Analyse quantitative 3D non destructive du ligament parodontal résiduel sur des prémolaires humains extraits à l’aide d’un scanner intraoral

Résumé

Ce protocole détaille une méthode numérique 3D quantitative non destructive pour évaluer les ligaments parodontaux résiduels sur les dents extraites. En utilisant des scanners intra-buccaux et des logiciels de rétro-ingénierie, nous avons mis en place un flux de travail ex vivo pour l’évaluation parodontale, fournissant une base méthodologique pour comparer les techniques d’extraction dans la recherche préclinique.

Résumé

La replantation intentionnelle des dents est un traitement précieux pour préserver les dents naturelles présentant des lésions endodontiques. Son succès dépend de manière cruciale de la viabilité et de l’intégrité structurelle du ligament parodontal résiduel (PDL). Les méthodes d’évaluation traditionnelles, telles que la coupe histologique ou la photographie bidimensionnelle, sont soit destructrices, soit limitées par des erreurs de projection. Pour répondre à ces limitations, ce protocole propose une méthode quantitative non destructive pour évaluer les PDL résiduels à l’aide d’un scan intra-oral de haute précision. Les dents extraites ont été colorées pour visualiser le tissu PDL et balayées en trois dimensions pour générer des modèles numériques haute fidélité. Les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel d’ingénierie inverse, où une région d’intérêt a été définie, et la couverture résiduelle PDL a été quantifiée via le seuil de couleur. Cette approche a calculé la véritable zone de couverture 3D du PDL sans compromettre l’échantillon biologique. Pour évaluer la sensibilité et l’utilité de ce protocole, il a été appliqué pour comparer les extractions mini-invasives (IM) utilisant des périotomes aux extractions conventionnelles par pinces. L’analyse numérique a révélé que la méthode MI a conservé significativement plus de tissu PDL (61,99 %) que la méthode conventionnelle (50,46 %). De plus, un test de viabilité cellulaire ultérieur a corroboré les résultats numériques, démontrant une activité métabolique significativement plus élevée dans le groupe MI. En fin de compte, ce travail établit un flux de travail de preuve de concept pour l’évaluation quantitative ex vivo des PDL, fournissant une base méthodologique solide pour comparer les techniques d’extraction dans la recherche préclinique.

Introduction

La replantation intentionnelle des dents est de plus en plus reconnue comme une méthode de traitement viable et de dernier recours pour préserver des dents naturelles qui seraient autrement considérées comme désespérées. Il est indiqué pour la gestion de lésions périapicales persistantes, de perforations inaccessibles du canal ou de lésions résorptives étendues qui ne peuvent pas être traitées non^{chirurgicalement 1,2}. La procédure standard consiste à extraire intentionnellement la dent affectée, suivie d’une inspection visuelle extraorale, d’une intervention thérapeutique (incluant la résection de l’extrémité raciculaire, la préparation et le plombage de l’extrémité de la racine), puis la replantation ultérieure dans l’alvéole^{d’origine 1,2}.

La présence et l’intégrité de tissu résiduel viable du ligament parodontal (PDL) sur la surface racinaire sont les facteurs pronostiques les plus critiques déterminant le schéma de cicatrisation après la replantation dentaire ^3,4. Une barrière PDL saine et intacte est essentielle pour rétablir la mobilité physiologique et prévenir des complications telles que la résorption de remplacement (ankylose) ou la résorption inflammatoire des radicules. Cependant, l’avulsion d’une dent à partir de l’alvéole alvéolaire, qu’elle soit traumatique ou intentionnelle, perturbe intrinsèquement l’attachement des fibres PDL et sectionne l’apport^{neurovasculaire 5}. Par conséquent, la reconstruction biologique de la PDL est cruciale pour la guérison parodontale des dents^{replantées 3}. Des recherches approfondies ont établi que maximiser la vitalité et le volume des tissus résiduels de PDL lors des procédures cliniques extraorales constitue un facteur pronostique critique, et que son importance pour la survie fonctionnelle à long terme des dents replantées est bien documentée dans la^{littérature 6,7}.

