Évaluation de l’efficacité de la transduction et du ciblage cellulaire par les peptides pénétrant les cellules dans le poumon de la souris

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail intégré pour évaluer l’efficacité de la transduction et la spécificité cellulaire des peptides pénétrants dans les cellules, en utilisant le peptide cyclisé R11A (cR11A ; KAPWHLSSQYSAT) en exemple. Le flux de travail combine FACS en fractions appariées suivies de séquençage de l’ARN unicellulaire, de cytométrie en flux chez des souris rapporteures AT2, et d’imagerie par pile z confocale pour confirmer l’engagement de la cible peptidique associée à AT2.

Résumé

Les peptides pénétrants cellulaires (CPP) sont des peptides courts (5 à 30 acides aminés) capables de traverser les membranes cellulaires et de livrer des charges macromoléculaires sans nécessiter de réactifs de transfection. Cependant, la définition in vivo. de la sélectivité cellulaire nécessite une validation au niveau du type cellulaire. Un flux de travail intégré est présenté pour évaluer l’efficacité de transduction d’un CPP cyclisé marqué Cy5.5, cR11A, dans les cellules épithéliales alvéolaires de type II (AT2) après injection intraveineuse rétro-orbitale chez la souris. Les poumons ont été prélevés à 15 ou 60 minutes après l’injection et analysés à l’aide de lectures complémentaires, incluant le tri cellulaire activé par fraction par fraction par appariement (FACS) pour isoler les suspensions monocellulaires pulmonaires Cy5,5⁺ et Cy5,5⁻, suivies du séquençage d’ARN unicellulaire, cytométrie de flux des cellules uniques pulmonaires de Sftpc-CreERT2^(+/−) ; ^{LSL-GFP(+/−)} des souris rapporteures AT2 pour quantifier les événements GFP⁺/Cy5,5⁺, et l’imagerie par pile z confocale des cryosections pulmonaires pour confirmer la colocalisation de cR11A-Cy5.5 avec un signal associé à AT2. Ce protocole fournit des preuves concordantes de l’engagement des types cellulaires grâce à plusieurs lectures complémentaires et fournit un cadre reproductible pour évaluer le ciblage spécifique aux cellules des CPP, avec des modifications pour différents organes cibles.

Introduction

Les peptides pénétrants cellulaires (CPP) sont des peptides de 5 à 30 acides aminés qui peuvent traverser les membranes cellulaires et faciliter la livraison intracellulaire de cargaisons macromoléculaires sous une forme intacte et pleinement fonctionnelle, sans nécessiter de réactifs de^{transfection 1,2}. Des travaux antérieurs utilisant des méthodologies combinatoires de présentation in vitro et in vivo ont identifié un peptide ciblant le cœur cardiaque de 12 acides aminés (APWHLSSQYSRT) qui est spécifiquement absorbé par les cardiomyocytes en aussi peu que 5^{min 3,4}. Pour étudier son mécanisme de transduction, un scan alanine a été réalisé, conduisant à la découverte de deux variantes, S7A et R11A (APWHLSSQYSAT), qui ont présenté un enrichissement pulmonaire in vivo de manière inattendue. et ont donc été appelées peptides ciblant les poumons (LTP⁾⁵. De plus, l’ajout de lysine N-terminale et la cyclisation tête-queue ont généré une version cyclique de R11A (cR11A) avec une stabilité sérique nettement améliorée et une absorption intracellulaire nettement améliorée par rapport à son homologue^{linéaire 5}.

Les LTP ont le potentiel de délivrer des traitements avec précision aux populations épithéliales pulmonaires distales, y compris les cellules épithéliales alvéolaires de type II (AT2). Ces cellules sont essentielles au maintien de l’homéostasie du tensioactif et servent de progénitrices de la régénération^{alvéolaire 6}. Cependant, un défi majeur dans le développement de la LTP est l’évaluation rigoureuse de la sélectivité cellulaire in vivo. La biodistribution au niveau des organes seule ne peut pas distinguer la véritable transduction cellulaire du signal vasculaire, de la rétention extracellulaire ou de la clairance phagocytaire, et doit donc être complétée par des mesures résolues par une seule^{cellule 7}. Pour répondre à cette limitation, ce flux de travail intègre l’affectation transcriptomique unicellulaire, la cytométrie en flux basée sur rapporteurs et l’imagerie par pile z confocale afin de générer des preuves au niveau cellulaire d’engagement peptidique au-delà des lectures de fluorescence ou de biodistribution au^{niveau des organes 8,9}.

