Stratégies d’insertion de lentilles spécifiques à une région pour l’imagerie calcique in vivo chez la souris à travers les circuits corticaux et hippocampiques

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’insertion et la stabilisation des lentilles spécifiques à une région afin de permettre une imagerie calcique in vivo fiable chez la souris, afin d’améliorer la reproductibilité et de réduire les essais et erreurs en imagerie calcique.

Résumé

L’imagerie calcique in vivo des populations neuronales utilisant des lentilles optiques implantées chirurgicalement est largement utilisée pour surveiller l’activité des populations neuronales pendant le comportement. Cependant, le succès chirurgical et la qualité de l’imagerie dépendent de manière cruciale des contraintes anatomiques qui varient selon les régions cérébrales. Ce protocole fournit des conseils chirurgicaux spécifiques à la région pour la sélection et l’implantation de lentilles d’imagerie dans les zones corticales et hippocampiques couramment ciblées. Plus précisément, il décrit un flux de travail chirurgical comprenant la localisation de la cible et le nivellement du crâne, la craniotomie régionale et, si nécessaire, le retrait ou l’aspiration de la dure-mère des tissus supérieurs, ainsi que la sélection, l’insertion et la fixation des lentilles et supports appropriés. En particulier, nous décrivons trois stratégies d’implantation : l’implantation conventionnelle du cristallin pour l’hippocampe ventral, l’implantation par aspiration tissulaire pour l’hippocampe dorsal, et l’implantation du cristallin prismatice pour l’imagerie corticale. Nous fournissons également des conseils pratiques sur la manière dont les différences de profondeur tissulaire, d’architecture vasculaire et d’organisation des circuits influencent les paramètres chirurgicaux clés, notamment le diamètre du cristallin, la taille de la craniotomie, l’étendue de l’extraction tissulaire, la vitesse d’insertion, les procédures hémostatiques et les méthodes de fixation. En documentant explicitement les considérations chirurgicales souvent sous-déclarées dans les méthodes écrites, ce protocole vise à réduire les essais et erreurs lors de l’implantation du cristallin et à améliorer la reproductibilité expérimentale. Dans l’ensemble, ce protocole fournit un guide pratique pour sélectionner et mettre en œuvre de manière fiable des stratégies d’implantation de lentilles adaptées à la région à travers les circuits corticaux et hippocampaux.

Introduction

L’imagerie calcique in vivo utilisant des lentilles optiques implantées est devenue une technique centrale pour surveiller l’activité neuronale au niveau de la population chez les animaux en comportement 1,2,3,4,5,6. En permettant des enregistrements longitudinaux à partir d’ensembles neuronaux génétiquement définis, cette approche a fourni des éclairages essentiels sur la dynamique des circuits sous-jacentes à la perception, à l’apprentissage et à la prise^{de décision} 2,6,7,8. Cependant, le succès de l’imagerie basée sur des lentilles dépend non seulement de l’accès optique, mais aussi d’une prise en compte attentive des contraintes anatomiques spécifiques à chaque région. Les régions corticales telles que le cortex préfrontal (CPF), les structures de profondeur moyenne comme l’hippocampe dorsal, et les cibles profondes comme l’hippocampe ventral diffèrent considérablement dans l’orientation des circuits et la tolérance au déplacement tissulaire, entre autres facteurs. Ces différences anatomiques nécessitent des stratégies chirurgicales spécifiques à chaque région pour la sélection et l’implantation du cristallin. Des études antérieures ont établi des méthodes fiables pour imager les neurones dorsaux CA1 chez des souris fixées à la tête en utilisant les lentilles implantées^{verticalement} 6,9,10,11, et les lentilles à prisme sont largement utilisées pour l’imagerie ^{corticale 7,8}, où l’accès optique latéral permet des enregistrements spécifiques à la totalité ou à la laminaire selon l’orientation du circuit cible. Bien que ces approches partagent le principe commun d’accès optique via des lentilles implantées, elles imposent des contraintes chirurgicales distinctes qui doivent être traitées de manière spécifique à chaque région.

