Criblages knockout à l’échelle de l’épigénome basés sur CRISPR-Cas9 sur des cellules chimiorésistantes

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour générer des cellules chimiorésistantes en utilisant une approche d’escalade de dose, suivi d’un criblage basé sur CRISPR/Cas9 utilisant une bibliothèque focalisée d’ARNsgRNA ciblant les modificateurs épigénétiques pour identifier les régulateurs de la chimiorésistance acquise. Le protocole fournit également plusieurs points d’optimisation adaptés aux modèles cellulaires chimiorésistants, offrant un cadre robuste aux chercheurs étudiant les mécanismes de résistance.

Résumé

La résistance à la chimiothérapie reste un défi majeur dans le traitement du cancer, stimulée par la capacité des cellules cancéreuses à acquérir des propriétés adaptatives, à reconfigurer les voies de signalisation et à modifier la structure de la chromatine pour échapper à la cytotoxicité induite par les médicaments. Parce que ces processus reposent fortement sur des mécanismes épigénétiques qui régulent l’organisation de la chromatine et la plasticité transcriptionnelle, les régulateurs épigénétiques se sont révélés comme des contributeurs clés à la résistance à la chimiothérapie. Pour étudier la résistance au paclitaxel, l’un des agents chimiothérapeutiques les plus utilisés dans le cancer du sein triple négatif (TNBC), nous avons utilisé une bibliothèque knockout axée sur l’épigénome (EPIKOL), une bibliothèque basée sur CRISPR-Cas9, conçue pour perturber systématiquement les gènes impliqués dans la régulation de la chromatine. Les lignées cellulaires chimiorésistantes ont été générées via un protocole d’augmentation progressive de la dose qui reprend l’adaptation cliniquement pertinente des médicaments. Cependant, ces cellules résistantes présentent un phénotype multirésistant aux médicaments (MDR), posant des défis importants pour une transduction virale efficace et la sélection de populations cellulaires stables. Dans cette étude, nous décrivons les étapes méthodologiques clés pour obtenir une transduction et une sélection lentivirales à haute efficacité, permettant l’application réussie des criblages EPIKOL CRISPR dans des modèles TNBC chimiorésistants. Suivant le protocole décrit, un dépistage CRISPR à l’échelle de l’épigénome a été réalisé sur des cellules TNBC chimiorésistantes, et de nouveaux régulateurs épigénétiques de la chimiorésistance ont été identifiés. Ce protocole fournit un cadre robuste pour identifier les régulateurs épigénétiques contribuant à la résistance acquise aux paclitaxels en utilisant une approche de perte de fonction basée sur CRISPR.

Introduction

Le cancer du sein triple négatif (TNBC) est un sous-type de cancer du sein qui représente 12 à 17 % de tous les cancers^{du sein 1}. Elle se caractérise par une expression altérée du récepteur œstrogène (RE), du récepteur de progestérone (PR) et du récepteur du facteur de croissance épidermique humain 2 (HER2), ce qui limite fortement la disponibilité des options thérapeutiques ciblées et laisse la chimiothérapie conventionnelle comme principale modalité^{de traitement 2}. Les taxanes et les anthracyclines sont couramment utilisées dans le traitement TNBC ; cependant, les patients développent généralement une résistance ^2,3. L’acquisition de la chimiorésistance est un processus complexe et multidimensionnel qui inclut à la fois des adaptations génétiques, métaboliques, transcriptionnelles et^{épigénétiques 2,4}. Les altérations épigénétiques sont apparues comme des régulateurs centraux de la plasticité cellulaire, facilitant la reprogrammation transcriptionnelle dynamique qui permet aux cellules cancéreuses de tolérer la toxicité induite par^{la chimiothérapie 5}.

Le taxol (paclitaxel) est un membre de la classe des taxans, qui provoque la mort cellulaire en altissant la dynamique des microtubules et agit comme un agent^{antimitotique 6}. Même si les patients TNBC répondent initialement aux schémas de chimiothérapie incluant le Taxol, la résistance se développe généralement avec le^{temps 2}. La résistance acquise au Taxol est couramment associée à la surexpression des transporteurs de cassettes liant l’ATP (ABC), en particulier ABCB1 (MDR1, P-glycoprotéines), qui médiatisent l’efflux médicamenteux de Taxol, entraînant une diminution de la toxicité intracellulaire^{des médicaments 7}. Puisqu’une large gamme d’agents chimiothérapeutiques est le substrat de ces transporteurs ABC, leur régulation à la hausse limite l’utilisation d’autres médicaments chimiothérapeutiques, provoquant un phénotype de résistance multimédicamenteuse (MDR⁾⁸. L’inhibition des transporteurs ABC s’est révélée largement inefficace comme stratégie pour surmonter la résistance multimédicamenteuse en milieu clinique, principalement en raison de leur expression omniprésente et de leur rôle essentiel dans le transport d’une large gamme de substrats endogènes^{et exogènes 9}. Bien que le verapamil, un inhibiteur ABCB1 de première génération, ait démontré un bénéfice clinique limité ou inexistant et ait été associé à une toxicité significative dans les essais^{cliniques 10}, il reste un outil expérimental précieux pour améliorer l’efficacité de sélection dans les modèles in vitro de MDR.

Le phénotype MDR est un processus dynamique et adaptatif qui émerge principalement lors de conditions de stress². L’expression du téléporteur ABC est principalement contrôlée par des mécanismes de régulation transcriptionnelle et épigénétique, plutôt que par des événements^{mutationnels 5,11}. La limitation de la cible directe des transporteurs ABC souligne la nécessité d’identifier les régulateurs en amont de ces protéines comme une vulnérabilité spécifique aux cellules résistantes. Par conséquent, l’interrogation systématique des facteurs épigénétiques est devenue une stratégie importante pour identifier de nouveaux régulateurs de la résistance à la chimiothérapie et développer des thérapies combinées ciblant ces vulnérabilités.

Les criblages fonctionnels knockout basés sur CRISPR-Cas9 permettent des perturbations systématiques et non biaisées à l’échelle du génome pour étudier les effets de la perte génique dans le cancer à l’échelle^{génomique 12}. Cependant, les bibliothèques CRISPR à l’échelle du génome offrent une représentation limitée de l’ARN guide unique (ARNsg) par gène, ce qui réduit la sensibilité par rapport aux bibliothèques^{focalisées 13}. Il est important de noter qu’un criblage robuste dépend non seulement de la qualité des perturbations, mais aussi d’un modèle approprié et d’un protocole expérimental optimisé. Dans ce contexte, étudier un processus dynamique et complexe tel que la résistance aux médicaments pourrait bénéficier d’une bibliothèque ciblée avec un^{protocole 13} personnalisé. Dans un travail précédent, nous avons généré une bibliothèque knockout CRISPR-Cas9 centrée sur l’épigénome pour cibler les régulateurs^{de la chromatine 14}. Comparée à d’autres bibliothèques CRISPR axées sur l’épigénome disponibles publiquement, la bibliothèque épigénétique knockout (EPIKOL) contient 779 gènes, composés de lecteurs, d’écrivains, de gommes et de protéines associées, chacun ciblé avec 10 sgRNA, permettant ainsi d’augmenter la profondeur par gène et d’améliorer la robustesse et la reproductibilité des écrans fonctionnels axés sur^{la chromatine 14}. EPIKOL est disponible à la fois dans le système LentiGuide, dans lequel Cas9 est exprimé à partir d’un autre vecteur, et dans le système LentiCRISPR, qui inclut Cas9, offrant une flexibilité selon la lignée cellulaire. Atteindre une couverture suffisante des bibliothèques, définie comme le nombre moyen de cellules par ARNsg (par exemple, 500×–1000×), est plus facile pour EPIKOL comparé aux bibliothèques génomiques, offrant un avantage lors de l’étude des lignées cellulaires chimiorésistantes à croissance lente.

Bien que le dépistage CRISPR offre une approche puissante pour examiner les mécanismes de chimiorésistance, les flux de travail de dépistage regroupés standard ne sont pas optimisés pour les cellules chimiorésistantes présentant un efflux actif de médicaments. La puromycine, un antibiotique de sélection couramment utilisé dans les systèmes CRISPR lentiviraux, peut être extraite des cellules résistantes par des transporteurs ABC, principalement ABCB1, empêchant ainsi la sélection réussie des cellules^{transdues 15,16}. Cette limitation peut entraîner des populations cellulaires hétérogènes, augmenter le bruit de fond et, en fin de compte, compromettre la qualité des données. Pour relever ce défi, nous avons optimisé l’étape de sélection de la puromycine en inhibant transitoirement l’efflux médicamenteux médié par l’ABC avec du vérapamil, permettant ainsi un enrichissement efficace des cellules infectées par l’ARNsg. En utilisant cette stratégie, nous avons identifié le Bromodomaine et le PHD Finger Containing 1 (BRPF1) comme régulateur de l’expression d’ABCB1 et de la résistance au taxol dans le TNBC¹⁷. L’inhibition de BRPF1, génétiquement ou pharmacologiquement, a restauré la sensibilité au Taxol dans les cellules résistantes, démontrant l’utilité de ce protocole optimisé pour identifier des cibles exploitables dans la^{chimiorésistance 17}.

Ici, nous décrivons les étapes clés du dépistage CRISPR à sélection négative sur les modèles chimiorésistants, en nous concentrant spécifiquement sur les défis techniques souvent négligés dans la plupart des protocoles de dépistage par chimiorésistance ou CRISPR. Le protocole démontre d’abord une méthode d’augmentation progressive de la dose pour la génération de cellules chimiorésistantes, puis optimise la délivrance virale et les conditions de sélection pour surmonter l’efflux médicamenteux médié par le transporteur ABC. Ensemble, ces optimisations assurent un enrichissement efficace des cellules sgRNA-positives lors des criblages CRISPR, tout en éliminant efficacement les cellules non transduites, offrant ainsi une stratégie robuste et efficace pour la transduction et la sélection dans les cellules TNBC chimiorésistantes. Enfin, le protocole met en lumière les fondamentaux de l’identification des résultats de dépistage CRISPR grâce au séquençage de nouvelle génération et à l’analyse bioinformatique.  Ensemble, ce protocole permet une mise en œuvre efficace de la plateforme de dépistage EPIKOL pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles afin de surmonter la résistance^{17, 18, 19}.

