Ce protocole présente une approche d’échocardiographie transthoracique basée sur le Doppler chez la souris pour une évaluation reproductible de la fonction systolique et des indices diastoliens conventionnels.
Article de méthode
Échocardiographie Doppler pour l’évaluation de la fonction diastolique chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’insuffisance cardiaque (IC) est un fardeau majeur pour la santé mondiale caractérisé par une altération de la fonction cardiaque. Elle peut résulter d’une fonction systolique réduite ou d’une relaxation diastolique anormale, comme en cas d’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF). Des modèles précliniques fiables et des outils quantitatifs sont essentiels pour étudier les mécanismes de la maladie et les interventions thérapeutiques. L’échocardiographie transthoracique est une modalité d’imagerie non invasive largement utilisée pour mesurer la structure et la fonction cardiaques dans des modèles murins. Ce protocole décrit une méthode standardisée pour réaliser une échocardiographie à haute résolution basée sur Doppler chez des souris utilisant des transducteurs à haute fréquence (30–40 MHz) sous anesthésie inhalée. Les animaux sont placés sur une plateforme à température contrôlée avec un suivi continu du rythme cardiaque, de la respiration et de la température corporelle afin d’assurer la stabilité physiologique. Le flux de travail comprend l’acquisition de Doppler en mode B, M, Doppler à ondes pulsées, Doppler couleur et imagerie Doppler tissulaire pour évaluer la structure du ventricule gauche, la performance systolique et les indices diastoliens conventionnels. L’analyse hors ligne est réalisée à l’aide de mesures à l’aveugle moyennées sur plusieurs cycles cardiaques. Cette méthode permet une évaluation reproductible de la fonction cardiaque et convient aux études longitudinales sur des modèles murins de maladies cardiovasculaires.
Introduction
L’insuffisance cardiaque (IC) touche plus de 64 millions de personnes dans le monde et reste une cause majeure de morbidité et demortalité 1,2. Elle est cliniquement classée en insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection réduite (HFrEF), fraction d’éjection légèrement réduite (HFmrEF) et fraction d’éjection préservée (HFpEF)3,4. La prévalence croissante de la HFpEF et l’absence de thérapies ciblées soulignent la nécessité de modèles précliniques robustes et de méthodes quantitatives pour le phénotypagecardiaque 5. Une caractéristique centrale de la HFpEF est une fonction diastolique altérée, soulignant l’importance d’outils fiables pour évaluer la relaxation ventriculaire et la dynamique de remplissage dans les systèmes expérimentaux.
Les modèles murines sont largement utilisés pour étudier les maladies cardiovasculaires, notamment la surcharge de pression, les lésions ischémiques et les modèles pharmacologiques, et sont susceptibles de modifiergénétiquement 6,7. Une évaluation précise et reproductible de la fonction cardiaque est essentielle dans cesmodèles 8,9. L’échocardiographie transthoracique offre une méthode non invasive, rapide et reproductible, susceptible de répéter des mesures pour documenter l’évolution de la maladie et sa réponse à des interventions thérapeutiques potentiellement, avec la capacité d’évaluer la structure et la fonction cardiaques in vivo10. Elle a l’avantage supplémentaire d’éliminer l’exposition aux radiations pour les chercheurs ou les animaux étudiés, ce qui pourrait compromettre les résultats expérimentaux.
L’objectif principal de ce manuscrit est de fournir une approche standardisée et reproductible pour évaluer la fonction diastolique du ventricule gauche chez la souris à l’aide d’une échocardiographie Doppler. Ce protocole intègre des mesures conventionnelles d’entrée transmissoire et l’imagerie Doppler tissulaire pour quantifier des paramètres tels que les rapports E/A et E/e′, qui servent de marqueurs de relaxation ventriculaire et de pressions de remplissage. En permettant une évaluation longitudinale sur le même animal, cette technique facilite l’étude de la progression de la maladie et des réponses thérapeutiques dans les modèles précliniques d’insuffisance cardiaque.
La raison d’être du développement et de l’utilisation généralisée de l’échocardiographie Doppler dans les études murines réside dans sa capacité à combler les lacunes translationnelles entre les modèles précliniques et la cardiologie clinique. Bien que les mesures hémodynamiques invasives restent la référence absolue, leur caractère terminal empêche l’utilisation dans les études en série. L’échocardiographie Doppler, adaptée de la pratique clinique, permet aux chercheurs d’obtenir des indices physiologiquement pertinents de la fonction diastolique de manière minimalement invasive. Les avancées des systèmes d’échographie à haute fréquence ont encore amélioré la résolution spatiale et temporelle, permettant une capture précise des cycles cardiaques murins rapides pour une analysequantitative 11.