Malgré l’adoption croissante de cette technique, une source fréquente d’échec expérimental ne réside pas dans une mauvaise compréhension conceptuelle, mais dans l’absence de directives chirurgicales suffisamment détaillées et spécifiques à chaque région. En pratique, les enregistrements infructueux résultent fréquemment d’une craniotomie imprécise, d’un ablation de tissu sous-optimale ou d’une prise en compte insuffisante des contraintes vasculaires et structurelles spécifiques à chaque région. Bien que les procédures générales d’implantation de lentilles aient été décrites dans les protocoles^{précédents 9, 10, 11, 12}, les subtilités chirurgicales pratiques qui déterminent le succès en imagerie, en particulier celles qui diffèrent selon les régions cibles, restent incomplètement documentées.

Ce protocole vidéo comble cette lacune en fournissant des indications explicites et spécifiques à chaque région pour la sélection et l’implantation du cristallin à travers des cibles corticales et hippocampiques, en utilisant le CPF ainsi que les régions CA1 dorsale et ventrale de l’hippocampe comme exemples représentatifs. Plus précisément, nous décrivons trois stratégies d’implantation, chacune adaptée aux contraintes anatomiques et chirurgicales de la région cible, et nous mettons en évidence les points de décision clés ainsi que les écueils techniques associés à chaque approche.

Dans l’imagerie CA1 hippocampale dorsale, le diamètre relativement grand des lentilles conventionnelles nécessite souvent une aspiration tissulaire pour créer suffisamment d’espace pour l’implantation. Si l’ablation tissulaire est incomplète ou mal réalisée, le tissu environnant peut être comprimé plutôt que déplacé, entraînant une accumulation de neurones près de la surface du cristallin et la formation de couches cellulaires densément compactes qui obscurcissent le plan d’imagerie prévu. Pour l’hippocampe ventral, situé profondément dans le cerveau, un ciblage précis nécessite un contrôle précis de l’angle d’insertion, de la trajectoire et de la vitesse de pénétration afin de minimiser les lésions tissulaires et d’assurer un positionnement correct. En revanche, l’implantation de lentilles prismatiques pour l’imagerie PFC met davantage l’accent sur la minimisation des saignements et la préservation de l’intégrité corticale grâce à une craniotomie précise et à une insertion soigneuse du cristallin afin d’éviter des dommages vasculaires.

Ce protocole est destiné aux chercheurs qui envisagent de mettre en œuvre l’imagerie calcique basée sur le cristallin GRIN dans des cibles corticales ou hippocampiques chez des rongeurs, en particulier ceux ayant rencontré des difficultés en matière de reproductibilité chirurgicale ou de qualité d’imagerie. Il est particulièrement pertinent pour cibler le CA1 dorsal, le CA1 ventral ou le cortex préfrontal, et lorsqu’on utilise des lentilles GRIN ou prismatices standard en combinaison avec un miniscope ou un système d’imagerie équivalent monté sur la tête. Les chercheurs ciblant d’autres régions cérébrales ou utilisant différentes configurations matérielles devraient considérer les principes spécifiques à chaque région décrits ici comme des lignes directrices adaptables plutôt que comme des procédures fixes. En documentant explicitement ces considérations pratiques, cette vidéo vise à réduire les essais et erreurs, à améliorer la reproductibilité entre les laboratoires et à fournir un cadre de principe pour sélectionner les stratégies d’implantation appropriées.

Protocole

Toutes les procédures de soins et expérimentales des animaux ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut avancé coréen de science et de technologie (KAIST) sous le numéro d’approbation KA2025-060-V3. Toutes les expériences étaient conformes au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale et diminuer le nombre d’animaux utilisés.

1. Étapes préparatoires à l’opération

REMARQUE : Ce protocole a été développé avec des souris adultes de 8 semaines C57BL/6J et VIP-Cre knock-in (RRID : IMSR_JAX :000664, IMSR_JAX :031628). La même approche générale peut être appliquée à d’autres souches ; cependant, certains ajustements à des détails spécifiques, comme les coordonnées de la cible, peuvent être nécessaires.

