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Une seule dose intraveineuse de brucella atténuée productrice d’indole chez des souris NOD : évaluation de l’apparition du diabète de type 1 et remodelage immunitaire des îlots

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DOI :

10.3791/71193

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26 mai 2026

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1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A'M University Health Science Center, 2Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine ' Biomedical Sciences, Texas A'M University, 3Bond Life Sciences Center, The University of Missouri

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’administration intraveineuse d’une souche atténuée de Brucella melitensis productrice d’indole à des souris NOD/ShiLtJ, suivie d’un suivi longitudinal du diabète, d’une histologie pancréatique et d’une protéomique spatiale à haute plex et d’un séquençage d’ARN unicellulaire optionnel pour évaluer la reprogrammation immunitaire des îlots.

Résumé

Le diabète de type 1 (DT1) résulte de la destruction auto-immune des cellules β pancréatiques, et les traitements actuels ne parviennent pas à rétablir une tolérance immunitaire durable. Les bactéries métaboliquement modifiées produisant des métabolites immunomodulateurs représentent une stratégie thérapeutique prometteuse à dose unique. Ici, cet article présente un protocole complet dans lequel une seule administration intraveineuse d’une souche atténuée produite d’indole produit par Brucella melitensis , BmΔvjbR ::tnaA, est utilisée pour évaluer les effets sur l’apparition du diabète auto-immun chez des souris prédiabétiques NOD/ShiLtJ.

Le protocole commence par la préparation de BmΔvjbR ::tnaA à partir de stocks de glycérol congelés, la croissance en milieu sélectif jusqu’à la phase mi-logarithmique, et le calcul des unités formant des colonies en fonction de la densité optique. Les souris femelles NOD, âgées de <5 semaines, sont retenues sans anesthésie et injectées par voie intraveineuse via une veine latérale de la queue avec une dose bactérienne définie dans un sérum physiologique tamponné phosphate, tout en étant maintenues sur des coussins chauffants. La glycémie est surveillée deux fois par semaine après un jeûne de 2 heures pendant 70 à 105 jours, le diabète étant défini comme glucose ≥250 mg/dL sur deux lectures consécutives. Aux extrémités expérimentales, le pancréas prélevé est fixé dans du formol tampon neutre pendant 72 heures, intégré dans la paraffine, puis sectionné pour la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine, l’immunohistochimie de l’insuline et la quantification totale de la surface des îlots. Des sections fixées au formol dans la paraffine sont soumises à la protéomique spatiale avec un panel d’anticorps à 25 marqueurs afin de visualiser les populations régulatrices et immunitaires aux effecteurs. Enfin, le tissu pancréatique frais subit une isolation unicellulaire, une préparation par bibliothèque 3′, un séquençage et une analyse bioinformatique basée sur Seurat afin de profiler les changements transcriptionnels à travers les populations immunitaires et stromales.

Ce protocole intégré permet la délivrance reproductible d’une thérapie bactérienne à dose unique et la caractérisation multimodale du remodelage immunitaire des îlots, fournissant un cadre pour tester des microbes métabolites dans des modèles auto-immuns et disséquer les mécanismes immunitaires spécifiques aux tissus à résolution unicellulaire.

Introduction

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune chronique caractérisée par la destruction immunitaire des cellules β pancréatiques productrices d’insuline, entraînant une dépendance à l’insuline à vie et un risque accru de complicationsvasculaires 1. La souris NOD/ShiLtJ reprend des caractéristiques clés du diabète auto-immun humain, notamment l’insulite spontanée et la progression vers un diabète manifeste, et est largement utilisée comme modèle préclinique pour des études mécanistiques etthérapeutiques 1,2,3. Les thérapies actuelles pour le DT1 — y compris les immunosuppresseurs, les anticorps monoclonaux et les thérapies adoptives régulatrices par cellules T (Treg) — peuvent ralentir temporairement la progression de la maladie mais échouent souvent à rétablir durablement la tolérance immunitaire ni à assurer une préservation soutenue de la masse cellulaireβ 1,2,4,5,6,7,8,9,10. 11.

