Préparation standardisée du muscle lisse duodénal isolé chez le lapin pour l’évaluation pharmacologique in vitro de l’activité contractile

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour standardiser la préparation du muscle lisse duodénal isolé du lapin pour l’évaluation pharmacologique in vitro , en utilisant un système d’expérience du muscle lisse horizontal à température constante pour l’enregistrement en temps réel de l’activité contractile.

Résumé

L’activité contractile coordonnée du muscle lisse gastro-intestinal constitue la base physiologique du maintien de la digestion, de l’absorption et du transport normaux, avec une dysfonction étroitement liée aux troubles de la motilité. La technique de perfusion d’organes isolés élimine les interférences complexes in vivo — telles que les facteurs neuraux, endocriniens et hémodynamiques — servant de modèle classique pour les études pharmacologiques. À cette fin, cette étude détaille un protocole par étapes pour la préparation standardisée du muscle lisse duodénal isolé chez le lapin. Le flux de travail procédural met en lumière les étapes cruciales de la préparation des solutions, de l’euthanasie du lapin, de la réalisation d’une laparotomie aseptique précise du milieu de l’abdomen pour une excision rapide des tissus, de la suspension des bandes de muscle lisse et de l’étalonnage des transducteurs pour l’enregistrement en temps réel de la tension. Sur la base de cette plateforme technique, nous avons validé la méthode en évaluant les effets du liquide oral Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL) sur les contractions spontanées et les contractions tétaniques induites par l’acétylcholine/chlorure de baryum. En conclusion, ce protocole offre un cadre méthodologique robuste et hautement reproductible, fournissant une plateforme de dépistage in vitro largement applicable pour l’évaluation pharmacologique des agents thérapeutiques ciblant la motilité gastro-intestinale.

Introduction

L’activité contractile coordonnée du muscle lisse gastro-intestinal sert de fondement physiologique pour maintenir des fonctions digestives, absorbantes et de transport^normales. Son dysfonctionnement est étroitement associé à divers troubles cliniques courants, notamment le syndrome du côlon^{irritable 2}, la dyspepsie^{fonctionnelle 3} et les troubles de la motilité gastro-intestinale^{postopératoire 4}. L’élucidation des mécanismes moléculaires et pharmacologiques régulant l’activité des muscles lisses est cruciale pour développer de nouvelles thérapies prokinétiques ou antispasmodiques. Dans ce domaine de recherche, la technique de perfusion d’organes isolés sert de modèle classique. Il offre une valeur pratique en éliminant les interférences complexes in vivo telles que les facteurs neuronaux, endocriniens et hémodynamiques, permettant ainsi une évaluation directe et précise des effets des médicaments ou des substances actives sur le tonus musculaire^{lisse 5,6}.

Établir des protocoles stables et fiables pour la préparation des tissus in vitro et l’enregistrement des données est essentiel pour obtenir des résultats reproductibles et de haute qualité. Les méthodes expérimentales in vitro existantes sur les muscles intestinaux nécessitent une optimisation et une standardisation supplémentaires dans plusieurs domaines : gestion standardisée des animaux expérimentaux, techniques chirurgicales méticuleuses pour la récolte des tissus, contrôle environnemental cohérent des systèmes de perfusion, et acquisition automatisée de données associée à une analyse standardisée. Par exemple, la température et le pH du liquide de perfusion, les dommages mécaniques lors de la prélève des tissus et les réglages de précharge tissulaire peuvent tous impacter significativement la viabilité des tissus et introduire des erreurs expérimentales. Ces facteurs compromettent la fiabilité des résultats et nuisent à la comparabilité entre différentes^{études 7,8}.

