Protocole pour différencier les cellules souches pluripotentes en cellules primordiales semblables à des cellules germinales

Résumé

Une directive étape par étape pour générer des cellules germinales primordiales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’humain, de manière robuste, en utilisant une méthode monocouche 2D avec une superposition d’extrait membranaire basale.

Résumé

L’utilisation de la différenciation pluripotente des cellules souches humaines in vitro a considérablement élargi la compréhension des événements de spécification de la lignée qui surviennent lors du développement précoce in vivo, une période extrêmement difficile à étudier. L’une des premières lignées embryonnaires spécifiées dans l’embryon humain est la lignée des cellules germinales, caractérisée par l’induction des cellules germinales primordiales (PGC). Les PGC sont la seule population fondatrice des gamètes plus tard dans leur vie, et leur spécification constitue une première étape cruciale vers la fertilité de l’organisme. Ici, un protocole robuste pour générer des cellules de type PGC (PGCLC) à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) est décrit, en commençant par l’évaluation initiale de l’état pluripotent et des caractéristiques cellulaires des hiPSC afin d’assurer une différenciation efficace des PGCLC. Pour cela, les effets des différentes densités cellulaires, des revêtements de plaques et des hiPSC utilisés pour la différenciation des PGCLC sont discutés. Enfin, un flux de travail pour la caractérisation et la quantification des hPGCLC, utilisant l’immunofluorescence et la cytométrie en flux, est fourni. Le protocole de différenciation se concentre sur des conditions faciles à établir et à tester dans la plupart des laboratoires et pouvant être ajustées selon les besoins. De plus, ce protocole est rapide, permettant de déterminer si les hiPSC sont adaptés à la différenciation PGCLC. Le protocole vise à promouvoir la cohérence et la compatibilité des résultats des hPGCLC entre différentes lignées et plateformes de culture hiPSC, en garantissant des rendements robustes qui soutiennent une caractérisation fiable et une optimisation supplémentaire des étapes de différenciation en aval vers une gamétogenèse in vitro réussie chez l’humain.

Introduction

Le développement de la lignée germinale humaine est un processus hautement coordonné qui débute tôt dans le développement embryonnaire et commence par la spécification des cellules germinales primordiales (PGC), la population qui donne finalement naissance aux ovocytes et aux^{spermatozoïdes 1}. In vivo, la spécification PGC se produit peu après l’implantation ^2,3 en réponse aux signaux inductifs des cellules^{voisines 4,5}. Le développement des PGC a été largement étudié chez les rongeurs, notamment grâce à des études génétiques ayant démontré l’implication de voies de signalisation, telles que BMP, WNT et^TGFβ 6,7,8,9. Après la spécification, les PGC subissent une reprogrammation épigénétique, caractérisée par la déméthylation de l’ADN à l’échelle du génome et le remodelage de la chromatine, afin d’établir ultérieurement l’identité germinale (spécifique au sexe^{) 10,11,12,13,14}.

Chez les mammifères, la spécification PGC est guidée par une diaphonie coordonnée entre les voies de signalisation, et certains aspects sont conservés évolutivement chez les humains, les primates non humains, les porcs et les souris, y compris l’implication de facteurs de pluripotence tels que POU5F1 et NANOG ^{9,15,16,17,18}. Malgré des caractéristiques communes, les différences spécifiques à chaque espèce dans les mécanismes de différenciation PGC et les réseaux de régulation génétique limitent la traduction directe des modèles animaux vers^l’humain 9,19,20,21.

Pour comprendre la gamétogenèse chez l’humain, des études utilisant du matériel humain sont nécessaires, mais elles restent difficiles en raison de l’accès limité aux embryons humains précoces. Les progrès continus dans les protocoles permettant la différenciation in vitro des cellules primordiales humaines similaires aux cellules germinales (hPGCLC) issues de cellules souches pluripotentes humaines, telles que les cellules souches pluripotentes induites (hiPSC), ont réduit la dépendance au tissu gonadal humain tout en permettant l’augmentation de l’échelle et des études^{génétiques 18,22}. La plupart des stratégies établies pour la différenciation des hPGCLC reposent sur des agrégats tridimensionnels (3D) ou des corps embryoïdes¹⁸. Grâce à ces plateformes, de nombreuses études ont montré que les hPGCLC récapitulent des caractéristiques épigénétiques clés des PGC humains précoces, notamment les programmes de transcription germinale^23,24 et la reprogrammation de la méthylation de l’ADN à l’échelle du^{génome 25}. Ensemble, ces plateformes in vitro ont considérablement fait progresser les connaissances sur la biologie PGC humaine, incluant l’engagement de la lignée et la réinitialisation épigénétique. Cependant, les protocoles de différenciation des hPGCLC basés sur l’agrégation restent difficiles car ils prennent du temps, et le rendement total des hPGCLC pour une caractérisation épigénétique robuste, des tests de différenciation supplémentaires ou une utilisation dans des applications expérimentales à haut débit reste faible.

