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Article de méthode

Protocole intégré pour l’évaluation des lymphatiques méningées : injection de cisterna magna, imagerie des ganglions lymphatiques, dissection méningée et coloration totale

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DOI :

10.3791/71140

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29 mai 2026

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1School of Medicine, School of Life Sciences, Shanghai University, 2Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 3Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4First Clinical College, Fujian Medical University; Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Key Laboratory of Laboratory Medicine

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour évaluer les vaisseaux lymphatiques méningés (MLV) de la souris, qui jouent un rôle important dans de multiples maladies neurologiques. L’objectif de ce protocole est de fournir une méthode intégrée permettant à la fois l’évaluation fonctionnelle du drainage des traceurs et la caractérisation morphologique détaillée du réseau dorsal des MLV.

Résumé

Les vaisseaux lymphatiques méningés (MLV) sont apparus comme des régulateurs critiques de l’homéostasie du système nerveux central (SNC), et le dysfonctionnement des VLM a été impliqué dans divers troubles neurologiques. Une évaluation complète de la morphologie et de la fonction des MLV est donc essentielle pour comprendre leur rôle dans la physiologie et les maladies du SNC. Ce protocole décrit une méthode intégrée d’évaluation des MLV chez la souris utilisant quatre techniques clés : injection intra-cisterna-magna (i.c.m.) de traceurs fluorescents, imagerie vivante des ganglions lymphatiques cervicaux (CLN), dissection méningée et coloration complète. D’abord, l’aiguille de 30 G est reliée à la seringue et à la pompe d’infusion via un tube en polyéthylène (PE). Après anesthésiation de la souris, la dure-mère est exposée par dissection contondante des muscles du cou, et l’aiguille d’injection est insérée dans la cisterna magna (CM) pour délivrer le traceur dans le liquide céphalorachidien (LCR) avec un contrôle précis. Le drainage traceur vers les CLN peut être visualisé en temps réel, tandis que la dissection méningée ultérieure et la coloration totale permettent une analyse morphologique détaillée des MLV dorsaux. L’ensemble de la procédure peut être réalisé en moins de 3 heures, comprenant l’injection i.c.m., la perfusion tissulaire, l’isolement du crâne et la mise en solution fixative. Ce protocole peut également être adapté pour la délivrance intracrânienne de médicaments ou combiné à des analyses moléculaires, car la procédure de dissection méningée est compatible avec des tissus frais et non fixés adaptés à l’extraction d’ARN et de protéines.

Introduction

Les MLV se trouvent dans les sinus duraux et peuvent transporter des composants du LCR et des cellules immunitaires du SNC jusqu’aux SNC 1,2. La découverte des MLV a remis en question le concept traditionnel de « privilège immunitaire » du système nerveux central et est devenue un point chaud de recherche cesdernières années 3. Des études ont montré que la fonction altérée des VLM est étroitement liée à diverses maladies, notamment la maladie d’Alzheimer, le déclin cognitif lié à l’âge, les tumeurs cérébrales et les infections duSNC 4,5,6,7. À mesure que la recherche dans ce domaine progresse, le besoin de méthodes expérimentales intégrées, reproductibles et bien standardisées s’épaissit.

La plupart des protocoles existants pour la recherche sur les vaisseaux lymphatiques se concentrent sur les vaisseaux lymphatiquespériphériques 8,9,10. Dans des études liées aux MLV, une étude a décrit une procédure simple de canulation du CM permettant un accès direct au LCR sans endommager le parenchyme du crâneou du cerveau 11. Combinée aux techniques d’imagerie, cette méthode peut évaluer efficacement la fonction du système glymphatique et la dynamique du LCR. Cependant, les protocoles expérimentaux détaillés pour étudier la fonction et la morphologie des MLV n’ont pas été bien documentés.

Le protocole actuel intègre l’imagerie fonctionnelle à l’analyse morphologique, permettant l’acquisition simultanée de données de fonction de drainage et de morphologie structurale auprès d’un même animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés et améliorant la comparabilité et la cohérence des données. Dans l’ensemble, ce protocole peut être utilisé pour étudier les changements structurels et fonctionnels des MLV dans divers modèles de maladies, ainsi que pour évaluer les effets des interventions pharmacologiques ou génétiques sur les MLV. Le protocole fournit des descriptions détaillées des étapes opérationnelles, des précautions clés et des conseils de dépannage. De plus, la technique d’injection d’i.c.m. décrite dans ce protocole peut être appliquée indépendamment pour l’administration intracrânienne de médicaments, et la procédure de dissection méningée est compatible avec des tissus frais pour l’extraction ultérieure d’ARN ou de protéines, offrant une flexibilité et une scalabilité considérables.

