme décrit ci-dessous :
   1. Aspirez le milieu à partir de la plaque de culture tissulaire.
   2. Lavez deux fois les cellules adhérentes avec du sérum stérile 1X tamponné phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium. La présence de calcium et de magnésium dans le PBS peut interférer avec l’activité de la trypsine et favoriser l’adhésion cellulaire. Aspirez le PBS de la plaque de culture tissulaire.
   3. Ajoutez 0,05 % de trypsine-EDTA à la plaque de culture tissulaire. La quantité de trypsine à utiliser dépendra de la taille de la plaque de culture tissulaire et de la lignée cellulaire sur laquelle on travaille. Pour la plupart des lignées cellulaires croissant sur une plaque de 100 mm, utilisez 1 mL de trypsine-EDTA à 0,05 %. Pour les lignées cellulaires de cancéreuses de l’ovaire fortement adhérentes telles que OVCA420, 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % est recommandé.
   4. Transférez la plaque avec les cellules dans l’incubateur_CO2 à enveloppe d’eau à 37 ^°Cutilisé pour la culture tissulaire et incubez pendant 1 à 5 minutes. Le temps exact d’incubation requis dépendra de la lignée cellulaire. Certaines lignées cellulaires, comme TYK-Nu et HEYA8, se détachent très rapidement (1 à 2 minutes), tandis que d’autres, comme OVCA420, prennent plus de temps (4 à 5 minutes).
   5. Une fois les cellules détachées, ajoutez un milieu contenant du FBS pour stopper l’action de la trypchine. Ajoutez 6 mL de milieux contenant FBS pour 1 mL de trypsine. Pipeter doucement de haut en bas pour déloger les cellules de la plaque de culture tissulaire et les dissocier en une suspension unicellulaire.
      Note : Lorsqu’elles sont observées sous un microscope inversé en champ clair, les cellules détachées paraissent arrondies (au lieu de plates/allongées) et flottent librement plutôt que d’être collées au fond de la plaque.
   6. Collectez les cellules dans un tube conique et centrifugez à 400 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
   7. Retirez le surnageant contenant de la trypsine et remettez le pellet cellulaire en suspension dans un milieu de culture cellulaire frais contenant du FBS.
3. Comptez les cellules à l’aide d’un colorant de viabilité cellulaire tel que le bleu de trypan et un hémocytomètre. Sinon, un compteur automatique de cellules peut être utilisé pour compter les cellules.
4. Reconstituer les cellules dans un volume défini de PBS 1X stérile (pH 7,4) afin d’atteindre la concentration désirée de cellules par unité de volume. Le nombre recommandé de cellules à injecter pour les lignées cellulaires de cancer de l’ovaire humain couramment utilisées est indiqué dans le tableau 1^{à 13}.
   Note : Le volume maximal pouvant être injecté en toute sécurité dans les souris dépend du modèle. Pour le modèle intrapéritonéal, le volume maximal recommandé est de 500 μL (voir section 2.1). Pour le modèle intraboursaire, le volume maximal recommandé est de 5 μL (voir section 2.2).
5. Gardez la suspension cellulaire sur glace jusqu’au moment de l’injecter chez la souris. Injectez les cellules dans les souris dès que possible, de préférence dans les 30 à 45 minutes suivant la préparation des cellules.

2. Établissement de modèles transplantables de cancer de l’ovaire chez la souris

1. Établissement du modèle intrapéritonéal du cancer de l’ovaire
   Note : Dans ce processus, des cellules cancéreuses de l’ovaire exprimant de manière stable la luciférase sont injectées dans la cavité péritonéale d’une souris adulte. L’utilisation de cellules exprimant de manière stable la luciférase permettra un suivi longitudinal non invasif de la progression tumorale grâce au Système d’Imagerie In Vivo (IVIS).
   1. Préparez les cellules comme décrit à la section 1. Resuspendez doucement les cellules à l’aide d’une micropipette de 1000 μL et assurez-vous que les cellules restent dissociées.
      Note : Ne pas déloger les amas provoquera un bouchon des aiguilles.
   2. Extraire 500 μL de suspension à cellules dans une seringue de 1 mL et fixer une aiguille de 21G x 1 pouce. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue.