Récemment, une méthode 2D monocouche sans alimentateur, utilisant un extrait de membrane basale dilué (BMEx) combiné à de faibles niveaux de BMP4 pour différencier les hiPSC en hPGCLC s’est avérée relativement facile à étendre sur les plaques de culture tissulaire et a permis d’obtenir de hautes efficacités (~55 %) en une courte fenêtre de différenciation (5 jours⁾²⁶. Comparé à d’autres systèmes 2D nécessitant une étape intermédiaire d’amorçage d’Activine A avant l’induction et utilisant des concentrations BMP4 plus élevées (40–50 ng/mL)^27,28, cette approche BMEx ne nécessitait pas d’étape de pré-induction et utilisait des niveaux BMP4 plus faibles (10 ng/mL), tout en maintenant une efficacité comparable et une meilleure scalabilité.

Ici, un guide détaillé, étape par étape, du protocole de différenciation 2D hPGCLC BMEx est fourni, en commençant par l’évaluation initiale du maintien des hiPSC, incluant la pluripotence et les caractéristiques cellulaires, suivie des tests des effets des différents revêtements de plaques hiPSC et des densités cellulaires sur la différenciation des hPGCLC. De plus, la caractérisation en aval par cytométrie en flux et immunofluorescence est décrite. Des points critiques de manipulation et des conseils de dépannage pour réduire les déviations de laboratoire sont fournis, permettant aux chercheurs de reproduire de manière cohérente la différenciation des hPGCLC dans ce format 2D.

Protocole

Ce protocole suit les directives et réglementations du Centre Médical de l’Université de Leiden (LUMC), de la LUMC Biobank & Biomatériaux (TCBio) et du LUMC Leiden hiPSC Center (en vertu de BB24.037). Tous les matériaux et les lignes mâle de contrôle (XY) hiPSC (M54 et M199) utilisés dans ce protocole sont listés dans le Tableau des matériaux. Toutes les procédures de culture tissulaire ont été réalisées dans une salle dédiée dédiée à la culture tissulaire de niveau 2 de biosécurité, équipée d’un incubateur normoxique humidifié (37 °C, 5 % de_CO2), d’une centrifugeuse polyvalente (rotor à seau oscillant) et d’une armoire de biosécurité de classe II avec stéréomicroscope.

ATTENTION : Toutes les lignes hiPSC ne peuvent pas se différencier en hPGCLC^26,29. Cependant, si d’autres hiPSC étaient utilisés pour la différenciation PGCLC et que des PGCLC étaient observés, la méthode décrite ici (Figure 1A) permettra d’augmenter la production de hPGCLC.

1. Revêtement des plaques de culture tissulaire pour la culture hiPSC

Ce protocole décrit le revêtement des plaques de culture tissulaire contenant à la fois BMEx dilué et vitronectine.

1. Revêtement à extrait de membrane basale (BMEx)
   1. Décongeler une aliquote de BMEx sur glace. Cela peut être Geltrex, Cultrex ou Matrigel.
   2. Diluez l’aliquote de l’extrait de membrane basale dans du DMEM/F12 froid jusqu’à une concentration finale de 1 % (v/v) et resuspendez doucement.
   3. Enrobez le nombre désiré de puits d’une plaque à 6 puits avec 1 mL de BMEx dilué par puits.
   4. Couver la plaque enduite pendant au moins 30 minutes à 37 °C.
      REMARQUE : Les plaques revêtues peuvent être conservées à 2–8 °C pendant jusqu’à 1 semaine. Lorsque vous utilisez des plaques enduites stockées à 2–8 °C, faites éclore la plaque pendant au moins 10 minutes à 37 °C avant une utilisation supplémentaire.
2. Revêtement à la vitronectine
   1. Décongelez une aliquote de vitronectine à température ambiante (RT) pendant 10 à 15 minutes.
   2. Diluez la vitronectine à une concentration finale de 5 μg/mL dans le DPBS sans calcium ni magnésium (DPBS -/-) et resuspendez doucement.
   3. Recouvrir le nombre de puits désirés d’une plaque à 6 puits avec 1 mL de vitronectine diluée par puits.
   4. Incubez la plaque revêtue à 6 puits pendant 1 heure à la réchauffe.