1. Anesthésiez la souris avec un dosage d’isoflurane à 3 % délivré par inhalation à un débit de 1 L·^min-1 dans une chambre d’induction.
2. Fixez la souris dans un cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreilles et placez le masque anesthésiant sur le museau.
   REMARQUE : Maintenez la même concentration anesthésique tout au long de la procédure.
3. Réglez le système homéotherme à 33,5 °C pour maintenir la température corporelle pendant l’opération.
4. Rasez la zone chirurgicale et retirez les poils résiduels avec un coton-tige trempé dans une solution de gluconate de chlorhexidine.
5. Appliquez du lubrifiant pour les yeux de la souris et recouvrez-les de petits morceaux de papier aluminium pour les protéger pendant l’opération.
6. Avant l’incision, effectuez une pincement de l’orteil pour confirmer que la souris est complètement anesthésée.
7. Injectez localement la solution de lidocaïne à 1 % (mélangée à 0,5 % de bupivacaïne) au site de l’incision et administrez la solution de kétoprofène à 1 % par injection intramusculaire.
8. Incire la peau en forme elliptique, dimensionnée pour offrir suffisamment d’espace pour l’implantation ultérieure de la tête de la tête. Faites attention à ne pas couper les muscles autour du crâne.
   REMARQUE : Une incision excessive peut provoquer une inflammation importante, qui peut interférer avec les enregistrements à long terme dans la même région.
9. À l’aide de cotons-tiges stériles, rétractez doucement l’incision latéralement. Nettoyez la surface du crâne exposée avec des cotons-tiges stériles puis grattez légèrement avec un grattoir.
   REMARQUE : Cette étape élimine les débris et rugueuse légèrement la surface pour faciliter la fixation ultérieure de la lentille et de la plaque de tête.
10. Pour l’alignement selon l’axe antéropostérieur (AP), utilisez le bregma et le lambda comme points de référence. Mesurez les différences de hauteur entre les points de référence à l’aide d’une aiguille calibre 26.
11. Si l’axe AP n’est pas à niveau, desserrez le masque anesthésique et ajustez la hauteur de l’adaptateur de mâchoire sur le cadre stéréotaxique jusqu’à ce que la différence de hauteur entre bregma et lambda soit inférieure à 0,02 mm.
12. Pour l’alignement le long de l’axe médiolatéral (ML), utilisez des points ± 3 mm de la ligne médiane comme points de référence.
13. Si l’axe ML n’est pas à niveau, repositionnez correctement les barres d’oreilles jusqu’à ce que la différence de hauteur gauche-droite soit à moins de 0,02 mm.

2. Craniotomie

1. Marquez les emplacements des cibles (par exemple, PFC, hippocampe) sur le crâne à l’aide d’une aiguille trempée dans l’encre. Lorsque vous marquez l’emplacement de la cible, marquez également les limites de forage dans les directions antérieure, postérieure, médiane et latérale.
   REMARQUE : Pour la PFC, où l’implantation est guidée par des repères vasculaires, une lentille de 1 mm nécessite une ouverture de 1,5 mm (Figure 1A). Pour l’hippocampe ventral, une cible profonde, une lentille de 0,6 mm nécessite une ouverture de 0,8 mm (Figure 1B). Pour l’hippocampe dorsal, où une aspiration tissulaire est nécessaire, une lentille de 1 mm nécessite une ouverture de 1,2 mm (Figure 1C) pour minimiser l’espace non soutenu autour de la lentille et diminuer le déplacement latéral lors du positionnement avant la fixation de l’adhésif.
2. Créez une ouverture carrée arrondie à l’aide d’une perceuse manuelle guidée par des marques.
3. Lors de la première étape, le forage doit être effectué aussi verticalement que possible pour éviter les bords inclinés en forme.
4. Effectuez le forage en plusieurs étapes courtes pour minimiser le risque de lésions cérébrales.
   REMARQUE : Évitez de déchirer la dure-mère pendant ce processus.
5. Lorsque le crâne restant devient très fin (comme le confirme une pression douce avec une pince), soulevez le lambeau osseux à l’aide de pinces, en veillant à ne pas endommager la surface cérébrale.
6. Lisser les bords à une vitesse de forage réduite (Figure 2A). Si des fragments d’os pointus subsistent le long du bord du crâne (Figure2B), ils peuvent endommager le cristallin ou la surface cérébrale.
7. Retirez soigneusement tous les débris osseux générés lors du forage. Irriguez le site avec du sérum physiologique pour éliminer les fragments osseux restants.

Figure 1. Exemples représentatifs de forage du crâne pour chaque région cible Photographies représentatives de crânes de souris après craniotomie. (A) Craniotomie ciblant le cortex préfrontal. (B) Craniotomie ciblant l’hippocampe ventral. (C) Craniotomie ciblant l’hippocampe dorsal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2. Forage du crâne et finition des bords Illustration schématique du forage et finition du tranchant. (A) Schéma en coupe transversale d’une craniotomie correctement finie avec une limite inférieure polie de façon fluide. (B) Exemple montrant des restes d’os tranchants causés par un polissage insuffisant du bord inférieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Préparation des tissus préimplantatoires

Avant d’insérer la lentille, préparez le tissu pour permettre une insertion stable de la lentille. Selon la cible, utilisez soit la méthode 3.1, soit la 3.2.

