Article de revue
La thérapie génique du virus adéno-associé (AAV) nécessite des Matériaux Standard de Référence (RSM) bien caractérisés afin d’assurer des mesures analytiques précises et reproductibles au sein et entre les laboratoires. Cette revue examine le besoin critique des RSM, évalue les normes commerciales et pharmacopéennes disponibles, et propose des stratégies pratiques pour le développement interne de RSM afin de promouvoir des thérapies AAV sûres et efficaces.
Le virus adéno-associé (AAV) est devenu un vecteur majeur de la thérapie génique in vivo, avec huit produits actuellement autorisés à la mise en marché. À mesure que le domaine évolue rapidement, le besoin de méthodes analytiques robustes pour caractériser les attributs de qualité critique (CQA) — y compris le titer de la capside, le titer du génome, la teneur en capside (ratio vide/plein), l’identité et la pureté — ne cesse de croître. Les Matériaux Standards de Référence (RSM) jouent un rôle central en fournissant des lots AAV bien caractérisés et standardisés qui servent de repères universels. Les RSM facilitent la validation des technologies analytiques émergentes, garantissent la précision et la reproductibilité des tests de routine, et permettent la comparabilité inter-laboratoires. Cependant, le développement universel de RSM AAV est fondamentalement limité par la biologie complexe, la diversité des sérotypes, les génomes vectoriels et les variantes de capsides modifiées, ce qui nécessite des normes spécifiques aux sérotypes et à leurs applications. Les avancées récentes, notamment la publication des standards de référence pharmacopéaux AAV8 caractérisés par plusieurs méthodes orthogonales, représentent des avancées significatives vers l’harmonisation des mesures. Cette revue aborde le besoin crucial de RSM dans la thérapie génique AAV, évalue les normes pharmacopéennes et commerciales actuellement disponibles, et expose des stratégies pratiques pour le développement interne de RSM. Établir des RSM AAV robustes et spécifiques à chaque sérotype ainsi que des protocoles opérationnels standard harmonisés (SOP) est essentiel pour faire progresser la thérapie génique AAV et garantir la précision, la reproductibilité et la sécurité dans la recherche, le développement et la fabrication clinique.
La thérapie génique offre une stratégie transformative pour traiter les maladies génétiques et acquises en délivrant du matériel génétique fonctionnel dans les cellules du patient pour corriger ou réguler l’expression génique. Parmi ceux-ci, les virus adéno-associés (AAV) se distinguent par leurs applications in vivo en raison de leur tropisme tissulaire diversifié à travers différents sérotypes, et de leur expression prolongée du transgèneépisomal 1.
Les AAV sont des virus à ADN compacts (~25 nm de diamètre) appartenant au genre Dependoparvovirus de la famille des Parvoviridae . Ces virus sont non pathogènes et déficients de réplication, nécessitant des virus auxiliaires tels que l’adénovirus ou le virus de l’herpès simplex pour leurréplication 2. Le génome AAV possède deux gènes, rep et cap, flanqués de deux répétitions palindromiques de 145 paires de bases connues sous le nom de répétitions terminales inversées (ITRs)3. Les vecteurs AAV recombinants (rAAV) sont générés en remplaçant les séquences codantes virales par des cassettes thérapeutiques contenant un promoteur, un transgène et des éléments régulateurs flanqués de RIT. Pendant la production, les gènes rep et cap sont délivrés en trans, facilitant la réplication et l’emballage de la cassette thérapeutique dans des capsides virales et produisent des particules non intégrantes et déficientes en réplication qui maintiennent une capacité de transduction robuste tout en empêchant la réplication virale de typesauvage 4. Huit thérapies géniques basées sur le rAAV ont reçu une autorisation de mise en marché de l’Agence européenne des médicaments (EMA) ou de la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, et les essais cliniques avec les AAV sont en augmentation. En janvier 2025, 343 essais cliniques AAV avaient été enregistrés dans le monde, soit une augmentation de 34 % par rapport aux 255 essais de la mi-20225. Cette expansion clinique rapide renforce la nécessité d’un contrôle qualité rigoureux pour garantir la sécuritédes patients 6.