2. Passage pour l’entretien des hiPSC

1. Préparez un milieu de culture : milieu de culture cellulaire sans sérum mTeSR Plus, complété par une solution de prévention de la contamination par mycoplasmes (MycoZap (1:1000)).
2. Aspirez le milieu de culture des cellules prêtes à être passées.
3. Ajoutez 0,5 mL d’agent de sélection et de passage de PSC humain (ReLeSR) à chaque puits et aspirez cela en 1 minute. Assurez-vous qu’une couche très fine reste sur les cellules.
4. Incubez les cellules pendant 6 minutes à 37 °C.
5. Tapez plusieurs fois sur les côtés de la plaque à 6 puits.
6. Détachez soigneusement les cellules avec un milieu de culture de 1 mL en pipettant de haut en bas avec une pipette p1000, et veillez à vérifier régulièrement la taille des fragments de colonie pour maintenir leur taille entre 50 et 200 μm.
7. Prenez les plaques pré-revêtues à 6 puits et retirez la solution de revêtement (étape 1).
8. Ajoutez 2 mL de substrat de culture à chaque puits.
9. Transférez le milieu de culture contenant les fragments de colonie des hiPSC détachés vers le nouveau puits dans le ratio souhaité.
   REMARQUE : Le ratio idéal pour diviser les fragments de colonie hiPSC est de 1:6 à 1:50, permettant un passage tous les 4 à 7 jours.
10. Placez la plaque de culture cellulaire avec les fragments de colonie des hiPSC passés dans un incubateur normoxique humidifié (37 °C, 5 % de CO₂).
11. Renouvelez le milieu culturel tous les deux jours avec un milieu de culture de 2 mL jusqu’à ce que les hiPSC soient prêts à être à nouveau appliqués.
    REMARQUE : Ajoutez 4 mL de substrat de culture au lieu de 2 mL à chaque 6-puits pour éviter la nécessité de se rafraîchir le week-end.
    ATTENTION : Ne pas passer les hiPSC lorsque la confluence est trop basse, et abandonner la culture lorsque la confluence est trop élevée pour maintenir une culture hiPSC saine et éviter une différenciation spontanée.

3. Différenciation hPGCLC

1. Préparation avant la différenciation des hPGCLC (jour 0).
   1. Rafraîchir le milieu de culture des hiPSC 1 h avant de commencer la différenciation des hPGCLC.
   2. Préparez la solution de revêtement : solution BMEx à 1 % diluée v/v dans du DMEM/F12 froid.
   3. Enduire le nombre désiré de puits d’une plaque à 12 puits avec une solution de revêtement de 0,5 mL.
   4. Incubez la plaque recouverte pendant au moins 30 minutes à 37 °C avant de commencer la différenciation.
   5. Préparez le milieu de plaquage : solution BMEx à 2 % (v/v) dans un milieu de culture froid et compléter cela par un milieu de récupération post-dégel (RevitaCell) (1:100).
      ATTENTION : Gardez le matériau de plaque sur glace pendant la préparation et le dressage des hiPSC.
2. Plaquage hiPSC pour la différenciation des hPGCLC (jour 0).
   1. Retirez le milieu de culture du puits 6 contenant les hiPSC pour l’utiliser dans la différenciation des hPGCLC. Commencez par des hiPSC de haute qualité à 50–80 % de confluence, sans signe de différenciation spontanée.
   2. Ajouter 1 mL de solution de trypsine (TrypLE) par puits.
   3. Incubez les hiPSC pendant 5 minutes à 37 °C.
   4. Réalisez une suspension à cellule unique en resuspendant soigneusement les colonies des hiPSC 2 à 3 fois avec une pipette p1000.
   5. Vérifiez au microscope inversé si une suspension monocellulaire est obtenue. Sinon, resuspendez les colonies du hiPSC encore 1 à 2 fois avec une pipette p1000.
   6. Transférez la suspension de la cellule hiPSC dans un tube de 15 mL.
   7. Ajoutez 4 mL de DMEM-F12 medium au tube de 15 mL.
   8. Centrifugez la suspension à cellules hiPSC à 200 x g pendant 5 minutes.
   9. Aspirez le surnageant et resuspendez soigneusement les cellules hiPSC dans un milieu de plaque de 0,5 à 1,0 mL.
   10. Comptez le nombre de hiPSC à l’aide d’un compteur cellulaire ou d’un hémocytomètre et calculez le nombre de hiPSC nécessaires par puits pour la différenciation des hPGCLC.
       REMARQUE : Pour commencer, une densité de placage de 40 à 80 K cellules/^cm2 peut être utilisée. Cependant, pour chaque lignée cellulaire et à chaque nombre de passages, l’optimisation de la densité de placage est recommandée afin d’obtenir un rendement optimal. Ici, les hiPSC étaient placés à une densité de placage de 10K à 100K cellules/^cm2.
   11. Suspendez soigneusement le nombre requis de hiPSC dans le volume approprié de milieu de placage (1 mL par puits d’une plaque à 12 puits), et assurez-vous qu’une suspension homogène à cellules soit obtenue à l’aide d’une pipette p1000.
   12. Prenez la plaque à 12 puits revêtue de l’incubateur et retirez la solution de revêtement.
   13. Ajoutez 1 mL de suspension à cellules à chaque puits d’une plaque à 12 puits.
   14. Secouez soigneusement la plaque pour vous assurer que les cellules sont réparties uniformément dans le puits.
   15. Placez la plaque à 12 puits dans un incubateur normoxique humidifié (37 °C, 5 % CO₂) pendant 16 à 24 heures.
3. Différenciation hPGCLC (Jours 1–2)
   1. Préparez un milieu basal RB27 : RPMI160 avancé avec B-27 (1:100), 1x substitut d’acide aminé (Glutamax), 1x acides aminés non essentiels MEM et solution de prévention de la contamination par mycoplasme (1:1000).
   2. Préparez un milieu de différenciation : solution BMEx à 2 % (v/v) dans un milieu basal froid RB27 et ajoutez BMP4 à une concentration finale de 10 ng/mL. L’extrait de la membrane basale est nécessaire pour induire la lumenogenèse et déclencher la spécification PGCLC in vivo.
      ATTENTION : Gardez le milieu de différenciation sur glace ou à 4 °C. Le support de différenciation peut être préparé pour les jours 1 et 2 du protocole de différenciation.
   3. Le jour 1 (dans les 16 à 24 heures suivant le dressage des hiPSC), retirez la plaque de l’incubateur et retirez le substrat de platenage.
   4. Lavez les puits en ajoutant 0,5 mL de substrat basal RB27 par puits.
   5. Aspirez le milieu basal RB27 et ajoutez 1 mL de milieu de différenciation par puits.
   6. Replacez la plaque avec les cellules dans l’incubateur normoxique humidifié (37 °C, 5 % CO₂).
   7. Au deuxième jour de la différenciation, rafraîchir les cellules avec 1 mL de milieu de différenciation par puits.
4. Différenciation hPGCLC (jours 3–5)
   1. Préparez le milieu à commutation : milieu basal RB27 complété par BMP4 (10 ng/mL), LIF (10 ng/mL), SCF (50 ng/mL) et EGF (50 ng/mL). Le médium de commutation reflète le passage in vivo de la spécification hPGC à la survie et à la prolifération. BMEx est omis car la lumenogenèse n’est plus nécessaire.
   2. Au jour 3 et au jour 4, rafraîchissez chaque puits avec un média d’interrupteur de 1 mL.
   3. Au cinquième jour de différenciation, les hPGCLC peuvent être caractérisés à l’aide d’immunofluorescence ou de cytométrie en flux.

