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Article de recherche
* These authors contributed equally
Chez le poisson zèbre, la mollugine à des doses sûres (≤200 µg/mL) s'est associée à une amélioration de la régénération de la queue, accompagnée de modifications de l'expression des gènes liés à l'apoptose, des marqueurs inflammatoires, de l'activité des enzymes antioxydantes et des marqueurs associés aux macrophages. Ces résultats suggèrent que la mollugine pourrait moduler la réponse locale à la lésion durant la régénération de la queue chez le poisson zèbre.
La mollugine est un composé naturel de type naphtoquinone dont on rapporte des activités anti-inflammatoires et antioxydantes, mais son rôle dans la régénération tissulaire reste incomplètement compris. Dans cette étude, un modèle de zebrafish ayant subi une amputation de la queue a été utilisé pour examiner les effets de la mollugine sur la réparation des plaies ainsi que sur les réponses immunitaires et redox associées. Des embryons de zebrafish ont été traités avec de la mollugine aux concentrations de 22 µg/mL, 66 µg/mL et 200 µg/mL après une lésion de la queue. Le traitement par la mollugine s'est associé à une amélioration de la récupération de la surface de la queue de manière dépendante de la dose, accompagnée d'une réduction de l'expression des gènes liés à l'apoptose et d'une inhibition des médiateurs pro-inflammatoires, notamment IL-1β, IL-6, TNF-α, TLR4 et NF-κB1. Parallèlement, la mollugine a restauré l'activité des enzymes antioxydantes superoxyde dismutase et catalase. L'imagerie par fluorescence chez des zebrafish Tg(mpeg1:GFP) a révélé un effet temporel de la mollugine sur l'accumulation des macrophages, sans réduction notable à 24 h, mais avec une diminution de la surface positive aux macrophages à 48 h dans les groupes 66 et 200 µg/mL par rapport au groupe modèle lésé. Une analyse par qRT-PCR a en outre montré une diminution de l'expression du marqueur associé au phénotype M1, iNOS, et une augmentation de l'expression du marqueur associé au phénotype M2, l'arginase-1. Dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que la mollugine pourrait favoriser la régénération de la queue chez le zebrafish en lien avec des modifications des marqueurs liés à l'inflammation, au stress oxydatif, à l'apoptose et aux macrophages. Des études supplémentaires sont nécessaires pour préciser les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.
La régénération tissulaire est un processus physiologique essentiel permettant aux organismes de réparer les lésions, impliquant une régulation complexe de la prolifération cellulaire, de la différenciation et du maintien de l'homéostasie du microenvironnement1. Parmi les modèles de vertébrés, le poisson-zèbre s'est imposé comme un système fondamental pour l'étude des mécanismes de réparation des plaies en raison de sa capacité remarquable à régénérer des tissus. En particulier, la régénération de la nageoire caudale chez le poisson-zèbre implique la coordination spatiotemporelle de plusieurs événements biologiques, notamment la régulation de l'inflammation, l'équilibre de la réponse oxydative et le contrôle de l'apoptose2,3. Ces dernières années, les activités pharmacologiques des produits naturels sont devenues un point central de la recherche en médecine régénérative. Les composés naphtoquinoniques, en particulier, ont fait l'objet d'études approfondies en raison de leurs effets biologiques variés4. La mollugine est un composé naphtoquinonique dérivé de plantes de la famille des Rubiacées et a montré, dans des études antérieures, des activités anti-inflammatoires, antioxydantes et de régulation du cycle cellulaire5,6. Toutefois, son mécanisme d'action dans la régénération tissulaire reste mal compris, et son rôle potentiel dans la modulation du microenvironnement inflammatoire et de la polarisation des cellules immunitaires nécessite une investigation systématique.
Après une lésion, l'inflammation est rapidement activée et influence directement la réparation tissulaire. Une signalisation inflammatoire modérée est essentielle pour éliminer les tissus nécrosés et initier le programme de régénération, tandis qu'une cascade inflammatoire excessive peut aggraver le stress oxydatif et conduire à une fibrose tissulaire7. Les cytokines, notamment l'IL-1β, l'IL-6 et le TNF-α, augmentent nettement après la lésion et s'accompagnent d'une activation de la voie de signalisation TLR4/NF-κB, entraînant une amplification des réponses inflammatoires et du remodelage tissulaire8,9. La molécule d'adhésion intercellulaire-1 (ICAM-1) et le ligand chimiotactique CC-2 (CCL-2) sont également augmentés après la lésion et sont associés à un recrutement accru de neutrophiles et de macrophages vers les tissus endommagés10. Notamment, un déséquilibre oxydatif aggrave davantage les lésions tissulaires, et une activité réduite de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase (CAT) indique une capacité antioxydante altérée2,11.