Étant donné que l’extraction perturbe intrinsèquement l’attachement de la PDL, le choix de la technique d’extraction influence directement le volume et la viabilité du tissu résiduel de PDL restant sur la surface racinaire. L’extraction conventionnelle avec pinces applique des forces de rotation et de traction qui peuvent écraser la PDL contre l’os alvéolaire ou la découper par friction. Pour minimiser ce traumatisme, des méthodes d’extraction mini-invasives (IM) ont été développées. Des études antérieures ont indiqué que les méthodes d’IM peuvent réduire significativement les traumatismes chirurgicaux sur le parodontium des dents^affectées. Des techniques utilisant des périotomes pour sectionner l’attache du PDL, ou des systèmes d’extraction verticale évitant les forces de levier, ont été développées pour préserver le PDL résiduel sur la surface racinaire. Par exemple, les rapports de cas ont documenté une amélioration des résultats cliniques lors de la replantation intentionnelle des dents et de l’extrusion chirurgicale lorsque les systèmes MI étaient^{utilisés 9,10}. Ces résultats suggèrent que la minimisation des traumatismes d’extraction pourrait améliorer la rétention du tissu résiduel de PDL à la surface racinaire.

Cependant, malgré un consensus clinique sur les bénéfices de l’extraction non traumatique, il existe peu de preuves directes quantifiant l’étendue du tissu résiduel PDL préservé lors de l’utilisation des méthodes d’IM par rapport aux techniques conventionnelles. Cette lacune de connaissances provient en grande partie des limites des méthodologies d’évaluation disponibles. Les recherches existantes utilisent principalement des méthodes d’évaluation subjective ou destructrice pour évaluer le PDL résiduel à la surface racinaire. La coupe histologique reste la norme pour l’analyse^{cellulaire 11}, mais elle est intrinsèquement destructrice, rendant l’échantillon inutilisable pour des études ultérieures. Alternativement, la coloration combinée à la photographie bidimensionnelle (2D) a été utilisée pour caractériser le PDL¹² résiduel. Cependant, ces méthodes sont insuffisantes pour quantifier le tissu résiduel PDL de toute la surface racinaire. Une photographie 2D ne peut pas cartographier avec précision la surface d’une racine complexe et courbe en trois dimensions ; elle introduit inévitablement des erreurs de projection et des distorsions, conduisant à des quantifications inexactes.

Ces dernières années, la technologie de balayage numérique intraoral a considérablement progressé, offrant une grande précision et une acquisition rapide de données. La méthode numérique a été utilisée dans des études antérieures pour mesurer les empreintes et les modifications des tissus mous, ou pour évaluer l’usure dentaire chez les jeunes^{de 13} ans. Les applications se sont même étendues aux analyses volumétriques complexes, telles que l’évaluation du gonflement facial en chirurgie^{buccale 14}. Ces technologies permettent la création de modèles tridimensionnels (3D) haute fidélité pouvant être manipulés et mesurés dans des logiciels de rétro-ingénierie, offrant une solution potentielle pour une analyse quantitative non destructive. Cependant, à ce jour, l’application potentielle de l’échographie intra-orale pour évaluer la PDL résiduelle des dents extraites n’a pas encore été explorée.

L’objectif principal de ce protocole est d’établir un flux de travail standardisé et non destructif qui combine coloration biologique avec un scan intraoral de haute précision et de l’ingénierie inverse 3D. En créant des modèles numériques haute fidélité avec des cartes de surface texturées en couleur, cette méthode permet une mesure plus objective et reproductible du PDL résiduel sur toute la surface de la racine. Cette étude applique le flux de travail proposé pour comparer la couverture résiduelle de PDL de deux techniques d’extraction, l’extraction MI assistée par périotome et l’extraction conventionnelle par pinces, dans les prémolaires humains. On suppose que la méthode MI préserve une plus grande proportion de la couverture résiduelle de PDL que la méthode conventionnelle.