Protocole

Tous les réactifs et équipements utilisés dans cette étude sont fournis dans le tableau des matériaux.

1. Génération de lignées cellulaires triple négatives du cancer du sein résistantes au taxol

1. Pour déterminer la sensibilité des cellules aux médicaments, ajustez SUM159PT la densité cellulaire des cellules adhérentes à 2 × 10^{3 cellules} par puits dans des plaques noires claires à 96 puits avec le mélange nutritif F12 de Ham complété avec 5 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine, 5 μg/mL d’insuline, 10 mM de HEPES et 1 μL/mL d’hydrocortisone, puis incubez les cellules pendant 16 heures dans un incubateur en culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂.
2. Préparez du stock de Taxol dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Pour traiter les cellules, préparez des dilutions en série de Taxol dans des milieux de culture, allant de 0,3 nM à 10 μM (par exemple, 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1μM, 10 μM), et utilisez le DMSO seul comme contrôle du véhicule.
3. Traiter les cellules avec 200 μL de doses croissantes de Taxol (préparées à l’étape 1.2) en triple exemplaires et laisser la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 72 heures à 37 °C avec 5 % de_CO2.
4. Après 72 heures de traitement médicamenteux, mesurez la viabilité cellulaire avec un test de quantification de la viabilité cellulaire à base de luminescence par adénosine triphosphate (ATP). Utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer la luminescence et normaliser les valeurs aux contrôles DMSO. Calculez les valeurs de concentration inhibitrice de 10 % (IC10) et IC50 par régression non linéaire à l’aide d’un modèle logistique dose-réponse à quatre paramètres dans un logiciel statistique approprié.
5. Pour commencer à produire des cellules chimiorésistantes, semez 2 × 10^{cellules de 5} SUM159PT par puits dans des plaques à 6 puits. Incubez toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO₂.
6. Le lendemain, traiter les cellules contenant soit des valeurs IC10 soit IC50 de Taxol dans 2 mL de milieux de culture pendant 72 heures, comme concentrations de départ.
7. Si les cellules tolèrent la concentration actuelle du médicament, séparez-les en deux puits. Maintenir un puits comme secours dans un milieu frais et remplacer le milieu du second puits par un milieu contenant deux fois la concentration précédente de Taxol.
   REMARQUE : Si les cellules ont besoin de récupération en raison de changements morphologiques induits par le stress tels que des projections cellulaires anormales, un arrondi et un décollement importants, ou une réduction marquée de la prolifération, maintenez-les dans un milieu sans médicament et attendez que les cellules deviennent saines et confluentes. Ensuite, répétez les étapes en commençant par l’étape 1.7.
8. Lors de la génération de cellules résistantes, les cellules parentales passent avec un milieu contenant du DMSO comme témoin. Ajustez le volume de DMSO pour correspondre à la quantité de DMSO présente dans le traitement Taxol correspondant.
9. Mesurez la viabilité cellulaire comme aux étapes 1.2 à 1,4 toutes les 3 à 4 semaines et poursuivez cette procédure jusqu’à obtenir une différence significative (p < 0,05 ou 10–50 fois selon le médicament appliqué) entre les valeurs IC50 des lignées cellulaires parentales et résistantes. La procédure d’incrémentation de la dose prend généralement de 6 à 9 mois, selon le médicament utilisé.
10. Après l’obtention de cellules résistantes stables, maintenez-les dans la dose d’entretien (dernière dose appliquée) du médicament tout en cultivant pour préserver le phénotype résistant.
    REMARQUE : La génération de cellules chimiorésistantes par la méthode d’augmentation de dose est un processus long et sa durée dépend de plusieurs facteurs, notamment la lignée cellulaire, le taux de croissance intrinsèque et l’agent chimiothérapeutique spécifique utilisé. Cela prend généralement entre 6 et 9 mois, selon le niveau de résistance cliniquement pertinent. Une approche alternative pour déterminer des différences significatives dans les niveaux de résistance consiste à évaluer la concentration minimale de médicaments à laquelle les cellules résistantes survivent, mais pas les cellules parentales.
11. Caractérisation des cellules résistantes : effectuer le séquençage à ARN, le western blotting, la réaction en chaîne quantitative de la polymérase (qPCR) et des tests de viabilité cellulaire avec traitement médicamenteux (par exemple, test de formation de colonies) pour caractériser le phénotype cellulaire résistant. Veillez à réévaluer le phénotype résistant après plusieurs passages afin de démontrer que le phénotype élevé d’IC50 reste stable dans le temps.

2. Production de lentivirus

1. Jour 0 : Semence HEK293T cellules en 4 × 10⁶ par 100 mm de culture tissulaire avec le Médium Eagle Modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptycine, pour atteindre une confluence de 90 % le lendemain.
2. Jour 1 : Préparez séparément les mélanges de polyéthylenimine (PEI) et d’ADN dans du DMEM sans sérum (-/-) pour chaque virus. Utilisez les tableaux 1 et 2 pour ajuster le volume et les concentrations d’IPE et d’ADN selon le rendement viral souhaité.
   REMARQUE : Le PEI est utilisé quatre fois le total de μg d’ADN (par exemple, dans une plaque de 100 mm, utiliser 30 μL d’EPI pour un total de 7,5 μg d’ADN). La production de virus dans des antennes de 100 mm est suivie dans ce protocole, et le virus obtenu sur 5 à 10 antennes de 100 mm permettra d’effectuer plusieurs écrans. Pour des expériences de validation ou des infections à petite échelle, un seul puits d’une plaque à 6 puits ou d’une antenne de 60 mm est suffisant. Puisque le chlorhydrate linéaire de polyéthyléminine est un agent de transfection toxique, assurez-vous que la confluence cellulaire soit de 90 % au moment de la transfection.
   1. Après avoir bien mélangé, ajoutez le mélange d’ADN au tube PEI. Mélangez bien et laissez les complexes PEI-ADN reposer 30 minutes à température ambiante.
   2. Ajoutez ensuite les 600 μL du complexe PEI-ADN aux HEK293T, goutte à goutte. Placez les plaques dans l’incubateur viral pendant 16 heures à 37 °C avec 5 % de_CO2.
3. Jour 2 : Remplacer le milieu des cellules infectées en aspirant le PEI et le milieu viral et en ajoutant 8 mL de DMEM complet pour chaque bol de culture tissulaire de 100 mm. Incubez les cellules pour permettre la production virale.
4. Jour 3 : Effectuer la première collecte de virus en retirant doucement les 8 mL de surnageant dans un tube centrifugeuse de taille appropriée et en conservant à 4 °C. S’il y a plusieurs plaques pour la production virale, combinez les surnatants. Ajoutez ensuite 8 mL de DMEM frais et complet à chaque plat et remettez les assiettes dans l’incubateur viral.
5. Jour 4 : Répétez les étapes de collecte et combinez avec les surnatants du jour 3.
   1. Préparez une solution de polyéthylène glycol (PEG)-8000 à 50 % (p/v) dans une solution saline tamponnée phosphate (PBS) pour obtenir une solution de stock de 5× PEG. Autoclave pour dissoudre et stériliser.
   2. Centrifugez les surnatants viraux collectés à 300 x g pendant 5 minutes pour pelleter les cellules résiduelles, puis procédez à la filtration.
   3. Filtrez 16 mL de surnageant viral à l’aide d’un filtre de 0,45 μm (soit à seringue, soit à vide de 50 mL) dans le tube contenant 4 mL de solution PEG afin d’obtenir une concentration finale de 1× PEG et d’éliminer les débris et cellules restants.
   4. Bouchez le tube et mélangez par inversion. Répétez cette étape pour toutes les préparations virales. Conservez toute la nuit à 4 °C dans le noir, avec une agitation douce en option.
   5. Le lendemain, des précipitations visibles devraient être présentes. Centrifugez les tubes à 1400 x g pendant 20 minutes à 4 °C.
      REMARQUE : Les granulés viraux précipités par PEG peuvent être stockés à 4 °C jusqu’à 5 jours avant la centrifugation ; cependant, le titre viral peut diminuer avec une incubation prolongée.
   6. Après centrifugation, il faut détruire soigneusement le surnageant, en laissant un petit volume (environ 100 μL) dans le tube pour éviter de perturber la pastille.
   7. Centrifugez les tubes 5 minutes à 300 x g pour collecter autant de liquide que possible sur les côtés du tube. Puis jetez soigneusement le surnageant restant.
   8. Pour concentrer le virus 100 fois, ajoutez le PBS à 1/100 du volume initial du surnageant viral au pellet et resuspendez le pellet par pipette (par exemple, si vous commencez avec 16 mL de surnageant viral, ajoutez 120 à 140 μL de PBS au pellet pour atteindre un volume final de 160 μL, en tenant compte du volume du pellet). Évitez la pipetation vigoureuse ; Aliquot le virus.
      REMARQUE : Le titre attendu après la concentration de PEG est de >1 × 10⁸ particules infectieuses/mL (ip/mL) pour le système LentiGuide et >1 × 10⁷ pour le système LentiCRISPR. Des titres inférieurs d’un ordre de grandeur peuvent encore être acceptables, mais doivent être vérifiés par rapport à l’infectiosité de la lignée cellulaire cible et au volume viral requis.
   9. Si la concentration virale n’est pas requise, aliquotez le virus pour minimiser les cycles de gel et de dégel. Conservez le virus concentré ou non concentré à -80 °C. De l’eau de Javel et des assiettes de poubelle.
      REMARQUE : Pour une description plus détaillée de la production et de la manipulation des lentiviraux, les lecteurs sont référés aux protocoles^{établis 20}. Pour les problèmes courants rencontrés lors de la production de lentivirus, voir le Tableau Supplémentaire 1.

