Évaluer la rigidité intrinsèque de l’aorte murine à l’aide de la myographie par pinos : un cadre de traduction pour interroger l’influence du milieu circulant

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer la rigidité intrinsèque de la paroi aortique (module élastique) via la myographie par broches et des approches pour examiner le rôle potentiel du milieu circulant dans la modulation de la rigidité intrinsèque de la paroi aortique.

Résumé

Le raidissement de l’aorte est un facteur de risque indépendant pour les maladies cardiovasculaires et d’autres affections chroniques, notamment le déclin cognitif, les dysfonctions rénales, la déficience visuelle et la diminution de la fonction glucose-insuline. In vivo, la raideur aortique est couramment évaluée à l’aide de techniques basées sur la tonométrie ou l’échographie qui visualisent respectivement les formes d’onde artérielles ou les segments artériels longitudinaux. Cependant, les mesures in vivo sont influencées par de multiples facteurs — tels que la pression artérielle et l’apport autonome — qui limitent la compréhension mécanistique de la manière et des raisons pour lesquelles la rigidité aortique évolue. Les modèles murins précliniques, qui permettent l’acquisition directe de tissu aortique, offrent un cadre expérimental unique pour évaluer à la fois la raideur aortique in vivo et les propriétés mécaniques intrinsèques de l’aorte, exemptes de variables physiologiques confondantes. Ces modèles permettent également d’examiner directement le milieu circulant (c’est-à-dire la collecte de molécules bioactives circulantes dans la circulation sanguine) et son rôle dans la modulation de la raideur aortique à travers le spectre translationnel préclinique à clinique. Les modifications du milieu circulant sont apparues comme un fondement mécanistique clé du raidissement aortique dans de nombreuses affections — y compris le vieillissement primaire et le vieillissement prématuré associé au cancer et aux traitements contre le cancer — tant dans les études précliniques que cliniques, ainsi que dans la médiation des effets des interventions. Cet article propose un guide étape par étape pour évaluer : (1) la rigidité aortique intrinsèque (module élastique) dans les modèles murins précliniques, et (2) la contribution du milieu circulant (et de ses constituants) au rigidification aortique en utilisant à la fois des bioéchantillons précliniques et cliniques.

Introduction

Le raidissement de l’aorte est un facteur de risque indépendant pour les maladies cardiovasculaires et autres maladies^{chroniques 1,2}. L’évaluation de la raideur aortique in vivo peut manquer de résolution mécanistique, compte tenu des processus physiologiques intégratifs qui régulent la raideur de l’aorte in vivo (par exemple, la pression artérielle et l’entrée autonome⁾². Ainsi, l’évaluation de la raideur intrinsèque de l’aorte (c’est-à-dire la rigidité/module élastique de la paroi aortique) ex vivo à l’aide de la myographie par pins permet d’évaluer directement la raideur aortique indépendamment des variables physiologiques^{de confusion 2}. De plus, l’utilisation d’une approche expérimentale ex vivo permet d’interroger les mécanismes moléculaires potentiels pouvant provoquer le raidissement de la paroi aortique. Contrairement à d’autres méthodes établies pour évaluer la raideur artérielle ex vivo, telles que la myographie par pression, les tests biaxiaux planaires et les systèmes myographiques cycliques/pulsatiles, qui reposent sur la modélisation des systèmes physiologiques (par exemple, pression intraluminale et hémodynamique pulsatile), la myographie par broches permet une évaluation directe de la rigidité de la paroi aortique via une force isométrique, dans des contextes très contrôlés qui ne nécessitent pas de modélisation in vivo.

