Association de l'expression de MPO avec le microenvironnement immunitaire dans le cancer du sein : perspectives issues de la bioinformatique et d'analyses à cellule unique

Résumé

Cet article présente un flux de travail bioinformatique et unicellulaire reproductible permettant d'explorer les associations entre l'expression de la myéloperoxydase (MPO) et les caractéristiques immunitaires/myéloïdes dans le cancer du sein. Étant donné que les analyses reposent sur des jeux de données publics et des méthodes in silico, les résultats sont interprétés comme exploratoires et générateurs d'hypothèses.

Résumé

Le cancer du sein demeure une cause majeure de mortalité liée au cancer, et des flux de travail computationnels exploratoires peuvent aider à hiérarchiser les marqueurs associés au système immunitaire pour des investigations ultérieures. Ici, nous avons utilisé les données transcriptomiques d'ensemble du cancer du sein invasif provenant de l'Atlas du génome du cancer (TCGA-BRCA) ainsi que le jeu de données public unique-cellule GSE161529 afin d'examiner les associations entre l'expression de la myéloperoxydase (MPO), les résultats cliniques, l'infiltration immunitaire, la méthylation, les annotations des régulateurs en amont, les profils d'expression à l'échelle de la cellule unique, les sorties de sensibilité à l'extinction virtuelle, la récupération des interactions médicament-gène, et les annotations relatives à l'absorption, la distribution, le métabolisme, l'excrétion et la toxicité (ADME-Tox). L'expression de la MPO était plus faible dans les tissus tumoraux du sein que dans les tissus non tumoraux adjacents. Une expression plus élevée de la MPO était associée à un intervalle sans progression plus long, tandis que ses associations avec la survie globale et la survie spécifique à la maladie n'étaient pas statistiquement significatives. Une analyse des caractéristiques d'efficacité (ROC) a suggéré une séparation entre tumeur et tissu normal au sein du jeu de données public analysé, mais ceci ne doit pas être interprété comme une validation diagnostique clinique. Des analyses de désinconvolution immunitaire et d'enrichissement ont indiqué que l'expression de la MPO était principalement corrélée à des caractéristiques transcriptionnelles liées au système immunitaire et aux cellules myéloïdes, plutôt qu'à une régulation intrinsèque tumorale du microenvironnement immunitaire. À la résolution de la cellule unique, le signal MPO était dispersé, avec seulement 85 cellules positives pour la MPO détectées avant l'expansion du voisinage basée sur les k plus proches voisins (KNN). Le signal MPO détectable et les scores associés à la MPO ont été interprétés avec prudence, car ils pourraient être influencés par une expression clairsemée, une incertitude dans l'annotation des types cellulaires, des effets de « dropout », des doublets ou l'ARN ambiant. In silico L'analyse de type « knockdown virtuel » a suggéré des modifications transcriptionnelles candidates liées à l'immunité et à l'inflammation, mais ces résultats ont été considérés comme exploratoires et nécessitent une validation. La récupération de relations médicament-gène basée sur la base de données Drug-gene Interaction Database (DGIdb) ainsi que l'annotation ADMET ont été utilisées uniquement comme annotations chimiques préliminaires et n'ont pas été interprétées comme une preuve thérapeutique. Dans l'ensemble, cette étude propose un flux de travail in silico reproductible permettant de générer des hypothèses sur les caractéristiques immunitaires/myéloïdes associées à la MPO dans le cancer du sein, lesquelles nécessitent une validation sur des cohortes externes et une confirmation expérimentale.

Introduction

Le cancer du sein est une tumeur maligne fortement hétérogène et liée au système immunitaire¹. L'évolution de la maladie, le risque de récidive et de métastase, ainsi que la réponse au traitement, sont étroitement associés à la composition et à l'état fonctionnel du microenvironnement immunitaire tumoral (TIME)². Malgré l'optimisation continue des stratégies de traitement globales, certains patients connaissent tout de même une progression ou une récidive, ce qui souligne l'urgence d'identifier des biomarqueurs moléculaires caractérisant l'état du TIME et permettant la stratification des risques, tout en élucidant leurs mécanismes sous-jacents.

La myéloperoxydase (MPO) est une peroxydase contenant un groupe hème, exprimée principalement dans les neutrophiles et, dans une moindre mesure, dans les monocytes et les macrophages. Grâce à la production d'acide hypochloreux et d'autres oxydants réactifs, la MPO contribue à la défense antimicrobienne, mais peut également favoriser les lésions tissulaires oxydatives et l'inflammation chronique. Dans le cancer, la signification biologique de la MPO semble dépendre du contexte³. D'une part, le stress oxydatif médié par la MPO a été impliqué dans la cancérogenèse et la progression tumorale par le biais de dommages à l'ADN, de l'oxydation des lipides et des protéines, de la signalisation inflammatoire et de la remodélisation du microenvironnement tumoral^4,5,6. D'autre part, l'infiltration de cellules innées immunitaires ou myéloïdes positives pour la MPO a été associée à un pronostic favorable ou à une activité immunitaire antitumorale dans certains contextes tumoraux^7,8,9. Ces résultats apparemment contradictoires suggèrent que la signification clinique et biologique de la MPO pourrait dépendre du type de tumeur, du stade de la maladie, de la source cellulaire de la MPO et de la composition immunitaire du microenvironnement tumoral. Toutefois, le profil d'expression et la pertinence pronostique de la MPO dans le cancer du sein, en particulier au niveau cellulaire unique, restent incomplètement caractérisés.

Le microenvironnement immunitaire tumoral (TIME) contient des compartiments hétérogènes de lignée myéloïde, lymphoïde, stromal et épithélial¹⁰. La MPO est classiquement associée aux neutrophiles et à d'autres cellules de la lignée myéloïde, et les signaux liés à la MPO dans les profils tumoraux globaux peuvent donc refléter la composition des cellules immunitaires plutôt qu'une activité intrinsèque des cellules tumorales¹⁰. Dans le cancer du sein, la distribution du signal de la MPO dans les jeux de données globaux et unicellulaires, son association avec les estimations d'infiltration immunitaire, ainsi que les limites de reproductibilité des analyses computationnelles ultérieures, restent insuffisamment caractérisées. Cette étude considère donc la MPO comme un marqueur associé à l'immunité dans le cadre d'un développement exploratoire de protocole, et non comme un régulateur causal prouvé du TIME ou une cible thérapeutique validée. Par rapport aux analyses différentielles d'expression sur une seule cohorte ou aux estimations d'infiltration immunitaire basées sur une seule plateforme, un protocole intégré combinant transcriptomique globale, déconvolution immunitaire, annotation des profils de méthylation, cartographie unicellulaire et perturbation computationnelle peut offrir une vision exploratoire plus large du contexte immunitaire associé au gène. Cette approche est utile pour hiérarchiser les marqueurs candidats et générer des hypothèses testables, notamment lorsque les jeux de données expérimentaux ne sont pas encore disponibles. Toutefois, une telle intégration computationnelle ne peut pas, par elle-même, déterminer la source cellulaire, la causalité, l'activité pharmacologique ou l'utilité clinique. Grâce à l'avancement des grandes cohortes publiques de cancers et des technologies transcriptomiques unicellulaires, les approches bioinformatiques peuvent être utilisées pour explorer les associations entre l'expression génique, les résultats cliniques, la composition des cellules immunitaires et les états transcriptionnels, à la fois aux niveaux de population et unicellulaire¹¹. Les méthodes de perturbation computationnelle fondées sur les réseaux régulateurs géniques unicellulaires peuvent en outre fournir des informations génératrices d'hypothèses concernant la sensibilité transcriptionnelle associée au gène^12,13. Cette étude visait donc à caractériser le profil d'expression, l'association avec la survie, le contexte immunitaire/myéloïde, le profil de méthylation, la distribution unicellulaire et le profil exploratoire de perturbation computationnelle de la MPO dans le cancer du sein. Le protocole global est illustré dans la Figure 1.

Protocole

Acquisition à partir de la base de données TCGA

Les données de séquençage de l'ARN et les informations cliniques concernant la cohorte de carcinome mammaire invasif du projet TCGA (TCGA-BRCA) ont été obtenues à partir du portail Genomic Data Commons¹⁴. Les données d'ARN-séquençage du flux de travail STAR au format de transcrits par million (TPM) ont été extraites conjointement avec les annotations cliniques appariées. Les échantillons d'ARN-séq pour lesquels aucune information clinique correspondante n'était disponible ont été exclus. Pour les analyses basées sur l'expression, les valeurs de TPM ont été transformées selon log2(TPM + 1). L'expression de MPO a été extraite à l'aide du symbole génique MPO et de l'identifiant génique Ensembl ENSG00000005381.8. Pour les analyses nécessitant un regroupement en MPO-élevé et MPO-faible, seuls les échantillons tumoraux de la cohorte TCGA-BRCA ont été inclus, tandis que les échantillons normaux adjacents ont été exclus de l'attribution des groupes. Les échantillons tumoraux ont été divisés selon la valeur médiane de l'expression de MPO, transformée en log2(TPM + 1), parmi les échantillons tumoraux TCGA-BRCA. Les échantillons dont l'expression de MPO était supérieure ou égale à la médiane ont été classés dans le groupe MPO-élevé, tandis que ceux dont l'expression était inférieure à la médiane ont été classés dans le groupe MPO-faible. Cette stratégie de regroupement fondée sur la médiane a été utilisée pour l'analyse de survie, l'analyse d'expression différentielle, l'analyse d'enrichissement, le regroupement par méthylation et les comparaisons d'enrichissement en cellules immunitaires, sauf indication contraire. Les caractéristiques clinico-pathologiques, incluant le sexe, l'âge, l'ethnicité, le stade pathologique T, le grade histologique, le sous-type PAM50, le stade pathologique, le statut tumoral, ainsi que les critères de jugement relatifs à la survie, notamment la survie globale (OS), l'intervalle sans progression (PFI) et la survie spécifique à la maladie (DSS), ont été analysées à l'aide de la version 4.2.1 du logiciel R.