	1 puits de plaque à 6 puits	Plaque de 60 mm	Plaque de 100 mm	Plaque de 150 mm
Volume PEI (stock 1 mg/mL)	6 μL	9 μL	30 μL	60 μL
Volume DMEM (-/-)	54 μL	100 μL	270 μL	540 μL

Tableau 1 : Volumes PEI et DMEM requis pour différentes plaques pour le mélange PEI.

	1 puits de plaque à 6 puits	Plaque de 60 mm	Plaque de 100 mm	Plaque de 150 mm
VSV-G	75 ng	150 ng	375 ng	750 ng
Gag-Pol	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
Vecteur cible	750 ng	1500 ng	3750 ng	7500 ng
DMEM (-/-) ajuste le volume final à	60 μL	100 μL	300 μL	600 μL

Tableau 2 : Volumes plasmides et DMEM requis pour différentes plaques pour le mélange d’ADN.

3. Établissement d’une sélection optimisée de puromycine pour les cellules MDR

REMARQUE : Dans les cellules chimiorésistantes présentant une surexpression d’ABCB1, la sélection de la puromycine échoue en raison d’un efflux actif médié par ABCB1 de puromycine, empêchant ainsi la sélection efficace des cellules infectées par l’ARNsg. Pour surmonter cette limitation, le verapamil est co-administré avec la puromycine afin d’inhiber transitoirement l’efflux médié par ABCB1, permettant une accumulation intracellulaire de puromycine et éliminant efficacement les cellules non infectées.

1. Déterminez la concentration de vérapamil qui bloque l’efflux médicamenteux médié par ABCB1 sans affecter la viabilité cellulaire. Pour cela, utilisez l’agent chimiothérapeutique auquel la résistance a été acquise (dans ce cas, le Taxol) en combinaison avec des doses croissantes de vérapamil.
   1. Semence SUM159PT cellules résistantes au taxol et parentales à 96 puits noires dégagées à 2 × 10³ cellules par puits en triple exemplaire. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 °C avec 5 % de CO_2.
   2. Traiter les cellules avec des dilutions en série de vérapamil (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 et 80 μM) tout en maintenant une concentration constante de Taxol (par exemple, la dose d’entretien) dans toutes les conditions.
   3. Après 72 heures de traitement, évaluer la viabilité cellulaire à l’aide d’un test de quantification de la cellule basé sur la luminescence de la cellule ATP. Déterminer la concentration de verapamil qui ne réduit pas la viabilité en soi (≥90 % à 95 % par rapport aux témoins non traités) mais qui restaure la sensibilité des cellules résistantes.
2. Pour déterminer la concentration de puromycine à utiliser en combinaison avec du verapamil, semez SUM159PT cellules résistantes au Taxol dans une plaque de 96 puits à 2 × 10^{cellules 3}par puits. Couver la plaque pendant 16 heures à 37 °C avec 5 % de CO_2.
   1. Préparez des dilutions en série de puromycine (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 μg/mL) dans le milieu contenant la concentration de verapamil précédemment déterminée et traitez les cellules en conséquence.
   2. Après 72 heures, mesurez la viabilité cellulaire avec un test de quantification de la viabilité cellulaire par ATP basé sur la luminescence, et déterminez la concentration minimale de puromycine qui élimine toutes les cellules (viabilité ≤5 %) en présence de vérapamil. Cette concentration sera utilisée pour la sélection lors du dépistage CRISPR.
      REMARQUE : Ces étapes d’optimisation des concentrations de médicaments dépendent de la lignée cellulaire et du contexte. Des facteurs tels que la sensibilité intrinsèque aux médicaments, les niveaux d’expression du téléporteur ABC et le taux de croissance peuvent influencer les concentrations effectives. Par conséquent, effectuez cette optimisation pour chaque nouvelle lignée cellulaire et modèle de résistance. (Pour référence, 5 μg/mL de puromycine en combinaison avec 20 μM verapamil est utilisé pour les cellules résistantes au Taxol utilisées dans cette étude¹⁷). Pour la résolution de problèmes entre puromycine + vérapamil, consultez le Tableau Supplémentaire 1.

4. Calcul de la titration virale et de la multiplicité de l’infection (MOI)

1. Jour -1 : Semencer SUM159PT cellules résistantes au Taxol en 2 × 10⁵ dans chaque puits d’une plaque à 6 puits avec le mélange complet de nutriments F12 de Ham.
2. Jour 0 : Effectuer quatre dilutions en série du virus dans le mélange nutritif F12 de Ham contenant du sulfate de protamine (PS) à 8 μg/mL. (Pour les virus concentrés, commencez par 1 μL et diluez dix fois à chaque dilution en 1 > ^10-1 > ^10-2 > ^10-3. Pour les virus non concentrés, ajustez les volumes en conséquence (par exemple, 100 μL > 10 μL > 1 μL > 0,1 μL).
   1. Donnez 1 mL de média contenant un virus à chacun des quatre puits. Laissez un puits pour contrôler la sélection puromycine et un autre aussi pour le contrôle non traité.
3. Jour 1 : Remplacer le média viral par 2 mL de milieux frais 16 h après l’infection.
4. Jour 2 : Transférer le contenu cellulaire de chaque puits vers une boîte de culture cellulaire de 100 mm avec le mélange nutritif F12 de Ham contenant puromycine + vérapamil aux concentrations déterminées à l’étape 3.2. Si les cellules non sélectionnées sont surconfluentes, semez une fraction définie (par exemple, 1/2), et cela sera pris en compte lors des calculs finaux.
   REMARQUE : Réapprovisionner le milieu en puromycine + vérapamil frais, si nécessaire, au cours des 3 à 4 jours suivants jusqu’à ce que toutes les cellules de la plaque témoin soient mortes.
5. Jours 4–5 : Lorsque les cellules de la plaque de contrôle sont mortes, déterminez celles qui contiennent suffisamment de cellules pour compter. Trypsinisez les cellules, comptez-les et déterminez le nombre total de cellules.
6. Après avoir compté les cellules viables, calculez l’efficacité de transduction et la multiplicité de l’infection (MOI) comme suit (utilisez le Tableau Supplémentaire 2 comme modèle) :
   1. Calculez le taux de transduction (fraction de cellules infectées) en utilisant la formule ci-dessous
      
      
      N_{sélectionné} : Nombre total de cellules après sélection de puromycine dans les puits infectés
      _{N contrôle} : Nombre total de cellules dans le puits de contrôle non transduit et non sélectionné
      p : Taux de transduction (fraction des cellules infectées).
      REMARQUE : Si seule une fraction des cellules témoins non traitées a été ensemencée, tenez-en compte lors du calcul de_{N Contrôle}
   2. Calculez le MOI. Lors de la transduction lentivirale, les événements d’infection suivent une distribution de Poisson. Par conséquent, la fraction de cellules infectées par au moins un virus est définie comme suit :
      p =1- ^{e -MOI}
      Ainsi, calculez le MOI comme suit :
      MOI = - ln(1-p)
   3. Calculez le titre lentiviral (particule infectieuse/millilitre, IP/mL) en fonction du nombre de cellules infectées :
      Titer (IP/mL) = (MOI x_{N au départ})/ Volume du virus
      _{N au départ} : nombre de cellules ensemencées pour l’infection
      Volume du virus : volume de virus ajouté par puits (en mL)
      REMARQUE : Calculez séparément le titre lentiviral pour chaque infection et déterminez le titre final en prenant la moyenne des puits montrant la quantité proportionnelle de virus et les valeurs de titre. Les puits présentant une saturation ou une déviation par rapport à l’échelle proportionnelle doivent être exclus des calculs de titre.

5. Génération et/ou validation d’une lignée cellulaire stable exprimant Cas9

REMARQUE : Cette étape est nécessaire lors de l’utilisation de LentiGuide_EPIKOL. Si une ligne Cas9-stable validée est déjà disponible, ou si LentiCRISPR_v2_EPIKOL est utilisée, il faut passer directement à la Section 6.

1. Produire le lentivirus Cas9 en utilisant le vecteur LentiCas9_blast décrit à la section 2.
2. Infecter les cellules le lendemain, en visant un MOI de 10. Calculez la quantité du virus selon le MOI prévu dans la section 4, utilisez la quantité calculée de volume viral, et donnez-la directement aux cellules de la plaque contenant un milieu de culture contenant 8 μg/mL de sulfate de protamine (PS).
3. Remplacer le milieu viral par un médium frais 16 heures après l’infection
4. Le lendemain, appliquez la sélection de blasticidine en administrant aux cellules le milieu de culture contenant la concentration de blasticidine précédemment déterminée (concentration finale déterminée par lignée cellulaire avec un test de viabilité cellulaire décrit à la section 3) jusqu’à élimination des cellules non infectées (généralement 6 à 7 jours).
   REMARQUE : Si les cellules exprimant Cas9 sont cultivées pendant de longues périodes avant le dépistage, répétez la sélection de blasticidine pour éliminer les cellules Cas9 négatives.
5. Validation Cas9 (recommandée) : Valider l’activité Cas9 en utilisant des sgRNA témoins ciblant des gènes essentiels (les séquences d’ARNsg sont disponibles dans la bibliothèque EPIKOL ; voir le Tableau Supplémentaire 3) ou des systèmes rapporteurs tels que la protéine fluorescente verte (GFP) pour évaluer l’efficacité de l’élimination et la cinétique. Des méthodes de validation détaillées se trouvent dans une étude précédente¹⁹.