Les techniques alternatives, telles que l’imagerie par résonance magnétique cardiaque, sont coûteuses, longues et ont une disponibilité limitée, rendant les études répétées impraticables. L’analyse des boucles pression-volume, bien que considérée comme la référence pour évaluer la fonction diastolique, est invasive, techniquement exigeante et généralement une procédure terminale. En revanche, l’échocardiographie offre un équilibre pratique entre précision et faisabilité, en faisant la modalité la plus accessible pour le phénotypage longitudinal chez les petits animaux. Comparées aux approches émergentes telles que l’imagerie de souche par suivi de taches ou l’analyse fonctionnelle de l’atrie gauche, les méthodes conventionnelles basées sur le Doppler nécessitent moins d’expertise spécialisée et sont plus facilement mises en œuvre en laboratoire, améliorant la reproductibilité et la comparabilité des résultats. Par conséquent, cette méthode offre une approche robuste, accessible et transférable pour évaluer la fonction diastolique dans les modèles murins, en particulier dans la HFpEF ou dysfonction cardiaque en débutde phase 12,13.
Protocole
Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC : Approbation n° A00007272-23-R26) et menées conformément aux directives institutionnelles et nationales. Un total de 8 souris témoins C57BL/6NJ ont été utilisées dans cette étude. L’anesthésie à l’isoflurane a été administrée à l’aide d’un vaporisateur calibré avec un nettoyage approprié afin de minimiser l’exposition du personnel. Les animaux étaient continuellement surveillés pour leur fréquence cardiaque et leur respiration afin de maintenir la stabilité physiologique et d’éviter une surdose d’anesthésique. Une plateforme de réchauffement a été utilisée pour prévenir l’hypothermie. Les chercheurs peuvent choisir de surveiller la température corporelle profonde à l’aide d’un thermomètre anal. Un lubrifiant ophtalmique a été appliqué pour éviter le dessèchement cornéen. Les animaux n’étaient pas laissés sans surveillance sous anesthésie et surveillés jusqu’à leur réveil complet, comme l’indique la reprise de la posture droite et des mouvements normaux dans la cage (Table of Materials).
1. Préparation animale
- Retirez les poils thoraciques 24 à 48 heures avant l’imagerie à l’aide d’une crème dépilatoire et nettoyez soigneusement avec de la gaze humide.
- Assurez-vous d’un retrait complet de la région thoracique et laissez l’irritation/rougeur cutanée disparaître complètement avant l’imagerie.
- Préparez le système d’imagerie, l’installation d’anesthésie et le matériel de surveillance avant l’induction.
- Sélectionnez le préréglage d’imagerie cardiaque et réglez la profondeur d’imagerie à 2 à 2,5 cm, un taux d’images ≥200 images/s, et ajustez le gain pour optimiser la visualisation myocardique.
2. Anesthésie et surveillance physiologique
- Induire l’anesthésie en utilisant 2–3 % d’isoflurane dans l’oxygène et maintenir un taux de 1–1,5 % via le cône nasal.
- Placez la souris sur position allongée sur une plateforme à température contrôlée et fixez les membres aux électrodes ECG.
- Appliquez un lubrifiant ophtalmique pour éviter le dessèchement cornéen.
- Surveillez en continu la fréquence cardiaque et la respiration.
- Maintenez un rythme cardiaque d’environ 450 à 500 battements/minute pour assurer la séparation des ondes Doppler E et A.
REMARQUE : Des fréquences cardiaques trop basses (<400 battements/min) peuvent refléter une anesthésie plus profonde et des conditions de charge modifiées, tandis que des fréquences cardiaques plus élevées (>500 battements/min) peuvent entraîner une fusion E/A. Maintenir des paramètres physiologiques dans des plages qui préservent à la fois la physiologie normale et l’interprétation optimale du signal Doppler. Un rythme cardiaque d’environ 400 à 500 bpm est recommandé pour permettre une séparation claire des ondes E et A transmissibles et améliorer la précision des mesures diastoliques. Cette plage cible est principalement déterminée par des considérations de mesure plutôt que par une exigence physiologique stricte. Des fréquences cardiaques inférieures à 400 bpm peuvent refléter des niveaux d’anesthésie plus profonds et des conditions de charge modifiées, pouvant affecter les indices diastoliques. Inversement, des fréquences cardiaques supérieures à 550 bpm peuvent entraîner la fusion des ondes E et A, limitant l’interprétabilité. La fréquence respiratoire doit être maintenue entre 80 et 120 respirations par minute, et la température corporelle à 37 ± 0,5 °C. La concentration d’isoflurane doit être ajustée progressivement (±0,1–0,2 %) pour maintenir la stabilité.