Garantir que les produits rAAV soient sûrs et efficaces pour un usage humain nécessite une caractérisation approfondie des attributs de qualité critiques (CQA), notamment la quantité, la puissance, la pureté, l’identité, la sécurité et la stabilité. Cependant, la caractérisation de l’AAV reste intrinsèquement difficile en raison de la complexité structurelle de ces vecteurs. Les AAV sont des particules icosaédriques composées de trois protéines capsides virales (VP1, VP2, VP3), assemblées dans un rapport approximatif de 1:1:10, et des variations dans l’assemblage des protéines peuvent affecter l’efficacité de latransduction 7. La charge utile d’ADN thérapeutique doit être emballée dans la capside avec une haute fidélité ; Des populations hétérogènes de capsides sont intrinsèquement générées lors de la production de rAAV, composées de capsides contenant un génome complet (capsides complètes), un génome partiel (capsides partiellement remplies) ou aucun matériel génétique (capsides vides). Pour aggraver cette complexité, différents sérotypes AAV présentent des efficacités d’emballage distinctes, des tropismes tissulaires et des profils immunologiques, nécessitant le développement d’essais adaptés au sérotype. Au-delà de ces défis biologiques, un problème crucial subsiste dans la manière dont les mesures sont réalisées. Différents laboratoires utilisent des tests, protocoles et approches d’analyse de données différents pour mesurer la même CQA. En conséquence, les valeurs rapportées pour des échantillons identiques peuvent différer d’ordres de grandeur entre les sites8. Même au sein d’un même laboratoire, des changements au fil du temps dans les réactifs, les instruments, les opérateurs ou les paramètres d’analyse peuvent entraîner des modifications des résultats du même lot9. Lorsque les mesures ne sont pas comparables, établir des associations fiables entre les CQAs et les résultats précliniques ou cliniques devient difficile, compliquant ainsi la prise de décision réglementaire10,11.
La normalisation vise à résoudre ce problème en garantissant la comparabilité des mesures. En analytique pharmaceutique, la normalisation englobe deux aspects clés : l’utilisation de matériaux de référence physiques communs (RSM) et le respect de procédures opérationnelles standard écrites harmonisées (SOP), garantissant que différents laboratoires mesurent de manière cohérente le titre, l’identité, la qualité, la puissance et lapureté 12. Les RSM sont des échantillons bien caractérisés qui servent de références. En validant les tests contre le même RSM, les laboratoires ancrent leurs mesures à un point de référence commun. Cela réduit la variabilité entre les laboratoires et permet de comparer de manière fiable les résultats de différentes études, produits et sitesde fabrication 13. De plus, il sert également de contrôle interne pour surveiller la performance des tests et la cohérence sur le temps14. Les procédures opérationnelles standard garantissent en outre que les méthodes analytiques sont exécutées de manière cohérente entre les laboratoires, minimisant la variabilité résultant des différences dans le prétraitement des échantillons, l’instrumentation, la stratégie d’étalonnage, le traitement des données et la pratique desopérateurs 8,9,12. Ensemble, ces deux composantes forment la base d’un cadre solide de normalisation analytique.
Cette revue aborde systématiquement les aspects clés de la normalisation dans l’analyse des AAV. Nous examinons les types de RSM et leurs applications analytiques, évaluons les RSM spécifiques à l’AAV actuellement disponibles pour leur adaptation à leur usage, et fournissons des conseils pratiques consolidés pour la production, la purification, la caractérisation et le stockage en interne des RSM. Nous identifions également les défis manufacturiers actuels et les limites analytiques. Reconnaissant que les RSM seules ne suffisent pas, nous discutons également des SOP harmonisées comme composante complémentaire et tout aussi importante de la normalisation. Ensemble, cette revue est destinée à servir de référence pratique pour les scientifiques analytiques, les professionnels de la qualité et les fabricants souhaitant faire progresser l’harmonisation des mesures et soutenir la prise de décision réglementaire fondée sur la science en thérapie génique AAV.