Le milieu circulant (c’est-à-dire l’accumulation de molécules bioactives dans la circulation sanguine), qui entre en contact direct et fréquent avec l’aorte, est fréquemment modifié dans des contextes de raidissement aortique (par exemple, le vieillissement chronologique/primaire et le vieillissement prématuré, comme chez les survivants du cancer ou les modèles de survie au cancer)^3,4. Nous avons établi, à partir de biospécimens précliniques (murin) et cliniques (humains) (plasma et sérum), que le milieu circulant contribue directement au raidissement de l’aorte chez les premiers⁴ premiers et prématurés³. De plus, nous avons établi un cadre expérimental pour déterminer la ou les contributions directes de certains constituants dans le milieu circulant en médiant son effet sur le raidissement ^{aortique 3,5,6}. Ici, nous exposons et décrivons les approches expérimentales étape par étape pour évaluer la rigidité intrinsèque de l’aorte et la contribution du milieu circulant (et de ses constituants) au raidissement aortique à l’aide de la myographie par pins, et fournissons des résultats représentatifs (avec des figures et des citations).

Protocole

Des souris mâles de type sauvage C57BL/6J jeunes adultes (4 mois) ont été utilisés tout au long de cette étude. Le logement et les procédures impliquant des souris expérimentales ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) du campus médical Anschutz de l’Université du Colorado.

1. Préparation de solution physiologique saline froide (CPSS)

1. Préparez la solution de bouillon de Ca²⁺ Ringer dans 1 L de_{diH 2}O et conservez à 4 °C (Tableau 1).
2. Ajoutez 13,9 g de MOPS dans 100 mL de_{diH 2}O pour préparer la solution de stock tampon MOPS et stockez à 4 °C.
3. Ajoutez 0,186 g d’EDTA dans 100 mL de_{diH 2}O pour préparer la solution d’EDTA stock, pH à 8,0, et conservez à température ambiante.
4. Préparez les solutions CPSS contenant des produits stock préparées ci-dessus et les produits chimiques listés ci-dessous (Tableau 2). Réduisez le volume total à 2 L avec_{diH 2}O, pH à 7,4 °C à 34 °C, et filtrez CPSS à travers un filtre ≤ 0,45 μm. Distribuez dans des tubes coniques de 50 mL et conservez à -20 °C.

2. Dissection de l’aorte de la souris (Figure 1, Figure 2 et Figure 3)

1. Anesthésiez la souris par inhalation d’isoflurane (2,5 %) et placez la souris en position dorsale couchée (Figure 1A-C).
2. Une fois la souris sous le plan chirurgical d’anesthésie, on prélève du sang par ponction cardiaque et une méthode d’euthanasie secondaire complète par thoracotomie bilatérale (Figure 1B–C).
3. Ensuite, retirez délicatement l’aorte de l’arc aortique vers l’aorte abdominale (figure 1D–F).
4. Placez l’aorte dans le CPSS et retirez tout le tissu adipeux conjonctif et périvasculaire à l’aide des ciseaux ressorts Vannas Fine Science Tools (2,5 mm) (Figure 2A–E).
5. Découpez soigneusement trois segments aortiques de 1 mm de large dans la région thoracique juste sous l’arc aortique (Figure 3).
6. Placez les deux segments aortiques de 1 mm dans un tube de 1,5 mL rempli de CPSS et stockez-les à -80 °C jusqu’aux expériences de myographie des broches contrainte-déformation. Stockez le^3e segment de manière appropriée pour les mesures histologiques ultérieures décrites ci-dessous.

3. Expériences de myographie de goupille contrainte-déformation

REMARQUE : Le système de myographie par épingles sera utilisé pour effectuer des tests in vitro de la rigidité aortique (Figure 4 et Figure 5).