3. Flux de travail d’imagerie
- Imagerie en mode B
- Positionnez le transducteur le long du sternum pour obtenir une vue parasternale sur l’axe long.
- Acquérir des boucles cinématographiques (enregistrements vidéo continus) montrant les chambres cardiaques et le mouvement des parois sur plusieurs cycles cardiaques.
- Imagerie en mode M
- Positionner le transducteur pour obtenir une vue parasternale à court axe au niveau des muscles papillaires, où le ventricule gauche ressemble à un beignet avec la base de deux muscles papillaires visibles aux positions de 4 heures et 8 heures.
- Alignez le curseur en mode M perpendiculairement à la cloison nasale interventriculaire et à la paroi postérieure.
- Notez 3 à 5 cycles cardiaques et gardez pour analyse.
- LVOT Doppler
- Activez le Doppler couleur pour visualiser l’écoulement au niveau aortique.
- Alignez le faisceau Doppler parallèlement à l’écoulement dans le voile d’évacuation du ventricule gauche.
- Enregistrer les signaux Doppler à ondes pulsées sur 3 à 5 cycles cardiaques.
- Doppler d’entrée mitrale
- Obtenez une vue apicale à quatre chambres.
- Placez le volume de l’échantillon Doppler pulsé aux extrémités des folioles de la valve mitrale.
- Enregistrer les ondes E et A à une vitesse de 200 à 300 mm/s.
- Imagerie Doppler tissulaire
- Positionnez le volume de l’échantillon à l’anneau mitral septal.
- Enregistrer les vitesses diastoiques tissulaires précoces (e′) et tardives (a′) sur plusieurs cycles cardiaques.
4. Récupération
- Arrêtez l’anesthésie et retirez le gel à ultrasons.
- Placez la souris dans une cage de récupération chaude.
- Surveillez jusqu’à ce qu’il soit complètement ambulatoire avant de retourner au logement.
5. Analyse d’image
- Ouvre le logiciel d’analyse et charge la boucle cinéma.
- Mesurez les dimensions ventriculaires à l’extrémité diastole et à l’extrémité systole.
- Mesurez les vitesses d’onde E et A et calculez le rapport E/A.
- Mesurez la vitesse e′ et calculez le rapport E/e′.
- Mesures moyennes sur 3 à 5 cycles cardiaques.
Résultats
Ce protocole permet d’acquérir des images échocardiographiques de haute qualité pour une évaluation fiable de la structure et de la fonction cardiaques chez la souris. Une anesthésie appropriée, un positionnement et un suivi physiologique sont essentiels pour une imagerie cohérente (Figure 1). L’imagerie en mode B permet une visualisation claire de l’anatomie cardiaque. La vue apicale à quatre chambres permet d’évaluer toutes les chambres cardiaques (Figure 2A–B), tandis que la vue à long axe parasternal définit la structure du ventricule gauche et sert de référence pour les mesures (Figure 3A–B). L’imagerie en mode M au niveau du muscle papillaire permet de mesurer avec précision les dimensions du ventricule gauche et l’épaisseur de la paroi, y compris LVID, LVAW et LVPW (Figure 4A–B), soutenant l’évaluation de la taille cardiaque et de la fonction systolique. L’imagerie Doppler démontre des ondes d’entrée mitrales distinctes E et A pour le calcul du rapport E/ A (Figure 5), tandis que le Doppler tissulaire fournit des vitesses mesurables E′ et A′ pour l’évaluation E/e ′ (Figure 6). Un alignement optimal de la fréquence cardiaque et de la sonde est essentiel pour éviter la fusion des formes d’onde et garantir des mesures précises.