      Note : Le volume maximal pouvant être injecté intrapéritonéalement chez une souris adulte (25–30 g) est de 500 μL. Par conséquent, resuspendez les cellules dans un volume tel que le nombre requis de cellules soit contenu dans un volume maximal de 500 μL. Le nombre recommandé de cellules à injecter pour les lignées cellulaires de cancer de l’ovaire humain couramment utilisées est indiqué dans le tableau 1^{à 13}.
      Note : Si la souris pèse entre 20 et 25 g, il est recommandé d’injecter un volume plus petit (moins de 400 μL).
   3. Retirez l’animal de la cage et posez-le sur une surface rugueuse ou filhavée pour le retenir.
   4. Immobiliser la souris en grattant doucement la peau lâche à la base du cou avec la main non dominante, comme illustré à la Figure 1A.
   5. Soulevez doucement la souris et tournez-la de façon à ce que son côté ventral soit orienté vers le haut. Sécuriser la queue de l’animal avec des doigts comme montré à la Figure 1B.
   6. Tracez une ligne imaginaire au milieu de l’abdomen. Pour localiser le site d’injection, imaginez un triangle entre la ligne médiane et les deux mamelons dans le quadrant inférieur droit. Assurez-vous que le site d’injection se trouve au centre de ce triangle imaginaire. Voir la Figure 1B.
   7. Inclinez légèrement la tête de la souris vers le sol, la rendant plus basse que l’arrière-arrière. Maintenir la souris dans cette position aide le contenu abdominal à se déplacer crâniquement. Cela réduit le risque de perforation des organes internes lors de l’injection.
   8. Utilisez un couvette alcoolisé stérile pour nettoyer la zone d’injection.
   9. Avec la main dominante, insérez l’aiguille dans le site d’injection à un angle de 45° ou moins. Avancez seulement de 0,5 pouce et pas plus de la moitié de la longueur de l’aiguille. Assurez-vous que l’aiguille reste stable, car un mouvement dans la cavité abdominale peut causer des lésions aux organes internes.
   10. Distribuez les cellules lentement et régulièrement dans la cavité abdominale de la souris.
   11. Retirez l’aiguille de la souris avec le même angle d’insertion. Placez immédiatement un manomètre stérilisé sur le site d’injection pour éviter toute fuite.
   12. Jetez l’aiguille et la seringue dans le contenant approprié pour objets tranchants.
   13. Avant de mettre la souris dans la cage, utilisez-lui une marque d’oreille en utilisant la méthode préférée. Le marquage auditif permettra d’identifier la souris injectée plus tard.
2. Établissement du modèle intrabursal du cancer de l’ovaire
   Note : Dans le modèle intrabursaire, les cellules cancéreuses de l’ovaire qui expriment de manière stable la luciférase sont injectées directement dans la bourse ovarienne d’une souris adulte. La bourse est un sac membraneux qui entoure les ovaires murins. Une expression stable de la luciférase dans les cellules cancéreuses de l’ovaire permettra un suivi longitudinal non invasif de la progression tumorale via IVIS.
   1. Jour 1 – Préparation du matériel et de la souris pour la chirurgie de transplantation intrabursale
      1. Autoclave : les instruments nécessaires à la chirurgie. La liste des instruments est (Figure 2A) :
         Ciseaux à pointe fine, pinces à pointe fine courbes de 5 pouces, porte-aiguille Mayo-Heger, microforceps de bijoutiers disséquants, pointe fine, instruments de dissection des pinces à pointes fines
      2. Administrez un analgésique préopératoire de carprofène (15 mg/Kg) toutes les 24 heures par injection sous-cutanée chez la souris.
         Remarque : administrez l’analgésique carprofène par voie sous-cutanée toutes les 24 heures, commençant un jour avant l’opération et poursuivant pendant 3 jours après l’opération.
   2. Jour 2 – Transplantation intrabursale de cellules cancéreuses de l’ovaire chez une souris
      1. Préparez les cellules cancéreuses de l’ovaire pour l’injection comme décrit dans la section I. Le volume maximal pouvant être injecté en toute sécurité par intrabursie chez une souris est de 5 μL. Il est donc préférable d’avoir des cellules à une concentration de 10⁴ cellules/μL. Cela permettra la transplantation de 5 x 10⁴ cellules.