1. Premièrement, préchauffez les chambres à 37 °C contenant environ 6 mL de solution séline tamponnée phosphate (PBS) et décongelez des segments aortiques congelés de 1 mm.
   REMARQUE : Des solutions physiologiques alternatives salines, correctement oxygénées et contrôlées par le pH, peuvent également être utilisées comme décrit précédemment⁷.
2. Une fois 37 °C obtenus, suivez le protocole d’étalonnage du fabricant.
   1. Placez le pont d’étalonnage sur le myographe de façon à ce que la barre de balance en T ne touche pas la broche reliée au transducteur de force de la chambre de myographie des broches.
   2. Assurez-vous que la goupille du transducteur de force n’est pas soumise à aucune force. Lorsque la force relative est stable, placez un poids de 2 g sur le pont en T de sorte que la barre d’équilibre en T applique maintenant ~2 g de force sur la broche du transducteur de force.
   3. Confirmez que la lecture de force est comprise entre 9,71 et 9,91 mN. Si oui, la calibration est terminée.
3. Déterminer la lecture de base du micromètre et enregistrer la valeur (c’est-à-dire la lecture initiale).
   1. Au cas d’une lunette de dissection, déterminer la distance micrométrique de base à laquelle les deux broches parallèles sont presque en contact (Figure 4).
      REMARQUE : Ne laissez pas les deux broches se toucher, car cela pourrait endommager ou perturber le transducteur de force dans la chambre du myographe.
4. Au microscope de dissection, placez un segment aortique de 1 mm au-dessus des deux broches et notez la largeur du segment à l’aide de micro-étriers (Figure 6A). Ensuite, connectez l’unité de chambre à l’interface du système de myographie par broches.
   REMARQUE : Augmentez la largeur de la goupille pour exercer une tension sur le segment de l’aorte lors du montage de l’aorte afin de la fixer sur les deux broches, ce qui empêche le segment d’aorte de se déloger.
5. Si une tension est appliquée sur l’aorte et que la chambre a été connectée et montée sur le système de myographie à broches, remettez le micropositionneur à la « position initiale » déterminée à l’étape 3.3 ci-dessus.
6. Pré-étirement complet de l’aorte.
   1. Étirer l’aorte en augmentant la distance entre les deux broches de 1 mm par rapport à la position initiale du micropositionneur (Figure 6B).
   2. Ensuite, relâchez l’aorte en ramenant les broches à la lecture initiale du micropositionneur. Effectuez cette séquence étirement-relâchement trois fois (Figure 6A).
      REMARQUE : Après la dernière séquence étirement-relax, le micropositionneur devrait revenir à la lecture initiale.
7. Sur l’interface du système de myographie par broches, lecture de force zéro pour chaque chambre utilisée (Figure 7).
8. Commencez l’expérience contrainte-déformation.
   1. Augmentez la lecture de force à environ 1 mN en ajustant le micropositionneur (Figure 7).
   2. Après une équilibration de force de ~1 mN (3–5 s), enregistrez la nouvelle lecture du micropositionneur à la force de ~1 mN et notez la première lecture de force.
   3. Augmentez le micropositionneur de 50 μm (c’est-à-dire 5 clics/hachages) et laissez le segment de l’aorte être étiré pendant 3 minutes. Après 3 minutes, force d’enregistrement.
   4. Continuez à augmenter le micropositionneur de 50 μm toutes les 3 minutes et enregistrez la force jusqu’à atteindre le « point de cédent ».
      REMARQUE : Le point de cédent est la plus grande force générée avant que des dommages structurels irréversibles ne surviennent sur l’aorte (c’est-à-dire une déchirure ou une rupture de l’aorte, une baisse significative de la force).
   5. Confirmez le point d’élasticité en étirant l’aorte de 50 μm supplémentaires après le point d’élasticité initial. Assurez-vous que la valeur de force reste inférieure ou légèrement supérieure au point d’écoulement. Si le point de cédent n’est pas confirmé, il faut continuer avec des augmentations de 3 minutes jusqu’à ce que le point de cédent soit atteint.
   6. Une fois confirmé le point de cédement, les expériences sont terminées. Commencez l’analyse maintenant.