L’objectif global de ce protocole est de fournir un flux de travail reproductible et multi-lecture pour valider l’efficacité de transduction in vivo et la spécificité cellulaire du cR11A marqué par Cy5.5 dans le poumon distal, avec un accent particulier sur les cellules AT2 après injection rétro-orbitale. Le protocole définit l’identité cellulaire associée aux peptides à l’aide de lectures complémentaires et indépendantes, incluant le tri cellulaire activé par fluorescence par fractions appariées (FACS) (Cy5.5⁺ vs Cy5.5⁻) suivi d’un séquençage d’ARN unicellulaire pour cartographier les populations associées aux peptides, une évaluation quantitative de l’absorption dans les poumons rapporteurs d’AT2 via cytométrie en flux, et l’imagerie par pile z confocale des cryosections pulmonaires pour confirmer la colocalisation de cR11A-Cy5.5 avec un signal associé à AT2. Ce protocole peut être facilement adapté à d’autres LTP ou vecteurs de délivrance et appliqué aux systèmes pulmonaires ou autres organes afin d’évaluer la spécificité cellulaire des CPP en développement. Il convient particulièrement aux applications nécessitant une validation au niveau cellulaire du ciblage de la CPP in vivo, plutôt qu’une évaluation unique de l’accumulation au niveau des organes.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux directives du Comité de Soins et d’Utilisation Institutionnelles des Animaux (IACUC) de la Mayo Clinic et ont été approuvées sous le protocole numéro A00006842-22-R25. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale et garantir une manipulation éthique conforme aux réglementations nationales et institutionnelles pertinentes. Les outils de recherche utilisés pour ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Animaux

1. Utilisez des souris adultes mixtes C57BL/6J (6 à 8 semaines) obtenues auprès du Jackson Laboratory (souche #000664).
2. Pour la quantification spécifique à AT2, on utilise Sftpc-CreERT2^(+/+) (Souche Jax #028054) croisée avec LSL-GFP^(+/+) (Souche Jax #007906) pour générer Sftpc-CreERT2^(+/−) ; Souris rapporteures ^{LSL-GFP(+/−)} AT2.
3. Les souris d’intérieur dans des cages ventilées individuellement. Veillez à ce que tous les protocoles animaux soient approuvés par le Comité de Soins et d’Utilisation Institutionnels des Animaux.
4. Effectuer une induction par tamoxifène dans Sftpc-CreERT2^(+/−) ; Souris ^{LSL-GFP(+/−} ). Lorsque les souris ont ≥6 semaines, administrez 100 mg/kg de tamoxifène dissous dans de l’huile de maïs par gavage oral pour trois doses sur 7 jours. Réaliser des expériences au moins 2 semaines après la dose finale pour permettre une efficacité maximale de recombinaison.

2. Préparation des réactifs et équipements

1. Préparez une anesthésie (mélange de travail kétamine/xylazine).
   1. Préparez une solution de travail de 5 mL : kétamine (1 mL de 50 mg/mL), xylazine (50 μL de 100 mg/mL) et solution saline stérile (3,95 mL).
   2. Administrez 1 μL/g de poids corporel via .injection intrapéritonéale (dose finale : 10 mg/kg de kétamine et 1 mg/kg de xylazine).
2. Préparez le peptide (cR11A-Cy5.5).
   1. Obtenez des CPP sous forme de poudres lyophilisées. Conserver les poudres à −20 °C pendant jusqu’à 2 ans ou sous forme de solutions d’origine dans du DMSO à −80 °C pendant jusqu’à 6 mois dans des tubes protégés par la lumière. Évitez les cycles de gel-dégel et minimisez l’exposition à la lumière. Préparez une solution de 10 mM de cR11A-Cy5.5 en DMSO.
   2. Peser la souris, calculer la dose, puis diluer le fond à 1 mg/kg dans de l’eau sans nucléase pour un volume final de 100 μL par souris.
3. Préparez un tampon de digestion (frais ; conservez sur glace).
   1. Préparez un tampon de digestion contenant 2 mg/mL de Dispase II, 0,1 mg/mL de DNase I, DMEM/F12 et 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine.
   2. Utilisez 3 mL par souris.
4. Préparez un tampon de lavage enzymatique protéase non spécifique (à garder sur glace).
   1. DMEM/F12 contenant 0,05 mg/mL de DNase I et 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine.
   2. Utilisez 10 mL par souris.
5. Préparez un tampon de lyse des globules rouges (gardez sur glace).
   1. Diluez 10× tampon de lyse à 1× avec du PBS.
   2. Utilisez 2 mL par échantillon.
6. Préparez le tampon de perfusion.
   1. Utilisez du DMEM/F12 glacé (10 mL par souris).
7. Préparez le tampon de lavage.
   1. Utilisez DMEM/F12 avec 2 % de FBS.
8. Pré-refroidissez les centrifugeuses à 4 °C.