Les macrophages jouent un rôle clé de régulateurs du microenvironnement inflammatoire, et leur polarisation fonctionnelle influence de manière significative le processus régénératif12. Les macrophages M1 sont associés à l'expression de l'oxyde nitrique synthase inducible (iNOS) et à une activité inflammatoire, tandis que les macrophages M2 expriment l'arginase-1 (Arg-1) et sont liés à la réparation tissulaire13,14. La polarisation des macrophages est influencée par les cytokines locales, le stress oxydatif et les signaux liés à l'apoptose. Dans ce contexte, le réseau régulateur de l'apoptose composé des protéines de la famille de la lymphome B (Bcl-2) et de la caspase-3 affecte non seulement la survie cellulaire au site de la lésion, mais module également indirectement le comportement chimiotactique des cellules immunitaires par la libération de signaux "find-me"15. Par conséquent, l'exploration de stratégies d'intervention capables de moduler simultanément les réponses inflammatoires, le stress oxydatif et la polarisation des macrophages pourrait contribuer à améliorer la régénération tissulaire.
Les composés naturels ont démontré des avantages uniques dans la modulation de ces processus biologiques. Des études récentes ont confirmé que les substances naphtoquinoniques, en raison de leurs structures conjuguées, possèdent un potentiel pour piéger les radicaux libres ; leur noyau benzoquinonique peut affecter les voies de signalisation sensibles au redox par des mécanismes de transfert d'électrons16,17. On a signalé que la mollugine atténue les réponses inflammatoires dans la colite induite par le DSS, avec une réduction de la production de cytokines pro-inflammatoires et une diminution de l'expression de TLR4 dans les tissus coliques18. La mollugine s'est également révélée inhiber la signalisation TAK1-NF-κB/MAPK et activer la voie Keap1-Nrf2 dans les macrophages6 ; toutefois, son impact sur la polarisation des macrophages et sur le réseau apoptose–anti-apoptose dans un modèle de plaie in vivo n'a pas encore été élucidé. De plus, les effets biologiques de la mollugine dépendants de la dose ainsi que son rôle régulateur au cours du processus de régénération restent à clarifier systématiquement.
La présente étude a examiné les effets de la mollugine dans un modèle de régénération de la nageoire caudale du poisson zèbre. Plus précisément, nous avons analysé la repousse de la queue, l'expression des gènes liés à l'apoptose, la signalisation inflammatoire, l'activité des enzymes antioxydantes et les réponses associées aux macrophages après un traitement à la mollugine. Nos résultats suggèrent que le traitement par la mollugine est associé à une amélioration de la régénération de la queue et à des modifications de plusieurs marqueurs de réponse à la lésion dans ce modèle de poisson zèbre.
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Toutes les procédures animales ont suivi les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches et ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'Hôpital général de Fuzhou (numéro d'approbation : 202408002).
Élevage de poisson zèbre
Toutes les expériences ont été réalisées à l’aide de poissons zèbres (Danio rerio) maintenus dans des conditions standard de laboratoire. Des poissons zèbres de type sauvage AB ont été utilisés pour le test de toxicité et le test de régénération après amputation de la queue. Les poissons zèbres Tg(mpeg1:GFP) ont été utilisés spécifiquement pour l’imagerie des macrophages. Tg(mpeg1:GFP) est une lignée rapporteuse de macrophages dans laquelle l’expression de la GFP marque les cellules de la lignée des macrophages sous le contrôle du promoteur mpeg1 exprimé dans les macrophages. Toutes les lignées de poissons zèbres ont été maintenues à 28,5 °C selon un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h. Seuls les embryons morphologiquement normaux ont été utilisés pour les expériences. Pour toutes les expériences, les embryons ont été incubés dans du tampon de Danieau, préparé à partir de produits chimiques de qualité réactif, notamment du NaCl, du KCl, du Ca(NO₃)₂·4H₂O, du MgSO₄·7H₂O et du HEPES ajusté à un pH de 7,2.