1. RSM : définitions et besoins
Les RSM sont organisés hiérarchiquement, avec deux principaux types : les RSM primaires et secondaires. Selon le Guide ISO 30, une norme primaire est définie comme une « norme désignée ou largement reconnue comme possédant les plus hautes qualités métrologiques et dont la valeur est acceptée sans référence à d’autres normes de la même quantité, dans un contexte spécifié ». Par exemple, les MRS de la Pharmacopée des États-Unis (USP), de la Pharmacopée européenne (Ph. Eur), de la Pharmacopée britannique (BP), etc., qui ont été largement caractérisés par des études multi-laboratoires, sont qualifiées de MRS primaires. Les fabricants individuels utilisent ensuite ces RSM primaires pour étalonner et qualifier leurs propres matériaux de référence de travail propriétaires, qui servent de RSM secondaires pour les tests de contrôle qualité de routine12,15. Ainsi, l’ISO définit un RSM secondaire comme une « norme dont la valeur est attribuée par comparaison avec une norme primaire de la même quantité ». Cette approche hiérarchique garantit la traçabilité : les mesures internes remontent aux normes primaires, elles-mêmes caractérisées par des méthodes analytiques depointe 16. L’utilisation des RSM fournit des benchmarks communs qui permettent aux fabricants d’étalonner et de valider leurs méthodes analytiques au même point de référence, conduisant ainsi à des mesures plus précises. Les autorités réglementaires encouragent donc l’utilisation des RSM primaires pour étalonner les RSM internes et valider les méthodes de test, améliorant ainsi la cohérence dans toute la fabrication desAAV 17,18. Cela permet une standardisation à travers différentes techniques analytiques, conduisant à une meilleure comparaison des résultats de caractérisation des rAAV entre les laboratoires et différentsproduits 17,19. Cette comparabilité améliorée améliore la compréhension des risques potentiellement liés à des doses élevées ou aux impuretés liées au produit, telles que les capsides vides ou partiellement remplies. En fin de compte, ces connaissances peuvent orienter la formulation de politiques réglementaires fondées sur la science, telles qu’un seuil minimum de capsides complètes, analogue au critère de ≥70 % de cellules viables pour les thérapies cellulaires somatiques, contribuant ainsi à des produits de thérapie génique plus sûrs etplus fiables 13,20,21.
Pour rAAV, plusieurs CQAs illustrent clairement la nécessité de la standardisation. Le titre du génome vectoriel détermine directement la dose du patient ; Des titres inexacts risquent un sous-dosage ou un surdosage. La PCR quantitative (qPCR) et la PCR numérique (dPCR) sont largement utilisées pour mesurer le titre, mais les résultats peuvent différer pour un même échantillon si des calibrants ou protocoles de courbe standard internes différentssont utilisés 11. La teneur en capsides (le ratio des capsides pleines, partiellement remplies et vides) est une autre CAQ critique, car les capsides vides et partiellement remplies peuvent contribuer à l’immunogénicité ou réduire leur efficacité6. Plus de dix techniques différentes sont utilisées pour mesurer la teneur en capside, notamment l’ultracentrifugation analytique (AUC), la chromatographie par exclusion de taille couplée à la diffusion de la lumière multi-angle (SEC-MALS), la photométrie de masse (MP), la spectrométrie de masse par détection de charge (CDMS), la microscopie électronique (EM), la chromatographie à échange d’anions (AEX), la focalisation isoélectrique capillaire (cIEF), la spectroscopie ultraviolet-visible (UV/Vis), etc. De plus, la teneur en capsides est souvent estimée indirectement en utilisant le rapport entre le titre du génome du vecteur et le titre des particules virales, déterminé respectivement par qPCR ou dPCR et ELISA, respectivement (PCR/ELISA)22. Chaque technique mesure différentes propriétés physiques et peut rapporter différentes valeurs de contenu de capside pour les mêmes échantillons. Une étude interlaboratoire récente du NIST comparant UV/Vis, AUC, SEC-MALS et PCR/ELISA a démontré une variabilité importante entre méthodes et entre laboratoires, la PCR/ELISA montrant une reproductibilité particulièrement faible et l’AUC présentant une divergence significative entre les laboratoires malgré sa grande considération comme méthodede référence 8. Ces résultats indiquent que réduire la variabilité dans l’analyse des AAV nécessite à la fois des RSM partagés et des flux de travail analytiques harmonisés, comme expliqué à la Section 5.