Cibler les Tregs et d’autres populations régulatrices est un axe majeur des thérapies émergentes pour le DT1, notamment les perfusions autologues polyclonales de Treg, les Tregs spécifiques aux antigènes modifiés et les schémas basés surl’IL-2 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11 . Cependant, un microenvironnement pro-inflammatoire au sein des îlots pancréatiques peut compromettre l’efficacité de ces approches, soulignant la nécessité de reprogrammer localement les réseaux immunitaires résidents dans lestissus 2,7. Les métabolites du tryptophane d’origine microbienne, en particulier l’indole et les composés apparentés, peuvent moduler à la fois l’immunité innée et adaptative en favorisant la différenciation régulatrice des lymphocytes T, en induisant la polarisation anti-inflammatoire des macrophages et en supprimant les réponses Th1712,13. Les thérapies microbiennes vivantes et les bactéries métaboliquement modifiées représentent donc une stratégie prometteuse pour délivrer des métabolites immunomodulateurs in situ et remodeler l’immunitétissulaire 12,13,14,15,16,17,18.

Nous avions précédemment développé une souche métaboliquement modifiée de Brucella melitensis, BmΔvjbR ::tnaA, qui produit constitutivement l’indole et contrôle l’arthrite auto-immune en dégrandissant les Tregs et en remodelant les microenvironnements inflammatoires 14,15,16. Les souches atténuées de Brucella telles que BmΔvjbR ont été largement caractérisées comme plateformes vaccinales et peuvent être génétiquement modifiées pour transporter des charges utilesimmunorégulatrices 14,15,16.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour évaluer une dose intraveineuse unique de BmΔvjbR ::tnaA dans le modèle NOD/ShiLtJ, incluant la préparation bactérienne, l’administration intraveineuse standardisée, la surveillance du diabète et l’analyse multimodale du tissu pancréatique par histologie, la protéomique spatiale à haute plexe et l’ARN-seq unicellulaire. Ce flux de travail fournit un cadre pratique pour tester les microbes métabolites modifiés sous forme d’immunothérapies à dose unique dans l’auto-immunité spécifique aux organes. Une analyse dose-réponse antérieure a démontré la sécurité et la tolérabilité jusqu’à 1 × 1010 UFC de la souche atténuée.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été menées conformément strictement aux directives éthiques et approuvées par le Comité Institutionnel de Soins et d’Utilisation des Animaux (IACUC) de l’Université Texas A&M (Numéro de protocole : 2021-0123).

1. Préparation et caractérisation de BmΔvjbR ::tnaA

  1. Antécédents et stockage des souches bactériennes
    REMARQUE : BmΔvjbR ::tnaA est dérivé de Brucella melitensis 16M avec délétion du régulateur de virulence vjbR et insertion du gène Escherichia coli tnaA pour la production constitutive d’indole, comme décritprécédemment 14,15,16.
    1. Maintenir des stocks de glycérol à −80 °C avec 20 % de glycérol.
  2. Culture bactérienne sur agar sélectif
    1. Récupérez un stock de glycérol congelé dans un stockage à −80 °C. Tracez 10–20 μL sur des plaques d’agar de soja tryptique (TSA) complétées de chloramphénicole (25–30 μg/mL).
    2. Incuber les plaques à 37 °C dans des conditions de CO₂ ambiant pendant 48 à 72 heures jusqu’à ce que les colonies individuelles (2 à 3 mm de diamètre) soient visibles.
      ATTENTION : Le travail avec les souches de Brucella nécessite des installations de niveau de biosécurité appropriées (minimum BSL2). Suivez les protocoles de biosécurité institutionnels et les autorisations requises.
  3. Préparation en culture liquide
    1. Choisissez une plaque TSA neuve (≤ 1 semaine). Choisissez 2 à 3 colonies isolées en utilisant une boucle stérile.
    2. Inoculez dans 10 mL de bouillon de soja tryptique (TSB) complétés de chloramphénicole (25–30 μg/mL) dans un tube stérile de 15 mL. Incuber à 37 °C avec secouement à 250 tr/min dans des conditions de CO₂ ambiant.
      REMARQUE : Pour l’échelle, utilisez une fiole Erlenmeyer déflectrice de 250 mL.
  4. Surveillance de la croissance et récolte
    1. Blanchissez le spectrophotomètre avec un TSB stérile complété au chloramphénicol.
    2. Mesurez OD₆₀₀ toutes les 2 à 3 heures.
    3. Poursuivre l’incubation jusqu’à ce que OD₆₀₀ atteigne 2,0 ± 0,2 (environ 18 à 24 heures).
      ÉTAPE CRITIQUE : Récolte à OD₆₀₀ = 2,0 ± 0,2 pour une concentration bactérienne et une viabilité constantes.
      REMARQUE : Dans ces conditions, OD₆₀₀ ≈ 2.0 correspond à la phase logarithiste moyenne à tardive.
  5. Estimation de la CFU
    1. Estimez la concentration bactérienne en utilisant la relation suivante :
      OD₆₀₀ = 1 correspond à 5 × 109 CFU/mL.
      REMARQUE : Une culture de 10 mL à OD₆₀₀ = 2,0 contient environ 1 × 1011 UAC.
    2. OPTIONNEL : Préparez des dilutions en série 10 fois (10⁻6 à 10⁻9) dans des PBS stériles. Plaque 100 μL sur TSA complétée de chloramphénicol. Incuber à 37 °C pendant 48 à 72 heures. Comptez les colonies pour confirmer l’EFC.
  6. Récolte et concentration bactérienne
    1. Transférez la culture de 10 mL dans un tube conique stérile de 15 mL.
    2. Centrifugeuse à 3 000–4 000 × g pendant 10 minutes à température ambiante.
    3. Aspirez soigneusement et jetez le surnageant sans déranger la pellete.
  7. Resuspension pour injection
    1. Ajoutez 1 mL de solution stérile 1× phosphate tamponée (PBS, pH 7,4) stérile et sans endotoxines au pellet bactérien. Résuspendez doucement en pipettant 10 à 15 fois jusqu’à obtenir une suspension homogène sans amas visibles.
      REMARQUE : La concentration finale est d’environ 1 × 1011 UFC/mL.
  8. Stockage et utilisation
    1. Gardez la suspension bactérienne sur de la glace dans un tube fermé. Utilisez la suspension pour les injections intraveineuses dans les 4 heures suivant la préparation.
      REMARQUE : Ne pas congeler ni stocker toute la nuit, car la viabilité bactérienne diminue.
      POINT DE PAUSE : Les bactéries peuvent être retenues sur la glace jusqu’à 4 heures ; Une utilisation le jour même est recommandée.