Récupération d'images publiques d'immunohistochimie

Des images représentatives d'immunohistochimie (IHC) de la protéine MPO provenant de tissus mammaires normaux adjacents et de tissus cancéreux du sein ont été utilisées comme références qualitatives au niveau protéique. Ces images n'ont pas été incluses dans les analyses morphométriques quantitatives ou les analyses statistiques. Les zones encadrées indiquent les régions montrées à un grossissement plus élevé. Les barres d'échelle indiquent 100 µm sur les images à 20× et 50 µm sur les images à 40×.

Analyse de corrélation d'expression

Le jeu de données TCGA-BRCA a été utilisé pour examiner les gènes co-varyant avec l'expression de MPO dans le cancer du sein. Des coefficients de corrélation de Pearson au niveau du génome ont été calculés entre MPO et les gènes codant pour des protéines, et les 30 gènes les plus fortement corrélés positivement et les 30 gènes les plus fortement corrélés négativement ont été sélectionnés pour la visualisation. Pour les analyses de corrélation impliquant plusieurs gènes testés, les p-values nominales ont été ajustées selon la méthode de taux de fausses découvertes de Benjamini-Hochberg. Le réseau d'interactions protéine-protéine (PPI) associé à MPO a été construit à l'aide de la base de données Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING), les paires de protéines présentant un score d'interaction supérieur à 0,40 étant conservées pour la visualisation¹⁵.

Analyse d'enrichissement fonctionnel

Les gènes différentiellement exprimés (DEG) ont été identifiés en comparant les groupes de tumeurs TCGA-BRCA à forte et faible expression de MPO à l'aide de seuils de |log2FC| > 1 et d'une valeur de p ajustée selon Benjamini-Hochberg < 0,05. Une analyse d'enrichissement fonctionnel des DEG a été réalisée à l'aide du package R clusterProfiler version 4.4.4, incluant des analyses des processus biologiques, des composants cellulaires et des fonctions moléculaires de l'ontologie génique (GO), ainsi que des analyses de voies de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)^{16,17,18,19,20}. Les termes GO et KEGG enrichis ont été considérés comme significatifs lorsque la valeur de p ajustée était < 0,05.

Une analyse d'enrichissement de gènes (GSEA) a été réalisée à l'aide d'une liste de gènes préclassés basée sur des statistiques d'expression différentielle entre les groupes à forte expression de MPO (MPO-high) et à faible expression de MPO (MPO-low). La collection MSigDB C2 Canonical Pathways c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt, correspondant à MSigDB v2022.1.Hs et contenant 3 050 jeux de gènes, a été utilisée^21,22. Les termes enrichis ont été considérés comme significatifs selon une valeur-p ajustée par la méthode de Benjamini–Hochberg < 0,05, une valeur-q FDR < 0,25 et une valeur |score d'enrichissement normalisé| > 1. Lorsque cela était applicable, les Z-scores des termes significativement enrichis ont été calculés à l'aide du package GOplot pour la visualisation.

Analyse de l'enrichissement des cellules immunitaires dans les tumeurs

Les composants immunitaires et stromaux dans la cohorte TCGA-BRCA ont été évalués à l'aide de l'algorithme ESTIMATE implémenté dans le package R estimate version 1.0.13. Les données d'expression transformées selon log2(TPM + 1) ont été utilisées comme entrée, et les scores immunitaire, stromal et ESTIMATE ont été calculés pour chaque échantillon tumoral. TIMER/TIMER2.0 a été utilisé pour évaluer les associations entre l'expression de MPO et les niveaux d'infiltration estimés des principales populations de cellules immunitaires dans la cohorte TCGA-BRCA, notamment les cellules B, les cellules T CD8+, les cellules T CD4+, les macrophages, les neutrophiles et les cellules dendritiques^23,24,25. Les résultats basés sur TIMER ont été interprétés comme des estimations de l'infiltration immunitaire dérivées de la ressource en ligne correspondante. Pour l'analyse d'enrichissement des cellules immunitaires parmi 24 types de cellules immunitaires, une analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes par échantillon unique (ssGSEA) a été mise en œuvre à l'aide du package R GSVA version 1.46.0²⁶. La matrice de signatures immunitaires LM22 utilisée pour la désconvolution basée sur CIBERSORT de 22 types de cellules immunitaires est fournie dans le Tableau supplémentaire 1. Les corrélations entre l'expression de MPO et les scores d'enrichissement des cellules immunitaires ont été évaluées à l'aide du coefficient de corrélation de rang de Spearman. Les différences de scores d'enrichissement des cellules immunitaires entre les groupes tumoraux définis comme MPO-élevé et MPO-faible selon la médiane ont été comparées à l'aide du test de Wilcoxon à somme de rangs. Pour les analyses impliquant plusieurs types de cellules immunitaires, les valeurs de p ont été ajustées selon la méthode de taux de fausses découvertes de Benjamini–Hochberg.

Méthylation de l'ADN du gène MPO

Les profils de méthylation de l'ADN au niveau du locus MPO ont été évalués à l'aide de MethSurv. Les valeurs bêta de méthylation des sites CpG et les associations avec la survie pour TCGA-BRCA ont été obtenues à partir de la plateforme MethSurv. Les sites CpG associés au gène MPO sélectionnés ont été visualisés, et leurs associations avec les résultats de survie ont été évaluées à partir des sorties d'analyse de survie fournies par MethSurv²⁷. Pour les analyses impliquant plusieurs sites CpG, les valeurs de p ont été ajustées sur l'ensemble des sites CpG liés à MPO testés à l'aide de la méthode de taux de fausses découvertes de Benjamini-Hochberg. Ces analyses de méthylation ont été interprétées comme des annotations épigénétiques exploratoires.

Construction du réseau PPI et analyse de corrélation des gènes liés aux neutrophiles

Afin d'examiner l'association entre la MPO et la biologie liée aux neutrophiles, une analyse systématique en réseau a été réalisée. Un ensemble de gènes comprenant des médiateurs établis de l'activation des neutrophiles et des processus inflammatoires associés a été recensé à partir de la littérature actuelle. La liste complète des gènes liés aux neutrophiles est fournie dans le Tableau supplémentaire 2. Les symboles des gènes ont été harmonisés selon les symboles officiels, les doublons ont été supprimés, puis les gènes disponibles ont été croisés avec la matrice d'expression TCGA-BRCA avant l'analyse STRING/RIP, la priorisation des gènes centraux et l'analyse de corrélation entre la MPO et les gènes centraux. Le réseau RIP parmi ces gènes a été construit à l'aide de la base de données STRING (version 11.5), en utilisant un seuil de confiance moyenne pour le score d'interaction (>0,40). Les gènes centraux de ce réseau ont été priorisés algorithmiquement selon la centralité de degré, qui quantifie le nombre d'interactions directes par nœud. Les 20 gènes présentant les scores de degré les plus élevés ont été sélectionnés pour l'analyse de corrélation ultérieure.

Par la suite, les profils d'expression de ces gènes centraux et de la MPO ont été extraits du jeu de données transcriptomiques TCGA-BRCA. L'association entre la MPO et chacun des gènes centraux a été évaluée statistiquement à l'aide du coefficient de corrélation de Spearman. Afin de caractériser les profils de corrélation entre les gènes centraux eux-mêmes, une matrice de corrélation de Spearman par paires a été calculée pour tous les échantillons tumoraux. Ces analyses de corrélation ont fourni la base quantitative pour les visualisations ultérieures, notamment le graphique en bâtonnets des corrélations entre la MPO et les gènes centraux, ainsi que le diagramme en cordes et la carte thermique illustrant les profils de corrélation entre les gènes centraux.

Prédiction des facteurs de transcription en amont et des ARNmi ciblant MPO

La base de données KnockTF (https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)^28,29, la base de données ChIP (http://chip-atlas.org/)^30,31 et la base de données GTRD^32,33 (https://gtrd.biouml.org/#!) ont été utilisées pour prédire les facteurs de transcription ciblés par MPO. De plus, la base de données TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_80/) a été utilisée pour prédire les sites de liaison potentiels des miARN ciblant MPO. Les diagrammes de Venn ont été générés à l’aide du site MicroBioinformatics (https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)³⁴.