Par conséquent, cette étude vise à établir et à élaborer un protocole standardisé pour préparer des spécimens isolés de muscle lisse duodénal provenant de lapins et pour réaliser l’enregistrement en temps réel des tensions. Ce protocole décrit systématiquement l’ensemble du processus, de l’éthique et du bien-être expérimentaux des animaux, à la laparotomie aseptique et à l’isolement précis des segments intestinaux, à la réalisation du contrôle environnemental, à la normalisation des réglages de précharge sous tension et à l’acquisition de données haute fidélité grâce à un système intégré de perfusion horizontale à température constante et un système d’acquisition physiologique multicanal. Sur la base de cette plateforme technique standardisée, nous avons également appliqué des méthodes de dosage cumulativ pour évaluer quantitativement les effets du liquide oral Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), répondant aux normes de qualité de la Pharmacopée chinoise (édition 2025)⁹, sur les contractions spontanées et les contractions tétaniques induites par l’acétylcholine et le chlorure de baryum dans des muscles lisses duodénaux isolés. Le liquide oral Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), une forme orale de la formule classique de la médecine traditionnelle chinoise Huoxiang Zhengqi, est couramment utilisé en Chine pour les troubles gastro-intestinaux, fournissant la justification pour évaluer ses effets directs sur le muscle lisse intestinal isolé. Cette étude fournit non seulement des preuves pharmacologiques expérimentales directes éclairant les effets régulateurs du muscle lisse gastro-intestinal de l’HXZQ-OL, mais le protocole expérimental sert également de modèle méthodologique standardisé et reproductible pour le dépistage pharmacologique et les études tissulaires in vitro du muscle lisse gastro-intestinal.

Protocole

Des adultes en bonne santé de lapins blancs de Nouvelle-Zélande, de chaque sexe (pesant 2,0 à 2,5 kg), ont été utilisés dans ce travail. Toutes les procédures expérimentales animales ont été menées conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité d’éthique des animaux de laboratoire de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (Approbation n° : [2026070]). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale et diminuer le nombre d’animaux utilisés. Le diagramme de flux de travail est illustré à la Figure 1.

1. Préparation de la solution

REMARQUE : Toutes les solutions de travail, y compris la solution de Tyrode, l’acétylcholine (ACh), le chlorure de baryum, l’atropine et le verapamil, doivent être préparées fraîches immédiatement avant l’expérience.

1. Préparez 1 L de solution de Tyrode en dissolvant 137 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl₂, 0,4 mM de NaH₂PO₄, 1,0 mM de MgCl₂, 12 mM de NaHCO₃ et 5,6 mM de D-glucose. Avant utilisation, saturez avec un mélange 95 % O₂ / 5 % CO₂ pendant 15 à 30 minutes, en ajustant le pH à 7,3–7,4 (voir le tableau des matériaux).
2. Préparez une solution d’origine ACh de 1 mM. Prenez 20 μL et ajoutez 20 mL de solution de Tyrode. Mélangez soigneusement pour obtenir une solution ACh de 1 μM.
3. Préparez une solution de bouillon de chlorure de baryum (BaCl₂) de 1 M. Prenez 20 μL et ajoutez 20 mL de solution de Tyrode. Mélangez soigneusement pour obtenir une solution de 1 mM de BaCl₂.
   REMARQUE : BaCl₂ est très toxique et irritant. Lors de la manipulation, portez un équipement de protection individuelle dans une hotte à fumée et jetez les déchets liquides conformément à la réglementation.
4. Préparez une solution de bouillon de sulfate d’atropine de 10 mM. Prenez 20 μL et ajoutez 20 mL de solution de Tyrode. Mélangez soigneusement pour obtenir une solution de sulfate d’atropine à 10 μM.
5. Préparez une solution de bouillon d’hydrochlorure de verapamil de 1 m. Prenez 2 μL et ajoutez 20 mL de solution de Tyrode. Mélangez soigneusement pour obtenir une solution d’hydrochlorure de vérapamil à 0,1 μM.
   REMARQUE : Les concentrations des solutions préparées ont été déterminées en se référant aux études^{antérieures 6, 10, 11} et ont été optimisées lors de nos expériences préliminaires afin d’assurer des conditions expérimentales optimales.