6. Élimination de l’épigénome CRISPR, infection et dépistage de la bibliothèque lentivirale

REMARQUE : Pour garantir une cartographie génotype-phénotype précise, les criblages CRISPR regroupés nécessitent une infection à faible MOI et une couverture de bibliothèque suffisante (typiquement 500×–1000), selon la rigueur expérimentale et le comportement des lignées cellulaires. Pour les principes généraux des flux de travail de dépistage CRISPR à l’échelle du génome groupé, y compris la conception de bibliothèque et la mise en place expérimentale, voir les protocoles^{précédemment publiés 21,22}. Pour EPIKOL, il est fortement recommandé de maintenir une couverture >500x tout au long du criblage, car descendre en dessous de ce seuil augmente le risque de perte stochastique de sgRNA, notamment dans le domaine du traitement médicamenteux du crib. Les calculs suivants sont nécessaires pour déterminer le nombre de cellules de départ, l’efficacité de la transduction et le volume viral nécessaires pour que la transduction EPIKOL réalise une infection à faible MOI sans compromettre la complexité de la bibliothèque.

1. Jour -1 : Semez un nombre total de cellules calculé ci-dessous dans des plateaux de culture cellulaire de 100 mm ou 150 mm avec un nombre approprié de cellules par plaque.
   1. Calculez le nombre de cellules infectées avec succès pour atteindre la couverture de bibliothèque souhaitée (utilisez le Tableau Supplémentaire 2 comme modèle) :
      N_infectés = (nombre d’ARNsg) × (couverture de la cible)
   2. Calculez le nombre de cellules de départ par réplication pour compenser la fraction de cellules non infectées lors d’une infection à faible MOI (0,3–0,4) :
      _{N au départ} = N_infectés/p
      où p est le taux de transduction (fraction de cellules infectées) déterminé sur la base de la distribution de Poisson (voir étape 4.6).
      REMARQUE : Cet ajustement garantit qu’un nombre suffisant de cellules individuelles infectées par un sgRNA sera présent dans le pool lors d’une infection à faible MOI pour atteindre la couverture de bibliothèque souhaitée.
2. Jour 0 - Transduction
   1. Calculer le volume viral requis par réplication
      Volume viral requis = (_{N au départ} × MOI) / (Titer viral (ip/mL précédemment déterminé))
      REMARQUE : L’efficacité de transduction à la plage MOI cible de 0,3–0,4 correspond à environ
      26 % à 33 % de cellules résistantes à la puromycine avant la sélection.
   2. Infecter les cellules dont le volume viral calculé est dans le milieu de culture complet contenant 8 μg/mL de sulfate de protamine (PS). Réduire le volume du milieu pour augmenter le contact virus-cellule pendant l’infection (par exemple, 8 mL au lieu de 10 mL pour une plaque de 100 mm)
   3. Préparez des mélanges d’infection indépendants pour chaque réplication biologique.
      REMARQUE : Au moins deux réplicés biologiques sont recommandés ; trois sont préférés. Les répliques biologiques doivent être transduites, sélectionnées et maintenues séparément (y compris les changements de milieu et le passage des sources) et ne doivent pas être mises en commun à aucune étape avant le séquençage.
3. Jour 1 - Remplacer les milieux viraux par des milieux frais après 16 heures et incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂
4. Jour 2 - Sélection des cellules transduites : Appliquer la sélection de puromycine en présence de vérapamil (concentrations déterminées à l’étape 3.2) pour enrichir les cellules infectées par l’ARNsg dans SUM159PT cellules résistantes au taxol. Poursuivre la sélection jusqu’à ce que toutes les cellules de la plaque témoin non infectée soient éliminées (généralement ~3 jours).
5. Jour 5 - Échantillonnage de référence T₀ : Après la fin de la sélection puromycine + verapamil, trypsinisez les cellules et collectez une pellete cellulaire initiale à zéro temps (T₀) de chaque réplication biologique correspondant au niveau de couverture décidé lors de la transduction. Puisqu’il servira de référence pour la distribution initiale de la bibliothèque, collectez les granulés de cellules dès que la sélection est terminée, avant qu’une perte de cellule ne survienne. Semez suffisamment de numéros de cellules pour préserver la couverture en permanence.
   REMARQUE : Après la sélection puromycine + vérapamil, le nombre de cellules transduites survivantes variera en fonction du temps de doublement de la lignée cellulaire et de l’efficacité de transduction atteinte. La population survivante revient généralement à la densité initiale de semis à l’achèvement de la sélection et peut la dépasser dans les lignées cellulaires à croissance plus rapide. Si le numéro de cellule survivant le permet, prélever plusieurs pastilles T₀ et congeler les échantillons de secours à -80 °C. De plus, les cellules infectées par EPIKOL peuvent être cryopréservées dans de l’azote liquide tout en maintenant leur couverture. Ces stocks de secours peuvent être décongelés en cas de défaillance inattendue de l’écran ou pour de futures approches expérimentales alternatives (par exemple, tester des traitements médicamenteux supplémentaires). Vérifiez l’efficacité de transduction à l’aide d’une plaque de contrôle non infectée pour confirmer que l’efficacité de transduction souhaitée a été atteinte (voir section 4). Si l’efficacité de transduction observée est supérieure à l’attente, redémarrer l’expérience pour s’assurer que la transduction est réalisée à un faible MOI, empêchant ainsi l’intégration multiple d’ARNsg-sg-sg.
6. Exécution du dépistage : Après avoir permis la réalisation de l’édition du génome médiée par Cas9, pour la durée déterminée à la section 5, divisez les cellules en groupes de traitement.
   REMARQUE : Cela prend généralement 7 à 9 jours après la transduction, car l’efficacité maximale de l’élimination est atteinte approximativement au jour 7²³ post-transduction. Pour les cibles épigénétiques, une fenêtre de 9 jours permet également des changements au niveau de la chromatine avant le début de la sélection du médicament.
   1. Diviser les cellules en bras expérimentaux tout en préservant la couverture : l’un est le bras témoin qui est une condition de base recevant le DMSO, et l’autre est le bras de traitement qui reçoit le Taxol.
   2. Maintenir les cultures pour des doublements de population de 14 à 16 ans. Le niveau de doublement de la population (PDL) est calculé comme suit :
      PDL =_{PDL s} + 3,322 (Log C_f – log_{C i})
      PDL_s = niveau de doublement de population initial
      C_i = numéro de cellule initial semé
      C_f = nombre total de cellules à la fin d’une période de croissance
   3. À chaque passage, surveillez la viabilité et la cinétique de croissance et évitez les goulets d’étranglement en maintenant un nombre suffisant de cellules. Ajustez l’intensité du traitement en cas de mort cellulaire excessive.
      REMARQUE : Essayez de collecter des pastilles de cellules de secours à chaque passage, chaque semaine ou à certains PDL pendant l’écran. Ces échantillons de secours peuvent servir de points temporels alternatifs pour le séquençage ou d’échantillons d’optimisation pour le processus d’extraction de l’ADN génomique. Cryopréserve périodiquement les cellules pour éviter une perte cellulaire inattendue.
7. Échantillonnage_final de T : À l’atteinte du PDL souhaité, collectez les granulés de points temporels finaux (T_final) pour chaque réplique et condition en maintenant la couverture de la bibliothèque par pellet. Conserver les granulés à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ADNg en aval.
   REMARQUE : Visez à terminer l’écran à des PDL comparables entre les bras, même si la durée de la culture varie selon les conditions.

7. Extraction d’ADN génomique

1. Extraire l’ADN génomique (gDNA) à l’aide d’une méthode validée (par exemple, MN NucleoSpin Tissue Kit), avec de légers ajustements de protocole pour améliorer l’efficacité de la lyse à partir de grosses granulés cellulaires regroupées.
   1. Suivez le protocole tissulaire plutôt que celui des cellules en raison de la grande taille des granules. Envisagez d’augmenter les volumes de réactifs et d’utiliser plusieurs colonnes de spin par pellet de cellule (ne pas dépasser 5 × 10⁶ cellules par colonne) si nécessaire pour garantir une lyse efficace.
      REMARQUE : Avant la lyse, resuspendre le pellet avec une quantité minimale de PBS (~50 μL) peut améliorer l’efficacité de la lyse. Une lyse incomplète du globule peut boucher la colonne de spin, entraînant une réduction du rendement ADN.
   2. Suivez les recommandations d’élution à haut rendement et à haute concentration. Éluter de l’ADNGG dans un volume réduit de tampon d’élution (environ 2/3 du volume recommandé) par colonne, en particulier si les granulés cellulaires sont divisés en plusieurs colonnes.
2. Mesurer la qualité et la quantité de l’ADNg (par exemple, Nanodrop).