1. Ablation de la dure-mère (pour hippocampe ventral, cortex préfrontal) : Si une aspiration de tissu cérébral est réalisée, l’ablation de la dure-mère n’est pas nécessaire. Cependant, si le cristallin est implanté sans aspiration tissulaire, la dure-mère doit être retirée.
   1. Pour retirer la dure-mère, pliez légèrement la pointe d’une aiguille à seringue d’insuline et utilisez-la comme outil de coupe.
   2. Incisez soigneusement la dure-dure-mère par petites étapes. Si nécessaire, maintenez le tissu incisé avec une pince fine tout en coupant les parties restantes. Veillez à ne pas endommager le cerveau pendant ce processus.
2. Aspiration du tissu supérieur (pour l’hippocampe dorsal) : Cette approche nécessite un intervalle minimum de deux semaines entre l’injection du virus et l’implantation du cristallin afin d’éviter la perte ou la réduction de l’expression virale due à l’aspiration.
   REMARQUE : Il n’est pas recommandé de réaliser une aspiration tissulaire avant l’injection virale, car l’injection dans un tissu récemment endommagé peut compromettre une expression stable. Inversement, permettre une longue période de récupération après l’aspiration est également sous-optimal, car la repousse tissulaire peut freiner l’implantation ultérieure du cristallin.
   1. Connectez la pompe à un tuyau de 8 mm de diamètre, qui est ensuite connecté à l’extrémité d’une seringue de 1 ml. Toutes les connexions sont hermétiquement scellées avec du ruban adhésif pour éviter les fuites d’air.
      REMARQUE : Utilisez une pompe à aspiration capable de générer une pression négative maximale d’au moins 50 kPa. Comme la pompe peut générer d’importantes vibrations, placez-la à l’écart de la table chirurgicale.
   2. Connectez l’aiguille lissée de calibre 24 à l’extrémité de la seringue de 1 mL connectée (Figure 3).
   3. Augmentez la pression de la pompe d’aspiration à au moins 50 kPa.
   4. Rapprochez soigneusement la pointe de l’aiguille du tissu afin que le tissu soit aspiré avec le sérum physiologique. Pendant cette étape, utilisez une main pour manipuler l’aiguille d’aspiration tandis que l’autre main applique continuellement du sérum physiologique avec une seringue. Cela empêche le sang d’obstruer la vue et facilite une aspiration fluide.
      REMARQUE : Bien que des saignements soient anticipés pendant le processus d’aspiration, cela ne nécessite pas de cycles répétés d’aspiration et d’hémostasie. Il est important d’éviter une aspiration excessive aux sites de saignement actif, car elle peut aggraver les hémorragies par des perturbations mécaniques supplémentaires.
   5. Effectuez l’aspiration tissulaire par petites échelons. À intervalles réguliers, irriguez le champ chirurgical avec du sérum physiologique pour évaluer l’étendue et l’emplacement de l’extraction des tissus.
   6. Retirer le tissu cérébral au-dessus de la cible dans un volume en forme d’entonnoir centré sur la cible plutôt que d’enlever le tissu sur toute l’ouverture. Une illustration schématique de cette procédure est fournie à la Figure 4.
      REMARQUE : Pour cela, ne pas approcher le tissu uniquement sous un angle ; Au lieu de cela, ajustez l’aiguille à plusieurs angles lors de l’aspiration.
   7. L’ablation tissulaire doit s’arrêter légèrement au-dessus de la région cible, en laissant une fine couche intacte. Pour l’hippocampe dorsal, l’aspiration est avancée au niveau du corps calleux ; L’aspiration est arrêtée une fois que la substance blanche sous le cortex devient visible (ne pas retirer le corps calleux).
3. Si un saignement survient après l’ablation de la dure-mère ou l’aspiration tissulaire, appliquez une éponge à la gélatine (par exemple, Cutanplast) trempée dans une solution saline refroidie (4 °C) pour contrôler les saignements avant la coagulation. Veillez à empêcher le sang de rester dans le champ chirurgical.
   REMARQUE : Au lieu d’essuyer le sang, appliquez une pression douce avec l’éponge.
4. Une fois le cerveau exposé, placez l’éponge à la gélatine imbibée de solution saline sur la zone pour maintenir le tissu humide tout au long de la procédure jusqu’à l’implantation du cristallin.