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Protocole

Les procédures souris décrites dans ce protocole ont été réalisées conformément au protocole approuvé par le Comité Institutionnel de Soins et d’Utilisation des Animaux (IACUC) de l’Université de Shanghai (Approbation n° ECSHU 2023-099).

1. Préparation des instruments chirurgicaux et des tampons

ATTENTION : Utilisez une hotte chimique et portez des gants pour minimiser les risques potentiels lors de l’utilisation de PFA, une substance modérément toxique et cancérigène. Toutes les opérations impliquant de l’alcool isoamylique doivent être effectuées dans une hotte chimique à l’écart des sources d’inflammation, en portant des gants et un masque, afin de réduire les risques d’exposition.

  1. Préparez des instruments chirurgicaux, tels qu’une paire de ciseaux droits, deux paires de pinces courbes à pointe fine, deux paires de pinces à pointe émoussée, une paire de micro-ciseaux et une paire de micropinces droites avec des pointes lisses (non dentelées).
    REMARQUE : Essuyez les instruments chirurgicaux avec 75 % d’éthanol et gardez-les secs avant et après l’expérience.
  2. Préparez des tampons.
    1. 1x PBS.
    2. 4 % de solution paraformaldéhyde Fix (4 % PFA).
    3. Solution bloqueante (1x PBS contenant 3 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,5 % de Triton X-100 et 2 % de sérum bovin fœtal).
    4. Tampon de dilution d’anticorps (1x PBS contenant 3 % de BSA et 0,5 % de Triton X-100).
    5. Médium de montage antifade.
      REMARQUE : Le réactif préparé peut être conservé à 4 °C pendant un mois.
  3. Préparer une solution anesthésique 2,2,2-Tribromoéthanol (Avertin, 1,25 %, 50 mL)
    1. Pèser 0,625 g de Tribromoéthanol dans un tube de 2 mL, ajouter 1,25 mL d’alcool isoamylique, puis dissoudre soigneusement (shaker 37 °C).
    2. Transférez la solution entièrement dissoute de Tribromoéthanol-isoamyle alcool dans un tube conique de 50 mL, ajoutez 1x PBS pour porter le volume total à 50 mL, et mélangez soigneusement.
    3. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 μm dans un meuble de sécurité biologique.
  4. Préparez de l’ovalbumine, solution conjuguée Alexa Fluor 647 (OVA-647) (2 mg/mL). Dissoudre 2 mg d’OVA-647 dans 1 mL de liquide cérébro-rachidien artificiel (LCR).

2. Assemblage de l’aiguille d’injection et connexion à la pompe à microinjection

  1. Utilisez des pinces émoussées pour détacher l’aiguille de 30 G et retenez lapointe à 11 (diamètre extérieur 0,30 mm, diamètre intérieur 0,15 mm, longueur 8 mm).
  2. Utilisez une longueur de 30 cm de tube PE-10 (diamètre extérieur 0,64 mm, diamètre intérieur 0,28 mm) pour connecter l’aiguille cassée de 30 G à l’aiguille de microinjection contenant une aiguille de 30 G (Figure 1).
  3. Montez l’aiguille de microinjection, avec le tube et l’aiguille de 30 G attachés, sur la pompe à microinjection.

3. injection de CIM et imagerie en conditions réelles

ATTENTION : Si l’aiguille est insérée trop profondément et pénètre dans le parenchyme cérébral, l’injecté sera injecté dans le tissu cérébral plutôt que dans le compartiment du LCR, compromettant la précision du résultat et pouvant entraîner la mortalité des souris. Pendant la chirurgie, une surveillance physiologique continue de la souris est nécessaire. La profondeur de l’anesthésie doit être évaluée toutes les 15 minutes en utilisant le réflexe de pincement des orteils pour garantir que l’animal reste indolore. La température corporelle doit être maintenue à 37 °C ± 0,5 °C à l’aide d’une bouillotte pour prévenir l’hypothermie et ses effets associés sur la fonction physiologique. De plus, la respiration et la fréquence cardiaque doivent être enregistrées toutes les 30 minutes, évaluées en observant les mouvements thoraciques et en palpant l’apex cardiaque. Lors de l’injection en c.i.m., si l’aiguille est insérée trop profondément et provoque un saignement, cela indique une injection ratée. Mettez fin à l’expérience et euthanasiez l’animal.