Préparation du médicament et détermination de la sécurité
La mollugine (40 mg) a été dissoute dans 1 mL de DMSO afin d'obtenir un stock à 40 mg/mL. Ce stock a d'abord été dilué au 1:10 dans du tampon de Danieau pour atteindre une concentration de 4 mg/mL, puis davantage dilué à 22, 66 et 200 µg/mL pour les traitements. Afin de déterminer la concentration maximale sans danger, des embryons de souche AB âgés de 48 heures post-fécondation (hpf) ont été déchorionés et désinfectés avec de l'hypochlorite de sodium à 0,003 % avant d'être répartis dans des plaques de 6 puits (n = 20, puits en triple par groupe). Les embryons ont été incubés avec de la mollugine (22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL, 240 µg/mL, 280 µg/mL, 320 µg/mL ou 360 µg/mL) dans du milieu E3 pendant 48 h à 28,5 °C. La survie a été surveillée au microscope stéréoscopique, et la concentration la plus élevée présentant une viabilité embryonnaire ≥90 % a été établie comme limite supérieure sans danger pour les expériences ultérieures.
Construction du modèle d'amputation et de régénération de la queue
Pour les études de régénération, des embryons sauvages AB âgés de 48 hpf ont été anesthésiés avec de la tricaïne à 0,03 % préparée dans un milieu embryonnaire et positionnés latéralement sous un microscope stéréoscopique. Avant l'amputation de la queue, les embryons ont été maintenus dans du tampon de Danieau. Une amputation transversale standardisée de la queue a été réalisée sous guidage stéréomicroscopique. La ligne d'amputation a été placée immédiatement en arrière de l'extrémité de la notocorde, l'extrémité postérieure de la notocorde servant de repère anatomique. Le repli de la nageoire caudale situé au-delà de ce repère a été retiré à l’aide d’un microscalpel afin d’assurer un niveau de lésion constant entre les spécimens. Immédiatement après l’amputation (0 h), des images ont été acquises à l’aide d’un microscope stéréofluorescent. Après l’amputation, les embryons ont été transférés dans le milieu de traitement correspondant à base d’E3 pour le test de régénération. Les solutions travail de mollugine ont été préparées en diluant la solution mère de mollugine dans du milieu E3 jusqu’à des concentrations finales de 22, 66 et 200 µg/mL. La mollugine a été administrée par exposition en bain pendant la période de régénération. Pour équilibrer l’exposition au véhicule, le groupe témoin non lésé et le groupe modèle lésé ont été maintenus dans du milieu E3 contenant 0,5 % de DMSO, correspondant à la concentration finale de DMSO dans le groupe traité à 200 µg/mL de mollugine. Les embryons ont été maintenus dans des plaques à 6 puits à 28,5 °C pendant 2 jours, avec un renouvellement quotidien du milieu de traitement correspondant à base d’E3. La régénération a été documentée par imagerie à 24 et 48 h après l’amputation, en lumière blanche et en conditions de fluorescence, afin d’évaluer la repousse de la queue et la distribution des macrophages. Les mesures d’image ont été effectuées avec ImageJ.
Pour la quantification de la régénération, la surface de la queue récupérée a été mesurée comme une surface absolue en µm2 et n’a pas été normalisée par rapport à la taille de l’embryon ou à la taille initiale de la queue. Afin de minimiser la variabilité, tous les embryons ont été amputés au même repère anatomique situé immédiatement en arrière de l’extrémité de la notocorde, et ce même repère a été utilisé pour définir la région mesurée dans tous les groupes. Les régions d’intérêt ont été délimitées manuellement dans ImageJ en fonction du contour de la queue, et l’analyse a été réalisée par un investigateur aveugle aux groupes de traitement. Pour la quantification de la surface positive pour les macrophages, les images de fluorescence GFP des embryons Tg(mpeg1:GFP) ont été analysées dans ImageJ. La région de lésion/régénération de la queue a été définie manuellement comme région d’intérêt en utilisant le même repère anatomique que celui appliqué pour la mesure de la surface de la queue. Les images ont été converties en niveaux de gris 8 bits, et la fluorescence de fond a été soustraite en utilisant les mêmes paramètres de correction de fond pour toutes les images d’une même expérience. Un seuil de fluorescence fixe a ensuite été appliqué uniformément à toutes les images de chaque expérience afin d’identifier les signaux associés aux macrophages positifs pour GFP. La surface positive pour les macrophages a été calculée comme la surface GFP positive au seuil dans la ROI définie. Les mesures étaient basées sur la surface positive en fluorescence plutôt que sur l’intensité de fluorescence ou un décompte manuel des cellules. Toutes les analyses d’image ont été effectuées par un investigateur aveugle aux groupes de traitement.