4. Analyse des expériences de myographie des goupilles contrainte-déformation pour déterminer le module élastique de la région du collagène et de l’élastine

1. En utilisant les relevés de force obtenus à partir du myographe, générez une courbe contrainte-déformation à l’aide des équations suivantes :
   Déformation (λ)=∆d/[d(i)]
   ici d est le diamètre et d_i est le diamètre initial et ;
   Contrainte (t)=λL/[2(HD)]
   où L est la charge unidimensionnelle, H l’épaisseur du milieu intima, et D la longueur du vaisseau. Une fois les courbes contrainte-déformation générées, utilisez-les pour calculer les régions de force élevée et de force faible comme décrit^{précédemment 8,9} (Figure 8).
2. Calculez la région de force élevée (région du collagène) (Figure 8B).
   1. Déterminez le module élastique de la courbe contrainte-déformation lorsque la pente de la régression linéaire s’ajuste aux quatre derniers points de la courbe contrainte-déformation. Pour obtenir la mesure de la haute force à partir du graphique contrainte-déformation, suivez les étapes ci-dessous :
      1. Faites un clic droit sur un point de données sur le graphique et sélectionnez Sélectionner les données > Ajouter > Entrer le nom de la série : Module élastique.
      2. Valeurs de la série X : Sélectionnez 4 points de données parmi les valeurs de déformation. Ce sont les 3 points lorsque la force approche du « point de fluence ». Assurez-vous d’inclure le point de limite de cédement comme quatrième point.
      3. Valeurs de la série Y : Sélectionnez 4 points de données parmi les valeurs de contrainte. Ce sont les 3 points lorsque la force approche du « point de fluence ». Assurez-vous d’inclure le point de limite de cédement comme quatrième point.
      4. Cliquez sur OK et ajoutez la ligne de tendance > l’équation d’affichage linéaire > sur le graphique > affichez la valeur R-carré sur le graphique.
   2. La pente de l’équation est le module élastique de force élevée. Assurez-vous que la valeur R-carré est ≥ 0,99 pour que le module élastique soit précis.
3. Calculer la région de force faible (région de l’élastine) (Figure 8C)
   1. Déterminez les frontières de la région dominante en élastine (région de faible force où la courbure est ~0) de la courbe contrainte-déformation en ajustant une équation polynomiale du septième ordre aux données (r² > 0,99) puis en calculant les racines de l’équation. Considérons la première racine, la frontière entre la région à très faible force et la région de l’élastine, et la seconde racine, la frontière entre la région de l’élastine et l’apparition de l’engagement des fibres de collagène.
   2. Déterminez ensuite le module d’élasticité de la région à faible force comme la pente d’une équation linéaire ajustée aux données contrainte-déformation entre les^{deux racines 8,9}. Pour obtenir cela :
      1. Faites un tableau Excel contenant des colonnes comme illustré dans le Tableau Supplémentaire 1.
      2. Transformez cela en un document « txt » et ouvrez-le dans le script R du logiciel de code R « Modulus of Elasticity ».
      3. Pour utiliser les données, vérifiez les pentes normales : le graphe^de dérivée 3 sur la sortie R doit avoir la forme de « M ».
      4. Dans l’onglet résultats , la valeur numérique sous la colonne Pente est le module d’élasticité. Assurez-vous que la valeur R-carré est supérieure ou égale à 0,99 pour que le module d’élasticité soit précis.
      5. Pour obtenir cette valeur dans le tableur, sélectionnez les valeurs de déformation (et leurs valeurs de contrainte correspondantes) entre la première et la seconde dérivée obtenues dans l’onglet des résultats du code R .
      6. Suivez les étapes décrites à l’étape 4.2 pour obtenir l’équation et la valeur de^{R 2} sur le tableau de calcul.