  1. Peser la souris et administrer 200 mg/kg d’Avertin par injection intrapéritonéale pour anesthésier la souris.
    REMARQUE : Des anesthésiques alternatifs (par exemple, kétamine/xylazine) peuvent être utilisés.
  2. Appliquez une crème dépilatoire sur la région cervicale pour enlever les poils sur les ganglions lymphatiques lorsque le réflexe de pincé de l’orteil cesse et que la respiration devient lente et régulière.
  3. Rase la région dorsale du cou.
  4. Placez la souris dans un cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant avec la tête inclinée à un angle de 120° par rapport au tronc (Figure 2A).
  5. Nettoyez la zone séquentiellement avec de la povidone-iode et 75 % d’éthanol.
  6. Appliquez une pommade ophtalmique à l’érythromycine.
  7. Faites une incision médiane sur la peau du cou et séparez brutalement les couches musculaires.
    REMARQUE : En utilisant deux paires de pinces à pointe émoussée, séparez les couches musculaires pour minimiser les saignements.
  8. Séquez le muscle avec une pince à extrémité fine jusqu’à ce que la dure-mère translucide recouvrant le MC devienne visible  (Figure 2B, C).
    REMARQUE : Utilisez une pince courbée à pointe fine pour rétracter les muscles et maintenir une exposition constante du cerveau cerviculaire.
  9. Sous un stéréomicroscope, utilisez des pinces émoussées pour maintenir l’aiguille et insérez-la à un angle de 45° par rapport au plan de la dure-mère matière, à une profondeur d’environ 1 à 2 mm. Placez le biseau de l’aiguille parallèlement à la dure-mère de façon à ce qu’il soit complètement sous la dure-mère (Figure 2D).
    REMARQUE : Appliquez une force légère avec l’aiguille pour percer la dure-mère. La perforation réussie est indiquée par une perte palpable de résistance, ainsi que par la visualisation de la pointe de l’aiguille sous la dure-mère maternelle et de l’écoulement du LCR.
  10. Utilisez du papier absorbant pour sécher toute fuite de LCR.
  11. Réglez la pompe de microinjection pour qu’elle délivre à 1 μL/min. Injectez 5 μL de solution d’OVA-647 (2 mg/mL) dans le CM4 (Figure 2E).
  12. Laissez l’aiguille en place pendant 2 minutes pour éviter le reflux.
  13. Appliquez une goutte de colle biologique sur les méninges.
  14. Fermez l’incision chirurgicale.
  15. Réalisez des images in vivo de la souris pour surveiller l’intensité des colorants dans les CLN à différents moments (30 min, 60 min). Utilisez les paramètres d’imagerie suivants : temps d’exposition : 0,5 s ; filtre d’excitation : 640 nm ; Filtre d’émission : 680 nm.

4. Isolement de l’aspect dorsal du crâne de la souris

REMARQUE : Confirmez l’absence du réflexe de pincé de l’orteil et l’arrêt de la respiration spontanée avant d’initier la dissection thoracique.

  1. Euthanasiez la souris avec une overdose d’Avertin (600 mg/kg) et effectuez une perfusion cardiaque avec 20 mL de 1x PBS ou de solution saline normale.
  2. Décapitez la souris pour isoler la tête.
  3. Faites une incision le long de la ligne médiane du crâne pour ouvrir le cuir chevelu.
  4. Utilisez deux hémostaux courbés pour séparer le cuir chevelu bilatéralement par une légère rétractation. Ensuite, insérez les hémostats courbés dans les fosses orbitaires et retirez soigneusement le cuir chevelu résiduel des régions nasale et orale (figure 3A–C).
    REMARQUE : Cette méthode permet une séparation rapide et complète du cuir chevelu.
  5. Retirez la mandibule tout en gardant le crâne intact (Figure 3D).
  6. Retirez l’os de la base du crâne pour exposer la partie ventrale du cerveau (Figure 3E).
  7. Extraire soigneusement le cerveau avec des pinces émoussées, en évitant le contact avec la dure-mère des os pariétaux (Figure 3F).
  8. Immergez complètement le crâne dorsal dans 5 mL, 4 % de PFA et fixez pendant 24 heures à 4 °C (Figure 3G).
    POINTS DE PAUSE : Conservez les crânes fixes à 4 °C pendant une semaine maximale. Retirez l’échantillon de 4 °C et laissez-le revenir à température ambiante avant la dissection méningée.