2. Préparation in vitro de spécimens de muscle lisse duodénal de lapin

1. Euthanasie du lapin
   1. Sécuriser le lapin dans le dispositif de contention (Figure 2A, B et Figure 3A). Effectuer l’euthanasie en administrant une surdose de pentobarbital sodique (120 mg/kg) via la veine auriculaire chez les lapins (Figure 2C et Figure 3B).
      REMARQUE : La mort complète doit être confirmée selon les critères suivants : pupilles dilatées, absence de réflexe lumineux pupillaire, arrêt de la respiration et du battement cardiaque, et perte du réflexe plantaire.
2. Préparation et désinfection du site chirurgical
   1. Fixez le lapin en position couchée sur la table d’opération (Figure 2D et Figure 3C). À l’aide de ciseaux chirurgicaux (Figure 2E) ou d’un rasoir électrique, retirez soigneusement tous les poils abdominaux afin d’exposer la peau dans la zone chirurgicale désignée (Figure 3D).
   2. À l’aide d’une pince éponge (Figure 2E), saisir une boule de coton imbibée d’iode (Figure 2F,G). En commençant par le centre de l’incision chirurgicale prévue, appliquez la solution antiseptique selon un motif concentrique et circulaire de l’intérieur vers l’extérieur (Figure 3E).
      REMARQUE : La zone de désinfection doit s’étendre au-delà des bords de l’incision afin d’assurer une couverture complète de toute la peau du champ chirurgical. Après la désinfection, attendez au moins 3 minutes pour laisser l’antiseptique sécher naturellement sur la surface de la peau.
   3. Placez un drape stérile (Figure 2H) sur la zone abdominale désinfectée pour exposer le champ chirurgical (Figure 3F).
3. Positionnement et incision de l’incision abdominale
   1. À l’aide d’un scalpel (lame #23) (Figure 2E), réalisez une incision longitudinale de 8 cm le long de la ligne médiane de l’abdomen, depuis le dessous du processus xiphoïde jusqu’au-dessus de la symphyse pubienne.
   2. Disséquez la peau et les tissus sous-cutanés couche par couche. En suivant la ligne blanche, disséquez la gaine antérieure du muscle droit de l’abdomen, les fibres musculaires et le péritoine couche par couche pour pénétrer dans la cavité abdominale (Figure 3G).
   3. REMARQUE : Pendant la procédure, évitez d’endommager les organes abdominaux tout en assurant l’hémostasie afin d’éviter la contamination du sang du champ chirurgical et des organes abdominaux.
4. Séparation duodénale
   1. Ouvrez la cavité abdominale le long de l’incision (Figure 3H). Rétractez doucement les lobes hépatiques céphales à l’aide d’une gaze saline humide (Figure 2I) pour exposer complètement l’estomac et le duodénum (Figure 3I).
   2. Sélectionnez le segment initial du duodénum (bulbaire ou partie descendante supérieure) situé à 2–3 cm du pylore comme site de prélèvement des tissus.
   3. REMARQUE : Évitez la traction directe ou le pincement du segment intestinal cible autant que possible afin de minimiser les blessures mécaniques. Utilisez plutôt des pinces émoussées pour saisir doucement le mésentère adjacent, ou des cotons-tiges humidifiés au sérum physiolique pour manipuler et positionner délicatement le tissu.
   4. À l’aide de ciseaux ophtalmiques stériles (Figure 2E), réséquez rapidement et précisément un segment de 1 à 2 cm (Figure 2J) du tube duodénal (Figure 3J,K).
   5. Transférez immédiatement le segment intestinal excisé dans une cuvette de culture (Figure 2K) contenant une solution de Tyrode prérefroidie (4 °C) perfusée en continu avec un gaz mélangé (95 % O₂ / 5 % CO₂).
5. Coupe, nettoyage et stockage temporaire des segments intestinaux
   1. À l’aide de pinces ophtalmiques (Figure 2E), disséquez doucement le mésentère et le tissu adipeux environnant adhérant à la paroi intestinale.
   2. À l’aide d’une seringue remplie de solution de Tyrode froide (équipée d’une aiguille à pointe émoussée) (Figure 2L), injectez doucement la solution de lavement dans la cavité intestinale. Rincez lentement l’intérieur de la cavité intestinale 2 à 3 fois pour bien en dégager le contenu.
   3. Placez les segments intestinaux nettoyés dans une solution de Tyrode fraîche oxygénée et froide pour un stockage temporaire jusqu’aux expériences ultérieures.

3. Démarrage du système expérimental horizontal à température constante du muscle lisse et infusion de solution

1. Ajouter la solution de Tyrode à la plaque de préchauffage du DSQG-1 Horizontal Constant Temperature Smooth Muscle Experiment System (Figure 4B ; voir le tableau des matériaux).
2. Allumez l’alimentation du système, touchez le panneau d’opération pour régler la température du bain à 37 °C, et commencez le préchauffage (Figure 4C).
3. Appuyez sur le bouton Infusion , et le système injectera automatiquement 20 mL de solution de Tyrode dans le réservoir du bain.
4. Appuyez sur le bouton Drainage pour évacuer complètement le liquide dans le récipient de collecte des déchets.
5. Appuyez sur le bouton Rincer , et le système terminera automatiquement le processus de d’abord d’évacuation du contenu puis de remplissage de liquide.
6. Appuyez sur le bouton Arrêt pour interrompre immédiatement tous les processus d’infusion, de drainage et de rinçage en cours.
7. Appuyez sur le bouton Inflation pour introduire continuellement le gaz mélangé (95 % O₂ / 5 % CO₂) dans le bain. Ajustez le débit de gaz à l’échelle 5 pour assurer une oxygénation tissulaire expérimentale ultérieure.
   REMARQUE : L’échelle 5 indique un débit de gaz de 100 mL/min. Des débits de gaz excessivement élevés peuvent entraîner une augmentation de la turbulence de la solution, affectant la stabilité des enregistrements de tension.