4. Caractérisation des hPGCLC par immunofluorescence et cytométrie en flux

1. Caractérisation par immunofluorescence.
   1. Préparez la solution de perméabilisation : Triton X-100 dilué à 0,3 % dans du PBS.
   2. Solution de lavage prépare : 0,05 % Tween 20 in PBS (PBST)
   3. Préparez une solution bloqueante : albumine sérique bovine à 1 % (BSA) dans du PBST.
   4. Retirez le milieu de commutation des puits utilisés pour la différenciation hPGCLC.
   5. Lavez les cellules avec 1 mL par puits DPBS (-/-).
   6. Fixer les cellules avec 1 mL par puits à 4 % de paraformodéhyde (PFA) dans le PBS pendant 15 minutes en RT.
   7. Lavez les cellules 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS, en utilisant 1 mL par puits.
      REMARQUE : À ce stade, les plaques peuvent être stockées à 4 °C avant le début de l’immunofluorescence.
   8. Perméabiliser les cellules avec une solution de perméabilisation pendant 15 minutes à RT, en utilisant 1 mL par puits.
   9. Lavez les cellules 3 fois pendant 5 minutes avec la solution de lavage, en utilisant 1 mL par puits.
   10. Bloquez les cellules avec solution bloqueante pendant 1 heure à la RT, en utilisant 1 mL par puits.
   11. Préparer la solution primaire d’anticorps : diluer les anticorps primaires d’intérêt pour la solution de blocage.
       REMARQUE : Ici, les deux combinaisons d’anticorps suivantes pour les marqueurs PGC ont été utilisées : anti-SOX17 de chèvre et anti-TFAP2C de lapin, et anti-SOX17 de chèvre et anti-POU5F1 de souris (Table of Materials).
   12. Retirez la solution bloqueante, ajoutez 0,4 mL de solution primaire d’anticorps par puits, puis incubez toute la nuit à 4 °C.
       REMARQUE : Il est important d’inclure des témoins négatifs pour évaluer la liaison non spécifique des anticorps. Pour cela, conservez-en une bien la nuit dans une solution bloquante, en omettant les anticorps primaires, puis colorez bien cette solution avec la solution secondaire d’anticorps.
   13. Le lendemain, retirez la solution primaire d’anticorps et lavez les cellules 3 fois pendant 5 minutes avec du PBST.
   14. Préparez une solution secondaire d’anticorps : diluez les anticorps secondaires d’intérêt (Table of Materials) et DAPI (1:500) dans une solution bloqueante.
       REMARQUE : La solution secondaire d’anticorps est sensible à la lumière et doit être conservée dans l’obscurité.
   15. Retirez le PBST et ajoutez 0,4 mL de solution secondaire d’anticorps par puits pendant 1 heure à la RT dans le noir.
   16. Lavez les cellules 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS, en utilisant 1 mL par puits.
   17. Faites de l’imagerie des cellules (lentille objective 20x).
       REMARQUE : Les images d’immunofluorescence ont été obtenues à l’aide d’un objectif 20x sur le microscope Airyscan, tandis que les images en champ clair ont été capturées avec un objectif 4x ainsi qu’un objectif 10x sur le microscope EVOS.
2. Caractérisation par cytométrie en flux
   1. Préparer le tampon FACS : 0,5 % BSA dans le DPBS (-/-)
   2. Retirez le milieu de commutation des puits avec les hPGCLC.
   3. Laver les cellules avec 1 mL de DPBS (-/-).
   4. Ajoutez 0,5 mL d’Accutase pré-chauffée par puits et faites éclore pendant 15 minutes à 37 °C. Pour la dissociation, l’Accutase est préférée à la solution de trypsine car les hPGCLC sont très sensibles à la dissociation.
   5. Réalisez une suspension à cellule unique en resuspendant soigneusement les cellules 2 à 3 fois avec un p1000.