Analyse unicellulaire de la MPO

Le jeu de données spécifique GSE161529 provient de la base Gene Expression Omnibus (GEO). Le prétraitement des données a d'abord consisté en un filtrage au niveau cellulaire afin d'exclure les cellules de faible qualité — celles répondant à l'un des critères suivants : expression des gènes mitochondriaux dépassant 25 %, nombre total d'identifiants moléculaires uniques (UMI) inférieur à 5000, ou moins de 2500 gènes détectés. Ensuite, la contamination par l'ARN ambiant et les effets techniques liés aux lots ont été corrigés³⁵. Une analyse en composantes principales (ACP) a été réalisée afin de réduire la dimensionnalité et évaluer la similarité cellulaire, suivie d'une analyse UMAP pour le regroupement et la visualisation des cellules. Puis, selon les gènes marqueurs typiques des cellules, les différents groupes ont été annotés en types cellulaires¹¹. L'ensemble de gènes associés à la MPO utilisé pour le calcul de signature unicellulaire est fourni dans le fichier supplémentaire 1. Avant le calcul des scores, les symboles des gènes ont été harmonisés avec les symboles officiels, les doublons ont été supprimés, et les gènes disponibles ont été croisés avec la matrice d'expression de GSE161529. Les méthodes AUCell, Seurat AddModuleScore et ssGSEA ont été utilisées pour calculer les scores associés à la MPO pour chaque cellule. Les scores obtenus par les trois méthodes ont été normalisés par Z-score, ajustés à une plage comparable, puis intégrés afin de produire un score composite associé à la MPO pour les analyses descriptives ultérieures. Les réseaux d'interactions entre cellules ont été analysés afin de comparer les profils de communication ligand–récepteur impliquant les cellules tumorales épithéliales stratifiées selon le signal associé à la MPO et divers types cellulaires partenaires. Ces résultats ont été interprétés comme des profils descriptifs de communication, et non comme une preuve que les cellules exprimant la MPO médiatisent directement la communication intercellulaire.

Abaissement virtuel au niveau de la cellule unique de MPO et analyse d'enrichissement des voies à l'aide de scTenifoldKnk

Un abaissement virtuel au niveau de la cellule unique de MPO a été réalisé en intégrant Seurat et scTenifoldKnk. Après un contrôle de qualité standard (200 à 6 000 gènes par cellule ; fraction mitochondriale < 10 %), les données ont été normalisées par logarithme, et 2 000 gènes hautement variables ont été sélectionnés pour la réduction de dimensionnalité et le regroupement en clusters. Afin d'enrichir les contextes pertinents pour MPO, seules les cellules présentant un score dans les 50 % supérieurs pour un module génique myéloïde/neutrophile ont été conservées. À partir de ces cellules, un sous-ensemble voisin de MPO a été défini en étendant à partir de cellules initiatrices positives pour MPO en utilisant k = 40 voisins les plus proches dans l'espace PCA. Ce sous-ensemble élargi n'a pas été considéré comme une population purement positive pour MPO, et aucune conclusion sur les proportions de types cellulaires n'a été tirée de cette étape d'expansion KNN. Ce sous-ensemble a été soumis à une analyse d'abaissement virtuel via scTenifoldKnk, en utilisant l'union des gènes hautement variables et de MPO (exprimé dans ≥25 cellules) comme ensemble génique. Les gènes significativement perturbés ont été identifiés (FDR < 0,05, ajusté par BH). Les gènes obtenus ont ensuite été analysés pour leur enrichissement fonctionnel dans les processus biologiques GO et les voies KEGG (q < 0,05).

Recherche exploratoire de médicaments et de gènes et annotation ADMET

DGIdb a été interrogé afin d'obtenir des enregistrements préliminaires d'interactions médicament–gène ou chimique–gène associées à l'MPO. Étant donné que les listes d'interactions issues de bases de données peuvent inclure des entrées étayées par des types de preuves hétérogènes et ne peuvent pas correspondre directement à des agents thérapeutiques cliniquement applicables, les composés récupérés ont été considérés comme des annotations exploratoires plutôt que comme des candidats thérapeutiques prioritaires. SwissADME et ADMETlab ont ensuite été utilisés pour résumer les propriétés physicochimiques, pharmacocinétiques et toxicologiques prédites. Ces annotations in silico ont servi à fournir un contexte préliminaire pour l'interprétation au niveau des composés et à souligner la nécessité d'une curation pharmacologique, toxicologique et clinique supplémentaire avant que toute pertinence thérapeutique puisse être envisagée³⁶.

Résultats

Profils d'expression de la MPO et associations exploratoires avec la survie dans le cancer du sein

Afin de décrire les profils d'expression de MPO dans divers ensembles de données sur le cancer, nous avons analysé les données de séquençage ARN de MPO provenant de l'ensemble de données pancancéreux du TCGA et observé une expression réduite de MPO dans les tissus tumoraux de carcinome urothélial de la vessie (BLCA), de carcinome invasif du sein (BRCA), de glioblastome multiforme (GBM), de carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSC), de chromophobe rénal (KICH), de carcinome hépatocellulaire (LIHC), d'adénocarcinome pulmonaire (LUAD), de carcinome épidermoïde du poumon (LUSC), d'adénocarcinome du pancréas (PAAD), d'adénocarcinome de la prostate (PRAD) et de carcinome thyroïdien (THCA), ainsi qu'une expression accrue de MPO dans l'adénocarcinome du côlon (COAD), le carcinome papillaire rénal (KIRP) et d'autres tissus (Figure 2A). Nous avons ensuite évalué les associations entre l'expression de MPO et les résultats cliniques pour chaque type de cancer. Dans la cohorte TCGA-BRCA, les comparaisons appariées et non appariées ont montré une expression de MPO plus faible dans le tissu tumoral que dans le tissu normal ou adjacent (Figure 2B,C). Après stratification des échantillons tumoraux de TCGA-BRCA selon le seuil médian d'expression tumorale de MPO, l'analyse de Kaplan-Meier a révélé que les patients présentant une expression plus élevée de MPO avaient un intervalle sans progression plus long (Hazard Ratio (HR) = 0,67, p = 0,028) (Figure 2D). La survie globale (OS) (p = 0,296 ; Figure supplémentaire 1A) et la survie spécifique au décès (DSS) (p = 0,18 ; Figure supplémentaire 1B) n'étaient pas statistiquement significatives. La courbe ROC tumeur versus normal suggérait une séparation entre les groupes de tissus dans cet ensemble de données (Figure 2E), mais cette analyse ne doit pas être interprétée comme une validation diagnostique clinique. Cette discrimination exploratoire pourrait être influencée par la source des échantillons normaux, les effets de lot, la pureté tumorale et les différences de composition tissulaire. L'expression de MPO était également associée au stade pathologique T (Figure 2F) et à la répartition des sous-types PAM50 (Figure 2G). Des images représentatives d'immunohistochimie (IHC) de MPO provenant de tissus mammaires normaux adjacents et de tissus cancéreux du sein ont été incluses comme références qualitatives au niveau protéique (Figure 2H). Les zones encadrées indiquent les régions montrées à un grossissement plus élevé. Les images d'aperçu à 20× incluent des barres d'échelle de 100 µm, tandis que les images à plus fort grossissement à 40× incluent des barres d'échelle de 50 µm.

Analyses de corrélation et d'enrichissement de la MPO dans la cohorte TCGA-BRCA

L'analyse de corrélation de Pearson a identifié les 30 gènes les plus fortement corrélés positivement avec MPO, qui présentaient une uprégulation coordonnée selon le gradient d'expression de MPO (Figure 3A), tandis que les 30 gènes les plus fortement corrélés négativement présentaient un profil d'expression inverse (Figure 3B). Au niveau des voies biologiques, l'expression de MPO était significativement et positivement associée à plusieurs scores de signatures liées au cancer, notamment le score de la signature de réponse inflammatoire (r = 0,41 ; Figure 3C), les marqueurs d'EMT (r = 0,264 ; Figure 3D) et le score du jeu de gènes associés aux espèces réactives de l'oxygène (ROS) (r = 0,415 ; Figure 3E), suggérant que l'expression de MPO est corrélée aux états transcriptionnels inflammatoires/oxydatifs et de type mésenchymateux dans la cohorte TCGA-BRCA.

Le regroupement non supervisé des gènes associés à la MPO a permis de stratifier davantage les tumeurs selon des profils d'expression correspondant à des annotations cliniques, notamment le stade pathologique T et les sous-types intrinsèques PAM50 (Figure 3F). Afin d'explorer d'éventuelles connexions entre les gènes associés à la MPO, nous avons construit un réseau d'interactions protéine-protéine (PPI) à l'aide de STRING, révélant un module interconnecté parmi plusieurs gènes corrélés à la MPO (Figure 3G). Dans ce réseau PPI, ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 et KRT18 présentaient une forte connectivité au sein de ce module dérivé de la corrélation. Ces résultats identifient des gènes dont l'expression varie conjointement avec celle de la MPO, mais n'établissent ni la pathogenèse liée à la MPO ni le sens de la causalité. L'analyse de l'expression différentielle entre les groupes à forte et faible expression de la MPO a révélé des différences transcriptomiques résumées dans le diagramme en volcan (Figure 3H). Un total de 1 159 gènes surexprimés et de 854 gènes sous-exprimés ont été identifiés, fournissant des données d'entrée pour les analyses d'enrichissement ultérieures.