5. Évaluation du diamètre aortique et de l’épaisseur de la paroi

1. Placez le dernier segment aortique de 1 mm dans un cryomold rempli d’un composé à température de coupe optimale (OCT). Orientez l’anneau avec le lumen plat et centré au fond du moule, avec l’axe luminal perpendiculaire à la surface de coupe pour obtenir des coupes transversales.
2. Préparez un récipient de 2-méthylbutane refroidi dans de l’azote liquide, puis immergez le cryomold dans du 2-méthylbutane froid jusqu’à ce que l’OCT devienne blanc opaque.
3. Conservez le cryomold à -80 °C jusqu’à la coupe. Réglez la température du cryostat à la température de découpe OCT appropriée (≈-20 °C) puis montez le bloc congelé sur le support à échantillons.
4. Une fois fixé au support, taillez soigneusement le bloc tout en maintenant une épaisseur de 7 μm jusqu’à ce que le tissu apparaisse.
5. Marquez une lame avec l’ID de la souris et coupez 4 à 5 sections transversales du tissu aortique à une épaisseur de 7 μm.
6. Pour transférer le tissu tranché sur les lames, placez toutes les sections coupées sur l’étage cryostat (appelé également l’étage couteau) avant de placer la lame étiquetée directement dessus.
7. Une fois le transfert terminé, le séchage à l’air est laissé sécher à l’air.
8. Sections d’image sous un grossissement de 10x sur un microscope en champ clair. Enregistrez les images au format JPG/TIFF avec une barre d’échelle en bas de l’image.
9. Pour analyser, ouvrez ImageJ, allez dans Fichier > Ouvrir et sélectionnez l’image aortique.
10. Une fois l’image aortique affichée, zoomez sur la barre d’échelle avec l’icône Control + + puis utilisez l’outil ligne pour mesurer la longueur de la barre d’échelle. Pour remplir le résultat, appuyez sur Contrôle + M. La mesure calculée sous la longueur correspond à la mesure de la barre d’échelle.
11. Pour calibrer le logiciel, allez dans Analyser > Échelle. Pour la distance en pixels, entrez la longueur de la droite calculée par ImageJ à l’étape 8. Pour la distance connue , entrez la longueur réelle de la barre d’échelle, et sous les unités écrivez l’unité de mesure (μm, mm, cm, etc.).
12. Cochez la case globale pour calibrer automatiquement toutes les images suivantes. Notez si la barre d’échelle dans les autres images diffère ou si ImageJ est fermée ; si oui, un recalibrage est nécessaire.
13. Pour l’épaisseur du mur, utilisez l’outil ligne droite et tracez une ligne perpendiculaire du bord luminal au bord extérieur adventitial. Appuyez sur Contrôle + M pour remplir automatiquement la longueur dans l’onglet des résultats .
14. Répétez l’étape 5.13 pour effectuer des mesures à 6 positions régulièrement espacées autour de la circonférence de l’aorte et notez chaque valeur.
15. Pour calculer l’épaisseur moyenne par aorte de souris, on fait la moyenne de toutes les épaisseurs obtenues à partir de 4 à 5 échantillons de la même souris.
16. Pour mesurer le diamètre luminal, sélectionnez l’outil polygonal et suivez la bordure luminale intérieure dans le sens horaire. Enregistrer le périmètre (μm) en appuyant sur Control + M.
17. Répétez le traçage dans le sens antihoraire, en commençant par un autre point. Assurez-vous que les deux valeurs de circonférence sont proches l’une de l’autre et moyennez-les pour cet anneau aortique.
18. Répétez l’étape 5.16 pour les 4 à 5 échantillons aortiques de la même souris et faites la moyenne de toutes les valeurs de circonférence.
19. Pour calculer le diamètre, utilisez l’équation : Diamètre (μm) = Périmètre/3,14.

6. Module élastique aortique médié par le milieu circulant

REMARQUE : Pour déterminer si des facteurs circulants ou des composés spécifiques modifient la raideur intrinsèque de l’aorte, des anneaux aortiques thoraciques issus de souris naïves interventionnistes peuvent être incubés ex vivo dans des conditions de culture standard définies (37 °C, 5 % CO₂, 20 %_O2, humidifié) (Figure 9).