Figure 1 : Anesthésie de la souris et positionnement pour l’échocardiographie transthoracique. (A) Installation d’imagerie montrant la plateforme à température contrôlée, le système d’administration d’anesthésie, les connexions des électrodes ECG et l’appareil de positionnement de la sonde à ultrasons. Le système est conçu pour permettre une surveillance physiologique stable et une manipulation précise de la sonde lors de l’imagerie. (B) Gros plan de la plateforme d’imagerie avec électrodes ECG intégrées et cône nasal pour l’administration d’isoflurane, conçue pour maintenir la souris en position allongée standardisée tout en maintenant l’anesthésie. (C) Souris anesthésiée positionnée sur le dosé sur la plateforme d’imagerie, les quatre pattes fixées aux électrodes ECG à l’aide d’un ruban chirurgical. Le cône nasal délivre de l’isoflurane inhalé (1,0 à 1,5 % d’entretien), et la poitrine est alignée à plat pour assurer une acquisition optimale de l’image et un suivi cardiaque constant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 2 : Vue échocardiographique apicale en mode B à quatre chambres. (A) Image représentative en mode B en niveaux de gris montrant les quatre chambres cardiaques : oreillette gauche, ventricule gauche, oreillette droite et ventricule droit dans un seul plan d’imagerie. (B) Image annotée mettant en évidence les principales structures anatomiques. La sonde échographie est positionnée sur la paroi thoracique latérale gauche et inclinée crânialement vers l’apex cardiaque afin d’obtenir une visualisation optimale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 3 : Imagerie en mode B à long axe parasternal. (A) Image représentative du long axe parasternal en mode B montrant l’anatomie cardiaque, incluant la chambre ventriculaire gauche, le septum interventriculaire et la paroi postérieure. (B) Image haute résolution exportée pour une analyse quantitative des dimensions cardiaques. Cette vue est utilisée pour évaluer la structure cardiaque globale et guider les modes d’imagerie ultérieurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 4 : Imagerie en mode M au niveau du muscle papillaire. (A) Vue parasternale sur axe court au niveau du ventricule moyen avec des muscles papillaires visibles. (B) Trace correspondante en mode M avec le curseur aligné perpendiculairement à la cloison nasale interventriculaire et à la paroi postérieure. (C) L’image en mode M avec analyse assistée par logiciel, où le système détecte et trace automatiquement des lignes le long des parois du cœur. Il calcule ensuite des valeurs comme LVID, LVPW et LVAW sur les cycles cardiaques. Abréviations ; LVID = diamètre interne du ventricule gauche (distance entre le septum interventriculaire et la paroi postérieure) ; LVPW = épaisseur de la paroi postérieure du ventricule gauche ; LVAW = épaisseur de la paroi antérieure du ventricule gauche ; ECG = électrocardiogramme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 5 : Installation expérimentale et aperçu du signal Doppler. (A) Préparation expérimentale montrant un petit modèle animal positionné sur une plateforme avec une sonde à ultrasons placée au-dessus de la région thoracique pour l’imagerie cardiaque. (B) Carte Doppler couleur représentative illustrant l’intensité et la direction du signal de flux sanguin localisé. (C) Traçage Doppler à onde pulsée montrant le placement du volume de l’échantillon, accompagné d’une forme d’onde Doppler pulsée représentative démontrant les vitesses de remplissage précoces (E) et auriculaires (A). La TRVI et la TVI sont indiquées, avec un traçage ECG simultané pour la corrélation du cycle cardiaque. Abréviations ; IVRT = temps de relaxation isovolumétrique ; IVCT = temps de contraction isovolumétrique Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Imagerie Doppler tissulaire du mouvement myocardique. Enregistrement Doppler tissulaire illustrant les schémas de vitesse du myocarde avec des composants précoces (E′) et auriculaires (A′) identifiables, acquis à partir de la paroi myocardique. La forme d’onde est affichée par une trace ECG synchronisée pour corréler l’activité électrique et mécanique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Discussion
Ce protocole propose une approche standardisée et reproductible pour l’échocardiographie transthoracique basée sur le Doppler chez la souris, permettant une évaluation complète de la structure cardiaque, de la fonction systolique et des indices diastoliens conventionnels. L’utilisation combinée du mode B, du mode M et de l’imagerie Doppler permet une quantification fiable des dimensions ventriculaires, de la fonction contractile et de la dynamique de remplissage dans les modèles précliniques de maladiescardiovasculaires 14.
Un point crucial en échocardiographie murine est l’influence de l’anesthésie inhalée sur la physiologie cardiovasculaire. L’isoflurane est connu pour réduire la fréquence cardiaque, modifier la précharge et la postcharge, et moduler la contractilité myocardique, ce qui peut tous influencer les indices de fonction diastolique dérivés duDoppler 15. En conséquence, une utilisation attentive de l’anesthésie et le maintien de conditions physiologiques stables sont essentiels pour garantir des mesures reproductibles et interprétables. La standardisation de la fréquence cardiaque, de la température corporelle et de la fréquence respiratoire minimise la variabilité et améliore la comparabilité entre les groupesexpérimentaux 16.