Il est important de noter que ce protocole est conçu strictement comme un outil de recherche ex vivo pour les laboratoires ou les contextes précliniques. La procédure consiste à colorer, sécher à l’air, numériser numériquement et segmenter par logiciel, avec un temps total d’analyse incompatible avec l’utilisation intraopératoire lors d’une replantation intentionnelle, où le temps extraoral doit être minimisé. Par conséquent, cette méthode est appropriée pour (i) comparer l’efficacité préservant la PDL de différentes techniques d’extraction dans des conditions contrôlées ; (ii) formation et calibration dans des milieux éducatifs ; et (iii) des études de validation reliant les métriques de couverture PDL numériques aux résultats biologiques. Son applicabilité aux dents à plusieurs racines avec des anatomies complexes nécessite des recherches approfondies.

Protocole

Le protocole de recherche a été réalisé conformément aux directives du Comité d’éthique de l’École de stomatologie de l’Université de Pékin (PKUSSIRB-202054022).

1. Sélection des patients et répartition des groupes

1. Sélectionner des patients nécessitant l’extraction de prémolaires à des fins orthodontiques. Assurez-vous que les prémolaires respectent les critères d’inclusion en l’absence de carie ou de maladie parodontale.
2. Excluez les patients ayant une hypertension artérielle, un diabète, des antécédents de tabagisme, ou ceux âgés de moins de 16 ans ou plus de 45 ans.
3. Répartir aléatoirement les prémolaires en deux groupes expérimentaux : le groupe témoin (extraction conventionnelle) et le groupe mini-invasif (MI) (extraction assistée par périotome).
4. Attribuez aléatoirement les dents de chaque groupe soit à la voie d’analyse à balayage 3D, soit à la voie de validation biologique (CCK-8), afin d’assurer l’utilisation d’échantillons indépendants pour chaque méthode d’évaluation.

2. Procédures d’extraction dentaire

1. Effectuer toutes les extractions sous anesthésie locale standard.
2. Méthode A : extraction conventionnelle (groupe témoin)
   1. Effectuez la séparation gingivale autour du col de la dent.
   2. Placez les pinces dentaires à la zone cervicale de la couronne dentaire.
   3. Appliquez des forces de rotation jusqu’à ce que la dent soit desserrée. Retirez la dent de l’alvéole à l’aide de la pince.
3. Méthode B : Extraction mini-invasive (groupe MI)
   1. Effectuer la séparation gingivale.
      ATTENTION : Manipulez le périotome avec précaution pour éviter une blessure aux tissus mous ou la casse de l’instrument.
   2. Insérer un périotome dans l’espace PDL aussi profondément que possible, atteignant au moins les deux tiers de la longueur de la racine.
   3. Sectionner circonférentiellement les fibres PDL autour de la racine à l’aide du périotome. Desserre la dent.
   4. Retirez verticalement la dent de l’alvéole à l’aide de pinces dentaires.

3. Préparation et coloration de l’échantillon

1. Immédiatement après l’extraction, rincez les dents avec du sérum physiologique stérile pendant 10 minutes pour éliminer le sang et les débris.
   ATTENTION : Le bleu de toluidine est un produit chimique dangereux. Portez un équipement de protection individuelle approprié (gants, lunettes) lors de la manipulation.
2. Colorez la surface de la racine en immergeant la dent dans une solution bleue de toluidine à 0,1 % (préparée dans une solution saline tamponnée phosphate, PBS) pendant 40 minutes pour visualiser le tissu PDL.
3. Rincez avec du sérum physiologique pendant 10 minutes pour retirer la solution de colorant et séchez doucement la surface avec une seringue à trois voies pour éliminer l’excès d’humidité.
   REMARQUE : La surface des racines devrait présenter une coloration uniforme bleu-violet, tandis que le cément exposé doit rester intact, paraissant beige clair.

4. 3D numérisation numérique

1. Calibrez le scanner numérique intraoral selon les instructions du fabricant afin d’assurer une précision de 0,02 mm.
2. Sécuriser la couronne dentaire à l’aide de pinces hémostatiques pour éviter d’obstruer la vue de la surface racinaire.
3. Scannez toute la surface racinaire dans des conditions de balayage standard. Effectuez un scan complémentaire de la couronne pour compléter le modèle 3D.
4. Utiliser le logiciel propriétaire du scanner pour exporter les données de balayage numérique sous forme de fichier objet 3D haute résolution (OBJ) et du paquet de données associé ; l’image de texture est enregistrée au format JPG.
   REMARQUE : L’aperçu du scan en direct doit afficher un maillage continu à haute densité, dépourvu de trous ou d’artefacts à la surface de la racine. L’image de la texture doit clairement distinguer les zones tachées de bleu de la surface racinaire non teintée.