   6. Vérifiez au microscope inversé si une suspension monocellulaire est obtenue. Sinon, resuspendez les cellules 1 à 2 fois de plus avec une pipette p1000.
   7. Filtrez la suspension de la cellule à travers un filtre de 40 μm dans un tube de 15 mL.
   8. Lavez la passoire de 40 μm avec un tampon FACS de 5 mL.
   9. Centrifugez la suspension à 300 x g pendant 5 minutes.
   10. Retirez le surnageant.
   11. Resuspendez la pellete cellulaire dans un tampon FACS de 0,3 mL dans un tube de 1,5 mL.
       REMARQUE : Il est optionnel de compter les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire ou d’un hémocytomètre. Si les cellules sont comptées, attendez-vous à environ 1 million de cellules par puits d’une plaque à 12 puits.
   12. Préparez des échantillons témoins adéquats pour la cytométrie en flux (témoins non colorés et à coloration unique). Pour cela, transférez 15 à 30 μL de la suspension de la cellule dans des tubes de 1,5 mL et remplissez jusqu’à 100 μL avec un tampon FACS.
       REMARQUE : Pour cette étude, 3 colorations uniques ont été préparées : EPCAM-PEcy7 (1:200), ITGA6-BV421 (1:200) et 7AAD (1:200). Les solutions contenant les anticorps conjugués et le 7AAD sont sensibles à la lumière et doivent être conservées dans l’obscurité.
   13. Ajoutez directement les anticorps conjugués d’intérêt à la suspension cellulaire pour obtenir une dilution adéquate. Ici, les anticorps conjugués suivants pour les marqueurs PGC ont été utilisés ensemble : EPCAM-PEcy7 (1:200) et ITGA6-BV421 (1:200) (Table of Materials).
   14. Incubez les cellules avec les anticorps conjugués pendant 30 minutes sur la glace dans le noir.
   15. Ajoutez 1 mL de tampon FACS aux échantillons, contrôle non coloré et contrôles à anticorps unique, puis centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes.
   16. Retirez le surnageant.
   17. Resuspendez les échantillons à 0,5 mL, et les échantillons témoins à 0,2 mL, du tampon FACS contenant 1 mM d’EDTA. Cela empêche les cellules de s’agglutiner.
   18. Ajoutez les échantillons et les contrôles dans un tube FACS de 5 mL avec un bouchon de filtre cellulaire, puis passez-les à travers le filtre.
   19. Ajoutez directement 7AAD à chaque échantillon plusieurs minutes avant de mesurer dans le cytomètre en flux.
   20. Mesurez les échantillons à l’aide d’un cytomètre à flux. Ici, l’analyseur cellulaire à base de fluorescence a été utilisé pour mesurer les échantillons, les données ont été collectées via le logiciel FACSDiva (v9.0), et le logiciel FlowJo (v10.10.0) a été utilisé pour analyser les données.
   21. Utilisez les échantillons témoins (non colorés et à anticorps unique) pour mettre en place la stratégie de barrage et effectuer la compensation si nécessaire.
   22. Faites un vortex des échantillons avant de les mettre dans la machine.
   23. Extraire la population cellulaire de tous les événements en posant d’abord une porte basée sur la zone [aire de diffusion avant (FSC-A) et la zone de dispersion latérale (SSC-A)].
   24. De cette population cellulaire, extraire des cellules uniques selon la taille [largeur de FSC (FSC-W) et la hauteur FSC (FSC-H)] et la granularité [SSC-W et SSC-H].
   25. Excluez les cellules mortes de l’analyse ultérieure en fixant une porte pour les cellules 7AAD négatives.
   26. Utilisez l’échantillon pour vérifier si les portes sont correctement réglées, et ajustez-les si nécessaire.
   27. Analysez les marqueurs d’intérêt de cette population de cellules vivantes. Ici, les cellules portées positives à la fois pour EPCAM et ITGA6 correspondaient aux hPGCLC.