Nous avons ensuite examiné la pertinence fonctionnelle des gènes différentiellement exprimés (DEG) entre les groupes MPO-élevé et MPO-faible à l'aide du package clusterProfiler dans R. L'analyse d'enrichissement de l'ontologie génique (GO) a indiqué que ces DEG étaient principalement impliqués dans des processus biologiques liés à l'immunité, notamment la régulation de la signalisation par récepteurs membranaires liés à la réponse immunitaire et l'immunité médiée par les lymphocytes, avec un enrichissement également observé dans des composants cellulaires tels que le complexe du récepteur des cellules T et des fonctions moléculaires associées à l'activité d'activateur de récepteur (Figure 4A). De manière cohérente, l'analyse des voies KEGG a mis en évidence des voies associées à l'immunité et à l'inflammation, notamment l'interaction cytokine–récepteur de cytokine, la signalisation chimioquines, la signalisation par récepteur des cellules T, la cytotoxicité médiée par les cellules tueuses naturelles, la différenciation Th1/Th2 et Th17, la signalisation NF-κB, l'immunodéficience primaire et le réseau immunitaire intestinal pour la production d'IgA (Figure 4B).

Afin d'intégrer davantage la directionnalité d'expression aux termes fonctionnels, le tracé GO a été utilisé pour calculer des scores Z au niveau des termes à partir des valeurs |log2FC| des gènes différentiellement exprimés, ce qui a de nouveau mis en évidence des programmes transcriptionnels enrichis en voies immunitaires, tels que la réponse immunitaire humorale, l'immunité médiée par les leucocytes ou les lymphocytes, l'activation de la réponse immunitaire et la transduction du signal (Figure 4C). Une analyse d'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) basée sur la liste de gènes classés a également révélé un enrichissement des voies du système immunitaire, notamment le système immunitaire adaptatif, l'interaction cytokine–récepteur de cytokine et la dégranulation des neutrophiles (Figure 4D–G). Étant donné que MPO est un gène associé aux cellules myéloïdes et aux neutrophiles, ces enrichissements sont interprétés comme une indication que les échantillons à forte expression de MPO présentent des signaux transcriptionnels immunitaires/myéloïdes plus marqués, plutôt que comme une preuve que MPO lui-même remodèle le microenvironnement immunitaire.

Corrélation entre l'expression de la MPO et l'infiltration des cellules immunitaires dans le cancer du sein

Nous avons évalué la relation entre l'expression de la MPO et les caractéristiques du microenvironnement tumoral dans la cohorte TCGA-BRCA. L'application de l'algorithme ESTIMATE a révélé des corrélations positives significatives entre l'expression de la MPO et le score ESTIMATE (R = 0,347, p < 0,001), le score immunitaire (R = 0,361, p < 0,001) et le score stromal (R = 0,232, p < 0,001) (Figure 5A). La répartition de ces scores selon les échantillons est présentée dans la Figure 5B. Une analyse à l'aide de la ressource TIMER/TIMER2.0 a indiqué que l'expression de la MPO était associée aux niveaux d'infiltration estimés des principales populations de cellules immunitaires, notamment les cellules B, les cellules T CD8+, les neutrophiles, les cellules T CD4+, les macrophages et les cellules dendritiques dans la cohorte TCGA-BRCA (Figure 5C). Ce profil d'association a été davantage évalué à l'aide de scores d'enrichissement des cellules immunitaires basés sur la ssGSEA pour 24 types de cellules immunitaires. Après correction du taux de faux positifs selon la méthode de Benjamini–Hochberg, l'expression de la MPO s'est révélée positivement associée à plusieurs scores d'enrichissement des cellules immunitaires, notamment les cellules T, les cellules B, les cellules cytotoxiques, les sous-ensembles de cellules dendritiques, les macrophages, les sous-ensembles de cellules T auxiliaires, les cellules T régulatrices, les cellules T CD8+, les cellules NK, les mastocytes et les neutrophiles (Figure 5D). Ces résultats sont interprétés comme des associations liées à la composition immunitaire, et non comme une preuve que la MPO contrôle directement l'infiltration des cellules immunitaires. Une carte thermique a été générée afin de visualiser les profils d'enrichissement des cellules immunitaires au niveau des échantillons dans la cohorte TCGA-BRCA (Figure 5E). Nous avons ensuite comparé les scores d'enrichissement des cellules immunitaires estimés par ssGSEA entre les groupes de tumeurs définis comme ayant une expression élevée ou faible de la MPO selon la médiane. Plusieurs scores d'enrichissement des cellules immunitaires différaient entre les deux groupes, notamment les cellules dendritiques activées (aDC), les cellules B, les cellules T CD8+, les cellules cytotoxiques, les neutrophiles, les cellules T, les Treg, les cellules Th1, les cellules Th2, les cellules Th17, les cellules T γδ, les cellules T auxiliaires folliculaires (TFH), les cellules à gènes hautement variables (HVG), les cellules T mémoire effectrices, les cellules T mémoire centrales et les cellules T auxiliaires (Figure 5F,G). De plus, une déconvolution basée sur CIBERSORT utilisant la matrice de signature LM22 a été réalisée afin d'estimer les fractions relatives des 22 types de cellules immunitaires, et les profils de composition des cellules immunitaires obtenus sont présentés dans la Figure 5H.

Analyse de la méthylation de l'ADN du gène MPO dans la cohorte TCGA-BRCA

En utilisant le même seuil médian d'expression de la MPO dans les tumeurs, les échantillons TCGA-BRCA ont été répartis en groupes MPO-élevée et MPO-basse, et les profils de méthylation de l'ADN ont été visualisés pour chaque groupe (Figure 6A). Certains sites CpG sélectionnés au sein du locus MPO présentaient des associations avec la survie dans l'analyse MethSurv, notamment les sites cg22331200, cg14619064 et cg11151395 (Figure 6B–G). Ces résultats liés à la méthylation ont été interprétés comme des annotations épigénétiques exploratoires et nécessitent une validation indépendante avant que des conclusions pronostiques ou mécanistiques puissent être établies.

Association entre l'expression de la MPO et les réseaux géniques liés aux neutrophiles dans le cancer du sein

La cohorte TCGA-BRCA a été utilisée pour examiner l'association entre l'expression de MPO et les gènes liés aux neutrophiles. Un réseau PPI basé sur STRING a été construit pour les gènes associés aux neutrophiles, et les gènes centraux ont été priorisés selon la topologie du réseau (Figure 7A). Les 20 principaux gènes centraux ont ensuite été évalués en fonction de leur corrélation avec l'expression de MPO. Comme le montre le graphique en bâtonnets, MPO présentait principalement des corrélations positives avec plusieurs médiateurs liés aux neutrophiles, des associations plus fortes étant observées pour des composants de la signalisation chimiotactique/immunité innée tels que CCL5, CCL2 et TLR2, ainsi que TLR4, CXCR4, TNF et MMP9 (Figure 7B).

Afin de caractériser davantage le modèle de co-régulation parmi ces gènes centraux, nous avons visualisé leurs relations par paires à l'aide d'un diagramme en cordes et d'une carte thermique de corrélation, ce qui a révélé d'importantes corrélations positives entre les gènes au sein du module central, en accord avec un programme transcriptionnel inflammatoire associé aux neutrophiles (Figure 7C,D). Dans leur ensemble, ces résultats indiquent qu'une expression plus élevée de MPO s'accompagne d'une expression coordonnée d'un réseau génique lié aux neutrophiles dans le cancer du sein.

Annotation des facteurs de transcription candidats pour MPO

Afin d'explorer les facteurs de transcription candidats potentiellement associés à MPO, des ressources publiques sur les facteurs de transcription, notamment KnockTF, ChIP-Atlas et GTRD, ont été interrogées et croisées. Les facteurs de transcription candidats ont ensuite été synthétisés à l'aide d'une analyse de corrélation et d'une priorisation fondée sur un réseau. Un résumé graphique est présenté dans la figure supplémentaire 2, et les résultats complets sous forme de tableau sont fournis dans le fichier supplémentaire 2. Étant donné que ces bases de données intègrent des preuves provenant de contextes expérimentaux hétérogènes, le chevauchement entre bases de données et le degré dans le réseau ont été utilisés uniquement pour l'annotation et la priorisation des candidats. Ces résultats n'ont pas été interprétés comme une preuve fonctionnelle d'une régulation transcriptionnelle directe de MPO dans le cancer du sein. Les facteurs candidats, notamment MYC, sont donc présentés comme des annotations exploratoires supplémentaires plutôt que comme des régulateurs en amont validés.