5. 3D reconstruction des modèles et analyse quantitative

1. Prétraitement d’image
   1. Étalonnage du seuil
      1. Importez la carte de textures JPG dans un logiciel de retouche d’image. Convertissez l’image en niveaux de gris 8 bits.
      2. Ouvrez l’outil Seuil (Image > Ajustez > Seuil) et inspectez l’histogramme pour enregistrer la valeur minimale en niveaux de gris capturant tous les pixels PDL teintés de bleu. Déterminez le seuil minimal en niveaux de gris à l’aide de trois observateurs indépendants.
   2. Importez la texture map JPG originale dans un logiciel de retouche d’image. Naviguez pour sélectionner > plage de couleurs. Choisissez le mode Ombres et réglez la plage à 65 et la tolérance à 20 % (calibré à partir des données de seuil 5.1.1).
      REMARQUE : Vérifiez que toutes les régions PDL colorées en bleu sont entièrement sélectionnées et qu’aucune surface racinaire non teintée n’est incluse.
   3. Copiez les régions sélectionnées et teintées de bleu et collez-les sur une nouvelle couche blanche pour générer un masque binaire (bleu pour PDL, blanc pour la racine nue). Enregistrez l’image de texture traitée pour écraser le fichier JPG original.
2. Mesure quantitative
   1. Importez le modèle 3D traité dans un logiciel d’ingénierie inverse.
   2. Utilisez les polygones > le trim pour définir la région d’intérêt (ROI) afin d’exclure les tissus gingivaux et périapicals. Fixez la limite supérieure du ROI à 2 mm sous la jonction ciment-émail (CEJ). Excluez le 3 mm apical de l’analyse.
   3. Sélectionnez les « régions bleues améliorées » dans le ROI. Après sélection, le tissu PDL résiduel est accentué en rouge.
   4. Naviguez dans Analyse > Calcul > Aire de calcul pour calculer la surface totale du ROI et la surface des régions bleues (PDL résiduel).
   5. Calculez le pourcentage de couverture PDL à l’aide de l’équation 1 :
      Couverture PDL ( %) = (Surface de PDL résiduelle/Surface totale de ROI) x 100
3. Visualisation
   1. Capturez des images des quatre surfaces racinaires (buccale, linguale, mésiale et distale) perpendiculaires à l’axe de la dent pour une évaluation visuelle détaillée.

6. Validation biologique (test de viabilité cellulaire)

REMARQUE : Cette section décrit les étapes de validation effectuées sur un sous-ensemble d’échantillons (n = 8 par groupe) pour corroborer l’analyse numérique.