Résultats

La qualité et l’état stable des hiPSC sont importants pour une différenciation plus poussée
les hiPSC étaient maintenus dans des plaques à 6 puits pendant au moins 3 passages (dans les différents revêtements) avant les expériences et analyses de différenciation. Les hiPSC ont été transmises lorsque les colonies cellulaires atteignent une confluence de 70 à 80 % (Figure 1B), qui est également la confluence hiPSC optimale pour initier la différenciation des hPGCLC. Les cultures hiPSC saines présentaient une morphologie uniforme des colonies sans zones sombres ou différenciées, visible dans les images en champ clair (Figure 1B). Cependant, la qualité des hiPSC a été affectée lorsque les colonies cellulaires n’ont pas été maintenues à leur confluence optimale ou ont montré des signes de différenciation (Figure 1B). À faible confluence, les hiPSC continuaient de proliférer, et il fallait plus de temps pour la formation de colonies jusqu’à ce que la confluence soit adaptée à des expériences de passage ou de différenciation. À forte confluence, les hiPSC se superposaient, tandis que des régions différenciées apparaissaient. L’état de pluripotence des hiPSC a été confirmé par l’expression de SOX2 ou POU5F1, deux facteurs de transcription essentiels au maintien de la pluripotence et de l’auto-renouvellement chez les hiPSC³⁰, et surtout, SOX2 n’est pas exprimé par les hPGCLC³¹. La coloration par phaloïdine a été utilisée pour évaluer l’organisation du cytosquelette et la morphologie des colonies, indiquant la qualité des hiPSC. Notez que les différences de morphologie cellulaire sont associées à la réduction de SOX2 ou POU5F1 (Figure 1B).

Effet du substrat de maintien de hiPSC sur la différenciation hPGCLC
Pour évaluer si le maintien des hiPSC sur différents substrats de revêtement affectait la différenciation vers les hPGCLC, les hiPSC ont été cultivés sur différents substrats (Geltrex, Matrigel, Cultrex et vitronectine) (Figure 2). Sur tous les substrats, les hiPSC ont montré des niveaux robustes et uniformes de SOX2 nucléaire ou POU5F1, indiquant leur état pluripotent. Les colonies hiPSC maintenues sur Geltrex, Matrigel et Cultrex présentaient une morphologie comparable, incluant des bordures bien définies et des formes globales irrégulières, comparées aux colonies rondes sous vitronectine (Figure 2). Les hiPSC atteignant 70–80 % de confluence ont été placés à une densité de 40K cellules/^cm2 et différenciés en hPGCLC sur Geltrex²⁶. Au jour 5, les images en champ clair ont montré des colonies caractéristiques de hPGCLC dans toutes les conditions (Figure 3). De plus, des hPGCLC SOX17/TFAP2C/PDPN ou SOX17/POUF51 triple positifs ont été identifiés dans toutes les conditions (Figure 3). Cela suggérait que le protocole de différenciation pouvait être utilisé avec des hiPSC cultivés dans différentes conditions.

Effet de la densité cellulaire hiPSC initiale sur la différenciation de hPGCLC
Il est important de vérifier la densité d’ensemencement optimale pour une différenciation optimale des hPGCLC (sur Geltrex), car différents hiPSC ont des taux de prolifération différents. De plus, si l’efficacité de la différenciation des hPGCLC diminue lorsque les hiPSC sont continuellement traversées, il est conseillé d’ajuster la densité des cellules de sémiement des hiPSC. Pour évaluer l’impact de la densité des cellules de séminage sur l’efficacité de la différenciation des hPGCLC, les hiPSC ont été ensemencées à différentes densités, de 10K à 100K cellules/^cm2 (Figure 4A). Au jour 5, le pourcentage de hPGCLC a été évalué par cytométrie en flux à l’aide de deux anticorps conjugués différents pour les marqueurs PGC humains, EPCAM et intégrine α6 (ITGA6)³². L’analyse par cytométrie en flux a suivi une stratégie standard de gating séquentielle, montrée pour les hiPSC M199 ensemencés à 40K cellules/^cm2 (Figure 4B). En résumé, la population cellulaire totale (tous événements confondus) a été verrouillée pour exclure les débris (surface de particules), puis les cellules individuelles ont été sélectionnées en fonction de leur taille (FSC) et de leur granularité (SSC), et enfin, les cellules mortes ont été exclues sur la base de la coloration 7AAD. Par la suite, la porte pour quantifier les cellules exprimant EPCAM-cy7 et ITGA6-BV421 a été établie à partir d’échantillons colorés et non colorés (Figure 4B).

La comparaison de l’efficacité de différenciation des hPGCLC en utilisant différentes densités de cellules de sémiement et en utilisant des hiPSC cultivés sur différents substrats a révélé une tendance dépendante de la densité (Figure 4C). À la densité d’ensemencement de 20–40K cellules/^cm2, les hiPSC M54 et M199 ont montré la plus forte proportion de hPGCLC doublement positifs EPCAM+/ITGA6+, obtenue à partir de hiPSC maintenus sur Geltrex et Cultrex. Fait intéressant, des densités plus élevées entraînaient une efficacité de différenciation plus faible. Les résultats d’immunofluorescence utilisant les marqueurs PGC SOX17/TFAP2C/PDPN ou SOX17/POUF51 sur les hPGCLC ont validé les résultats de cytométrie en flux (Figure 4D). Ces résultats ont suggéré qu’il est important d’ajuster la densité de semis aux hiPSC spécifiques pour obtenir une efficacité de différentiation optimale. La combinaison de l’immunofluorescence et de la cytométrie en flux renforce la robustesse du test de différenciation hPGCLC.