         Remarque : Le nombre recommandé de cellules à injecter pour les lignées cellulaires de cancer de l’ovaire humain couramment utilisées est indiqué dans le tableau 1¹³.
      2. Gardez les cellules sur la glace jusqu’à utilisation. Une fois prélevé, il est recommandé d’injecter les cellules dès que possible, de préférence dans les 30 à 45 minutes.
      3. Induire l’anesthésie en plaçant la souris dans une chambre d’isoflurane avec un débit d’isoflurane de 4 % et un débit d’oxygène de 3,5 L/min. Confirmez que la souris est anesthésiée en vérifiant l’immobilisation et l’absence de réflexe pincé de l’orteil.
      4. Transférez la souris anesthésiée sur un drap chirurgical stérile placé sur un coussin chauffant à rongeurs maintenu à 37 °C. Placez rapidement un cône de nez et maintenez l’anesthésie avec 1,5 % d’isoflurane et 98,5 % d’oxygène. Assurez-vous que la souris est anesthésiée en confirmant l’absence de réflexe pincé de l’orteil.
      5. Assurez-vous que la souris reste anesthésiée tout au long de la procédure en confirmant l’absence du réflexe de pincement des orteils toutes les 15 minutes. Surveillez la fréquence respiratoire de la souris pendant l’anesthésie pour vous assurer qu’elle est lente et fluide. Si le rythme respiratoire change, ajustez la dose d’isoflurane. Si la souris présente une respiration laborieuse ou un halètement, diminuez la dose. Inversement, si la souris présente un rythme respiratoire accru, augmentez légèrement la dose d’isoflurane.
         Note : Évitez de laisser la souris sous anesthésie plus de 40 minutes. Pour y parvenir, il est important d’être efficace et rapide pendant la procédure chirurgicale.
      6. Positionnez la souris du côté où les cellules cancéreuses de l’ovaire doivent être transplantées par intraburserie, face vers le haut comme montré à la Figure 2B.
      7. Appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux de la souris afin de les protéger du dessèchement (dessèchement cornéen).
      8. Si la souris a du poil, rasez les poils de la moitié inférieure de la souris du côté qui est vers le haut. Nettoie correctement la zone rasée et place la souris sur un nouveau tapis stérile. Si vous travaillez avec le Foxn1 nu (B6. Cg-Foxn1 nu/J) souche de souris, saute cette étape.
      9. Utilisez un drape chirurgical stérile pour couvrir la souris de manière à ce que seule la moitié inférieure de son corps soit révélée.
      10. Lavez-vous correctement les mains avec du savon avant le début de l’opération et mettez une paire de gants chirurgicaux stériles propres. Évitez de toucher les zones ou objets non stériles après avoir mis des gants chirurgicaux.
      11. Utilisez un applicateur stérile à pointe de coton pour appliquer le liquide de bétadine sur le site opératoire en mouvement circulaire dans le sens horaire de l’intérieur vers l’extérieur. Ensuite, utilisez un écouvillon alcoolisé stérile pour nettoyer la même zone de manière similaire. Répétez cette procédure deux fois de plus.
          Remarque : Ne touchez pas aux objets ou zones non stériles pendant l’intervention. Remplacez immédiatement les gants si une surface non stérile est en contact. Il est fortement recommandé d’avoir une autre personne pour l’aider lors de l’injection intraboursale. Cette personne peut aider à manipuler des objets non stériles pendant l’opération.
      12. Attends 1 minute que l’alcool sèche.
      13. Localisez le site situé à environ 1,5 cm au-dessus de la patte arrière et à 5 mm de la cage thoracique de la souris, comme montré à la Figure 2B. Soulevez la peau à cet endroit avec les pinces courbées, puis faites une incision verticale de 5 mm avec un ciseau à pointe fine.
          Note : Avant de pratiquer l’incision, assurez-vous que la souris est complètement sous l’influence de l’anesthésie en confirmant l’absence du réflexe pincé de l’orteil.
      14. Maintenez la peau d’un côté avec une micropince à pointe fine et faites une incision dans le tissu sous-cutané au même endroit.