Regroupement au niveau de la cellule unique et analyse descriptive de la communication intercellulaire stratifiée selon le signal MPO

Pour annoter les types cellulaires, nous avons d'abord effectué une analyse d'expression spécifique aux groupes basée sur des marqueurs canoniques pour chaque lignée. Les niveaux d'expression moyens et le pourcentage de cellules exprimant ces gènes clés dans les groupes sont présentés, ce qui soutient l'annotation ultérieure (Figure 8A). En conséquence, les groupes cellulaires annotés sont visualisés sur un graphique de projection et d'approximation de variété uniforme (UMAP), dans lequel chaque population est codée par couleur selon son type identifié, notamment les cellules dendritiques plasmocytoïdes, les cellules endothéliales, les cellules myoépithéliales, les cellules épithéliales en division, les plasmocytes, les lymphocytes T cytotoxiques, les cellules tumorales épithéliales, les cellules B, les lymphocytes T CD4 activés, les monocytes–macrophages, les fibroblastes et les lymphocytes T conventionnels (Figure 8B). La carte thermique affiche les niveaux d'expression de gènes sélectionnés à travers les groupes cellulaires (C1-C8). Chaque ligne représente un gène et chaque colonne représente un groupe cellulaire. Le dégradé de couleur indique les niveaux d'expression, le rouge correspondant à une forte expression et le bleu à une faible expression. Le dendrogramme de gauche regroupe les gènes présentant des profils d'expression similaires (Figure 8C). Le score associé à la MPO a été calculé pour chaque cellule à l'aide du jeu de gènes associés à la MPO fourni dans le Fichier Supplémentaire 1. AUCell, Seurat AddModuleScore et l'analyse d'enrichissement de jeu de gènes à l'échelle d'un échantillon unique (ssGSEA) ont été utilisés pour calculer les scores par cellule. Les scores obtenus par les trois méthodes ont été normalisés par Z-score, ajustés à une plage comparable et intégrés afin de produire un score composite associé à la MPO destiné à l'analyse descriptive ultérieure (Figure 8D).

Cette analyse des interactions cellule-cellule a comparé les profils de communication ligand-récepteur inférés entre des groupes cellulaires stratifiés selon le signal associé à la MPO, incluant le réseau d'interactions, les cartes thermiques des profils de signalisation, le graphique en bulles de la signalisation sortante et le graphique en bulles de la signalisation entrante (Figure 8E–H). Étant donné que le signal MPO était dispersé au niveau monocellulaire et que sa distribution apparente parmi les types cellulaires annotés pourrait être influencée par des effets de dropout, d'ARN ambiant, de doublets et d'incertitude dans l'annotation, ces graphiques de communication doivent être interprétés comme des sorties descriptives du flux de travail. Ils ne démontrent pas que les cellules exprimant la MPO médient ou contrôlent la communication intercellulaire. Un signal MPO détectable a été observé dans un nombre limité de cellules, notamment des cellules tumorales épithéliales annotées et des monocytes-macrophages (Figure 8I). Étant donné que la MPO est classiquement associée aux lignées neutrophiles/myéloïdes, ce profil doit être validé dans des jeux de données unicellulaires indépendants ou par des méthodes expérimentales orthogonales.

Analyse de sensibilité exploratoire scTenifoldKnk basée sur des cellules MPO-positives rares

Plusieurs échantillons 10x Genomics ont été intégrés, puis normalisés et sélectionnés pour les gènes à haute variabilité (HVG), suivis d'une réduction de dimensionnalité par ACP, de la construction d'un graphe de plus proches voisins (k-NN) et d'un regroupement de type Louvain. Les profils d'expression canoniques des gènes marqueurs selon les groupes ont été résumés à l'aide d'un DotPlot, facilitant l'annotation ultérieure des types cellulaires (Figure 9A). La visualisation UMAP a montré les populations cellulaires annotées au niveau monocellulaire dans le jeu de données intégré (Figure 9B). Les marqueurs canoniques de lignage (par exemple, EPCAM et KRT8/KRT18 pour les cellules épithéliales ; PTPRC pour les cellules immunitaires ; MS4A1 pour les cellules B ; LST1/S100A8/S100A9 pour les cellules myéloïdes ; PECAM1 pour les cellules endothéliales ; et COL1A1 pour les lignages de fibroblastes/muscle lisse) présentaient des profils d'expression spécifiques à chaque groupe, confirmant l'annotation des types cellulaires (Figure 9C). Des diagrammes en barres empilées stratifiés par échantillon ont indiqué que chaque échantillon contenait plusieurs groupes, avec une variation globale limitée d'un lot à l'autre (Figure 9D).

L'expression de MPO était relativement faible dans le jeu de données à cellule unique, avec seulement 85 cellules positives pour MPO détectées initialement (Figure 9E). Étant donné ce nombre limité, une expansion par voisinage basée sur les plus proches voisins (KNN) a été utilisée uniquement pour définir un sous-ensemble local de voisinage MPO destiné à une analyse de sensibilité exploratoire. Ce sous-ensemble élargi ne doit pas être interprété comme une population purement positive pour MPO, car il peut inclure des cellules voisines exprimant faiblement ou indétectablement MPO. Au sein de ce sous-ensemble de voisinage MPO, une extinction virtuelle de MPO a été réalisée à l'aide de scTenifoldKnk, en tant qu'analyse computationnelle de sensibilité. Le diagramme en volcan résultant, l'analyse de déplacement de la variété, la visualisation de l'alignement des variétés, les résultats d'enrichissement GO/KEGG et les gènes présentant les plus forts déplacements (Figure 9F-N) ont mis en évidence des programmes transcriptionnels candidats liés à la présentation de l'antigène, à l'activation des myéloïdes/lymphocytes, à la production de cytokines et aux voies liées au phagosome. Ces résultats doivent être interprétés comme des sorties exploratoires de sensibilité transcriptionnelle, et non comme une preuve directe que MPO régule mécaniquement ces voies dans le cancer du sein. Des jeux de données indépendants à cellule unique et une validation expérimentale orthogonale, telles que l'immunohistochimie, la cytométrie en flux, la qPCR ou des tests fonctionnels, seront nécessaires pour confirmer ces observations.

Extraction exploratoire des interactions médicament–gène et annotation ADMET

À titre d'extension exploratoire de l'analyse centrée sur la MPO, des informations sur les interactions médicament-gène ont été extraites de DGIdb. Un résumé graphique est présenté dans la figure supplémentaire 3, et les résultats au niveau des composés sont fournis dans le tableau supplémentaire 3. La requête DGIdb a renvoyé un ensemble hétérogène de composés chimiques associés à la MPO, incluant des composés ayant une plausibilité clinique limitée ou des profils toxicologiques défavorables. Par conséquent, ces composés issus de bases de données n'ont pas été considérés comme des candidats thérapeutiques pour le cancer du sein selon l'analyse actuelle. Des informations liées à l'ADMET ont été résumées afin de fournir une annotation préliminaire des propriétés physico-chimiques, pharmacocinétiques et toxicologiques prédites. La récupération de composés à partir de bases de données et l'annotation ADMET ne sont pas équivalentes à une priorisation clinique de médicaments. Ces résultats servent donc uniquement d'annotations chimiques de niveau de criblage et illustrent la nécessité d'un filtrage rigoureux pharmacologique, toxicologique et clinique avant qu'un composé puisse être envisagé pour une investigation thérapeutique. Les principaux résultats de cette étude portent sur l'association entre l'expression de la MPO et les caractéristiques transcriptionnelles liées aux cellules immunitaires/myéloïdes.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :

Les données transcriptomiques et cliniques de TCGA-BRCA ont été obtenues à partir du portail Genomic Data Commons (https://portal.gdc.cancer.gov ; téléchargées le 26 août 2025 ; version/libération des données 202208). Le jeu de données unicellulaire GSE161529 a été obtenu à partir de la base Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). Aucune nouvelle donnée de séquençage n’a été générée dans cette étude. Les scripts d’analyse sont accessibles publiquement à l’adresse suivante : https://github.com/tengfeitcm/MPO.