2. Acquisition, logement et préparation de souris NOD/ShiLtJ

  1. Obtenez des souris NOD/ShiLtJ femelles. Acclimatez les souris pendant au moins 7 jours avant l’expérimentation.
    REMARQUE : Utilisez des souris femelles en raison d’une incidence plus élevée et plus constante du diabète.
  2. Les souris d’intérieur dans des cages ventilées individuellement dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes. Maintenez jusqu’à cinq souris par cage.
  3. Fournissez de la litière, de l’enrichissement environnemental, de la nourriture et de l’eau à volonté de jeu. Maintenez la température entre 20 et 24 °C, l’humidité entre 40 et 60 %, et un cycle clair/obscurité de 12 heures.
  4. Utilisez des souris de moins de 5 semaines. Enregistrez le poids corporel de base.
  5. Randomisez les souris au niveau de la cage dans les groupes de traitement et de témoins. Attribuez des identifiants uniques (badge d’oreille ou tatouage sur la queue) à chaque souris.
    REMARQUE : Tenez un registre maître de toutes les souris et des affectations de groupe.
  6. Transférez les cages dans la salle de procédure au moins 30 minutes avant l’injection. Placez les cages sur des coussins chauffants réglés à 37–40 °C pour favoriser la dilatation des veines caudales.

3. Administration intraveineuse via la veine latérale de la queue

  1. En utilisant une technique stérile, prélever 100 μL de la suspension bactérienne dans des seringues d’insuline stériles (29G–30G). Étiquetez chaque seringue avec l’identifiant de souris correspondant.
  2. Préparez des seringues témoins contenant 100 μL de PBS stérile.
    REMARQUE : Préparez les seringues immédiatement avant l’injection.
  3. Placez chaque souris dans un dispositif de retenue, permettant d’accéder à la queue.
    REMARQUE : N’utilisez pas d’anesthésie pour les injections dans la veine caudale.
  4. Essuyez la queue avec de l’éthanol à 70 % et laissez sécher à l’air.
  5. Visualisez les veines latérales de la queue sous un éclairage adéquat.
    ASTUCE : Réchauffez la queue si les veines ne sont pas visibles.
  6. Maintenez le tiers distal de la queue avec une légère tension. Insérez l’aiguille en biseau vers le haut à un faible angle (10–15°) dans la veine latérale.
  7. Injectez lentement 100 μL sur 5 à 10 s. Retirez l’aiguille et appliquez une pression légère avec une gaze stérile.
    ÉTAPE CRITIQUE : Confirmez la réussite de l’injection intraveineuse en l’absence de résistance, de gonflement ou de blanchiment.
  8. Ramenez la souris dans sa cage sur un coussin chauffant. Observez pendant 5 à 10 minutes pour détecter des signes de détresse. Notez tout événement indésirable.
  9. Effectuez des injections sur toutes les souris dans un ordre aléatoire dans une fenêtre de 2 heures.