      15. À ce stade, la couche péritonéale sous le tissu sous-cutané devient visible. Utilisez une pince à pointe fine, courbée et dentelée pour maintenir la couche péritonéale, et réalisez une incision d’environ 2,5 mm de long avec des ciseaux à pointe fine.
      16. Maintenez le côté du lambeau de l’incision péritonéale avec la pince dentelée et localisez le coussinet graisseux ovarien à l’aide de pinces fines. L’ovaire est situé sous le coussin adipeux.
      17. Retirez doucement un peu du coussinet graisseux ovarien ainsi que l’ovaire à travers l’incision.
      18. Utilisez la pince de dissection pour maintenir le coussin adipeux de sorte que l’ovaire soit orienté vers le haut et immobile.
          Note : Ne tenez pas l’ovaire avec des pinces. Utilisez toujours des pinces dentelées pour maintenir le coussin adipeux car le tissu est glissant.
      19. Demandez à la personne qui assiste de préparer la seringue contenant la suspension cellulaire. Il est recommandé d’utiliser une seringue d’insuline de 0,3 mL.
      20. Insérez doucement l’aiguille avec le biseau orienté vers le haut dans la bourse ovarienne à partir de la jonction entre la trompe de Fallope et l’ovaire. Assurez-vous que tout le biseau est placé à l’intérieur de la bourse avant d’appuyer sur la ventouse.
          Note : Faites attention à ne pas percer la bourse à l’extrémité opposée du site d’insertion.
      21. Poussez doucement la ventouse et transférez le contenu de la seringue dans la bourse ovarienne. Retirez rapidement l’aiguille.
      22. Le gonflement de la bourse entourant l’ovaire indique une inoculation réussie des cellules.
      23. Attends 5 secondes et remets doucement l’ovaire dans la cavité péritonéale.
      24. Fermez le péritoine à l’aide d’une suture monofilament absorbable 6-0 avec un ou deux points chirurgicaux simples interrompus.
      25. Fermez l’incision cutanée à l’aide de la suture monofilament absorbable 6-0 avec un point chirurgical simple en courant. Assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement au niveau de l’incision.
      26. Appliquez une pommade antibiotique triple (bacitracine, néomycine et polymyxine B) sur le site de l’incision après l’avoir fermée.
      27. Administrez du Carprofène 15 mg/Kg par voie sous-cutanée à la souris pour soulager la douleur.
      28. Faites un ear tag à la souris en utilisant une méthode préférée. Le marquage auditif permettra d’identifier la souris injectée plus tard.
      29. Transférez la souris dans une cage neuve. Placez cette cage avec la moitié sur un coussin chauffant pendant au moins 60 minutes. Assurez-vous que l’effet de l’anesthésie s’est complètement dissipé à ce moment-là, et que la souris est éveillée et active.
          Note : Les souris sont sujettes à l’hypothermie sous anesthésie. Il est donc important de fournir de la chaleur externe pour réguler la température corporelle.
      30. Vérifiez les souris après 4-5 heures après l’opération pour détecter tout signe de saignement au niveau de l’incision ou d’autre inconfort.
      31. Administrez 15 mg/kg de carprofène aux souris par voie sous-cutanée toutes les 24 heures pendant les 3 jours suivants.
      32. Si les cellules inoculées sont génétiquement modifiées pour exprimer la luciférase de manière stable, la charge tumorale peut alors être mesurée à l’aide d’IVIS dès le premier jour après l’injection, comme décrit à la section 3.

3. Imagerie non invasive d’une tumeur de souris à l’aide du Système d’imagerie In Vivo (IVIS)

Un objectif important dans plusieurs études utilisant les modèles de tumeurs transplantables décrits dans ce rapport est d’obtenir des données longitudinales sur la progression tumorale. Bien que le volume des tumeurs sous-cutanées puisse être estimé avec un caliper vernier, cela n’est pas une option viable pour les tumeurs formées selon les modèles intrapéritonéal et intrabursaux. Pour surmonter ce défi et déterminer la charge tumorale intrapéritonéale, la plupart des laboratoires utilisent l’imagerie bioluminescente non invasive à base de luciférase. Pour cela, des cellules cancéreuses transplantées sont modifiées pour exprimer de manière stable la luciférase, qui produit la bioluminescence lors de l’administration du substrat, la D-luciférine. La bioluminescence est détectée de manière non invasive à l’aide d’un système d’imagerie In Vivo (IVIS). Ce signal est ensuite quantifié pour suivre la charge tumorale et révéler des informations sur la métastase et l’efficacité thérapeutique des médicaments. Ci-dessous, nous décrivons le protocole pour suivre la charge tumorale via l’imagerie bioluminescente non invasive à base de luciférase avec IVIS chez la souris.