2. paysage rAAV RSM
Les efforts pour établir des RSM pour l’AAV ont conduit à deux sources fournissant des RSM AAV primaires. Parmi les sources pharmacopéiennes, l’USP est actuellement le seul fournisseur de RSM AAV primaire. Au-delà des USP, les RSM AAV primaires sont également disponibles dans l’American Type Culture Collection (ATCC). Un éventail croissant de RSM secondaires commerciaux pour plusieurs sérotypes est également disponible, reflétant les efforts communautaires continus pour remédier au manque de standardisation inhérent à la caractérisation des AAV. Le tableau 1 résume les matériaux AAV RSM actuellement disponibles et leurs caractéristiques clés.
3. Stratégies de fabrication RSM :
La production de RSM AAV haute pureté présente des défis inhérents. Obtenir des préparations de capsides vides à 100 % est compliqué par le fait que les capsides « vides » peuvent contenir du matériel génétique résiduel. De même, obtenir des préparations complètes pures de capsides s’avère difficile car les capsides vides et partiellement remplies partagent des caractéristiques physiques similaires et co-purifient avec les capsides complètes lors des processusde séparation 10. Malgré ces défis, des avancées significatives dans la technologie de production permettent désormais l’enrichissement de populations de capsides majoritairement pleines ou majoritairement vides. La section suivante offre un aperçu complet des technologies actuelles de production et de séparation, ainsi que des méthodes de caractérisation et des conditions de formulation pouvant être employées pour produire, caractériser et stocker les RSM AAV.
4. Caractérisation analytique : Définition de la norme
Une fois le RSM produit, purifié et formulé, une caractérisation analytique complète est réalisée. Cette étape garantit la qualité du RSM et son applicabilité en tant que référence à travers différentes méthodes analytiques. L’utilisation de techniques analytiques orthogonales pour évaluer les mêmes attributs de qualité est particulièrement importante pour garantir la robustesse et est donc fortement recommandée. Les attributs de qualité clés spécifiquement pour les RSM de l’AAV peuvent être divisés en trois catégories : titre, identité et pureté, comme indiqué dans le tableau 2.
5. Les SOP harmonisées comme second pilier de la normalisation analytique de l’AAV
Au-delà de la disponibilité de RSM bien caractérisés, une standardisation significative en analytique AAV nécessite également des procédures opérationnelles standard harmonisées et suffisamment détaillées. Même lorsque la même méthode analytique est appliquée, les résultats peuvent différer considérablement d’un laboratoire à l’autre en raison de différences dans le prétraitement de l’échantillon, les paramètres instrumentaux, la stratégie d’étalonnage, le traitement des données et les critères d’interprétation, des facteurs qui ont démontré la variabilité interlaboratoire indépendamment de la plateforme analytiqueelle-même 8,9.
Cela est illustré par une étude collaborative du NIST, du National Institute for Innovation in Manufacturing Biopharmaceuticals (NIIMBL) et de l’USP, au cours de laquelle six laboratoires ont évalué les mêmes échantillons d’AAV5 et AAV8 pour la teneur en capsides à l’aide de quatre méthodes. Les méthodes optiques, dont SEC-MALS et UV/Vis, ont montré la plus forte concordance inter-laboratoire, tandis que PCR-ELISA montrait une faible reproductibilité et était jugée inadaptée à un usage quantitatif sans harmonisation supplémentaire. Bien qu’étant largement considérée comme une méthode de référence, la SV-AUC a montré une plus grande variabilité interlaboratoire que la SEC-MALS, et les efforts de suivi pour développer des procédures standardisées de SV-AUC ont été identifiés comme une étape suivanteimportante 8,81.
Une conclusion similaire a émergé pour la détermination du titrage du génome par dPCR, où le prétraitement de l’échantillon, la stratégie d’extraction, la plateforme instrumentale, les conditions de dilution, le moment de la lyse de la capside et l’historique de congélation-dégel peuvent tous influencer les valeurs rapportées. Il est important de noter qu’un contrôle procédural plus strict a montré qu’il réduisait considérablement la variabilité, soulignant encore la valeur des SOPharmonisés 9.