3. Administration rétro-orbitale de cR11A-Cy5.5

1. Anesthésiez la souris avec la solution active kétamine/xylazine. Confirmer une anesthésie adéquate par l’absence de retrait des membres en réponse à la pincée des orteils.
2. Injectez 100 μL de cR11A-Cy5,5 (1 mg/kg) par injection intraveineuse rétro-orbitale à l’aide d’une seringue d’insuline.
3. Lancez le minuteur et maintenez la souris sur un coussin chauffant sous surveillance appropriée pendant 15 ou 60 minutes.

4. Prélèvement et perfusion pulmonaire

1. Euthanasiez la souris selon des protocoles approuvés (par exemple, inhalation de CO₂ suivie d’une luxation cervicale). Placez la souris en position couchée et vaporisez le thorax avec 70 % d’éthanol.
2. Ouvrez la cavité thoracique pour exposer le cœur et les poumons.
3. Faites une incision dans l’oreillette droite pour permettre le drainage pendant la perfusion.
4. Insérez une aiguille de 26 G fixée à une seringue de 10 mL contenant du DMEM/F12 glacé dans le ventricule droit. Gardez l’incision auriculaire droite ouverte pendant la perfusion pour permettre le drainage.
5. Perfusez manuellement sans pompe à seringue en injectant lentement et régulièrement 10 mL de DMEM/F12 sur environ 1 à 2 minutes. Maintenez une pression basse pendant l’injection et évitez un surgonflement ou une fuite pulmonaire visible de la paroi ventriculaire. Continuez jusqu’à ce que les poumons deviennent uniformément pâles.

5. Inflation pulmonaire et digestion

1. Canulez la trachée avec un cathéter IV de 20G et fixez avec une suture de soie 3-0. Injectez 1 mL de tampon digestif avec une seringue de 1 mL pour gonfler les poumons.
2. Disséquez les poumons en une seule unité intacte et transférez immédiatement dans un plat pré-refroidi de 100 mm sur glace.
3. Séparer les lobes pulmonaires et transférer dans un tube conique de 15 mL contenant 2 mL de tampon de digestion froide (un poumon par tube).
4. Incubez à 4 °C pendant 20 heures sur un bascule rotatif (10–15 tr/min).
   REMARQUE : Consultez Janas PP. et ^al.10 pour une méthodologie détaillée.

6. Dissociation tissulaire

1. Placez une passoire cellulaire de 100 μm sur un tube conique de 50 mL et pré-humidifiez avec un tampon de lavage enzymatique protéase non spécifique de 1 mL.
2. Transférez le tissu pulmonaire sur la passoire et dissociez doucement à l’aide d’un piston à seringue stérile.
3. Rincez avec un tampon de lavage enzymatique protéase non spécifique de 10 mL.
4. Centrifugez à 130 × g pendant 15 minutes à 4 °C.
5. Résuspendez le pellet dans un tampon de lyse de 2 mL 1× globules rouges pendant 90 s à température ambiante.
6. Trempe la lyse avec un tampon de lavage de 10 mL.
7. Filtrez à travers une passoire de 40 μm et rinçez avec un tampon de lavage.
8. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
9. Resuspendre les cellules dans 500–1 000 μL PBS + 2 % FBS (≥1 × 10⁶ cellules/mL).
10. Passer à travers un bouchon filtre de 35 μm dans un tube FACS.
    REMARQUE : Consultez Konishi S. et ^al.11 pour une méthodologie détaillée.

7. Tri FACS par fractions appariées

1. Effectuez le tri à l’aide d’un cytomètre en flux.
2. Utilisez des poumons injectés par PBS comme contrôle négatif pour définir la porte Cy5.5.
3. Appliquer la barrière standard : exclusion des débris, pource-sols et cellules Cy5,5⁺.
4. Triez les populations Cy5,5⁺ et Cy5,5⁻ dans des tubes séparés.

8. préparation de l’échantillon scRNA-seq

1. Gardez les échantillons triés sur la glace.
2. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C puis remettez en suspension dans un tampon de 500 μL.
3. Ne procédez que si la viabilité est ≥80 %.
4. Préparez les bibliothèques et le séquençage selon les besoins.