1. Immédiatement après l’extraction, placez les dents dans un tube centrifuge stérile contenant un milieu de culture préchauffé (37 °C).
2. Transportez les échantillons au laboratoire dans une glacière à 4°C dans un délai d'1 heure. Utilisez le Médium Eagle modifié de Dulbecco, complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine pour le transport des échantillons et les tests de viabilité cellulaire.
3. Rincez les dents avec une solution stérile de phosphate tamponnée (PBS) dans une armoire de biosécurité immédiatement à l’arrivée.
4. Grattez soigneusement le tissu PDL du tiers central de la racine (le ROI est défini par une sonde parodontale graduée) à l’aide d’une lame de scalpel stérile à température ambiante dans les 10 minutes suivant l’arrivée afin de maximiser la viabilité cellulaire.
5. Digérez les tissus collectés avec 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 30 minutes. Centrifugez la suspension de la cellule à 120 × g pendant 5 minutes à température ambiante (22–25 °C) pour obtenir le précipité contenant la cellule.
   REMARQUE : Après centrifugation, une boule blanche visible doit se former au fond du tube. Si aucun pellet n’est observé, l’échantillon doit être récentrifugé à 120 × g pendant 1 minute supplémentaire.
6. Resuspendez le précipité dans un mélange de solution de 600 μL de Kit de comptage cellulaire 8 (CCK-8) et de milieu à un rapport de 1:10 (v/v), préparé selon les instructions du fabricant.
7. Une suspension à 200 μL par puits est aliquotée dans une plaque de 96 puits (3 répliques techniques par échantillon). Incubez la plaque à 37°C dans un incubateur humidifié avec 5 % de_CO2 pendant 3 heures.
8. Transférez 50 μL du surnageant de chaque puits vers une nouvelle plaque à 96 puits.
9. Mesurez l’absorbance (densité optique, OD) à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Notez les valeurs moyennes de l’OD pour une comparaison statistique.
   ATTENTION : (i) Collecter la solution de coloration au bleu de toluidine et rincer les déchets sous forme de déchets chimiques dangereux et les éliminer conformément aux directives de sécurité chimique institutionnelles ; (ii) Traiter les tissus PDL, les scalpels utilisés et les déchets de culture cellulaire comme déchets biologiquement dangereux (Niveau de biosécurité 1) et les autoclave ou les incinérer selon les protocoles institutionnels de biosécurité ; (iii) Jetez les EPI (gants, pointes de pipette, essuie-tout) dans des récipients désignés pour les biohazards.

7. Analyse statistique et validation méthodologique

1. Collecte des données : Compiler les données quantitatives, incluant la surface totale des racines (mm²), la surface totale colorée (mm²) à partir de l’analyse 3D, le pourcentage de couverture PDL ( %), et les valeurs OD issues de l’analyse biologique.
2. Test de normalité : Évaluer la distribution des données pour la normalité à l’aide du test de Shapiro-Wilk.
3. Comparaison de groupes :
   1. Comparez la couverture PDL et les valeurs OD entre les groupes MI et Témoin.
   2. Utilisez un test t de Student non apparié pour les données normalement distribuées ou un test Mann-Whitney U pour les données anormalement distribuées.
   3. Calculez la taille de l’effet (d de Cohen) pour déterminer l’ampleur de la différence.
4. Analyse méthodologique de la robustesse :
   1. Effectuer une analyse de régression linéaire avec la « Surface Racine » comme variable indépendante et la « Couverture PDL » comme variable dépendante.
   2. Calculez le coefficient de corrélation de Pearson (r) pour évaluer si la méthode de mesure est biaisée par la taille des dents. Une corrélation non significative (P > 0,05) indique une robustesse.
5. Analyse de fiabilité :
   1. Générez des graphiques de violon combinés avec des boîtes graphiques pour visualiser la densité de probabilité et les caractéristiques de distribution des données.
   2. Comparez la forme et la concentration de la distribution des données entre les groupes.
6. Tests de fiabilité intra-observateurs et inter-observateurs :
   1. Sélectionnez aléatoirement 16 échantillons dans l’ensemble des données (8 par groupe) pour une évaluation de la fiabilité.
   2. Pour la répétabilité intra-observateur, répétez la segmentation complète et la procédure de mesure sur les mêmes 16 échantillons à des intervalles d’une semaine, pour un total de deux essais.
   3. Pour un accord inter-observateurs, fournir une formation standardisée à deux observateurs indépendants supplémentaires sur le protocole de segmentation.
   4. Faites en sorte que les trois observateurs effectuent indépendamment la définition du ROI, le seuil de couleur et le calcul de la surface sur les mêmes 16 échantillons.
   5. Calculer le coefficient de corrélation intraclasse ICC(A,1) avec des intervalles de confiance à 95 % afin de quantifier l’accord absolu pour les comparaisons intra-observateurs et inter-observateurs. Les valeurs ICC du rapport > 0,90 comme excellent, 0,75–0,90 comme bon, 0,50–0,75 comme modéré et <0,50 comme médiocre.
   6. Effectuer une analyse de Bland-Altman pour toutes les comparaisons par paires. Calculez la différence moyenne (biais) et les limites de concordance à 95 % (différence moyenne +/- 1,96 DP). Un résultat non significatif du test t par appariements (P > 0,05) indique un biais systématique négligeable.
7. Logiciels : Effectuer toutes les analyses statistiques à l’aide de logiciels appropriés. Considérons P < 0,05 comme statistiquement significatif.