Figure 3. Installation du dispositif d’aspiration : photographie de l’ensemble du dispositif d’aspiration terminé. L’extrémité distale du tube est reliée à une pompe à aspiration, et toutes les jonctions sont solidement scellées pour assurer une aspiration stable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4. Aspiration tissulaire lors de la préparation de la craniotomie Une illustration schématique représentant la profondeur et l’étendue approximatives de l’aspiration tissulaire requise pour l’implantation du cristallin ciblant dCA1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Implantation de cristallin

Deux méthodes d’implantation de lentilles seront décrites ici. Les deux impliquent d’insérer le cristallin en le faisant avancer dans le tissu, mais ils diffèrent dans la manière dont le cristallin est appliqué. Sélectionnez la méthode appropriée parmi les sections 4.1 et 4.2.

1. Implantation de lentille avec support de lentille en aluminium (pour la PFC et le CA1 ventral)
   1. Avant la séance chirurgicale, assurez-vous que la lentille GRIN (ou prisme) est fixée de façon permanente dans le porte-lentille^{en aluminium 9} à l’aide de super glue.
   2. Immédiatement avant l’implantation, stériliser le cristallin et le support du cristallin par immersion dans une solution de gluconate de chlorhexidine à 0,5 %. Avant la pose du cristallin, assurez-vous que la solution est complètement sèche.
   3. Montez l’unité porte-lente préassemblée sur le manipulateur stéréo-taxique de monture, en veillant à ce que les écrous soient bien serrés pour éviter le déplacement lors de l’insertion.
   4. Comme la lentille peut ne pas être parfaitement orthogonale au support, il faut d’abord aligner manuellement la tige filetée à l’œil pour s’assurer qu’elle est alignée horizontalement avec le cadre stéréotaxique ou les repères environnants.
   5. Une fois l’alignement visuel atteint, utilisez un microscope stéréoscopique pour régler la référence du point zéro au niveau de la brèche.
   6. Baissez l’objectif à un débit constant de 0,5 mm·^min-1 (pour la PFC). Pour les zones cérébrales profondes comme l’hippocampe ventral, utilisez un taux d’insertion plus lent pour minimiser les dommages tissulaires et garantir une ciblage précis.
   7. Lors de l’implantation du cristallin dans l’hippocampe ventral, avancez le cristallin de 0,2 mm toutes les 2 minutes jusqu’à atteindre une profondeur de 2,0 mm. Continuez à baisser lentement l’objectif de 2,0 mm à 3,0 mm.
   8. L’étape d’avancement est réduite à 0,1 mm toutes les 2 minutes, au-delà de 3,0 mm de profondeur.
   9. Abaissez l’objectif par étapes de 0,05 mm toutes les 2 minutes jusqu’à atteindre la profondeur finale de la cible.
   10. Comme ce processus provoque souvent des saignements importants, appliquez de petits morceaux d’éponge gélatineuse imbibés de solution saline stérile sur le site de la craniotomie afin de maintenir un champ dégagé et de contrôler les saignements lors de l’avancement du cristallin.
   11. Après que la lentille atteigne la profondeur de cible, attendez au moins 10 minutes que le site chirurgical sèche complètement. L’humidité résiduelle peut compromettre l’adhérence du ciment dentaire.
   12. Une fois sec, appliquez l’adhésif jusqu’à ce que tout l’ensemble soit couvert, ne laissant exposée que la surface supérieure du porte-lentille.
   13. Une fois l’adhésif complètement durci, pour minimiser les chocs mécaniques lors du détachement du support, desserrez partiellement les barres d’oreilles.
   14. Coupez le chevalet du support avec des pinces. Une fois la coupe terminée, resserrez les barres d’oreilles avant de procéder aux étapes suivantes.
2. 4.2. Implantation du cristallin avec pompe d’aspiration (pour le CA1 dorsal)
   1. Préparation du porte-objectif : Reliez l’extrémité étroite d’une pointe P1000 à un tuyau en caoutchouc de 4 mm de diamètre, et l’extrémité opposée du tuyau est connectée à une seringue de 1 mL. Tous les joints sont scellés avec du ruban en téflon pour garantir des connexions hermétiques.
   2. Montez horizontalement la seringue de 1 mL connectée au tuyau sur le support stéréotaxique.
   3. Assemblage de la pointe : Coupez la pointe P1000 à 2 et 27 mm de l’extrémité étroite et gardez le segment de 2 à 27 mm. Coupez la pointe du P200 à 24,5, 27 et 45 mm à partir de l’extrémité étroite, et gardez les segments de 0–24,5 mm et 27–45 mm (Figure 5A).
   4. Insérez le segment 0–24,5 mm de la pointe P200 dans le segment 27–45 mm et fixez avec de la super glue (par exemple Loctite, Figure 5B). Insérez les segments P200 assemblés dans le segment de pointe P1000 et fixez-le avec de la super glue. Alignez les axes centraux de tous les segments de pointe. Réglez la distance entre l’extrémité de la pointe P1000 et l’extrémité étroite de la pointe intérieure P200 à 1 mm (Figure 5C).
   5. Retirez l’aiguille d’aspiration fixée à la seringue et remplacez-la par un porte-lentille fixé au porte-lentille stéréotaxique (décrit ci-dessus).
   6. Stérilisez la lentille en l’immergeant dans une solution de gluconate de chlorhexidine à 0,5 % avant de la charger dans le porte-cristallier.
   7. Montez le porte-objectif sur le système stéréotaxique et réglez la pompe à vide à ≥ 50 kPa. Fixez l’ensemble de la pointe (décrit ci-dessus) au support via un press-fit et chargez la lentille dans l’ensemble de la pointe à l’aide de pinces.
   8. Placement de l’objectif : Après avoir confirmé la fixation stable de l’objectif à l’ensemble de la pointe, positionnez le bord inférieur de l’objectif au niveau de la brèche comme point de référence, puis déplacez-vous vers la cible. Avancez la lentille d’une distance supplémentaire égale à son rayon (0,5 mm dans ce cas) le long de l’axe antéropostérieur (AP) afin d’aligner le centre de la lentille avec la cible.
   9. Alignez la pointe du cristallin avec le bord médial de la craniotomie.
   10. Abaissez la lentille de 1,7 mm le long de l’axe dorsovental (DV) (pour le CA1 dorsal). Si un saignement survient lors de l’avancement, rétractez lentement le cristallin, arrêtez le saignement, retirez le sang du cristallin et reprenez l’insertion.
       REMARQUE : Avancez les premiers 0,7 mm à un rythme de 0,1 mm toutes les 10 s et avancez lentement le 1 mm restant à un rythme de 0,2 mm par minute.
   11. Une fois que le cristallin atteint la cible, fixez le cristallin (décrit ci-dessous) à l’aide de Superbond et de ciment dentaire après avoir laissé la surface du crâne sécher complètement. À ce stade, veillez à empêcher l’adhésif de toucher l’interface entre la lentille et le porte-joint.
   12. Pour retirer le support après fixation, éteignez l’aspirateur, puis détachez le support et le tuyau.
       REMARQUE : Cette séquence garantit qu’aucune pression négative résiduelle ne reste dans le système après la désactivation de la pompe.
   13. Soulevez le support avec précaution pour éviter de faire tomber l’ensemble de la pointe.