Figure 1 : flux de travail de différenciation des hPGCLC et qualité des hiPSC. (A) Schéma du flux de travail utilisé dans cette étude. Les hiPSC ont été maintenus (dans un milieu de culture) et ont atteint une confluence de 60 à 80 % le jour de la différenciation (jour 0, D0). Sur D0, les hiPSC ont été dissociés en cellules uniques et placés à la densité de semis souhaitée (dans le milieu de placage). Le lendemain, les cellules ont été traitées avec un milieu de différenciation (D1–D3), suivi d’un milieu commutateur (D3–D5). Sur D5, les hPGCLC ont été utilisés pour l’immunofluorescence ou la cytométrie en flux. (B) Images en champ clair (rangée supérieure - grossissement 4x) ; immunofluorescence pour SOX2, coloration par PHALOÏDINE et coloration DAPI (rang central) ; et pour POU5F1, coloration PHALOÏDINE et coloration DAPI (rangée inférieure) montrant des hiPSC avec des confluences différentes. Barres d’échelle = 50 μm. Les dessins de la Figure 1A ont été créés par les auteurs à l’aide d’outils de dessin de base dans Adobe Illustrator ; aucun logiciel ou outil payant n’a été utilisé. Ainsi, aucune licence de droit d’auteur n’était requise. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Effet de divers substrats de revêtement lors de la culture hiPSC. Images en champ clair (rangée du haut) ; immunofluorescence pour SOX2, coloration par PHALOÏDINE et coloration DAPI (rang central) ; et pour POU5F1, coloration à la PHALOÏDINE et coloration DAPI (rangée du bas) montrant des hiPSC cultivés sur différents substrats de revêtement. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Effet de divers substrats de revêtement lors de la culture hiPSC sur la différenciation des hPGCLC. Images en champ clair (rangée supérieure - grossissement 10x) ; immunofluorescence pour SOX17, TFAP2C, PDPN et coloration DAPI (ligne du milieu) ; et pour la différenciation des POU5F1, SOX17 et DAPI (rangée inférieure) des hPGCLC (utilisant Geltrex) au jour 5, en partant des hiPSC cultivés sur différents substrats de revêtement. La ligne jaune pointillée met en évidence les régions avec des hPGCLC. Barres d’échelle = 25 μm (rangée du haut) et 50 μm (rangées du milieu et du bas). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Effet de la densité d’ensemencement hiPSC sur la différenciation des hPGCLC. (A) Images en champ clair au jour 1 (D1) et D3 de différenciation des hPGCLC utilisant différentes densités d’ensemencement hiPSC (40K cellules/^{cm 2}, 60K cellules/cm2, 80K cellules/^{cm 2}). Barres d’échelle = 250 μm. 4x de grossissement. (B) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux montrant la stratégie de verrouillage pour quantifier le pourcentage de HPCAM+/ITGA6+ hPGCLC. Pour cela, des hiPSC M199 (sur Geltrex) ont été utilisés à une densité d’ensemencement de 40K cellules/^cm2. (C) Graphique en barres représentant les pourcentages d’EPCAM+/ITGA6+ hiPGCLC à D5 lors de l’utilisation de hiPSC (M199 et M54) cultivés sur différents revêtements et ensemencés à différentes densités. (D) Immunofluorescence pour SOX17, TFAP2C, PDPN et coloration DAPI (panneaux de gauche) ; et SOX17, POU5F1, et la coloration DAPI (panneaux droits) à D5 de différenciation des hPGCLC utilisant des hiPSC (M199 et M54, sur Geltrex) ensemencées à 40K et 80K cellules/cm2. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La gametogenèse in vitro constitue une plateforme expérimentale puissante pour étudier le développement de la lignée germinale humaine, la toxicité reproductive et l’infertilité dans des conditions de culture contrôlées et selon chaque patient. Bien que plusieurs protocoles pour différencier les hPGCLC des hiPSC aient été^{rapportés 18}, les progrès dans ce domaine ont été freinés par la disponibilité limitée d’approches standardisées, évolutives et reproductibles dans les laboratoires. Des études récentes ont décrit des approches simplifiées et efficaces pour l’induction de hPGCLC, notamment la différenciation micropatternée^{basée sur BMP4 27}, une plateforme monocouche rapide 2D permettant la génération de hPGCLC en 3,5^{jours 28}, ainsi qu’un système de culture 3D modélisant le développement péri-implantatoire et la signalisation paracrine^{de niche 33}. Même si ces protocoles supportaient efficacement la différenciation hPGCLC, ils manquaient encore de la capacité de servir de plateformes à haut débit. Pour que les études basées sur les hPGCLC soient largement applicables, en particulier pour les dépistages toxicologiques de la reproduction, les protocoles doivent être robustes, techniquement accessibles et compatibles avec les tests quantitatifs en aval. Ici, une analyse étape par étape du protocole BMEx-différenciation des hPGCLC est présentée, mettant l’accent sur des paramètres techniques critiques qui déterminent la reproductibilité et la performance.