1. Disséquez l’aorte thoracique et découpez deux segments annulaires de 1 mm par état. Retirez tout le tissu adipeux périvasculaire.
2. Dans une plaque à 96 puits, incubez les anneaux aortiques dans un milieu standard, composé de DMEM + 1 % de pénicilline-streptomycine.
3. Ajoutez un traitement expérimental aux médias. Pour le plasma ou le sérum (le plasma/sérum non traité peut être utilisé pour cela), utilisez 10 % du volume total du milieu. Utilisez le plasma ou le sérum préclinique et clinique (humain^{) 3,4,6} (Figure 9).
4. Pour établir le rôle causal d’un facteur circulant démontré comme différent entre les groupes d’étude, répéter l’exposition plasma/sérique tout en corrigeant simultanément la différence de concentration observée entre les groupes (c’est-à-dire en normalisant la concentration du facteur d’intérêt), déterminer l’effet direct du facteur d’intérêt à une concentration qui représente la différence moyenne entre les groupes, ou bloquer la signalisation du facteur que l’on pense être responsable de la médiation de l’effet du milieu circulant.
   REMARQUE : Les deux dernières approches ont été précédemment exécutées, respectivement, avec de la triméthylamine-oxyde d’An-oxyde (TMAO⁾⁵ et avec un blocage du récepteur pour les produits finaux de glycation^{avancée 3}.
5. Pour élucider le rôle du stress oxydatif lié à l’excès de superoxydes ou des mitochondries
   le stress oxydatif spécifique lié au superoxyde dans ce système modèle, utiliser les concentrations respectives lors de l’incubation des anneaux d’aorte : TEMPOL : 1 μM ^5,10 et MitoQ : 1 μM⁶.
6. Après 48 à 72 heures d’incubation, chargez les anneaux aortiques dans le myographe à goupilles et suivez les étapes décrites ci-dessus.

Résultats

Rigidification aortique liée à l’âge

Pour la rigidité mécanique intrinsèque, la force correspondant à chaque intervalle d’étirement est enregistrée et utilisée pour les calculs. Dans les calculs précédemment discutés, on génère des courbes contrainte-déformation et on calcule le module d’élasticion pour la 1) région du collagène et/ou 2) la région de l’elastine de ces courbes, comme décrit ci-dessus et initialement montré par Gioscia-Ryan et<...

Discussion

L’utilisation de la myographie par pins pour évaluer la raideur intrinsèque aortique ex vivo offre l’opportunité d’évaluer la raideur intrinsèque aortique indépendamment des variables physiologiques in vivo potentiellement confondantes, telles que la pression artérielle et l’entrée^{autonome 2}. De plus, cette approche expérimentale ex vivo offre l’opportunité de dépister les mécanismes moléculaires potentiels qui pourraient sous-tendre les...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-méthylbutane	Fisher Scientific	AA19387AP
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma-Aldrich	C7902
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
D-(+)-Glucose (Dextrose)	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Fisher Scientific	MT10017CV
EDTA (A.C.S.)	Fisher Chemical	E478
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Sulfate de magnésium heptahydraté	Sigma-Aldrich	M2773
MitoQ	Cayman Chemical	845959-50-4
Phosphate monosodique	Sigma-Aldrich	S5011
MOPS (sel de Na)	Sigma-Aldrich	M9024
Système de myographie à plusieurs électrodes	Danish Myo Technology (DMT)	620M
NaCl	Fisher Chemical	S271
Pénicilline-streptomycine	Fisher Scientific	15-140-148
Anticorps RAGE	R&D System	AF1145
Pyruvate de sodium	Sigma-Aldrich	P2256
TEMPOL	Sigma-Aldrich	2226-96-2
Composé Tissue-tek OCT	Sakura	4583
N-oxyde de triméthylamine (TMAO)	Sigma Aldrich	317594