Figure 5. Assemblage de pointes (A) : Segments des pointes de pipette P1000 et P200 utilisés pour la construction de l’ensemble de pointes. (B) Schéma de la configuration assemblée. Insérez le segment de pointe P200 plus petit dans le segment de pointe P200 plus grand, puis placez le segment P1000 à l’extérieur. (C) Ensemble de pointe entièrement assemblé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

5. Cimentation

1. Appliquez du ciment à résine dentaire (par exemple Super-Bond C&B) pour couvrir la surface du crâne et la surface latérale du cristallin.
2. Une fois l’adhésif complètement durci, retirez le porte-lentille comme décrit ci-dessus.
3. Utilisez le ciment dentaire pour recouvrir le crâne exposé en une couche en forme de dôme. Assurez-vous que la lentille ne dépasse pas au-dessus du niveau du ciment dentaire.
4. Appliquez du ciment noir ou du vernis à ongles noir autour de la lentille pour éviter les interférences de la lumière ambiante.
5. Pour protéger la lentille, couvrez la surface de l’objectif avec un mastic siliconique (par exemple Kwik-Cast). Après que le scellant silicone a durci, appliquez de la colle siliconique (par exemple Kwik-sil) sur le ciment dentaire (Figure 6).
   REMARQUE : Ce protocole est basé sur l’implantation d’une lentille GRIN standard. Une chirurgie secondaire de la plaque de base est donc nécessaire après la récupération. Laissez 4 à 8 semaines après l’injection pour une expression virale suffisante, puis identifiez le plan focal optimal avant de fixer définitivement la plaque de base.