Résultats

Le flux de travail expérimental établi dans cette étude a démontré avec succès un protocole non destructif pour l’évaluation quantitative des résidus de PDL sur les dents extraites. Comme indiqué dans le plan expérimental (Figure 1), le protocole intégrait des procédures d’extraction clinique avec acquisition numérique et validation biologique. L’application du balayage numérique intraoral, suivie d’une rétro-ingénierie 3D, a permis une reconstruction précis...

Discussion

Le succès de la replantation intentionnelle dépend essentiellement de la préservation des cellules PDL viables à la surface racinaire. Bien que les méthodes d’extraction des MI aient été cliniquement recommandées pour réduire les^{traumatismes 8,9,10}, quantifier leur bénéfice biologique sur les tissus résiduels de PDL reste un défi en raison du manque d’outils d’évaluation objectifs. Cette étude a...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
96-well plate	Servicbio	CCP-96H	Plaque à puits multiples pour la culture cellulaire et la mesure d'absorbance
Biosafety cabinet	Thermo Fisher Scientific	1300 Series4 A2	Cabinet de sécurité biologique de classe II pour les procédures stériles
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) solution	MedChemExpress	HY-K0301	Réactif d'essai de viabilité cellulaire
Centrifuge	Ustc Zonkia Zcientific Instruments	SC-3610	Centrifugeuse de laboratoire pour la précipitation cellulaire
Culture medium	Gibco	DMEM 11965	Milieu de base pour le transport et l'incubation des cellules
Dental forceps	Jinzhong Surgical instruments	K0F130/K0F100	Instrument standard d'extraction dentaire
Fetal bovine serum	Anhui Kangyuan Biotechnology Co., Ltd	KY-01003S	Sérum bovin foetal pour le complément du milieu de culture
Graduated periodontal probe	Jinzhong Surgical instruments	K6F040	Aide au grattage du PDL du tiers moyen de la racine
Hemostatic forceps	Jinzhong Surgical instruments	J31130	Instrument chirurgical utilisé pour fixer la dent pendant le balayage
Humidified incubator	Thermo Fisher Scientific	Forma	Incubateur de culture cellulaire maintenu à 37°C avec 5% de CO2
Image editing software	Adobe Systems Inc.	Adobe Photoshop CC 2018	Logiciel de sélection de couleur
Image editing software	Wayne Rasband, National Institutes of Health	ImageJ2 v2.14.0	Logiciel pour le seuil de couleur
Intraoral digital scanner	Aidite (Qinhuangdao) Technology Co., Ltd.	Aidite Cameo	Scanner optique pour l'acquisition de modèles numériques 3D
Local anesthesia	Produits Dentaires Pierre Rolland	Primacaine Articaine	Agent anesthésique dentaire (par exemple, Articaine ou Lidocaine)
Microplate reader	Biotek	Elx808	Spectrophotomètre pour mesurer l'OD à 450 nm
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070063	Complément d'antibiotiques pour le milieu de culture
Periotome	Carl Martin	LS529PT	Instrument d'extraction à faible invasivité
Reverse engineering software	Geomagic Inc.	Geomagic Studio 2013	Logiciel de modélisation 3D pour le calcul de la surface
Sterile centrifuge tube	Servicbio	EP-1500-J	Tube en plastique pour la collecte et le traitement des échantillons
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010	Tampon de lavage pour les échantillons biologiques
Sterile scalpel blade	Jiayuan Medical Devices	Sterile Scalpel Blade	Lame pour le grattage des tissus du PDL
Sterile sline	Servicbio	G4702-500ML	Solution saline pour rincer les dents extraites
Toluidine blue	General laboratory supplier	Toluidine blue (0.1% solution)	Colorant biologique pour la visualisation du ligament parodontal
Trypsin	Gibco	25200056	Réactif enzymatique pour la digestion des tissus