Les indices conventionnels dérivés du Doppler, y compris l’apport transmissible (E/A) et l’E/e′ dérivé du Doppler tissulaire, sont largement utilisés pour l’évaluation de la fonction diastolique et sont généralement reproductibles lorsque des protocoles d’acquisition standardisés sontsuivis 17. La reproductibilité peut être encore améliorée en faisant la moyenne des mesures sur plusieurs cycles cardiaques et en réalisant des analyses de manière aveugle afin de réduire la variabilité entre et intra-observateurs. Un positionnement cohérent des sondes et des plans d’imagerie sont également essentiels pour améliorer la fiabilité des essais et des essais à travers les étudeslongitudinales 18.
Maintenir un rythme cardiaque approprié lors de l’imagerie est particulièrement important chez la souris en raison de leur fréquence cardiaque intrinsèque élevée. À des fréquences cardiaques plus basses, souvent associées à une anesthésie plus profonde, des conditions de charge modifiées peuvent influencer les schémas de plombage ventriculaire. Inversement, des fréquences cardiaques excessivement élevées peuvent entraîner la fusion des ondes E et A, limitant l’interprétation précise des indices diastoliques. Par conséquent, maintenir la fréquence cardiaque dans une plage qui préserve à la fois la pertinence physiologique et la séparation du signal Doppler est essentiel pour une évaluationprécise 19.
Bien que ce protocole se concentre sur les indices conventionnels de la fonction diastolique basés sur le Doppler, il n’intègre pas de techniques d’échocardiographie plus avancées qui ont gagné en importance dans la littérature récente. L’imagerie de la déformation et du taux de déformation myocardique (y compris les phases de réservoir, conduit et pompe de rappel), ainsi que l’évaluation du dé-torsion du ventricule gauche fournissent une compréhension mécanistique supplémentaire de la relaxation et de la compliancemyocardique 19. Cependant, ces techniques nécessitent des protocoles d’acquisition spécialisés, une résolution temporelle plus élevée et des outils dédiés au post-traitement, et dépassent donc le cadre du flux de travail actuel. Ces modalités doivent être considérées comme des approches complémentaires lorsque un phénotypage diastolique plus détaillé estnécessaire 16.
En plus de l’échocardiographie, des techniques alternatives telles que l’imagerie par résonance magnétique cardiaque (IRM) et l’analyse invasive de la boucle pression-volume offrent des évaluations complémentaires de la fonction cardiaque. L’IRM offre une haute résolution spatiale et des mesures volumétriques précises, tandis que l’analyse pression-volume fournit des données hémodynamiques de référence. Cependant, ces méthodes sont limitées par le coût, l’invasion et une faible adéquation aux études longitudinales. En revanche, l’échocardiographie transthoracique reste une technique rapide, non invasive et largement accessible pour l’évaluation en série de la fonction cardiaque dans les modèlesmurins 20.
Dans l’ensemble, ce protocole permet l’acquisition de données échocardiographiques de haute qualité et reproductibles chez la souris lorsqu’une attention particulière est portée à la surveillance physiologique et aux techniques d’imagerie standardisées. L’intégration de mesures structurelles, systoliques et diastoliques conventionnelles rend cette approche bien adaptée aux études longitudinales portant sur la physiologie cardiaque, la progression de la maladie et les interventions thérapeutiques dans la recherche cardiovasculaire préclinique.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention NIH/NHLBI HL153407.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Crème dépilatoire | Nair & reg ; | N/A | Épilation avant imagerie |
| Bouillotte | VetEquip (ou équivalent) | N/A | Maintient la température corporelle (~37 °F ; C) |
| Système d’échographie haute fréquence | FUJIFILM VisualSonics | Vevo F2 (ou équivalent) | Système d’imagerie pour petits animaux avec préréglages cardiaques |
| Plateforme d’imagerie | VisualSonics | Plateforme intégrée | ECG et ; Surveillance respiratoire |
| Chambre d’induction & Cône de nez | VetEquip (ou équivalent) | N/A | Administration d’anesthésie gazeuse |
| Vaporisateur à isoflurane | VetEquip (ou équivalent) | Système d’anesthésie classique (ou équivalent) | Système d’administration anesthésique |
| Transducteur à réseau linéaire (30-40 MHz) | VisualSonics | MS550D | Sonde haute fréquence pour imagerie cardiaque murine |
| Lubrifiant ophtalmique | Générique (par exemple, Refresh PM/équivalent) | N/A | Prévient le séchage cornéen |
| Ruban chirurgical | 3M (ou équivalent) | Ruban chirurgical micropore | Sécurise les membres pour l’ECG |
| Gel à ultrasons | Laboratoires Parker | Aquasonic 100 (ou équivalent) | Couplage acoustique |
| Logiciel Vevo LAB | VisualSonics | Dépendant de la version | Acquisition et analyse d’images |
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