Figure 1 : Organigramme du processus de collecte et d'analyse des données. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Profils d'expression de la MPO et associations exploratoires avec la survie dans le cancer du sein. (A) Les niveaux d'expression de la MPO ont été analysés dans 33 types de cancers distincts et leurs tissus normaux adjacents à l'aide de la base de données TCGA. (B) Des échantillons non appariés ont été sélectionnés à partir du jeu de données TCGA-BRCA afin d'analyser l'expression de l'ARNm de la MPO dans les tissus tumoraux et normaux du sein. (C) Des échantillons appariés ont été sélectionnés à partir du jeu de données TCGA-BRCA afin d'analyser l'expression de l'ARNm de la MPO dans les tissus tumoraux et normaux du sein. (D) Analyse de Kaplan-Meier du délai de progression de la maladie (PFI) chez des patients stratifiés selon le seuil médian d'expression tumorale de la MPO dans la cohorte TCGA-BRCA. (E) Courbe ROC exploratoire évaluant la discrimination entre tumeur et tissu normal basée sur l'expression de la MPO dans le jeu de données transcriptomiques public analysé. (F) Expression de la MPO selon les différents stades pathologiques T. (G) Expression de la MPO selon les sous-types moléculaires PAM50, avec les étiquettes des sous-types indiquées. (H) Images représentatives d'immunohistochimie (IHC) de la MPO dans un tissu mammaire normal adjacent et un tissu cancéreux du sein. Les zones encadrées indiquent les régions montrées à un grossissement plus élevé. Les images d'aperçu à 20× incluent des barres d'échelle de 100 µm, tandis que les images à 40× à plus fort grossissement incluent des barres d'échelle de 50 µm. Ces images sont présentées comme des références qualitatives au niveau protéique et n'ont pas été utilisées pour une analyse morphométrique ou statistique quantitative. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Analyse des corrélations et de l'expression différentielle associées à MPO dans le cancer du sein. (A) Les 30 principaux gènes codants positivement corrélés à l'expression de MPO au niveau ARNm, basés sur les coefficients de corrélation de Pearson provenant de la base de données TCGA. (B) Les 30 principaux gènes codants négativement corrélés à l'expression de MPO au niveau ARNm, basés sur les coefficients de corrélation de Pearson. (C) Nuages de points illustrant les corrélations de Spearman entre MPO et les gènes surexprimés lors de la réponse inflammatoire. (D) Nuages de points illustrant les corrélations de Spearman entre MPO et les gènes surexprimés par les marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). (E) Nuages de points illustrant les corrélations de Spearman entre MPO et les gènes surexprimés par les espèces réactives de l'oxygène (ROS). (F) Carte thermique des groupes de gènes associés à MPO basée sur la signification clinique (stade T et PAM50). (G) Réseau d'interactions protéine-protéine (PPI) prédit à l'aide de la base de données STRING pour les protéines associées à MPO. (H) Diagramme en volcan des gènes différentiellement exprimés entre les groupes de tumeurs à expression élevée et faible de MPO, définis selon la médiane, dans la cohorte TCGA-BRCA. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse d'enrichissement de MPO dans le cancer du sein. (A) Analyse d'enrichissement de l'ontologie génique des 2 013 gènes différentiellement exprimés entre les groupes à forte et faible expression de MPO. (B) Analyse d'enrichissement des voies de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pour les 2 013 gènes différentiellement exprimés. (C) Visualisation intégrée de l'enrichissement de l'ontologie génique combinant les termes enrichis avec la direction de la différentielle d'expression et les valeurs de |log2FC|. (D) Graphique d'enrichissement représentatif de l'analyse GSEA pour un ensemble de gènes liés à l'immunité associé à MPO ; le nom de l'ensemble de gènes, le score d'enrichissement normalisé et la valeur q de FDR sont indiqués dans le panneau. (E) Graphique d'enrichissement représentatif de l'analyse GSEA pour un autre ensemble de gènes liés à l'immunité associé à MPO ; le nom de l'ensemble de gènes, le score d'enrichissement normalisé et la valeur q de FDR sont indiqués dans le panneau. (F) Graphique d'enrichissement représentatif de l'analyse GSEA pour un autre ensemble de gènes liés à l'immunité associé à MPO ; le nom de l'ensemble de gènes, le score d'enrichissement normalisé et la valeur q de FDR sont indiqués dans le panneau. (G) Graphique d'enrichissement représentatif de l'analyse GSEA pour un autre ensemble de gènes liés à l'immunité associé à MPO ; le nom de l'ensemble de gènes, le score d'enrichissement normalisé et la valeur q de FDR sont indiqués dans le panneau. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Corrélation entre l'enrichissement en cellules immunitaires et l'expression de la MPO dans le cancer du sein. (A) Diagrammes de dispersion montrant les corrélations entre l'expression de la MPO et le score ESTIMATE, le score immunitaire et le score stromal. (B) Boîtes à moustaches illustrant les différences de score ESTIMATE, de score immunitaire et de score stromal entre les groupes de tumeurs à forte et faible expression de la MPO définis par la médiane. (C) Analyse basée sur TIMER/TIMER2.0 montrant les associations entre l'expression de la MPO et l'infiltration estimée des principales populations de cellules immunitaires. (D) Graphique en bâtonnets montrant les corrélations de Spearman entre l'expression de la MPO et les scores d'enrichissement estimés par ssGSEA pour 24 types de cellules immunitaires. Les valeurs de p issues de multiples corrélations entre cellules immunitaires ont été ajustées à l'aide de la méthode de taux de fausses découvertes de Benjamini–Hochberg. (E) Carte thermique illustrant les profils d'enrichissement en cellules immunitaires au niveau des échantillons dans la cohorte TCGA-BRCA. (F) Boîtes à moustaches montrant le premier ensemble de différences de scores d'enrichissement en cellules immunitaires estimés par ssGSEA entre les groupes de tumeurs à forte et faible expression de la MPO définis par la médiane ; les comparaisons entre groupes ont été effectuées à l'aide du test de Wilcoxon avec correction de Benjamini–Hochberg. (G) Boîtes à moustaches montrant le second ensemble de différences de scores d'enrichissement en cellules immunitaires estimés par ssGSEA entre les groupes de tumeurs à forte et faible expression de la MPO définis par la médiane ; les comparaisons entre groupes ont été effectuées à l'aide du test de Wilcoxon avec correction de Benjamini–Hochberg. (H) Graphique en barres empilées montrant les fractions de cellules immunitaires estimées par CIBERSORT selon la matrice de signature LM22 pour 22 types de cellules immunitaires dans les groupes de tumeurs à faible et forte expression de la MPO définis par la médiane. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse de la méthylation de l'ADN du gène MPO dans le cancer du sein. (A) Carte thermique montrant les profils de méthylation de MPO dans les groupes définis selon la médiane comme ayant une expression élevée (MPO-high) ou faible (MPO-low) de MPO. (B) Courbe de survie de Kaplan-Meier illustrant la signification pronostique de la méthylation au site cg27456487. (C) Courbe de survie de Kaplan-Meier illustrant la signification pronostique de la méthylation au site cg02668773. (D) Courbe de survie de Kaplan-Meier illustrant la signification pronostique de la méthylation au site cg07110356. (E) Courbe de survie de Kaplan-Meier illustrant la signification pronostique de la méthylation au site cg11151395. (F) Courbe de survie de Kaplan-Meier illustrant la signification pronostique de la méthylation au site cg14619064. (G) Courbe de survie de Kaplan-Meier illustrant la signification pronostique de la méthylation au site cg22331200. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 7: Analyse des corrélations entre MPO et les gènes associés aux neutrophiles au niveau ARNm à l'aide de la base de données TCGA. (A) Visualisation du réseau d'interactions protéiques, illustrant les interactions entre la protéine centrale et d'autres protéines. (B) Analyse de corrélation des 20 principaux gènes associés aux neutrophiles avec MPO, montrant les coefficients de corrélation et la distribution des valeurs P pour différents gènes. (C) Diagramme en cordes des corrélations entre les 20 principaux gènes associés aux neutrophiles, représentant visuellement l'intensité et le sens des associations géniques. (D) Carte thermique des corrélations des 20 principaux gènes associés aux neutrophiles, affichant les coefficients de corrélation et les niveaux de significativité à travers des dégradés de couleur et des marqueurs statistiques. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Analyse de regroupement au niveau cellulaire unique et analyse de la communication cellule-cellule associée à la MPO dans le jeu de données de cellules uniques du cancer du sein. (A) DotPlot des gènes marqueurs canoniques selon les groupes pour l'annotation des types cellulaires. (B) Visualisation UMAP des populations cellulaires annotées. (C) Carte thermique des gènes marqueurs sélectionnés selon les groupes cellulaires. (D) DotPlot résumant les scores associés à la MPO selon les types cellulaires annotés, calculés à l’aide d’AUCell, de ssGSEA et de Seurat AddModuleScore, basés sur le jeu de gènes fourni dans le Fichier Supplémentaire 1. (E) Réseau d’interactions cellule-cellule illustrant la communication entre les cellules tumorales épithéliales stratifiées selon le signal associé à la MPO et les autres types cellulaires ; la largeur des arêtes représente l’intensité de l’interaction et la taille des nœuds reflète l’activité globale d’interaction. (F) Cartes thermiques montrant les profils de signalisation sortants et entrants selon les types cellulaires. (G) Graphique en bulles des voies de signalisation sortantes des cellules tumorales épithéliales stratifiées selon le signal associé à la MPO vers d'autres types cellulaires. (H) Graphique en bulles des voies de signalisation entrantes provenant d'autres types cellulaires vers les cellules tumorales épithéliales stratifiées selon le signal associé à la MPO. (I) Distribution de l’expression de la MPO selon les types cellulaires annotés. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Analyse d'un atlas unicellulaire et inhibition virtuelle exploratoire des résultats liés à la sensibilité à la MPO. (A) DotPlot montrant l'expression des gènes marqueurs canoniques au sein des groupes unicellulaires ; la taille des points représente le pourcentage de cellules exprimant chaque marqueur, et l'intensité de la couleur représente le niveau d'expression moyen. (B) Visualisation UMAP des populations unicellulaires annotées, chaque couleur représentant un type cellulaire ou un groupe distinct. (C) Visualisation UMAP de l'expression des gènes marqueurs clés, montrant la distribution d'expression des gènes marqueurs pour les types cellulaires, incluant les cellules myéloïdes. (D) Graphique à barres empilées des proportions des groupes cellulaires selon les échantillons. (E) Visualisation UMAP de l'expression du gène MPO. (F) Tracé en violon montrant les métriques de contrôle qualité du séquençage unicellulaire. (G) Tracé de regroupement des gènes marqueurs clés. (H) DotPlot des gènes marqueurs canoniques au niveau du groupe. (I) Tracé en volcan des gènes modifiés dans l'analyse de sensibilité par inhibition virtuelle. (J) Nuage de points du déplacement en fonction de la significativité. (K) Tracé des flèches d'alignement de variété. (L) Analyse d'enrichissement des termes BP de l'ontologie génétique (GO) pour les gènes issus de la sortie d'inhibition virtuelle. (M) Analyse d'enrichissement des voies KEGG pour les gènes issus de la sortie d'inhibition virtuelle. (N) Les 20 gènes présentant le plus fort déplacement de variété après exclusion de MPO. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Analyses de survie supplémentaires pour MPO dans la cohorte TCGA-BRCA. (A,B) Ce fichier contient des analyses supplémentaires de survie de Kaplan-Meier pour (A) la survie globale et (B) la survie spécifique à la maladie, stratifiées selon le seuil médian d'expression tumorale de MPO. Ces analyses sont fournies comme analyses complémentaires des résultats de la Figure 2D et n'étaient pas statistiquement significatives dans la cohorte actuelle.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Annotation exploratoire des facteurs de transcription candidats pour MPO. (A) Diagramme de Venn montrant l'intersection des facteurs de transcription candidats provenant de trois ressources publiques sur les facteurs de transcription. (B) Résultats de la comparaison de l'expression de MYC. (C) Carte thermique des corrélations entre facteurs de transcription avec étiquettes de lignes et de colonnes. (D) Résultats de la corrélation entre MPO et MYC. (E) Résultats de l'analyse de survie pour MYC. (F) Résultats de la courbe ROC pour MYC. Les résultats liés à MYC sont présentés uniquement à titre d'annotations supplémentaires de facteurs de transcription candidats et ne servent pas à étayer des conclusions mécanistiques sur des régulateurs en amont.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Résultats exploratoires de la récupération de médicaments et de gènes à partir de DGIdb pour MPO. Les nœuds gris représentent le gène MPO, les nœuds orange représentent les entrées récupérées de petites molécules, et les lignes de connexion indiquent les relations médicament–gène prédites par la base de données.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : La matrice de signature des cellules immunitaires LM22 utilisée pour l'analyse de déconvolution des cellules immunitaires basée sur CIBERSORT portant sur 22 types de cellules immunitaires. Les symboles des gènes ont été harmonisés, les entrées en double ont été supprimées, et les gènes disponibles ont été croisés avec les matrices d'expression correspondantes de TCGA-BRCA ou de GSE161529 avant l'analyse en aval.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Liste des gènes liés aux neutrophiles utilisée pour l'analyse STRING/PPI, la priorisation des gènes centraux et l'analyse de corrélation entre MPO et les gènes centraux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 3 : Résultats exploratoires de la récupération de médicaments et de gènes via DGIdb et annotations ADMET pour MPO. Ce fichier contient les enregistrements d'interactions chimiques-gènes associés à MPO récupérés à partir de DGIdb, ainsi que des annotations au niveau des composés prédites pour les propriétés physicochimiques, pharmacocinétiques et liées à la toxicité. Ces résultats sont fournis uniquement comme annotations chimiques préliminaires et ne doivent pas être interprétés comme des listes de candidats thérapeutiques. Ils n'établissent ni l'inhibition de MPO, ni l'engagement de la cible, ni la spécificité ou la sélectivité du ligand, ni la sécurité, l'efficacité thérapeutique ou l'adéquation clinique. Les valeurs de ce tableau représentent les paramètres physicochimiques prédits et les caractéristiques de type médicament pour les composés listés. La masse moléculaire est exprimée en grammes par mole (g/mol). Les valeurs d'accepteurs et de donneurs de liaisons hydrogène indiquent respectivement les nombres prédits d'accepteurs et de donneurs de liaisons hydrogène. Le coefficient de partition octanol-eau de Moriguchi indique la lipophilie prédite. Les violations des règles de Lipinski indiquent le nombre de critères de la règle des cinq de Lipinski non satisfaits par chaque composé. Le score de biodisponibilité représente le score prédit lié à la biodisponibilité orale, et la surface polaire topologique fait référence à la surface polaire topologique prédite.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Liste des gènes associés à la MPO utilisée pour le calcul de signature unique cellule avec AUCell, Seurat AddModuleScore et ssGSEA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Résultats exploratoires d'annotation des facteurs de transcription et des miARN candidats pour MPO. Ce fichier contient des résultats d'annotation de facteurs de transcription candidats et de miARN issus de bases de données et basés sur des ressources publiques, notamment KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD et TargetScan. Ces annotations sont fournies uniquement à des fins d'exploration et de priorisation des candidats, et ne doivent pas être interprétées comme une preuve fonctionnelle d'une régulation en amont de MPO dans le cancer du sein.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette étude présente un ensemble de données publiques exploratoires et un flux de travail in silico pour examiner les associations entre l'expression de la MPO et les caractéristiques immunitaires/myéloïdes dans le cancer du sein. Les analyses TCGA-BRCA ont montré que l'expression de la MPO était plus faible dans les tissus tumoraux que dans les tissus non tumoraux adjacents, et qu'une expression plus élevée de la MPO était associée à un intervalle sans progression plus long. Toutefois, la survie globale et la survie spécifique liée à la maladie n'étaient pas statistiquement significatives. Par conséquent, la MPO ne doit pas être interprétée comme un biomarqueur pronostique solide ou établi selon les données actuelles. De futures études devraient évaluer la MPO à l'aide de modèles de régression de Cox multivariés ajustés pour des variables clinicopathologiques établies, de cohortes de validation indépendantes et d'analyses stratifiées par sous-type.