5. Dissection des méninges du crâne de souris

  1. Lavez le crâne fixe avec 5 mL 1x PBS, en répétant le lavage trois fois (10 min chacun).
  2. Placez le crâne face dorsale vers le bas dans un plat de 10 cm rempli de 1x PBS  (Figure 4A).
  3. Utilisez la pointe d’une pince à pointe fine pour saisir ou appuyer sur la bulle tympanique et la retirer du crâne (Figure 4B).
    REMARQUE : Le retrait de la bulle tympanique est une étape cruciale pour éviter la déchirure méningée causée par l’adhérence lors de la séparation du crâne.
  4. Taillez étroitement le long de la surface ventrale du crâne sur une distance d’environ 2 mm avec des ciseaux pour les lisser (Figure 4C).
  5. Utilisez des pinces fines, nettoyez méticuleusement les tissus blancs résiduels de la région de confluence des sinus (COS) des méninges (Figure 4D).
    REMARQUE : L’élimination incomplète des tissus résiduels est une cause majeure de coloration non spécifique lors de l’immunomarquage.
  6. Utilisez des micropinces fines pour soulever doucement un bord des méninges depuis le bord du crâne, puis soulever le bord opposé (Figure 4E, F).
  7. Saisir le bord en forme de bol des méninges et tirer pour le séparer du crâne dans la région du COS (Figure 4G).
  8. Retirez l’os maxillaire avec des ciseaux (Figure 4H).
  9. Saisir à nouveau le bord en forme de bol des méninges et tirer pour séparer les méninges du crâne au niveau de l’os frontal (Figure 4I).
  10. Placez les méninges intactes dans une plaque à 24 puits contenant 1 mL de PBS 1x, prête à être teintée.
    REMARQUE : Si les méninges se rompent lors de l’autopsie, notamment à la jonction des sinus sagittal supérieur et transvers, l’échantillon peut ne pas être adapté à une analyse plus approfondie. Si une coloration de fond non spécifique élevée est observée, ajouter une étape de trempe après la fixation de PFA (par exemple, incuber avec une solution de 0,1 M glycine pendant 40 min12) pour réduire davantage le signal de fond.

6. Coloration du blocage, anticorps primaire et anticorps secondaire

  1. Utilisez une pipette de 1 mL pour aspirer le PBS 1x afin que les méninges adhèrent au fond de la plaque du puits.
  2. Bloquez les méninges de montage complet avec une solution de blocage de 200 μL dans une plaque de 24 puits pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE : Étalez doucement les méninges complètement dans la solution de blocage à l’aide de pinces pour garantir une exposition uniforme.
  3. Utilisez une pipette pour retirer la solution de blocage.
  4. Incubez les méninges de l’ensemble avec 200 μL d’anticorps anti-LYVE-1 dilué (marqueur lymphatiquespécifique au vaisseau lymphatique 13) à une dilution de 1:200 (concentration finale de 1 μg/mL) pendant la nuit à 4 °C.
  5. Utilisez une pipette pour retirer la solution d’anticorps.
  6. Laver trois fois avec 1 PBS (10 min chacun).
  7. Incubez des méninges montées entières avec le DAPI (concentration finale 1 μg/mL) et l’IgG anti-âne Alexa Fluor 488 (concentration finale 2 μg/mL) pendant 1 h à température ambiante dans 1x PBS.
    REMARQUE : Protégez de la lumière pendant l’incubation des anticorps.
  8. Utilisez une pipette pour retirer la solution d’anticorps.
  9. Laver trois fois avec 1 PBS (10 min chacun).