1. Préparation du substrat de D-luciférine
   1. Préparez une solution de 15 mg/mL de D-luciférine dans 1X PBS (pH 7,4) dans des conditions stériles.
   2. Stérilisez la solution par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
   3. Enveloppez la solution dans du papier aluminium pour la protéger de la lumière jusqu’à utilisation.
2. Initialisation de l’imageur IVIS pour l’acquisition d’images
   1. Ouvrez le logiciel « image vivante » sur l’ordinateur connecté à l’imageur IVIS et connectez-vous.
   2. L’imageur doit être initialisé pour l’acquisition d’images. Cela se fait comme suit :
      1. Lors de la connexion, une fenêtre du panneau de contrôle IVIS s’ouvre comme montré à la Figure 3A.
      2. Cliquez sur le bouton « initialiser » situé en bas à droite de la fenêtre (Figure 3A). Il faudra quelques minutes pour que le système s’initialise.
         Note : Initialement, la barre de température en bas de la fenêtre devient rouge, indiquant que la caméra d’imagerie est en train d’atteindre sa température cible de -90 °C (Figure 3B).
      3. Lorsque la caméra d’imagerie atteint la température cible (-90 °C), la barre de température devient verte, et le statut du système indique « Prêt à l’emploi » (Figure 3C). L’imageur est maintenant prêt à imager la souris.
         Note : Le temps d’exposition, le binning et le f/stop peuvent être ajustés selon les besoins de l’utilisateur.
3. Préparation de la souris pour l’imagerie IVIS
   Avant d’imager la souris, la D-luciférine doit être injectée par voie intrapéritonéale.
   1. Retirez la souris de la cage et placez-la sur une surface rugueuse ou avec fil de fer. Grattez doucement les souris pour les retenir correctement comme décrit à la section 2.1.
   2. Prenez la souris et tournez-la de façon à ce que son côté ventral soit orienté vers le haut.
      Note : Si la souris est correctement attachée, ses quatre pattes s’étendront vers l’extérieur lors de la prise en main, comme montré à la Figure 1B. Tenez sa queue entre les doigts comme mesure supplémentaire de retenue pendant la procédure.
   3. Utilisez un écouvillon alcoolisé stérile pour nettoyer le site d’injection, comme le prévoit le protocole d’injection intrapéritonéale à la section 2.1.
   4. Utilisez une seringue de 1 ml de tuberculose et une aiguille de 30 g et demi-pouce pour injecter intrapéritonéalement un volume approprié de D-lucifèrine à partir de la solution d’origine afin d’obtenir une dose finale de 150 mg/kg de D-luciférine.
      Remarque : Consultez le protocole d’injection intrapéritonéale à la section 2.1 pour les instructions sur la manière d’effectuer l’injection intrapéritonéale. Si vous utilisez des souris C57BL/6 (pour des modèles d’allogreffes syngéniques), il est fortement recommandé d’enlever la fourrure avant de réaliser une imagerie bioluminescente avec IVIS. La fourrure noire et la peau pigmentée atténuent considérablement la lumière, réduisant l’intensité du signal.
   5. Remettez doucement la souris dans la cage. Le temps d’attente exact et le temps d’exposition devront être déterminés empiriquement. Cela peut se déterminer comme suit.
      1. Anesthésiez la souris immédiatement après l’injection de D-luciférine et imagez-la comme décrit à la Section 3.4 toutes les 2 minutes pendant 20 minutes.
         Note : Lors de la première expérience réalisée, il est recommandé de déterminer comment le signal de la luciférase varie au fil du temps après l’administration de la D-luciférine. Cela aidera à déterminer le moment le plus approprié pour imager la souris après l’administration de D-luciférine lors des expériences ultérieures. Le signal bioluminescent peut varier selon plusieurs facteurs, notamment la lignée cellulaire, le modèle de xénogreffe de souris, le niveau d’expression de la luciférase, etc.