Un déterminant majeur de la dérivation réussie est l’état initial de pluripotence des hiPSC. Le nombre de passage, la santé cellulaire, les caractéristiques spécifiques des lignes et les conditions de culture avant la différenciation peuvent influencer les résultats de différenciation de la hPGCLC. Initialement, lors de la maintenance des hiPSC, l’attention peut se porter sur le substrat de revêtement, la densité de la cellule de séminage et le format de la plaque de culture, qui définissent ensemble l’architecture de la colonie et les environnements de signalisation au début de la différenciation des hPGCLC. La présente étude démontre l’effet de l’utilisation de hiPSC cultivés sur différents revêtements et différentes densités de semis sur la différenciation des hPGCLC (sur Geltrex). Les deux lignes hiPSC testées ici ont montré une efficacité de différenciation maximale à une densité d’ensemencement de 20 000 à 40 000 cellules/^cm2 . Cela souligne la nécessité de déterminer les densités d’ensemencement optimales lors de l’introduction de nouvelles lignées cellulaires, de la suite d’un passage prolongé, ou de la modification des dispositions expérimentales ou des formats de plaques de culture. Même des changements apparemment mineurs dans les rapports surface/volume ou la cinétique de croissance peuvent nécessiter une optimisation pour préserver une grande efficacité de différenciation. En conséquence, il est recommandé aux utilisateurs de réaliser des expériences pilotes à petite échelle afin de déterminer d’abord les conditions optimales pour la différenciation des hPGCLC.

Malgré sa robustesse, la méthode présente des limites qui doivent être reconnues. Bien que compatibles avec plusieurs revêtements et densités, l’efficacité de différenciation reste sensible aux propriétés intrinsèques de la hiPSC, y compris l’état épigénétique et l’historique des passages, qui ne sont pas totalement contrôlables. Plusieurs hiPSC testés semblaient incapables de se différencier en^{hPGCLC 26}. Plus important encore, contrairement à la vitronectine, qui est un produit entièrement défini, BMEx est un produit d’origine animale soumis à des variations de lot en lot, ce qui peut affecter la reproductibilité. Bien que différents lots de Matrigel, Cultrex et Geltrex aient été testés auparavant et aient donné des résultats^{cohérents 26}, cela reste une préoccupation, et des alternatives entièrement définies à BMEx doivent être envisagées pour garantir la reproductibilité et la transférabilité futures. Ici, deux lignes hiPSC mâles (XY) ont été utilisées, mais ce protocole a été testé avec les lignes²⁶ à la fois femelles (XX) et mâles (XY). Enfin, alors que le protocole a permis de produire des hPGCLC, qui se sont avérés être transcriptionnellement similaires aux hPGC et compétents pour un développement ultérieur^26,34, la maturation ultérieure vers les stades ultérieurs des cellules germinales n’a pas été abordée ici. Bien que la scalabilité ait été démontrée pour des applications de type screening, l’adaptation basée sur l’automatisation et la validation inter-laboratoire à travers un panel plus large de lignes hiPSC renforceront encore l’utilité translationnelle.

Par rapport aux stratégies de différenciation hPGCLC existantes, ce protocole présente plusieurs avantages. Contrairement aux approches très spécialisées ou restreintes à la matrice, il s’adapte aux substrats d’entretien hiPSC couramment utilisés et aux formats de plaques de culture, réduisant ainsi les barrières techniques. L’accent mis sur l’optimisation de la densité et le contrôle qualité en phase précoce améliore encore la reproductibilité, un défi persistant dans le domaine de la gamétogenèse in vitro .

Le cadre méthodologique décrit ici est particulièrement pertinent pour la toxicologie de la reproduction, la modélisation de l’infertilité et la biologie du développement. Sa compatibilité avec les formats évolutifs permet un criblage composé à débit moyen à élevé, tandis que sa reproductibilité permet des comparaisons croisées et des efforts de consortium collaboratifs. Plus largement, la standardisation systématique des protocoles d’induction des hPGCLC dans les laboratoires, en comparant la caractérisation et les critères de résultat^{fonctionnels 18,35}, sera essentielle pour faire progresser la gamétogenèse in vitro vers des plateformes prédictives pertinentes pour l’humain.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Dilution 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Dilution 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Dilution 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Dilution 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Dilution 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Dilution 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Dilution 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Dilution 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Dilution 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Dilution 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Dilution 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Diltuion 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		Equipment for flow cytometry
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		Software
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	Dissolve in PBST
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	Dilute to in cold DMEM-F12
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Dilution 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		Equipment for imaging
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		Software
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		Equipment for cell counting
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		Software
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	Dilute to in cold DMEM-F12
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Dilution 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Dilution 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	Dissolve to 8% PFA in water first; and dilute to 4% (1:1) with 0.2 M phosphate buffer
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal Ejector	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal Ejector	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	Stock concentration of 100 µg/mL in 4 mM HCL containing 0.1% BSA
Recombinant Human EGF, CF	R&D Systems	236-EG-200	Stock concentration of 50 µg/mL in PBS
Recombinant human LIF	Gibco	300-05	Stock concentration of 100 µg/mL in 0.1% BSA
Recombinant Human SCF, CF	R&D Systems	11010-SC-100	Stock concentration of 100 µg/mL in PBS
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872
RevitaCell Supplement	Gibco	A26445-01