4. Surveillance de la glycémie et définition du diabète

  1. Commencez la surveillance de la glycémie 7 jours après l’injection. Mesurez la glycémie deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude.
  2. Retirez la nourriture 2 heures avant la mesure tout en maintenant l’accès à l’eau.
  3. Attachez la souris. Nettoyez la pointe de la queue avec 70 % d’éthanol.
  4. Égratignez la queue avec une lanceur ou une aiguille stérile. Jetez la première goutte de sang. Récupérez la deuxième goutte sur une bandelette de test de glucomètre. Notez les valeurs de glucose sanguin ainsi que l’identification et la date de la souris.
    REMARQUE : Utilisez un nouveau site si la pointe de la queue devient cicatrisée.
  5. Définissez le diabète comme une glycémie ≥ 250 mg/dL sur deux mesures consécutives séparées d’au moins 24 heures.
  6. Euthanasiez les souris présentant des signes graves de la maladie selon les directives institutionnelles.

5. Récolte, fixation et transformation du pancréas

  1. Euthanasiez les souris selon des protocoles approuvés. Disséquez et collectez soigneusement le pancréas, y compris tous les lobes.
  2. Placez le pancréas dans un formol neutre tamponné à 10 % avec un rapport fixateur/volume tissulaire minimum de 10:1. Fixe pour 72 h à température ambiante.
    ATTENTION : Manipulez le formol dans une hotte chimique avec des EPI appropriés.
  3. Transférez les tissus à 70 % d’éthanol après fixation.
  4. Soumettre les tissus fixes à une installation centrale d’histologie pour l’incorporation de paraffine, le coupement à 5 μm d’épaisseur sur des lames chargées positivement, la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine, ainsi que l’immunohistochimie de l’insuline.
    REMARQUE : Demandez des sections non colorées si des analyses supplémentaires en aval sont prévues.

6. Évaluation histologique et quantification de la surface des îlots

  1. Acquérez des images de lames entières à l’aide d’un scanner ou d’un microscope de lames.
  2. Ouvrez les images dans le logiciel référencé. Annoter manuellement les îlots avec les outils appropriés.
  3. Mesurez la surface des îlots à l’aide d’outils d’annotation.
  4. Mesures d’exportation pour analyse.
    REMARQUE : La surface totale des îlots comprend des cellules endocrines et infiltrantes.

7. Diverses analyses en aval

  1. Calculez la surface moyenne des îlots par souris. Comparez les groupes à l’aide de tests statistiques appropriés.
  2. Optionnel : Analyse de la protéomique spatiale (voir Tableau Supplémentaire S1)
    1. Préparez les sections FFPE sur des lames chargées positivement. Soumettez des échantillons à un prestataire de services de protéomique spatiale. Fournir les spécifications des panneaux d’anticorps.
  3. Optionnel : séquençage de l’ARN unicellulaire (voir Tableau Supplémentaire S2)
    1. Récoltez le pancréas et placez-le dans un milieu froid.
    2. Soumettre des échantillons à un centre central de génomique pour l’isolation unicellulaire et la préparation de la bibliothèque.
    3. Traiter les données de séquençage à l’aide de pipelines appropriés (par exemple, Cell Ranger, Seurat).
    4. Déposez les données de séquençage dans un dépôt public avant publication.

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Résultats

Bien que le protocole plus large décrit dans ce manuscrit ait depuis été optimisé en un schéma préventif à dose unique, ces résultats pilotes sont présentés ici uniquement pour illustrer les relevés histologiques et glycémiques attendus avec ce flux de travail.

Le contexte global de la maladie et le contraste entre le pancréas diabétique sain et le pancréas diabétique de type 1 sont illustrés de manière schématique à la Figure 1A....