Par rapport à l'analyse différentielle classique sur un seul groupe ou à l'estimation de l'infiltration immunitaire basée sur une seule plateforme, ce flux de travail centré sur la MPO intègre la transcriptomique globale, l'enrichissement immunitaire, l'annotation des méthylation, la cartographie en cellule unique et la perturbation virtuelle afin de fournir une vue exploratoire plus large des caractéristiques immunitaires/myéloïdes associées à la MPO. Toutefois, ce flux de travail reste complémentaire, et non substitut, à la validation sur des cohortes externes, à la validation spatiale ou au niveau protéique, ainsi qu'aux tests expérimentaux de perturbation.

Les résultats concernant l'infiltration immunitaire et l'enrichissement doivent être interprétés comme un contexte immunitaire associé à la MPO plutôt qu’un remaniement immunitaire induit par la MPO. La MPO est principalement exprimée dans les neutrophiles et d'autres cellules de la lignée myéloïde³⁷. Par conséquent, des corrélations positives entre l'expression de la MPO et les scores ESTIMATE, les scores immunitaires, les scores d'enrichissement en cellules immunitaires, les gènes liés aux neutrophiles, les voies des cytokines, les signatures de présentation de l'antigène ou les voies de dégranulation des neutrophiles sont biologiquement plausibles et pourraient refléter en grande partie des différences dans l'abondance des cellules immunitaires/myéloïdes au sein des échantillons tumoraux globaux. Cette interprétation est conforme à des études antérieures montrant que l'infiltration de neutrophiles positifs pour la MPO est associée à un pronostic favorable dans le cancer du sein, et que la MPO a été impliquée dans la fonction des cellules dendritiques et dans l'inflammation tissulaire induite par les lymphocytes T^38,39. Les données de séquençage ARN en masse ne permettent pas de déterminer si la MPO possède une activité intrinsèque aux cellules tumorales ou si le signal observé reflète principalement des cellules immunitaires infiltrantes. Des jeux de données indépendants à l'échelle de la cellule unique, des profils spatiaux, une immunohistochimie, une cytométrie en flux ou des modèles expérimentaux basés sur des perturbations seraient nécessaires pour préciser l'origine cellulaire et la fonction de la MPO.

L'analyse à une cellule unique fournit des informations descriptives supplémentaires, mais reste limitée par la détection clairsemée de la MPO. Seulement 85 cellules positives à la MPO ont été initialement détectées avant l'expansion du voisinage basée sur les plus proches voisins (KNN). Bien que l'expansion KNN ait permis une analyse de sensibilité des cellules présentes dans le voisinage transcriptionnel local des cellules positives à la MPO, cette procédure pourrait inclure des cellules qui n'expriment pas directement la MPO. Par conséquent, les résultats du rejet virtuel scTenifoldKnk doivent être interprétés comme une analyse computationnelle exploratoire de sensibilité, et non comme une preuve de régulation des voies médiées par la MPO⁴⁰. Une validation sur des jeux de données indépendants de cancer du sein à une cellule unique et par des tests expérimentaux orthogonaux sera nécessaire avant de tirer des conclusions mécanistiques.

L'analyse des facteurs de transcription doit également être interprétée avec prudence. Le recoupement des prédictions de KnockTF, GTRD et ChIP-Atlas, suivi d'une priorisation basée sur le degré, peut permettre de proposer des facteurs de transcription candidats, mais ne permet pas d'établir une régulation transcriptionnelle fonctionnelle de MPO dans le cancer du sein. Les facteurs MYC et d'autres candidats ont donc été conservés uniquement comme annotations exploratoires. Étant donné que l'activité des facteurs de transcription est fortement dépendante du contexte et peut varier selon le sous-type tumoral, la composition cellulaire, la plateforme d'essai et la stratégie de prétraitement, une validation spécifique au contexte serait nécessaire avant d'attribuer à un facteur candidat un rôle régulateur en amont. Une telle validation devrait inclure des expériences de ChIP-qPCR ou de ChIP-séquençage, des tests de promoteur rapporteur, ainsi que des perturbations du facteur de transcription suivies d'une mesure de l'expression de MPO.