Extraction d'ARN et PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)
Après l'achèvement du test de régénération, les embryons de chaque condition expérimentale ont été collectés et regroupés (au moins 20 embryons par groupe) pour l'analyse d'ARN. Pour chaque condition, un échantillon biologique indépendant était constitué d'un échantillon groupé contenant au moins 20 embryons provenant du même groupe expérimental. Trois réplicats biologiques groupés indépendants ont été préparés pour chaque condition et utilisés pour l'analyse statistique. L'ARN total a été isolé après homogénéisation mécanique dans un réactif d'extraction d'ARN à base de phénol/guanidine. La qualité et la concentration de l'ARN ont été évaluées par spectrophotométrie en mesurant les rapports A260/A280. La synthèse d'ADN complémentaire (ADNc) a été réalisée à l'aide d'un kit commercial de transcription inverse. L'amplification par PCR a été effectuée avec des réactifs SYBR Green. Les conditions de cyclage de la qRT-PCR étaient les suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 5 s et d'hybridation/extension à 60 °C pendant 30 s. Les niveaux d'expression des gènes liés à l'apoptose (caspase-3 et Bcl-2), à l'inflammation (TNF-α, IL-1β, IL-6, NF-κB1, TLR4, CCL2 et ICAM1) et au phénotype des macrophages (iNOS et arginase-1) ont été mesurés. L'actine β a servi de gène de référence. Les variations d'expression génique ont été déterminées selon la méthode 2−ΔΔCt. Les informations sur les amorces sont indiquées dans Tableau 1.
Dosage d'activité de la SOD et de la CAT
Les taux de SOD et de CAT ont été utilisés pour évaluer l'état antioxydant après une lésion de la queue. À 48 h post-amputation, les zebrafish de chaque groupe ont été collectés et homogénéisés dans du PBS froid. Après centrifugation, les extraits clarifiés ont été utilisés pour mesurer l'activité de la SOD et de la CAT à l'aide de kits commerciaux de dosage d'activité. L'activité de la SOD a été mesurée à l'aide d'un kit de dosage basé sur le WST-1, conformément aux instructions du fabricant. Les échantillons ont été déposés sur des plaques de dosage à 96 puits, conjointement avec les étalons, et la mesure de l'absorbance a été effectuée à l'aide d'un lecteur de microplaques. Les activités enzymatiques ont été déterminées à partir de courbes d'étalonnage. Tous les dosages ont été réalisés en triplicata.
Analyse statistique
Les données sont exprimées comme moyenne ± erreur type de la moyenne (ETM) à partir d'au moins trois expériences indépendantes. Pour le test de toxicité, chaque expérience indépendante comprenait un lot d'embryons, avec 20 embryons par groupe et des puits en triple exemplaire. Pour l'imagerie de la régénération et l'imagerie des macrophages chez les zebrafish Tg(mpeg1:GFP), des embryons individuels ont été utilisés comme unités de mesure, et 10 embryons ont été analysés par groupe. Pour l'analyse par qRT-PCR, un réplicat biologique correspondait à un échantillon groupé contenant au moins 20 embryons du même groupe expérimental, et trois réplicats biologiques groupés indépendants ont été analysés par condition. Pour l'analyse de l'activité de la SOD et de la CAT, cinq réplicats biologiques groupés indépendants ont été analysés par condition. Les différences entre groupes ont été évaluées par une ANOVA à un facteur suivie du test post hoc de Tukey. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism. Les différences avec une valeur de p < 0,05 ont été considérées comme significatives.
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Détermination de la toxicité et de la dose sûre
Afin d'étudier les effets de la mollugine, nous avons d'abord réalisé des tests de toxicité. Les résultats ont indiqué que la mortalité des embryons de poisson zèbre restait faible à des concentrations allant jusqu'à 200 µg/mL, tandis qu'une mortalité accrue était observée à des concentrations supérieures à 200 µg/mL (Tableau 2). Par conséquent, la dose sûre maximale a été fixée à 200 µg/mL, tandis que les doses faible et moyenne ont ét...