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Discussion

Une limitation cruciale des résultats représentatifs présentés ici est que les données fournies pour illustrer les critères analytiques (Figure 3) proviennent d’une cohorte pilote précoce utilisant un calendrier de deux doses. Parce que ce protocole a été affiné pour devenir un schéma préventif à dose unique, de futures études à plus grande échelle utilisant le protocole optimisé à dose unique décrit ici sont nécessaires pour établir une efficacité statistiq...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health R01CA273002 et R21AI167793 à J.S. et P.D.F., ainsi que par une bourse du NIH Institutional National Research Service (T32) soutenant les K.D. Nous remercions le Texas A&M University Health Science Center pour son soutien institutionnel. Nous remercions le Dr Yava Jones-Hall pour les évaluations en histopathologie aveugle, le laboratoire Song pour le soutien technique des pilotes et des animaux, le Texas A&M Institute for Genome Sciences & Society (TIGSS) Molecular Genomics Workspace pour la préparation et le séquençage de la bibliothèque d’ARN à séquence d’ARN unicellulaire, le TIGSS Bioinformatics Core pour l’analyse et l’interprétation des données, et Akoya Biosciences pour les services de protéomique spatiale. Nous remercions le soutien du Texas A&M Institute for Genome Sciences & Society (TIGSS) Bioinformatics Core (TBC) pour leur assistance.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Formol tamponné neutre à 10 % (NBF)VWR10790-714
Contrôleur Chromium 10x GenomicsEspace de travail en génomique moléculaire TIGSS, Texas A & Université M
70 % d’éthanolVWR89125-164
Lames de microscope adhésif pour le FFPELeica Biosystems3800084E
Analyse d’anticorps FFPE de souris Akoya (~25 marqueurs)Akoya Biosciences[ID de panneau/panneau personnalisé]
Bioanalyseur ou TapeStation avec kits ADN HSEspace de travail en génomique moléculaire TIGSS, Texas A & M/ Agilent
Bm&Delta ; Souche bactérienne vjbR ::tnaAMatériel de laboratoire (laboratoires Song/de Figueiredo)
Pipeline Cell RangerGénomique 10xv7.1
ChloramphénicolProduits de recherche International56-75-7
Kit Chromium Next GEM Single Cell 3'10x Génomique via le cœur TIGSS
Colagnase issue de Clostridium histolyticumMillipore SigmaC7657-100MG
Coloration nucléaire DAPIAkoya Biosciences[Service fourni]
Embedding FFPE, H& Coloration E, IHC à l’insuline et scan sur lamesLaboratoire d’histologie VMBS, Texas A & Université Mhttps://vetmed.tamu.edu/vmbs-histology-lab/
Bandes testeuses de glucoseEKF Diagnostics / Fisher Scientific22-022-649
Bandes de test de glucose (alternatives)Ascensia Diabetes CareBandes de test CONTOUR NEXT
Glycérol (en vrac, 500 mL)Millipore SigmaG7893-500ML
Glycérol (stérile, 100 mL)Sigma Aldrich (G Biosciences)G5516-100ml
GraphPad Prism (ou package survie R)Logiciel GraphPad / Rv10.2
Glucomètre portatifAscensia Diabetes CareCONTOUR NEXT EZ
Séquenceur Illumina NextSeq 2000Espace de travail en génomique moléculaire TIGSS, Texas A & Université M
Seringues à insuline, 29 et n ; 30 G (U-100)VWR10002-702
Lancets pour le dépistage du diabèteBecton, Dickinson and Company (BD)366594
Libérase TL Grade de rechercheMillipore Sigma5401020001
Coussins chauffants basse températureScience de la conduiteRWD-69025
Kit d’isolation des noyaux/cellules MiltenyiEspace de travail en génomique moléculaire TIGSS, Texas A & M/ Miltenyi Biotec
Tapis chauffant pour souris (alternatif)Kent ScientificRightTemp
Restreintes pour sourisBraintree ScientificTV-ROUGE 150-STD
Souris NOD/ShiLtJ (femelle, 5 semaines)Le laboratoire JacksonSouche #001976
Kit de cellules de débit P2 XLEAP 100 cyclesIllumina via le cœur TIGSS
Acquisition de données PhenoCycler et service QCAkoya Biosciences
Réactifs PhenoCycler et flux de travail d’imagerieAkoya Biosciences[Service fourni]
Système PhenoCycler-FusionAkoya Biosciences
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS), 1xThermo Fisher10010023
Inhibiteur de RNase protecteurMillipore Sigma3335402001
Fluoromètre Qubit et kit dsDNA HSEspace de travail en génomique moléculaire TIGSS, Texas A & M/ Thermo Fisher
QuPathOpen sourcev0.4.3
Logiciel RProjet Rv4.0+
Seurat (paquet R)Satija Lab / CRANv4.3
StarDistOpen sourcev0.8.3
Agar de soja à tryptone (TSA)VWRCA90002-706

Références

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Mots-clés

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