7. Montage et imagerie

  1. Pipettez 100 μL de 1x PBS sur le centre d’une lame.
  2. Flottez et étalez les méninges de la monture entière à l’intérieur de la gouttelette (Figure 5A).
  3. Aspirez le PBS 1x pour permettre au tissu d’adhérer à plat à la lame (Figure 5B).
  4. Appliquez 20 μL de milieu de montage sur les méninges de montage complètes.
  5. Placez une gaine de couverture sur le papier (Figure 5C).
  6. Faites sécher les lames à température ambiante à l’air et stockez les lames à 4 °C.
    POINTS DE PAUSE : Les diapositives peuvent être stockées à 4 °C pendant jusqu’à un mois. Retirez la lame de 4 °C et laissez-la revenir à température ambiante. Enlevez toute condensation de la surface de la glissière avec du papier absorbant.
  7. Utilisez un objectif 20x pour acquérir des images MLV. Réglez le canal sur FL Green avec une longueur d’onde d’émission de 518 nm et un temps d’exposition de 100 ms.

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Résultats

Après l’injection d’OVA-647 en i.c.m., l’imagerie in vivo de petits animaux a révélé des signaux fluorescents ovales distincts distribués bilatéralement dans la région cervicale (Figure 6A). Lors des injections réussies, le traceur était clairement visible dans les CLN après l’injection, avec une intensité de fluorescence culminant à environ 60 minutes (Figure 6B). De plus, des signaux fluorescents ont été observés dans...

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Discussion

Ce protocole offre une méthode complète pour évaluer la fonction et la morphologie des MLV en intégrant l’injection de CMI, l’imagerie in vivo des NCL, la dissection méningée et la coloration sur montage complet. Un avantage clé de cette approche intégrée par rapport aux méthodes conventionnelles est qu’elle permet une évaluation simultanée de la fonction de drainage lymphatique et de la morphologie des vaisseaux au sein d’un même animal, éliminant ainsi le besoin de cohortes sé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des financements du Programme national clé de R&D de Chine (2023YFC2306500), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82502108) et de la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2024M760542).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid)Tocris  Cat# 3525
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (1:1000 dilution)InvitrogenCat# A-21208
Antifade Mounting MediumBeyotimeCat# P0126
Blunt-tipped forcepsRWD Life ScienceCat# F12011-10
BSABeyotimeCat# ST023
CoverslipsCITOTESTCat# 80312-3161
Curved sharp forcepsRWD Life ScienceCat# F11003-11
DAPISigma-AldrichCat# D9542
Depilatory creamVeetN/A
Dish-10 cmThermo Fisher ScientificCat# 150464
Disposable intravenous (IV) infusion needleZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Ethanol-75%Sinopharm Chemical Reagent Cat# 80176961
Fetal Bovine SerumExcellCat# FSD500
Filter-0.22 µmMerck Millipore Cat# SLGPR33RB
Glass slidesCITOTESTCat# 80340-3610
Isoamyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Cat# 10003218
IVIS SpectrumPerkinElmerN/A
Micro forcepsShinva Medical Instrument Cat# ZD372RB 
Micro scissorsShinva Medical Instrument Cat# ZO13056R
Microinjection needle (25 µL)Shanghai Gaoge Industry & Trade N/A
Microinjection pumpVoyage PowerCat# QHZS-001A
Mouse: C57BL/6 wild-type, 8 weeks old, male CavensN/A
Needle-30GZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Normal SalineBeyotimeCat# ST341
Ovalbumin, Alexa Fluor™ 647 ConjugateThermo Fisher ScientificCat# O34784
Paraformaldehyde Fix Solution-4%BeyotimeCat# P0099
PE-10 tubingShanghai Qiujing Biochemical Reagent and InstrumentN/A
Phosphate-buffered saline (1x PBS)BeyotimeCat# ST447
Rat anti-LYVE-1 (1:200 dilution)Santa CruzCat# sc-65647
StereomicroscopeJonecCat# JSZ6
Stereotaxic frameRWD Life ScienceCat# 68030
Straight scissorsRWD Life ScienceCat# S12007-10
Syringe-1-mL Zhejiang Kindly Medical Devices N/A
Tissue Adhesive I3M VetbondCat# 1469SB
TribromoethanolSigma-AldrichCat# T48402
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T8787
VS120 High-throughput fluorescence imaging systemOlympusN/A

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Vaisseaux lymphatiques m ning sinjection de traceur fluorescentganglions lymphatiques cervicauxdure m resyst me nerveux centralperfusion tissulaire
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