9. Cytométrie en flux chez les souris rapporteures AT2

1. Préparez les suspensions pulmonaires monocellulaires comme décrit dans les sections 5 à 6.
2. Teignez avec une teinture vivante/morte réparable (1:1 000) pendant 30 minutes (protégez-la de la lumière).
3. Lavez et centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
4. Filtrez et gardez les échantillons sur la glace.
5. Acquérir des données sur un cytomètre en flux.
6. Effectuer des filtres pour identifier les cellules, sélectionner les singlets, exclure les cellules mortes et définir les populations GFP et Cy5.5.
   1. Quantifier les événements GFP⁺/Cy5,5⁺ en pourcentage des cellules GFP⁺.

10. Fixation et cryoprotection

1. Gonflez les poumons avec 1 mL de PFA à 4 % et sécurisez la trachée.
2. Fixez avec 10 mL de PFA à 4 % pendant la nuit à 4 °C.
3. Laver avec PBS (3×).
4. Incubez dans 15 % de saccharose pendant la nuit.
5. Transférez à 30 % de saccharose pendant ~48 heures.

11. Incrustation et cryosection

1. Préparez des cryo-moules avec OCT et positionnez les poumons et intégrez dans OCT.
2. Congelez avec de l’azote liquide. À conserver à ˗80 °C.
3. Coupe à 10 μm après équilibrage. Glisse à l’air libre pendant la nuit.

12. Imagerie et analyse

1. Laver les sections avec du PBS (3×).
2. Monter avec un support DAPI.
3. Procurez-vous des piles z confocales.
4. Utilisez des réglages d’imagerie appropriés.
5. Effectuer une reconstruction 3D.
6. Quantifier la colocalisation en utilisant des seuils cohérents.
   Méthodes optionnelles :
   Ces méthodes optionnelles ne sont pas incluses dans le flux de travail représentatif mais peuvent être intégrées pour permettre l’épuisement ou l’analyse de la population cellulaire immunitaire CD45⁺, qui constitue une grande proportion des cellules^{pulmonaires 12}.
   REMARQUE : Utilisez la déplétion ou l’exclusion de CD45⁺ lorsque l’analyse porte sur des populations pulmonaires non immunes, car ces étapes éliminent ou séparent les signaux d’absorption des cellules immunitaires et modifient la composition cellulaire de l’échantillon. La coloration CD45 peut également être utilisée pour analyser séparément la population de cellules immunitaires CD45⁺.

13. Épuisement de la population cellulaire CD45⁺

1. Après la dissociation tissulaire (Étape 6), utilisez soit un anticorps CD45 conjugué à une bille magnétique (Miltenyi Biotech 130-052-301), soit un anticorps CD45 conjugué à un fluorophore compatible avec Cy5.5, GFP et la coloration vivante/morte, par exemple CD45-BV605 (BioLegend #103140). Colorez pendant 20 minutes à 4°C dans le noir.
2. Si vous effectuez une déplétion des billes magnétiques CD45, suivez les instructions du fabricant pour l’utilisation de la colonne Lineage Depletion (LD) (Miltenyi Biotech 130-042-901) et procédez à la séparation magnétique des cellules (MACS) (Miltenyi Biotech). Ensuite, procédez au tri FACS par fractions appariées (étape 7).
3. Si vous effectuez une déplétion du CD45 à l’aide d’un anticorps conjugué fluorescentement, lavez d’abord la suspension cellulaire avec un tampon de lavage pour éliminer l’excès d’anticorps. Ensuite, passez à l’étape 7. Après avoir établi des portes pour exclure les doublets et les débris (Étape 7.3), insérer une porte supplémentaire pour exclure la population CD45⁺ . Ensuite, passez à l’étape 7.4.

14. Analyser la population cellulaire CD45⁺ lors de la cytométrie en flux

1. Après l’étape 9.3, utilisez un anticorps CD45 conjugué à un fluorophore compatible avec Cy5.5, GFP et la coloration vivante/morte, par exemple CD45-BV605 (BioLegend #103140). Colorez pendant 20 minutes à 4°C dans le noir.
2. Lavez la suspension cellulaire avec un tampon de lavage pour éliminer l’excès d’anticorps. Ensuite, passez à l’étape 9.4. Après avoir établi des portes pour exclure les doublets et les débris (Étape 9.6), insérer une porte supplémentaire pour exclure la population CD45⁺ avant de verrouiller pour établir les populations ^GFP+ et Cy5.5^{+ 12}.

Résultats

L’application réussie de ce protocole devrait générer des preuves concordantes issues de trois lectures complémentaires : scRNA-seq à fractions appariées, cytométrie en flux basée sur rapporteur et imagerie par pile z confocale.