8. Préparation de la bibliothèque de séquençage EPIKOL à partir de l’ADN génomique

1. Utilisez un cabinet PCR dédié pour effectuer toutes les étapes de la PCR de la bibliothèque afin d’éviter la contamination plasmidique lors des PCR à ADNG, car les gabarits plasmidiques s’amplifient plus efficacement que l’ADN génomique et peuvent déformer la distribution des sgARN.
   1. Nettoyez l’espace de travail, les micropipettes et les racks avec respectivement 10 % d’eau de Javel et 70 % d’éthanol.
   2. Aliquotez tous les réactifs (en particulier les amorces) en volumes à usage unique avant l’utilisation afin de réduire le risque de contamination croisée et de cycles de congélation-dégel.
   3. Conservez les réactifs à -20 °C et gardez-les sur glace pendant la préparation de la PCR.
2. Optimiser le volume d’entrée d’ADN gD de départ en visant une couverture de 200× à 500× par ARNsg afin de maintenir une complexité de bibliothèque appropriée. Exemple : Pour la bibliothèque EPIKOL, les gDNA sont de préférence extraits de granulés cellulaires collectés à 1000 × couverture, et une couverture finale de 250 × est utilisée pour l’amplification de l’ADN g.
   1. Calculez l’entrée d’ADN g requise pour la couverture souhaitée comme suit.
      Quantité d’ADN g = (Nombre d’ARNsg) × couverture × (66 pages d’ADN/noyau)
      Exemple : 8000 gRNA × (couverture de 250×) × (6,6 pg ADN/noyau) = 13,2 μg gADN/échantillon doivent être amplifiés.
   2. Effectuer une PCR test en utilisant les conditions de réaction PCR externes et internes dans les tableaux 3, 4, 5 et 6 avec des quantités croissantes de gDNA par réaction (par exemple, 1 μg, 3 μg, 6 μg) afin de déterminer la quantité optimale d’ADN par tube.
      REMARQUE : Un apport insuffisant de gDNA ou un cycle PCR excessif peuvent introduire un biais d’amplification et fausser la couverture du sgRNA.
   3. Utilisez un gel d’agarose à 2 % pour analyser les produits PCR internes. Assurez-vous qu’une bande claire d’environ 350 pb soit observée.
   4. En fonction de la quantité optimale d’ADN par tube, déterminez le nombre total de réactions PCR nécessaires par échantillon pour atteindre la couverture de la bibliothèque souhaitée tout en évitant des quantités excessives d’ADN par réaction individuelle.
      REMARQUE : Si 13,2 μg de gDNA total sont nécessaires et 3,3 μg d’ADN g par réaction permettent une amplification optimale, préparez quatre réactions PCR parallèles avec 3,3 μg d’ADN dans un volume de réaction de 100 μL. Dans ce contexte, le volume d’ADN g ne doit pas dépasser 10 % du volume de réaction afin d’éviter une inhibition par PCR due à une entrée excessive de gabarit.
3. Amplifier les cassettes sgRNA à partir du gabarit d’ADNG (PCR première/externe)
   1. Amplifiez les régions génomiques contenant la cassette sgRNA lentivirale stable à l’aide des amorces listées dans le Tableau Supplémentaire 2. Effectuez des réactions PCR avec la quantité d’ADN g déterminée à l’étape 8.2 (voir Tableau 3) en utilisant les conditions de réaction PCR du Tableau 4. Préparez un tube de contrôle PCR sans ADN modèle pour vérifier une éventuelle contamination, et gardez les tubes sur la glace en permanence.
   2. Ajoutez enfin de l’ADN polymérase, mélangez bien en tapotant ou en pipettant, puis faites brièvement tourner les tubes PCR avant de les mettre dans le thermocyclage. Effectuez le démarrage à chaud pour éviter toute amplification non spécifique.
   3. À l’issue de la PCR externe, concentrez toutes les réactions de PCR dans un tube microcentrifuge. Le nettoyage par PCR ou la visualisation du gel après une PCR externe n’est pas nécessaire. Utilisez directement le produit PCR en pool comme modèle dans la deuxième PCR (interne). Conservez les produits PCR à -20 °C.

Réactif	Volume par réaction
dNTP (10 mM chacun)	2 μL
Phusion polymérase	1 μL
Tampon GC 6'	20 μL
Amorce avant (10 μM)	5 μL
Amorce inversée (10 μM)	5 μL
ADNgD	X μL
Eau sans nucléase	jusqu’à 100 μL (67–X μL)
Total	100 μL

Tableau 3 : Réactifs requis pour la première PCR/PCR externe.

Numéro de cycle	Dénature	Recuissage	Extension
1	95 °C, 3 min
2–19	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
20			72 °C 3 min

Tableau 4 : Conditions de PCR pour la première/PCR externe.

4. Effectuer le codage à barres d’index (PCR second/interne) et l’extraction par gel
   1. Lors de la deuxième PCR (interne), une amorce d’index inversée est utilisée pour coder les échantillons en code-barres ; par conséquent, utilisez des amorces d’index différentes pour chaque échantillon.
      REMARQUE : Pour les bibliothèques générées avec le dorsal pLentiCrispr v2 , utilisez des amorces à index inversé qui se terminent par des bases CT, indiquées lenticrisprv2_rev(index X) (voir le Tableau Supplémentaire 2).
   2. Pour les bibliothèques générées avec le dorsal pLentiGuide , utilisez des index qui se terminent par des bases GT et sont indiqués comme rev_index_X dans le Tableau Supplémentaire 2.
   3. Préparez un mélange d’amorces décalées vers l’avant en combinant 2 μL de chacune des neuf amorces décalées (stock 100 μM) et en ajoutant 162 μL d’eau sans nucléase dans un tube microcentrifuge stérile. La concentration finale du mélange d’amorce sera de 10 μM.
   4. Utilisez le produit PCR externe en pool comme entrée et effectuez deux réactions PCR internes parallèles de 100 μL par échantillon en utilisant les instructions des Tables 5 et 6. Préparez une réaction de contrôle PCR en utilisant le contrôle « No template DNA » issu de la PCR externe (étape 7.3) en entrée pour surveiller une contamination potentielle.
   5. Ajoutez enfin de l’ADN polymérase, mélangez bien par tartapage ou pipette, faites tourner brièvement les tubes PCR avant de les mettre dans le cycle thermique. Effectuez le démarrage à chaud pour éviter les amplifications non spécifiques.
   6. Combinez et effectuez des réactions PCR internes dans un gel d’agarose à 2 % pour séparer l’amplicon cible.
      REMARQUE : Aucune bande ne doit être détectée dans les contrôles PCR sans gabarit. Une bande distincte autour de 337 pb pour LentiCrispr_V2 et 357 pb pour les bibliothèques LentiGuide doit être observée. Une bande supérieure non spécifique d’environ 500 pb peut également être présente et doit être exclue du traitement en aval.
   7. Chargez 12 μL (10 μL de produit PCR + 2 μL de colorant de chargement) de produit PCR interne pour visualiser les bandes, chargez le reste du produit PCR dans des puits fusionnés ou adjacents destinés à l’extraction sur gel. Minimisez l’épaisseur de l’agarose pour maximiser la récupération de l’ADN. Évitez de surexposer les voies d’extraction du gel lors de la visualisation afin de minimiser les dommages à l’ADN induits par les UV lors de l’excision du gel.
   8. Purifiez les produits PCR à partir du gel d’agarose à l’aide d’un kit d’extraction de gel spécifique (par exemple, NucleoSpin Gel et PCR Clean-up) en suivant les instructions du fabricant. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Conservez les produits PCR à -20 °C.
      REMARQUE : Une concentration minimale de >20 ng/μL après extraction du gel est requise pour un séquençage correct. Si le rendement requis n’a pas pu être atteint même avec trois réactions PCR internes parallèles, isolez un nouvel ADNg et répétez le processus.

Réactif	Volume par réaction
dNTP (10 mM chacun)	2 μL
Phusion polymérase	1 μL
Tampon GC 6'	20 μL
Amorce du mélange décalé avant (10 μM)	5 μL
Amorce à indice inversé (10 μM)	5 μL
PCR externe	5 μL
Eau sans nucléase	62 μL
Total	100 μL

Tableau 5 : Réactifs requis pour la seconde/PCR interne.

Numéro de cycle	Dénature	Recuissage	Extension
1	95 °C, 3 min
2–25	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
26			72 °C 3 min

Tableau 6 : Conditions de PCR pour la seconde/PCR interne.

9. Séquençage

1. Déterminez le nombre requis de lectures mappées en fonction de la couverture de la bibliothèque définie au début de l’écran. En supposant une efficacité de cartographie de 60 % à 70 %, demandez un nombre total plus élevé de lectures pour compenser la perte de lecture. Pour une couverture de 1000 × de la bibliothèque EPIKOL, il faut ~8 millions de lectures cartographiées, correspondant à 10 à 12 millions de lectures totales.
2. Effectuer le contrôle qualité des bibliothèques de séquençage à l’aide d’une Tapestation ou d’un Bioanalyseur avant le séquençage afin de confirmer la taille et l’intégrité de la bibliothèque.
3. Poolez des bibliothèques de séquençage à partir de différents échantillons avant le séquençage, car elles sont uniquement codées par des amorces d’index.
4. Confirmez les exigences de structure de lecture (orientation R1/R2) et de démultiplexage avec la fonction de séquençage. Le séquençage apparié 2× 150 pb est suggéré dans Illumina HiSeq, Novaseq ou une plateforme de séquençage compatible Illumina équivalente. Envisagez de demander au moins 5 % de spik-in PhiX pour améliorer la diversité du séquençage.