      2. À chaque intervalle, prenez des calculs de 5, 10 et 15 s.
      3. Utilisez ces données pour tracer une courbe standard. En fonction de la courbe, choisissez l’attente et le temps d’exposition auxquels le signal atteint un plateau tout en maintenant l’intensité la plus élevée.
         Note : En général, ce temps dure entre 5 et 10 minutes, mais cela peut varier selon le modèle.
4. Imagerie non invasive des tumeurs de souris utilisant l’IVIS
   1. Après la période d’attente, placez la souris dans une chambre d’isoflurane avec un taux d’isoflurane de 4 % et un débit d’oxygène de 3,5.
   2. Confirmez que la souris est anesthésiée en vérifiant l’absence de réflexe pincé de l’orteil.
   3. Placez la souris sur la scène à l’intérieur de l’imageur IVIS et glissez son nez à l’intérieur du cône du nez pour l’entretien anesthésique pendant l’imagerie. Assurez-vous qu’ils restent dans les lignes marquées de la mise au point de la caméra et fermez la porte de l’imageur.
      Note : Il y aura cinq positions sur la scène à l’intérieur de l’imageur. Chaque position comporte également son cône nasal anesthésique respectif. Cela permet d’imager 5 souris simultanément. Selon le nombre de souris à image, ajustez le champ de vision de la caméra dans la boîte de contrôle de « D » (champ plus large) à « A » (mise au point étroite). La souris peut être placée n’importe où sur la scène à condition que son nez reste à l’intérieur des cônes de nez d’anesthésie pendant toute la durée de l’imagerie. Il est recommandé d’imager les souris séquentiellement d’abord sur leur côté dorsal puis sur leur côté ventral.
   4. Ajustez le temps d’exposition et cliquez sur « Acquérir » dans le panneau de configuration (Figure 3C).
      Note : Assurez-vous que la luminescence, la photographie et la superposition sont « ACTIVÉES » dans le panneau de contrôle.
      Une fois l’image capturée, l’image de la souris avec le signal luciférase apparaîtra à l’écran.
   5. Ouvrez l’imageur, tournez la souris de façon à ce que le côté ventral soit vers le haut, puis cliquez sur « Acquérir » après avoir fermé la porte de l’imageur.
      Note : Assurez-vous que le nez de la souris se trouve à l’intérieur du cône du nez pour assurer le maintien de l’anesthésie lors de l’imagerie.
   6. Une fois les images dorsale et ventrale acquises, ouvrez la porte de l’imageur et remettez la souris dans sa cage.
   7. Attends 5 à 10 minutes pour t’assurer que la souris reprenne connaissance.
5. Analyse de l’image IVIS pour déterminer la charge tumorale chez la souris
   1. Ajustement de l’échelle des couleurs des images
      1. Sauvegardez les images brutes dans le dossier approprié en cliquant sur « fichier » suivi de « Enregistrer sous ».
         Remarque : L’imageur ajuste automatiquement l’échelle des couleurs en fonction de l’intensité du signal. Il est conseillé de maintenir l’échelle de couleurs constante sur toutes les images prises au cours de l’expérience. L’échelle des couleurs peut également être ajustée plus tard en ouvrant l’image brute avec ce logiciel.
      2. Pour un ajustement manuel, une autre fenêtre de la palette d’outils apparaît en haut à droite de l’écran (Figure 3D), allez dans « Ajuster l’image » puis choisissez « manuel » pour l’échelle. Entrez le nombre minimum et maximum souhaité pour la valeur de l’échelle et cliquez sur « Entrer » (Figure 3E).
         Remarque : Lors de l’ajustement de l’échelle des couleurs d’une image acquise précédemment, ouvrez d’abord le fichier brut infoclick.txt image enregistré depuis le dossier correspondant en utilisant « fichier » suivi de « ouvrir ».
         3.5.1.3. Sauvegardez cette image séparément de l’image brute dans le dossier approprié.
   2. Analyse de la charge tumorale chez la souris
      Note : Pour la mesure quantitative de la charge tumorale, vous pouvez mesurer l’intensité du signal de chaque souris sur des images prises sur toute la période. Vous pouvez placer ces valeurs dans Excel ou GraphPad Prism pour une analyse statistique et générer des graphiques linéaires de la progression tumorale.