La récupération des interactions médicament–gène et l'annotation ADMET doivent également être interprétées avec prudence. DGIdb peut renvoyer des associations hétérogènes entre composés chimiques et gènes, y compris des composés qui ne sont pas des ligands sélectifs de la MPO et qui peuvent présenter une plausibilité clinique limitée ou des propriétés toxicologiques défavorables³⁶. Les prédictions ADMET fournissent des annotations chimiques préliminaires, mais n'établissent pas l'engagement du cible, la puissance, la sélectivité, la sécurité ou l'efficacité thérapeutique⁴¹. Par conséquent, les résultats actuels au niveau des composés ne doivent pas être utilisés pour en déduire un potentiel thérapeutique. Une évaluation translationnelle significative nécessiterait un ensemble soigneusement sélectionné d'inhibiteurs ou de sondes de la MPO pharmacologiquement pertinents, une comparaison avec des composés ciblant la MPO déjà établis, ainsi qu'une validation à l'aide de tests biochimiques, cellulaires et pharmacologiques. Le rôle contextuel et potentiellement double de la MPO dans le cancer doit également être pris en compte lors de l'interprétation des résultats liés aux médicaments. La MPO peut contribuer à des processus favorisant la tumeur par le stress oxydatif, la production d'oxydants réactifs, les lésions de l'ADN, l'inflammation chronique et la remodélisation du microenvironnement tumoral. En même temps, l'expression de la MPO dans des jeux de données tumoraux globaux peut refléter une infiltration par des neutrophiles ou d'autres cellules immunitaires myéloïdes, qui, dans certains contextes, peuvent être associées à un microenvironnement immunitaire actif et à des résultats cliniques plus favorables^39,42. L'interprétation biologique de la MPO dépend donc du type de tumeur, de la source cellulaire, du stade de la maladie et de la composition en cellules immunitaires.

Les résultats relatifs à la méthylation de l'ADN au niveau du locus MPO ont également été considérés comme exploratoires. Certains sites CpG sélectionnés ont montré des associations avec la survie dans l'analyse MethSurv, mais ces résultats nécessitent une validation indépendante avant que des conclusions pronostiques ou mécanistiques puissent être tirées. La régulation épigénétique de MPO pourrait interagir avec la liaison des facteurs de transcription et la régulation au niveau de la chromatine, mais de telles interactions restent spéculatives en l'absence de données fonctionnelles sur la chromatine ou de données d'interférence⁴³.

Les implications cliniques de l'expression de la MPO doivent être interprétées avec prudence. Les résultats actuels n'établissent pas la MPO comme un biomarqueur cliniquement exploitable ni comme un marqueur pouvant actuellement orienter les décisions concernant l'immunothérapie dans le cancer du sein. Plutôt, la MPO pourrait refléter un contexte immunitaire lié aux myéloïdes/neutrophiles au sein du microenvironnement tumoral. Dans des études futures, l'expression de la MPO pourrait être évaluée conjointement avec des marqueurs établis liés à l'immunothérapie, notamment les lymphocytes infiltrant la tumeur, l'expression de PD-L1, l'expression des gènes des points de contrôle immunitaire, le sous-type moléculaire et les signatures immunitaires validées. Ces analyses devraient inclure des cohortes indépendantes, des modèles multivariés et des jeux de données sur la réponse au traitement avant que la MPO puisse être envisagée pour la stratification des patients ou la prise de décision en matière d'immunothérapie.

Plusieurs étapes du flux de travail sont essentielles pour la reproductibilité, notamment le prétraitement cohérent des données TCGA-BRCA, le regroupement basé sur la médiane en mode tumeur seule (MPO-élevé/MPO-faible), les seuils statistiques prédéfinis et la correction pour tests multiples, les algorithmes d'enrichissement des cellules immunitaires et les jeux de signatures, le contrôle qualité et l'annotation des cellules uniques, l'expansion du voisinage MPO basée sur les plus proches voisins (KNN), ainsi que le traitement exploratoire des résultats de l'extinction virtuelle et des données DGIdb/ADMET. Des modifications apportées à ces paramètres peuvent influencer les résultats ultérieurs et leur interprétation ; ils doivent donc être rapportés et reproduits avec soin. En cas de problème, les résultats incohérents doivent être examinés en vérifiant la source des échantillons, la normalisation de l'expression, le seuil de regroupement, la correction pour tests multiples, les jeux de signatures des cellules immunitaires, le contrôle qualité et l'annotation des cellules uniques, la définition du voisinage KNN, les seuils d'extinction virtuelle, les seuils d'enrichissement et les enregistrements hétérogènes de composés dans DGIdb/ADMET.

Plusieurs limites de cette étude doivent être reconnues. Premièrement, cette étude reposait sur des analyses rétrospectives de bases de données publiques utilisant TCGA-BRCA et des données unicellulaires accessibles publiquement, et pouvait donc être influencée par l'hétérogénéité des cohortes, les différences de source des échantillons, les effets de lot, l'annotation clinique incomplète et les différences de composition tumorale. Deuxièmement, les résultats actuels découlent principalement d'associations transcriptomiques et d'analyses in silico, et manquent de validation expérimentale directe. Par conséquent, les associations observées entre l'expression de MPO, les caractéristiques immunitaires/myéloïdes, les annotations de méthylation, les candidats de facteurs de transcription et les résultats de coupure virtuelle ne doivent pas être interprétées comme des mécanismes causaux. Troisièmement, la détection de MPO dans le jeu de données unicellulaire était peu abondante, avec seulement 85 cellules positives pour MPO détectées avant l'expansion du voisinage basée sur les K plus proches voisins (KNN). Le sous-ensemble élargi du voisinage de MPO pourrait inclure des cellules présentant une expression de MPO faible ou indétectable et ne doit pas être considéré comme une population purement positive pour MPO. Quatrièmement, comme MPO est principalement associée aux neutrophiles et à d'autres cellules de lignée myéloïde, les signaux liés à MPO dans les données de séquençage ARN en masse pourraient être biaisés par l'abondance des cellules immunitaires, la pureté tumorale et la composition cellulaire, plutôt que de refléter une activité intrinsèque aux cellules tumorales. Enfin, la récupération de médicaments et gènes basée sur DGIdb et l'annotation ADMET constituaient uniquement des annotations chimiques exploratoires. Ces résultats n'établissent pas l'inhibition de MPO, l'engagement de la cible, la sélectivité, la sécurité, l'efficacité thérapeutique ou l'adéquation clinique. Des études futures utilisant des cohortes indépendantes, une validation spatiale ou au niveau protéique, ainsi que des expériences fonctionnelles, sont nécessaires pour confirmer la pertinence biologique et clinique de ces résultats.

En résumé, les analyses des jeux de données publics actuels soutiennent une association entre l'expression de la MPO et les caractéristiques transcriptionnelles immunitaires/myéloïdes dans le cancer du sein, une expression plus élevée de la MPO étant associée à un intervalle sans progression plus long dans la cohorte analysée. Ces résultats restent exploratoires et génératifs d'hypothèses. Ils n'établissent pas que la MPO régule de façon causale le microenvironnement immunitaire tumoral, que MYC régule fonctionnellement la MPO, ou que les composés identifiés présentent une pertinence thérapeutique. Les principales contributions de cette étude sont un flux de travail computationnel reproductible et un ensemble d'hypothèses testables nécessitant une validation sur une cohorte externe et une confirmation expérimentale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CellChat	R package/Open source	https://github.com/sqjin/CellChat	Analyse des communications entre cellules
ChIP-Atlas	Base de données publique	https://chip-atlas.org/	Recherche de cibles de facteurs de transcription ; mise à jour 2021
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Analyse d'enrichissement GO/KEGG ; v4.4.4
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	Visualisation des réseaux et analyse de la topologie
DGIdb	Washington University/Base de données publique	https://www.dgidb.org/	Récupération des interactions médicament-gène
GDC/TCGA-BRCA	National Cancer Institute	https://portal.gdc.cancer.gov/	Source de données transcriptomiques globales et cliniques
Gene Expression Omnibus : GSE161529	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/	Source de jeux de données unicellulaires
GSEA/MSigDB	Broad Institute	https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb	Analyse d'enrichissement de jeux de gènes et référence de jeux de gènes ; Version 3.0
GSVA	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/GSVA/	Évaluation de la variation des jeux de gènes et scores liés à ssGSEA ; Version 1.46.0
GTRD	Base de données publique	http://gtrd.biouml.org/	Recherche de cibles de facteurs de transcription ; 2021
KnockTF	Base de données publique	http://www.licpathway.net/KnockTF/index.html	Ressource pour l'altération des facteurs de transcription ; Version 2.0
R	R Foundation for Statistical Computing	https://www.r-project.org/	Environnement de calcul statistique
scTenifoldKnk	R package/Open source	https://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnk	Analyse de coupure virtuelle
Seurat	R package/Open source	https://satijalab.org/seurat/	Prétraitement et regroupement des données unicellulaires
STRING	ELIXIR/Base de données publique	https://string-db.org/	Analyse des interactions protéine-protéine ; v11
SwissADME	SIB Swiss Institute of Bioinformatics	http://www.swissadme.ch/	Évaluation du caractère médicamenteux ; version 2017/outil web
TIMER	Ressource web publique	https://timer.cistrome.org/	Analyse de l'infiltration immunitaire ; TIMER2.0
UCSC Xena ou portail TCGA associé	UCSC	https://xenabrowser.net/	Accès exploratoire aux données/validation