10. Aperçu de l’analyse de séquençage pour EPIKOL

1. Utilisez le pipeline d’analyse MAGeCK pour analyser les fichiers FASTQ²⁴ en binaire. Organisez chaque réplication biologique comme un fichier d’entrée individuel.
2. Utilisez le fichier d’entrée sgRNA d’EPIKOL compatible avec MAGeCK comme bibliothèque de référence (fournie dans le Tableau Supplémentaire 4) et appliquez la fonction de comptage pour quantifier les lectures sgRNA à partir de fichiers FASTQ individuels afin de créer des fichiers de comptage bruts pour chaque réplication et condition.
   1. Normalisez chaque fichier de comptage en utilisant la normalisation des lectures par million (RPM) pour vérifier la qualité et la distribution de chaque échantillon en visualisant les graphiques de comptage des sgRNA^{normalisés 14}.
3. Effectuez une fonction de second -count pour fusionner les comptes en un seul fichier en utilisant la normalisation médiane avec les réglages par défaut.
4. Exécutez la fonction -test pour identifier les changements au niveau des gènes en utilisant des fichiers bruts fusionnés. Pour évaluer la performance au criblage, comparez les échantillons_finaux de T à ceux de T₀ et vérifiez la répartition des sgRNA témoins non ciblants et des ARNs ciblant génétiquement essentiels.
   REMARQUE : Il est crucial d’évaluer la déplétion des gènes témoins positifs dans chaque bras de dépistage afin d’évaluer la performance du criblage. On s’attend à ce qu’on observe une variabilité biologique entre les réplications dans le bras de criblage traité par médicaments, car l’exposition aux médicaments peut provoquer des différences stochastiques dans la réponse cellulaire. Cette variabilité est inhérente aux tests de chimiorésistance et n’indique pas nécessairement une mauvaise qualité d’écran. Ainsi, lors des appels d’impact, au moins trois répétitions biologiques doivent être analysées ensemble, et les hits doivent être déterminés comme les gènes ayant au moins 6 ARNg efficaces sur 10.
5. Pour identifier les changements induits par le médicament dans l’abondance des sgRNA et les effets au niveau des gènes, comparez les échantillons traités au T_final au Taxol avec le T_final-DMSO, en utilisant le groupe DMSO comme témoin.
6. Appliquer une coupure de taux de fausse découverte (FDR) de FDR < 0,05 pour identifier les gènes appauvris dans le groupe traité afin de révéler les gènes qui contribuent à la fitness ou à la résistance des cellules résistantes au Taxol.

Résultats

Pour étudier les régulateurs épigénétiques de la chimiorésistance dans le TNBC, le protocole global utilisant la lignée cellulaire SUM159PT est illustré à la Figure 1. Premièrement, les valeurs de Taxol IC₁₀ et_{IC 50} dans les cellules SUM159PT ont été déterminées en traitant les cellules avec des concentrations croissantes de Taxol (Figure 2A). Une méthode d’escalade progressive de dose a été utilisée pour générer des cellules de SUM159PT résistantes au Taxol. Après plusieurs mois, un changement des valeurs d’IC50 illustre l’établissement réussi d’un phénotype résistant grâce à ce protocole par rapport aux cellules témoins qui ont été traversées en parallèle sans exposition au Taxol (Figure 2B).

Figure 1 : Schéma de l’écran EPIKOL dans les cellules SUM159PT résistantes au Taxol. Flux de travail global du criblage EPIKOL dans les cellules SUM159PT résistantes au Taxol générées. La figurine a été créée avec BioRender.com Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Une fois les cellules résistantes établies, plusieurs expériences ont été menées pour caractériser leurs changements phénotypiques et moléculaires. Les capacités de prolifération des cellules résistantes sous traitement au Taxol ont été évaluées par un test de formation de colonie par rapport aux cellules parentales. Comme on le voit à la Figure 2C, D, les cellules résistantes maintiennent leur capacité proliférative sous traitement au Taxol tandis que les cellules parentales ne peuvent pas survivre. Ce test est l’une des étapes importantes dans la caractérisation des cellules résistantes et démontre comment la capacité proliférative sous traitement médicamenteux peut être évaluée entre cellules parentales et résistantes.

Dans le cadre de la caractérisation des cellules résistantes, un séquençage de l’ARN a été effectué sur les cellules parentales et résistantes afin d’analyser les modifications transcriptomiques associées à la chimiorésistance (Figure 2E). Parmi les gènes les plus augmentés dans les cellules résistantes figurait ABCB1, suivi par quelques autres transporteurs ABC, dont ABCB4 et ABCA5. La hausse de l’expression d’ABCB1 a été validée par la réaction en chaîne quantitative par polymérase (qPCR), ce qui illustre comment les changements d’expression des gènes candidats peuvent être validés à l’aide de qPCR (Figure 2F).

Figure 2 : Génération de cellules résistantes et leur caractérisation. (A) Schéma montrant la génération de cellules de SUM159PT résistantes au Taxol avec la méthode d’augmentation de dose. (B) Courbe de réponse à la dose montrant la différence entre les valeurs IC50 des cellules parentales et des cellules résistantes générées. IC50 parental = 6 nM et IC50 résistant au taxol = 355,4 nM. (C) Essai de formation de colonie en présence de Taxol. (D) Quantification des aires de colonie dans (C.) Analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec le test post hoc de Tukey a été appliquée à l’aide de Prism 8 (logiciel GraphPad). Les niveaux de signification étaient fixés comme *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Graphiques volcaniques montrant des gènes exprimés différemment dans les cellules Taxol-Res comparés aux cellules parentales, avec une coupure LFC>2 et p<0,001. (F) validation qPCR de l’expression d’ARNm ABCB1 dans les cellules parentales et Taxol-Res. P valeurs déterminées par le test t de Student à deux facettes en comparaison avec le groupe témoin ; **P < 0,01. Le panneau A a été créé avec BioRender.com. La figure du panneau E a été modifiée avec l’autorisation de Yedier-Bayram et ^al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Après avoir montré la surexpression d’ABCB1 et d’autres transporteurs ABC dans les cellules résistantes au Taxol et en considérant le large spectre du substrat d’ABCB1, la présence du phénotype MDR a été évaluée. À cette fin, les cellules résistantes au Taxol ont été traitées avec plusieurs médicaments connus comme substrats du transporteur ABCB1 et présentant des mécanismes d’action différents, et leur sensibilité au médicament a été évaluée (Figure 3A,B). Conformément au profil d’expression observé par le téléporteur ABC, les cellules résistantes au Taxol ont également montré une résistance à la Doxorubicine et à la Vincristine, confirmant la présence du profil MDR et illustrant comment le phénotype de résistance multimédicamenteuse peut être évalué fonctionnellement.

Le phénotype MDR constitue un défi pour l’approche de dépistage basée sur CRISPR, EPIKOL, étant donné que la bibliothèque nécessite une sélection de puromycine pour enrichir les cellules transdues. Puisque la puromycine peut être évacuée des cellules par un efflux médicamenteux médié par ABCB1, la sélection de la puromycine peut ne pas être efficace dans les cellules résistantes (Figure 3C). Ainsi, les cellules non transduites peuvent survivre à la sélection, confondant les résultats d’écran.

Pour répondre à cette limitation, le processus de sélection des cellules chimiorésistantes avec un profil MDR a été optimisé avant le criblage EPIKOL. Le vérapamil, un inhibiteur ABCB1 de première génération, a été utilisé pour bloquer l’efflux médicamenteux médié par le transporteur ABC, permettant ainsi l’accumulation intracellulaire d’agents chimiothérapeutiques ou de puromycine (Figure 3D). Bien que le verapamil seul n’ait pas affecté la viabilité cellulaire, il a rétabli la sensibilité des médicaments lorsqu’il est combiné à des agents chimiothérapeutiques (Figure 3E,F). De même, les courbes de mortalité de la puromycine combinées à des doses non toxiques de vérapamil ont démontré que l’inhibition d’ABCB1 restaure la sensibilité à la puromycine (Figure 3G,H). Cela garantit que les cellules survivant à la sélection sont celles qui sont transdues avec succès, plutôt que celles échappant à la sélection en raison de l’efflux médicamenteux provoqué par ABCB1. Établir un flux de travail de sélection efficace dans les cellules chimiorésistantes est crucial pour des résultats fiables du dépistage EPIKOL.

Figure 3 : Phhénotype de résistance multimédicamenteuse et effet du vérapamil sur les cellules résistantes. Courbes de réponse à la dose montrant la différence entre les valeurs d’IC50 des cellules parentales et des cellules résistantes générées contenant (A) Doxorubicine, (B) Vincristine, (C) Puromycine. (D) Schéma montrant la sélection des cellules de SUM159PT résistantes au taxol, avec ou sans vérapamil. La figurine a été créée avec BioRender.com. (E) Test de viabilité cellulaire avec des cellules Taxol-Res pour déterminer la concentration optimale de verapamil avec Taxol. (F) Le vérapamil sensibilise les cellules résistantes au Taxol au Taxol. (G) Le vérapamil ne modifie pas la réponse des cellules parentales à la puromycine. (H) Le vérapamil restaure la sensibilité à la puromycine dans les cellules Taxol-Res. Les panneaux A, B et F ont été réutilisés avec l’autorisation de Yedier-Bayram et ^al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Pour trouver de nouveaux régulateurs de la chimiorésistance dans le TNBC, un criblage EPIKOL a été réalisé avec des cellules de SUM159PT résistantes au Taxol, comme illustré à la Figure 4A. Comme les cellules résistantes croissent plus lentement que les cellules^{parentales 17}, les niveaux de doublement de population ont été surveillés tout au long du criblage dans les groupes traités par Taxol et DMSO afin de déterminer le temps nécessaire pour atteindre 16 doublements de population (Figure 4B). En conséquence, le dépistage EPIKOL pour le groupe traité par DMSO a été achevé vers le jour 35, tandis que le groupe traité par Taxol a été cultivé pendant 15 jours supplémentaires pour atteindre le même niveau de doublement de population.

Après séquençage, le pipeline d’analyse MAGeCK a été utilisé pour combiner l’effet des sgRNA ciblant le même gène afin de révéler les changements au niveau du gène lors du^{knockout 24}. La bibliothèque EPIKOL inclut des sgRNA ciblant des gènes essentiels comme témoins positifs, la première étape du contrôle qualité a été d’évaluer si ces sgRNA étaient épuisés comme prévu. Les diagrammes en cascade illustrent les changements de pliage Log2 des gènes essentiels à travers différentes comparaisons (Figure 4C–E). Lorsque les échantillons finaux de conditions traitées par DMSO ou Taxol ont été comparés au point temporel initial, presque tous les gènes essentiels étaient épuisés lors de l’élimination, indiquant une performance efficace à l’écran (Figure 4C,D). Cependant, cette diminution n’est pas clairement observée lorsque les deux échantillons de point final (traités par DMSO et traités au Taxol) sont comparés, comme prévu, car des gènes essentiels sont nécessaires à la survie cellulaire dans les deux conditions (Figure 4E).