4. Connexion d’un système d’enregistrement et de traitement physiologique multicanal avec un fonctionnement logiciel

1. Connectez le câble de données du transducteur du système d’expérimentation horizontale à température constante des muscles lisses au canal 1 du système multi-canal d’enregistrement physiologique et de traitement (Figure 4D).
2. Allumez l’alimentation externe du système d’enregistrement physiologique et de traitement multicanal et démarrez l’ordinateur. Double-cliquez sur l’icône RM6240XC Multi-Channel Physiological Recording and Processing System sur le bureau pour lancer le système logiciel expérimental (voir le tableau des matériaux).
3. Dans la barre de menu, sélectionnez Expérimenter | Gestion | Caractéristiques physiologiques du muscle lisse intestinal pour charger le module expérimental correspondant.
4. Régler les paramètres suivants : mode canal à Tension, fréquence d’échantillonnage à 400 Hz, sensibilité à 1,5 g, constante de temps à DC, et fréquence de filtre à 30 Hz.
5. Cliquez sur le bouton Start en haut à droite de l’interface logicielle pour commencer l’acquisition et l’affichage du signal en temps réel. Cliquez sur le bouton Enregistrer pour afficher simultanément l’oscilloscope et enregistrer le signal acquis sur le disque dur en temps réel.
6. Dans la barre de menu, sélectionnez Expérimenter | Mise à zéro rapide pour ajuster le signal de tension au niveau de base.
   REMARQUE : Si le signal dévie de la ligne de base de plusieurs unités de coordonnées verticales, ajustez manuellement le point zéro du transducteur de tension à l’aide d’un tournevis.
7. Dans la barre de menu, sélectionnez Expérimenter | Méthode d’affichage des données en temps réel | Plaque flottante. Dans la boîte de dialogue qui apparaît, choisissez Mesure en temps réel normale - Rapide pourafficher les données de tension en temps réel du muscle intestinal dans la fenêtre flottante.

5. Réglage de la suspension et de la précharge de tension du bandeau musculaire duodénal

1. Ajustez l’espacement avant-arrière des crochets en faisant pivoter le bouton horizontal selon la longueur de la bande musculaire duodénale, afin de vous assurer qu’elle correspond à la longueur de la bande.
2. Maintenez le segment intestinal dans sa configuration cylindrique naturelle et alignez la ligne de vue avec l’ouverture en section transversale circulaire de la lumière intestinale.
3. À l’aide de pinces ophtalmiques, rétractez doucement l’ouverture intestinale pour maintenir la persévérance.
4. Insérez doucement la pointe du crochet de tissu dans la lumière intestinale.
5. À une distance de 2 à 3 mm de la marge intestinale, percer la paroi intestinale supérieure à couche unique de l’intérieur vers l’extérieur à l’aide de la pointe du crochet de tissu.
   REMARQUE : Le crochet de tissu doit pénétrer la couche musculaire pour assurer un ancrage sécurisé, évitant une fixation superficielle uniquement à la couche sérose, afin d’éviter la découpe mécanique et la déchirure de la paroi intestinale par le crochet lors de l’application de la précharge.
6. L’autre côté de la paroi intestinale est identique au premier côté. Après avoir identifié le point correspondant parallèle, ne pénétrez que la paroi intestinale à couche unique à ce point (Figure 3L).
7. Faites pivoter à nouveau le bouton horizontal pour ajuster l’espacement des crochets, afin de vous assurer que la bande musculaire duodénale reste naturellement détendue.
8. Appliquez progressivement la tension en ajustant le réglage fin unidimensionnel jusqu’à ce que la tension moyenne de la bande musculaire duodénale se stabilise à 0,8 ± 0,1 g (Figure 4A).
   REMARQUE : Inspectez visuellement toute la longueur de l’intestin afin de vous assurer qu’il reste droit et cylindrique, sans torsion, rotation ou replis en spirale. Si ce n’est pas le cas, réduisez immédiatement la tension et réajustez le point de fixation à une extrémité.
9. Avant de commencer l’expérience, équilibrez la bande musculaire duodénale dans la chambre de perfusion pendant 60 minutes. Pendant cette période d’équilibre, remplacer la solution de Tyrode par un tampon frais toutes les 15 à 20 minutes jusqu’à ce que son rythme contractile spontané se stabilise.
   REMARQUE : La période d’équilibre de 60 minutes a été considérée comme complète uniquement lorsque les segments intestinaux isolés ont montré une activité contractile spontanée stable pendant au moins 15 minutes consécutives. Les critères objectifs de stabilisation ont été définis quantitativement comme suit : (1) dérive de la tension au repos de référence de < ±5 %, (2) variance de l’amplitude contractile moyenne de < ±10 % sur des intervalles consécutifs de 5 minutes, et (3) fluctuation de fréquence de < ± 1 cycle/min.
10. Enregistrer la courbe d’activité de contraction spontanée de la bande musculaire duodénale comme données de référence pour les expériences ultérieures.