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Dans cette étude, nous avons examiné les effets de la mollugine sur la régénération de la queue du poisson zèbre. Dans la plage de doses testée, le traitement par la mollugine a été associé à une amélioration de la récupération de la surface de la queue après une lésion, ainsi qu'à des modifications de l'expression des gènes liés à l'apoptose, des marqueurs inflammatoires, de l'activité des enzymes antioxydantes et des marqueurs associés aux macrophages.
Le poisson zèbre, un modèle important p...
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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt concurrent.
La présente étude a été financée par la Commission de la santé de la province du Fujian, en Chine (subvention n° 2022QNA085).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaques de culture tissulaire à 6 puits | Corning | 3516 | |
| Kit de dosage de la catalase (CAT) | Institut de bioingénierie de Nanjing Jiancheng | A007-1-1 | |
| Chloroforme | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Lecteur de microplaques CMax Plus | Molecular Devices | iD3s | |
| Buffer de Danieau’s – Ca(NO3)2·4H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., Chine | N/A | Concentration finale dans le tampon de Danieau’s : 0,6 mM. |
| Buffer de Danieau’s – HEPES | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., Chine | N/A | Concentration finale dans le tampon de Danieau’s : 5 mM ; pH ajusté à 7,2. |
| Buffer de Danieau’s – KCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., Chine | N/A | Concentration finale dans le tampon de Danieau’s : 0,7 mM. |
| Buffer de Danieau’s – MgSO4·7H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., Chine | N/A | Concentration finale dans le tampon de Danieau’s : 0,4 mM. |
| Buffer de Danieau’s – NaCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., Chine | N/A | Concentration finale dans le tampon de Danieau’s : 58 mM. |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Milieu embryonnaire E3 | Préparé en laboratoire (recette standard) | N/A | Recette standard. |
| Amorces spécifiques aux gènes pour qPCR (tnfα, il1β, il6, nfkb1, tlr4, ccl2, icam1, inos, arginase-1, caspase-3, bcl2, β-actin) | Sangon Biotech | N/A | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, États-Unis | N/A | Version 8.0. |
| Logiciel ImageJ | Instituts nationaux de la santé (NIH) | N/A | Version 1.52n. |
| Mollugine (≥98 %, HPLC) | Sigma-Aldrich | SMB00431 | Composé actif extrait de Rubia cordifolia, dissous dans du DMSO à 40 mg/mL puis dilué à 22, 66 et 200 µg/mL dans le milieu E3. |
| Homogénéisateur tissulaire motorisé | IKA, T10 basic ULTRA-TURRAX (ou équivalent) | N/A | |
| NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | Novoprotein | abs60077 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7,4 |
| Système de PCR en temps réel (Archimed X4) | Sansure Biotech Inc. | Archimed X4 | |
| Microcentrifugeuse réfrigérée | SCILOGEX | CF1524R | |
| Pipettes sans ARNase | Sangon Biotech | F603222-0010 | |
| RNAiso Plus | Takara Bio Inc. | 9109 | Réactif d'extraction d'ARN à base de phénol/guanidine. |
| Tubes microcentrifuges sans RNase, 1,5 mL | Axygen / Eppendorf | N/A | |
| Stéréomicroscope à fluorescence SMZ800N | Nikon | SMZ800N | Stéréomicroscope à fluorescence utilisé pour imager les larves Tg(mpeg1:GFP) et quantifier l'agrégation des macrophages. |
| Solution d'hypochlorite de sodium | McLean, États-Unis | N/A | Solution d'utilisation à 0,003 %. |
| SYBR Green qPCR Mix (2× SYBR qPCR Mix) | Novoprotein | E096 | |
| Stéréomicroscope SZX16 | Olympus | SZX16 | Utilisé pour les observations morphologiques, l'évaluation de la toxicité et l'amputation de la nageoire caudale des larves. |
| Kit de dosage de la superoxyde dismutase totale (T-SOD) | Institut de bioingénierie de Nanjing Jiancheng | A001-3 | |
| Poisson-zèbre transgénique Tg (mpeg1:GFP) | Anburui, Fujian, Chine (ou colonie interne) | N/A | Ligne rapporteuse des macrophages. |
| Méthanesulfonate de tricaïne (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | Solution d'utilisation à 0,03 %. |
| Eau distillée UltraPure sans DNase ni RNase | Invitrogen | 10977023 | |
| Poisson-zèbre sauvage, souche CZ98 (Danio rerio) | Anburui, Fujian, Chine | N/A | Des embryons fécondés et des larves ont été obtenus à partir de stocks adultes reproducteurs. |
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