      1. Ouvrez le fichier brut infoclick.txt enregistré depuis le dossier correspondant.
      2. Allez dans la section ROI (Région d’intérêt) de la fenêtre de palette d’outils qui apparaît en haut à droite (Figure 3F).
      3. Dessinez la zone de retour sur investissement sur chaque souris manuellement ou automatiquement avec l’aide de la fonction « dessin » en utilisant la forme qui vous convient le mieux. Pour cela manuellement, gardez la zone cohérente pour toutes les images de toutes les souris à comparer.
         Note : Pour l’inoculation intrapéritonéale, la sélection manuelle du ROI pour l’ensemble du thorax et de l’abdomen sur l’image ventrale de la souris est la plus efficace. Pour l’inoculation intrabursale, la sélection manuelle du ROI dans la zone d’image dorsale avec signal fonctionne le mieux.
         Note : La sélection automatique du ROI ne sélectionnera que les régions avec une intensité de signal d’image plus élevée.
      4. Cliquez sur « Mesurer le ROI » (Figure 3F). Cela ouvrira une nouvelle fenêtre avec des données sur les comptages totaux et moyens pour chaque ROI sélectionné.
      5. Sauvegardez ce fichier dans le dossier approprié afin qu’il puisse être consulté plus tard. Utilisez ces données pour tracer le graphique soit dans MS Excel, soit dans GraphPad Prism.

Résultats

Des données représentatives d’un modèle de cancer de l’ovaire intrapéritonéal utilisant des cellules OVCAR8 marquées à la luciférase chez des souris nues immunodéprimées de Foxn1 sont présentées dans la Figure 4. L’expression stable de la luciférase dans ces cellules a permis un suivi longitudinal de la progression tumorale par imagerie bioluminescente non invasive à l’aide de l’imageur IVIS, comme décrit à la section III. L’injection intrapéritonéale de 5 m...

Discussion

La capacité à imiter des interactions complexes entre cellules tumorales, microenvironnement et facteurs systémiques fait des modèles murins une excellente ressource pour étudier la progression du cancer de^{l’ovaire 12}. En plus d’améliorer notre compréhension des facteurs qui favorisent la progression et la métastase du cancer de l’ovaire, les modèles murins in vivo jouent également un rôle important dans l’évaluation préclinique des petites molécules et les straté...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre stérile à seringue 0,22 um, 33 mm	Fisher Scientific	09-720-004
Seringue de 1 ml TB	BD	309659
21G, aiguille de 1 pouce	BD	305167
30G, ½ ; aiguille de pouce	BD	305106
Pinces à pointe fine courbée de 5 pouces	Fisher Scientific	1631
Suture monofilament absorbable 6-0	MaxonTM  ;	6532-11
Couvette d’alcool (alcool isoprolyl à 70 %)	Dukal Corp	80003156
Bétadine (solution d’iode à 1 %)	Produits Purdue	367618150085
Carprofen Inj, 50mg/ml	Levafen	RXLEVA50-20INJ
Centrifuge  ;	Eppendorf	5702
D-luciférine	Syd Labs	MB000102-R70170
Microforceps de bijoutier disséquant, pointe fine	Fisher Scientific	08-953E
Pommade oculaire	Medvet	11897
Ciseaux à pointe fine	Fisher Scientific	8940
Coussin chauffant	Rayon de soleil	731-500
Instruments disséquant les pinces à pointes fines	Fisher Scientific	S08096
Seringue à insuline 3/10 ml	BD	328438
Isofurane	Fluriso	Fluriso250
IVIS	Perkin Elmer	IVISLMIII
Porte-aiguille droite Heger	Fisher Scientific	08-966
PBS 1X stérile, sans calcium ni magnésium	Corning	21-040-CV
Applicateurs stériles à pointe de coton	McKeesson	24-106-1S
Jauge stérile	Kendall	3033
Serviette/Rideau stérile, non fenestralé	Henry-Schein	100-9687
Pommade antibiotique triple	Globe	4006-4SL
Trypsine-EDTA (0,25 %), phénol rouge	Gibco	25200-056