Figure 6. Schémas de cimentation et d’étanchéité pour la fixation de lentille Illustrations schématiques de fixation de lentille après implantation. Le superliaison est appliqué sur la surface latérale du cristallin et sur le crâne environnant (gris). Après un durcissement complet du superliant, le ciment dentaire est formé en dôme pour correspondre à la hauteur du cristallin (rose). Une fois le ciment durci, un scellant siliconé est appliqué pour recouvrir la surface de la lentille (vert). Enfin, une colle silicone est appliquée pour recouvrir et entourer le dôme en ciment (bleu clair). (A) Fixation du cristallin ciblant l’hippocampe dorsal. (B) Fixation de lentille ciblant le PFC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

L’analyse histologique après l’implantation du cristallin en utilisant le protocole ci-dessus a confirmé un placement précis à la fois du cristallin GRIN et du cristallin GRIN couplé à prisme. Dans les deux cas, les lentilles étaient correctement positionnées pour enregistrer l’activité neuronale du cortex préfrontal médial (Figure 7A) et de la région CA1 de l’hippocampe dorsal (Figure 7B), respectivement.

Discussion

Le succès de l’imagerie calcique in vivo basée sur le cristallin dépend de plusieurs étapes chirurgicales qui varient selon les régions cérébrales et les géométries du cristallin, chacune déterminant directement la qualité et la fiabilité des signaux enregistrés. La figure 10 résume le flux de travail chirurgical global pour chaque stratégie d’implantation. Une taille précise de la craniotomie est une étape fondamentale : une ouverture trop grande p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
8  ; TUYAU MM (DIAMÈTRE EXTÉRIEUR)	Tygon	E-3603
Pompe à aspiration	Cliq	VC-701
Ciment noir (Liquide Ortho-Jet contemporain)	Lang Dental Mfg. Co.	1506, noir
Ciment noir (Poudre Ortho-Jet contemporaine)	Lang Dental Mfg. Co.	1530, noir
Bupivacaïne HCl injection lourde	Myungmoon	649801341
Solution de gluconate de chlorhexidine 5 %	Sungkwang	657400190
Cutanplast (dentaire)	Mascia Brunelli	5610101
Ciment dentaire	Sommet	Type 2, Classe 2
Mèche (diamètre de la pointe : 0,5 & nbsp ; mm)	Outils scientifiques finement	19007-05
Lubrifiant pour les yeux (Optixcare Pet Eye Lube Plus)	Santé animale Aventix	OPX-4242
Pinces	Outils scientifiques finement	11254-20, 11051-10
Objectif GRIN (0,6  ; & Times ;   ; 7,3  ; mm)	Inscopix	1050-004597
Objectif GRIN (1.0  ; & Times ;   ; 4.0  ; mm)	Inscopix	1050-004595
Système homéotherme pour contrôler la température corporelle chez les petits animaux	Appareil de Harvard	Modèle : HB101
Isoflurane (Terrell)	Piramal	NDC 66794-011-25
Injection de kétoprofène 100  ; mg/2  ; mL	Bukwang	642201001
Kwik-Cast	Instruments de précision mondiaux	KWIK-CAST
Kwik-Sil	Instruments de précision mondiaux	KWIK-SIL
Injection d’hydrates de lidocaïne HCl 2 %	Daihan	645104361
Vernis à ongles (Noir)	Wakemake	11
Objectif Prisme GRIN (1,0 x 4,3 mm)	Inscopix	1050-004601
Solution saline	JW Pharmaceutical Corporation	201703175
Micruscope stéréo	Olympe	SZ61
Porte-électrodes stéréo-taxiques (porte-électrodes standard)	KOPF	Modèle 1770
Super bond C & B (Catalyseur)	Sun Medical	0334-0010
Super bond C & B (radiopaque de type L)	Sun Medical	0334-0020
Super bond C & B (Monomère)	Sun Medical	0334-0013
Ciseaux chirurgicaux	Outils scientifiques finement	14060-10
Colle UV (adhésif optique Norland)	Produits Norland	NOA 63