6. Acquisition expérimentale de données

1. Pour les expériences en cours, dans la barre de menu, sélectionnez Outils | Vue divisée pour effectuer une analyse statistique en temps réel des données de forme d’onde capturées.
2. Pour les fichiers de données stockés, cliquez sur le bouton Ouvrir dans la barre d’outils, sélectionnez un fichier de données enregistré avec l’extension .lsd, et chargez les enregistrements historiques de l’expérience.
3. Cliquez sur l’icône Mesurer dans la barre d’outils, sélectionnez le mode Région . Déplacez le curseur de la souris sur la zone de la forme d’onde, maintenez le bouton gauche enfoncé pour sélectionner deux points quelconques, et le système affichera un panneau de données montrant la valeur moyenne de tension dans ce segment.
4. Cliquez sur l’icône Mesurer dans la barre d’outils, sélectionnez le mode Période . En utilisant le bouton gauche de la souris, cliquez sur cinq pics d’onde distincts consécutifs (points de pic) le long de la forme d’onde. Faites un clic droit sur la souris, et le panneau de données calculera et affichera la fréquence de contraction (en bpm) (Figure supplémentaire S1).

Résultats

Ce protocole expérimental décrit la méthode de préparation standardisée pour les bandes musculaires duodénales isolées du lapin et le processus d’enregistrement en temps réel de leur tension dynamique et des variations de fréquence à l’aide d’un système de perfusion d’organe isolé. En suivant ce protocole, le HXZQ-OL a été ajouté séquentiellement par dosage cumulatif dans un bain de solution de Tyrode de 20 mL, atteignant des concentrations volumiformes finales de 10, 20, 30, 40 et 50 μL/mL dans le bain. En se référant a...

Discussion

Les techniques de perfusion et d’enregistrement des tensions isolées représentent des méthodes classiques pour étudier la physiologie et la pharmacologie des muscles lisses. Leurs résultats revêtent une importance significative pour l’élucidation des mécanismes physiopathologiques sous-jacents aux troubles de la motilité gastro-intestinale, aux maladies vasculaires et aux dysfonctionnements^utérins 12,13,14,15.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0.5-10 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-10
10 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043804
100 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043807
100-1000 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-1250
20 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-010105
200 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-200
50 mL Conical centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
Acetylcholine chloride	Supelco	PHR1546
All-in-One Lab Computer	Lenovo	R5-3500U
Atropine sulfate	Macklin	A822893
Barium chloride	Sigma-Aldrich	342920
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	499609
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Freezing point osmometer	Shanghai Precision Instruments Co., Ltd.	BS100
Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment System	Chengdu Instrument Factory	DSQG-1
Huoxiang Zhengqi Oral Liquid	Taiji Group Co., Ltd.	Z50020409
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Multi-Channel Physiological Recording and Processing System	Chengdu Instrument Factory	RM6240XC
New Zealand White rabbits	Pizhou Dongfang Breeding Co., Ltd. (License No.: SCXK[Su]2022-0004)	either sex (weighing 2.0–2.5 kg)
pH meter	Shanghai Leici	PHS-25
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Povidone-iodine	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Precision balance (0.1 mg)	Sartorius	BCE64i
Saline solution	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium dihydrogen phosphate	Supelco	1063700250
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Verapamil Hydrochloride	Macklin	V820460
Vortex mixer	Kylin-Bell	XW-80A