Une autre visualisation des résultats à l’écran est le graphique volcanique, qui affiche les changements de pliage Log2 ainsi que la signification statistique (la valeur p ou valeurs FDR). Dans le criblage EPIKOL réalisé dans des cellules résistantes au Taxol, plusieurs gènes témoins positifs ont été identifiés comme significativement épuisés, ce qui renforce la fiabilité du criblage puisque la déplétion des ARNsgRNA ciblant des gènes témoins positifs illustre un contrôle qualité typique d’un criblage réussi (Figure 4F). En plus des contrôles géniques essentiels, la bibliothèque EPIKOL inclut des ARNsg-contrôles positifs spécifiques au contexte ciblant plusieurs gènes transporteurs ABC. Comme prévu, les décomptes normalisés des sgRNA ABCB1 dans différents groupes ont mis en évidence la diminution significative des sgRNA ciblant ABCB1, spécifiquement dans le groupe traité au Taxol (Figure 4G). Dans l’ensemble, cela démontre comment les changements au niveau de l’ARNsg peuvent être interprétés pour identifier les gènes candidats associés à la réponse aux médicaments.

Figure 4 : Analyse EPIKOL donne des résultats dans des cellules résistantes au Taxol et des graphiques d’exemple. (A) Schéma du protocole d’écran EPIKOL. (B) Niveau de doublement de population (PDL) des cellules Taxol-Res. (C–E) Diagrammes en cascade montrant les résultats du criblage EPIKOL sur les cellules Taxol-Res, mettant en évidence les gènes essentiels, groupe traité par DMSO comparé au point temporel initial dans le panneau C, groupe traité par Taxol comparé au point temporel initial dans le panneau D, groupe traité par Taxol comparé au groupe traité par DMSO dans le panneau E. (F) Graphique volcanique montrant les changements Log2Fold des gènes dans les échantillons traités par Taxol par rapport au point temporel initial. Les gènes ayant p<0,05 étaient colorés et marqués. Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication^{précédente 17}. (G) Lectures par million (trm) de 10 graphes différents de sgRNA ABCB1 provenant d’EPIKOL. Le panneau A a été créé avec BioRender.com. Le panneau E a été réutilisé avec l’autorisation de Yedier-Bayram et ^al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau complémentaire 1 : Tableau de dépannage.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 2 : Titres viraux et calcul du MOI.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 3 : liste des sgRNA de la bibliothèque EPIKOL.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 4 : Amorces utilisées dans la préparation de la bibliothèque de séquençage EPIKOL. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les approches de dépistage regroupé basées sur CRISPR-Cas9 sont bien établies dans différents contextes cellulaires. Cependant, le dépistage dans les cellules chimiorésistantes présente des défis distincts et nécessite une optimisation supplémentaire. Puisque les cellules chimiorésistantes servent de modèles précieux pour étudier les vulnérabilités des tumeurs chimiorésistantes, il est important de remédier à ces limites dans les stratégies de dépistage afin d’identifier de manière fiable les régulateurs génétiques ou épigénétiques de la chimiorésistance.

La génération de lignées cellulaires chimiorésistantes peut elle-même être fastidieuse et dépend fortement de l’agent chimiothérapeutique utilisé. Bien que les cellules puissent s’adapter facilement à certains médicaments, elles peuvent être très sensibles à^{d’autres 25}. Il est donc important de déterminer les valeurs spécifiques à la lignée cellulaire IC50 avant le protocole de génération de lignées cellulaires résistantes. Dans les cas où les cellules ne tolèrent pas l’exposition au niveau IC50 sur plusieurs passages, il est possible de commencer par une concentration de médicament plus faible (par exemple, IC10-20) (voir la section 1 du protocole⁾¹⁷. Puisque l’acquisition de la résistance est un événement stochastique, plusieurs puits/plaques de cellules peuvent être traités simultanément afin d’augmenter la probabilité d’obtenir des cellules résistantes. Il est crucial de caractériser de manière exhaustive la population cellulaire résistante aux médicaments obtenue afin de décrire les changements transcriptionnels et phénotypiques durant la procédure d’escalade de dose par rapport à leur état naïf. Des approches de profilage global telles que RNA-seq peuvent être employées pour identifier les gènes exprimés différemment par rapport à la lignée parentale. Sur le plan fonctionnel, la résistance acquise aux médicaments doit être validée par des tests de viabilité cellulaire et de prolifération afin de démontrer que les cellules résistantes maintiennent leur survie dans des conditions de traitement cytotoxiques pour les cellules parentales. De plus, les changements potentiels de leur capacité proliférative et de leur taux de croissance doivent être mesurés par rapport à la lignée cellulaire parentale pour calculer leurs PDL respectifs. Puisque la résistance acquise au Taxol est connue pour être médiée, au moins en partie, par un efflux médicamenteux médié par l’ABC, l’expression des principaux transporteurs ABC (par exemple, ABCB1) doit être évaluée aux niveaux d’ARNm et de protéines à l’aide de qPCR et de Western blotting, et peut être complétée par des données transcriptomiques. Sur la base du profil d’expression du transporteur ABC, la présence du phénotype MDR doit être prise en compte, et la résistance à d’autres agents chimiothérapeutiques doit être évaluée. Dans notre étude précédente, nous avons caractérisé les lignées cellulaires résistantes au Taxol et identifié ABCB1 comme l’un des gènes les plus augmentés, et nous avons estimé que la résistance multimédicamenteuse médiée par ABCB1 peut entraîner un échec dans la sélection^{de puromycine 17}. Ainsi, après la génération de cellules résistantes, l’expression des transporteurs ABC et du phénotype MDR doit être évaluée avant toute procédure de transfection.

La méthode d’augmentation de dose présente des avantages par rapport aux protocoles d’exposition à haute dose, car les cellules peuvent être cryopréservées à chaque étape avant d’augmenter la dose, offrant ainsi de la flexibilité et une protection contre la perte de culture. De plus, l’augmentation progressive de la dose permet d’acquérir des phénotypes de résistance au fil du temps, permettant une évolution adaptative ; contrairement au traitement aigu à haute dose, qui entraîne la sélection de sous-populations résistantes préexistantes. Sa progression progressive permet aux chercheurs de choisir délibérément le niveau de résistance souhaité pour arrêter la sélection et d’évaluer les propriétés du phénotype résultant. De plus, les étapes intermédiaires de l’augmentation de la dose pourraient être exploitées pour étudier les mécanismes de résistance acquise dans le temps. Selon la question biologique sous-jacente, différents niveaux de résistance pourraient être obtenus pour étudier soit les mécanismes adaptatifs précoces avec des niveaux de résistance plus faibles, soit des phénotypes de résistance stables et pleinement établis dans des cellules plus résistantes. De plus, les seuils de résistance cliniquement pertinents varient considérablement selon le médicament, la lignée cellulaire et le taux de prolifération intrinsèque ; par conséquent, le calendrier d’augmentation de la dose peut différer en conséquence (dans notre cas, la génération de cellules résistantes au Taxol a nécessité environ 6 mois). Conformément à cette logique, nous avons établi deux niveaux de résistance différents avec les cellules SUM159PT dans notre étude précédente et comparé leurs caractéristiques distinctes et^{partagées 17}. Par conséquent, nous recommandons aux chercheurs de définir la plage cible d’IC50 du médicament d’intérêt selon leur pertinence clinique et biologique.

Il est bien établi que le sevrage de la pression médicamenteuse peut entraîner une perte de chimiorésistance, car les cellules peuvent reconfigurer leur épigénome et leur^{transcriptome 25}. Pour cette raison, il est suggéré d’évaluer la stabilité du phénotype de résistance sur plusieurs mois. Si les cellules ont tendance à revenir à un état sensible lors du sevrage du médicament, les cellules résistantes peuvent être cultivées en présence de la dose d’entretien, correspondant généralement à la concentration finale utilisée lors de la génération de résistance, afin de préserver leur phénotype de résistance. Bien que les modèles de lignées cellulaires chimiorésistantes in vitro soient pratiques, reproductibles et largement utilisés pour étudier la chimiorésistance acquise, ils peuvent ne pas reproduire pleinement l’hétérogénéité phénotypique observée chez les tumeurs des patients et manquent du microenvironnement tumoral, des interactions immunitaires et de l’hétérogénéité^{spatiale 3,4,25}. De plus, un passage prolongé lors de la génération de résistance peut entraîner des altérations génétiques et épigénétiques divergent de celles observées dans les échantillons de patients, limitant potentiellement la pertinence translationnelle des correspondances identifiées. Par conséquent, les gènes et mécanismes candidats identifiés grâce à ce protocole devraient être validés davantage dans des systèmes expérimentaux plus cliniquement pertinents, tels que les modèles de coculture, les organoïdes dérivés du patient ou les études in vivo. EPIKOL offre des avantages grâce à sa nature ciblée si des criblages complémentaires sont réalisés sur ces modèles, où le nombre maximal de cellules pouvant être obtenues est intrinsèquement limité.

Les cellules chimiorésistantes croissent souvent plus lentement que leurs homologues parentaux, ce qui peut représenter un défi pratique pour les criblages génomiques qui nécessitent de grandes populations cellulaires pour maintenir la couverture des bibliothèques. Les bibliothèques ciblées comme EPIKOL offrent un avantage pour effectuer un criblage avec moins de matière de départ tout en offrant une profondeur accrue de sgRNA par gène, améliorant ainsi la sensibilité et la reproductibilité dans l’espace cible défini. Cependant, par conception, EPIKOL ne capture que les mécanismes de résistance épigénétique et ne couvre pas les contributeurs non épigénétiques à la chimiorésistance. Le choix de la bibliothèque doit donc être guidé par des expériences antérieures et la question biologique spécifique. Les utilisateurs de ces bibliothèques doivent être conscients des limites des bibliothèques ciblées et interpréter les résultats dans le cadre de la bibliothèque.