Les MRS et les SOP doivent donc être considérés comme des piliers complémentaires de la normalisation analytique de l’AAV. Les RSM fournissent l’ancrage de mesure nécessaire à la traçabilité et à l’étalonnage, tandis que les SOP réduisent la variabilité procédurale et contribuent à garantir que les valeurs assignées soient reproduites de manière cohérente entre analystes, instruments et laboratoires.
La thérapie génique rAAV progresse plus rapidement que la capacité du domaine à caractériser de manière cohérente les attributs de qualité. Cette revue démontre que le principal obstacle à la caractérisation comparable de l’AAV n’est pas le manque d’outils analytiques, mais plutôt l’absence d’ancrages de mesure partagés et de flux de travail harmonisés. Les MRR répondent à ce défi en transformant des mesures dépendantes de la méthode en valeurs traçables et comparables. Les RSM permettent la validation des méthodes, améliorent la reproductibilité inter-laboratoire et fournissent des contrôles continus pour détecter la dérive des essais. Cependant, la production de RSM AAV de haute qualité reste techniquement exigeante en raison de la difficulté d’obtenir des populations de capsides pures vides et complètes, de la nécessité d’une caractérisation orthogonale complète et de la nécessité d’une stabilité à long terme dans des conditions de stockage définies. Les avancées récentes dans les technologies de fabrication et de purification ont permis la production de préparations principalement vides et complètes de capside, qui peuvent être utilisées pour produire des RSM internes, et les offres actuelles des organismes pharmacopéaux (USP), des consortiums collaboratifs (ATCC) et des fournisseurs commerciaux représentent des progrès significatifs. Cependant, le développement universel de RSM AAV est fondamentalement limité par la diversité des sérotypes, des génomes vectoriels et, de plus en plus, des variantes de capsides modifiées. Contrairement aux anticorps monoclonaux, l’hétérogénéité de l’AAV exige des RSM spécifiques au sérotype et à l’application. Cette complexité est encore amplifiée par les capsides hybrides et/ou conçues, qui obligent les développeurs à maintenir des RSM primaires internes propriétaires, fragmentant ainsi le paysage de la mesure. De plus, d’autres attributs de qualité comme les modifications post-traductionnelles (PTM) ont été mis en avant comme CQA potentielles et ne comportent pas de RSM bien caractérisés pour les PTM, créant un vide critique dans la compréhension de cet attribut vectoriel. Au-delà de la disponibilité des RSM, les SOP harmonisées sont tout aussi essentielles. Le champ bénéficierait de méthodes compendiales — protocoles standardisés et détaillés publiés par des organismes pharmacopéens — qui garantissent que tous les laboratoires effectuent des tests cohérents et contrôlés pour les AQA AAV. Des documents d’orientation écrits détaillant les meilleures pratiques pour les méthodes couramment utilisées réduiraient encore la variation entre laboratoires et harmoniseraient les flux de travail analytiques. En établissant des MRS de mesure AAV traçables et en mettant en œuvre des pratiques de caractérisation cohérentes et précises, la communauté peut renforcer la base scientifique reliant les CQAs à la sécurité et à l’efficacité, soutenir une prise de décision réglementaire confiante et, à terme, fournir des thérapies géniques plus sûres et plus fiables aux patients.
Tableau 1 : Modèles rAAV actuellement disponibles et leurs caractéristiques
Ce tableau résume les matériaux de référence rAAV disponibles et leurs caractéristiques clés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Ensemble de méthodes analytiques recommandées pour la caractérisation interne des RSM
Ce tableau résume les méthodes analytiques recommandées pour la caractérisation interne des RSM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts
Ce projet a reçu un financement du Programme cadre de l’Union européenne pour la recherche et l’innovation, Horizon Europe, dans le cadre de l’accord de subvention n° 101119880. Ce projet a été financé par la subvention « Flandres Resilience » du gouvernement flamand, issue du « Mécanisme européen de reconstruction et de résilience » (RRF) (VV021/13).
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