Un obstacle majeur au dépistage CRISPR des modèles chimiorésistants est l’émergence du phénotype MDR provoqué par la hausse du transporteur^{ABC 9,10}. Différents transporteurs ABC médiatisent l’efflux de différents substrats. Une fois qu’une lignée cellulaire résistante aux médicaments est générée, il est important d’évaluer si la résistance s’étend à d’autres agents chimiothérapeutiques. La résistance à la puromycine est principalement causée par la surexpression d’ABCB1, ce qui affecte le processus de sélection des approches de dépistage CRISPR regroupées, car la plupart de ces bibliothèques contiennent des cassettes de sélection de puromycine pour l’enrichissement des cellules transduites. Ici, nous avons utilisé du vérapamil, un inhibiteur d’ABCB1 de première génération, pour faciliter l’accumulation intracellulaire de puromycine et éliminer sélectivement les cellules résistantes non transduites qui échapperaient autrement à la sélection en raison de l’efflux médicamenteux médié par ABCB1. Puisque le vérapamil se lie à ABCB1 de manière réversible, la fonction d’ABCB1 est rétablie en quelques heures après le retrait du vérapamil. Par conséquent, le verapamil ne confère pas de vulnérabilité supplémentaire aux cellules résistantes lors de la phase de traitement médicamenteux suivante du criblage. Cependant, plusieurs limites du verapamil doivent être reconnues. Puisque le vérapamil est un inhibiteur des canaux calciques et d’autres transporteurs, il peut influencer la physiologie cellulaire au-delà de l’inhibition d’ABCB1¹⁰. De plus, la concentration effective de vérapamil varie selon les lignées cellulaires et les modèles MDR selon le niveau d’expression d’ABCB1 et l’activité des autres transporteurs. Par conséquent, la concentration de verapamil doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire, et une nouvelle génération d’inhibiteurs d’ABCB1 plus spécifiques à ABCB1 pourrait être envisagée si des effets hors cible sont préoccupants. Autre étape cruciale, le titérage viral doit être effectué sur la cellule résistante elle-même plutôt que sur les homologues parentaux, car l’infectiosité et la sélection diffèrent souvent pour les cellules résistantes.

Un autre point important à considérer est de déterminer la durée appropriée du dépistage, car les cellules chimiorésistantes croissent souvent plus lentement que leurs équivalents^{parentaux 26}. Pour tenir compte de cette différence, nous avons utilisé des calculs de niveau de doublement de population (section 6 du protocole) pour évaluer quand les groupes témoins et traités atteignaient le seuil de PDL souhaité. Les criblages peuvent donc être interrompus à des jours différents, permettant des doublements comparables de la population et une interprétation plus sûre des effets de l’ARNsg dans le groupe traité.

Les PCR de préparation de la bibliothèque sont particulièrement importantes pour la précision de l’identification des impacts en aval. Un biais introduit par une faible entrée d’ADNg et des cycles PCR accrus peut entraîner l’amplification de certaines séquences d’ARNsg, provoquant des enrichissements ou des épuisements faussement positifs. Pour atténuer cela, nous recommandons d’utiliser la quantité maximale possible de gDNA, de respecter les numéros de cycle PCR fournis par ce protocole, et d’exécuter des réactions parallèles pour le pool avant le séquençage. Lorsque cela est possible, la couverture des bibliothèques ne devrait pas tomber en dessous des seuils recommandés (>300× de couverture) afin d’assurer une détection fiable des ARNsgRNA appauvris plutôt qu’une perte stochastique des ARNs à faible abondance due à une faible couverture.

Après séquençage, nous avons utilisé le cadre d’analyse MAGeCK et réalisé plusieurs analyses de contrôle qualité en aval ainsi que plusieurs étapes²⁴ d’interprétation des données. Premièrement, l’analyse en composantes principales (ACP) a été utilisée pour évaluer la distribution et la reproductibilité des réplications biologiques (données non présentées, résultat MAGeCK). Un regroupement réplicatif dans PCA est attendu au sein de chaque bras ; Cependant, une plus grande variabilité dans le bras traité par le médicament est une caractéristique courante des criblages de chimiorésistance, car le médicament peut induire des changements stochastiques. Si les contrôles positifs et négatifs se comportent comme prévu dans chaque bras, cette variabilité n’empêche pas l’identification des résultats vrais-positifs. Ensuite, la normalisation des lectures par million (RPM) du nombre de sgRNA aux premiers et derniers moments a été appliquée pour évaluer si les sgRNA ciblant des gènes essentiels étaient appauvris comme^{prévu 14}. Par la suite, la normalisation médiane a été utilisée pour agréger les effets au niveau de l’ARNsg, permettant d’identifier des déplétions au niveau des^{gènes 24}. Les scores de déplétion au niveau des gènes ont été visualisés à l’aide de graphiques en cascade, qui classent les gènes des plus appauvris aux enrichis. Les modifications du nombre de copies et la polyploïdie résultant d’une exposition prolongée aux médicaments peuvent perturber les résultats de dépistage par une coupe Cas9 inefficace^{ou excessive 27}. Bien qu’EPIKOL cible les régulateurs de la chromatine qui ne sont généralement pas soumis à des amplifications pilotées par le Taxol, nous recommandons d’évaluer le statut de ploïdie et les variations du nombre de copies dans les cellules résistantes avant le dépistage. Si des changements de nombre de copies sont suspectés, des outils de correction computationnelle tels que CRISPRcleanR ou CERES peuvent être appliqués lors de l’analyse MAGeCK.

Dans les criblages impliquant deux groupes expérimentaux, groupe témoin et groupe de traitement, des comparaisons différentes sont nécessaires pour interpréter correctement la performance du dépistage et les dépendances^{biologiques 17}. Les comparaisons initiales à finales conviennent à évaluer la performance à l’écran, y compris le comportement attendu des gènes essentiels et des témoins non ciblants. La comparaison du point final du groupe témoin (DMSO) avec le point temporel initial permet d’identifier les gènes nécessaires à la croissance et à la condition physique des cellules résistantes en l’absence de pression médicamenteuse. En revanche, la comparaison de deux échantillons d’extrémité, traité par médicament (Taxol) et témoin (DMSO), révèle les gènes spécifiques nécessaires à la résistance au médicament plutôt qu’à la condition physique générale. Il convient de noter qu’une comparaison directe des deux échantillons d’extrémité conduit à une distribution déséquilibrée des témoins géniques essentiels, car ils sont nécessaires à la survie dans les deux groupes. Une autre méthode de visualisation pourrait être le graphique Volcano, qui affiche les changements de repli log2 ainsi que les valeurs de signification, permettant d’identifier des gènes significativement appauvris. Une fois les gènes candidats identifiés, les décomptes de sgRNA normalisés et les graphiques de visualisation sont utiles pour décider des sgRNA les mieux performants pour les tests de validation en aval. Pour le criblage EPIKOL, nous recommandons de prioriser les gènes candidats soutenus par le comportement concordant d’au moins 6 des 10 sgRNA, car cela offre une plus grande confiance dans les effets au niveau des gènes.

Ici, nous proposons un protocole optimisé pour effectuer le dépistage EPIKOL sur des lignées cellulaires résistantes au Taxol qui ont augmenté ABCB1 et présentent un phénotype MDR. Ce protocole s’applique globalement à tout modèle chimiorésistant présentant une résistance croisée à la puromycine ou à d’autres antibiotiques de sélection, permettant ainsi le dépistage CRISPR dans ces cellules. Des conseils pratiques pour les défis techniques les plus courants rencontrés à travers toutes les étapes du protocole sont fournies dans le Tableau Supplémentaire 1.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100 mm plate	Corning	353003	Culture cellulaire
45 µm filter	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	Culture cellulaire
6 well plate	Corning	3506	Culture cellulaire
96-well black clear bottom plates	Sigma-Aldrich	CLS356259	Pour l'essai de viabilité cellulaire luminescente CellTiter-Glo
Blasticidin	Thermo Fisher	A1113903	Pour la sélection
CellTiter-Glo luminescent cell viability assay	CellTiter-Glo, Promega	G7570	Pour l'essai de viabilité cellulaire luminescente CellTiter-Glo
DMEM	Gibco		Culture cellulaire
DMSO	PanReac AppliChem	A3672,0050	Culture cellulaire
FBS	Gibco	16140071	Culture cellulaire
Ham’s F12 nutrient mix	Gibco	11765054	Culture cellulaire
HEK293T cells			Don gracieux de Robert Weinberg (MIT, Boston, États-Unis).
HEPES	Thermo Fisher	15630080	Culture cellulaire
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001-1G	Culture cellulaire
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	Culture cellulaire
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	Pour la génération de lignées cellulaires Cas9 stables
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	Support pour le clonage gRNA
MN NucleoSpin tissue kit	Macherey-Nagel	740952.5	Pour l'extraction d'ADN génomique
PBS	Gibco	10010023	Culture cellulaire
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Culture cellulaire
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	Support pour le clonage gRNA
Polyethylene glycol (PEG)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	Pour la concentration de lentivirus
Polyethylenimine, linear (PEI)	Sigma-Aldrich	765090-1G	Pour la production de lentivirus
Protamine sulfate (PS)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	Pour l'infection par lentivirus
psPAX2	Addgene	# 12260	Pour la production de lentivirus
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803	Pour la sélection
SUM159PT adherent cells			Don gracieux de Robert Weinberg (MIT, Boston, États-Unis).
Taxol	Paclitaxel, Sigma	PHR1803-200MG	Pour la génération et le maintien des cellules res
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054	Culture cellulaire
Verapamil	Selleck Chemicals	S4202	Pour la sélection
VSV-G	Addgene	# 8454	Pour la production de lentivirus