Dans l’analyse scRNA-seq par fractions appariées, les fractions monocellulaires pulmonaires Cy5,5⁻ et Cy5,5⁺ ont été récupérées après administration systémique de cR11A-Cy5.5 et analysées séparément. La visualisation UMAP a identifié les principales populations cellulaires pulmonaires, y compris les compartiments immunitaires, endothéliaux, épithéliaux et mésenchymiques (Figure 1A, B). Bien que les cellules immunitaires représentaient la population dominante dans les deux fractions triées, la fraction Cy5,5⁺ montrait un enrichissement relatif des compartiments non immunitaires, y compris les cellules épithéliales (Figure 1C). L’analyse des sous-ensembles épithéliaux a montré une plus grande représentation des cellules AT2 dans la fraction Cy5,5⁺ que dans la fraction Cy5,5⁻, tandis que les cellules AT1 restaient faibles dans les deux fractions (Figure 1D). Ces résultats indiquent que le scRNA-seq en fraction appariée peut identifier l’enrichissement des cellules AT2 au sein de la fraction cellulaire pulmonaire cR11A-Cy5.5–positive.

La cytométrie en flux a été utilisée pour quantifier le signal cR11A-Cy5.5 dans les cellules AT2 définies par rapporteur. Le filtrage représentatif comprenait la sélection des cellules totales par FSC-A/SSC-A, deux portes singlet séquentielles, le gating par cellules vivantes et le versus final GFP. Analyse Cy5.5 (Figure 2A–E). Dans l’échantillon témoin, les événements GFP⁺/Cy5,5⁺ étaient minimes, établissant le seuil de fluorescence de fond. Après administration de cR11A-Cy5.5, les événements positifs à la GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 ont augmenté à 7,99 % à 15 minutes et à 7,41 % à 60 minutes après injection dans ce jeu de données représentatif (Figure 2E). Ces résultats soutiennent un signal détectable cR11A-Cy5.5 dans les cellules AT2 rapporteur-positives in vivo.

L’imagerie confocale Z-stack permet une validation spatiale de la fluorescence associée aux peptides dans les sections du tissu pulmonaire. Un témoin non rapporteur a été inclus pour évaluer la fluorescence de fond et a montré un signal minimal dans les canaux GFP et Cy5.5. Dans les poumons rapporteurs AT2 traités à cR11A-Cy5.5, la fluorescence de Cy5.5 a été détectée à proximité des cellules rapporteuses positives à GFP⁺ AT2, et le canal de colocalisation généré par Imaris a identifié un chevauchement entre les signaux GFP et Cy5.5 (Figure 3A). L’analyse représentative de la colocalisation d’Imaris a montré 89,6 % et 86,8 % de colocalisation dans le compartiment GFP⁺ AT2 respectivement à 15 min et 60 min (Figure 3B).

Des résultats sous-optimaux peuvent inclure une fluorescence de fond élevée de Cy5.5 dans les échantillons témoins, une mauvaise récupération des cellules épithéliales, une faible viabilité cellulaire ou une séparation faible des événements GFP⁺/Cy5,5⁺. Ces problèmes indiquent généralement une perfusion incomplète, une perturbation tissulaire excessive, une compensation insuffisante ou des seuils d’imagerie incohérents.

Figure 1 : Le scRNA-seq à fraction appariée identifie l’enrichissement de l’épithélium alvéolaire dans la fraction pulmonaire cR11A-Cy5.5–positive. Les suspensions monocellulaires pulmonaires ont été triées en fractions Cy5,5⁻ et Cy5,5⁺ après injection rétro-orbitale de cR11A-Cy5.5, et chaque fraction a été analysée par séquençage d’ARN unicellulaire. (A) Les graphiques UMAP montrent des groupes de types cellulaires en fractions appariées provenant d’une souris représentative. (B) La superposition UMAP montre la répartition des cellules Cy5.5⁻ et Cy5.5⁺. Les régions encerclées dans (A) et (B) indiquent le compartiment épithélial mis en évidence pour l’analyse des sous-ensembles épithéliaux. (C) Les populations immunitaires sont très présentes dans les deux fractions, représentant plus de 80 % de chacune. Comparée à la fraction Cy5,5⁻, la fraction Cy5,5⁺ contient une plus grande proportion de populations endothéliales, épithéliales et mésenchymateuses, indiquant une captation de cR11A au sein de ces populations. (D) Au sein de la population épithéliale, les cellules AT2 sont plus fortement représentées dans la fraction Cy5,5⁺ que dans la fraction Cy5,5⁻, tandis que les cellules AT1 restent faibles dans les deux fractions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Validation par cytométrie en flux de l’absorption de cR11A-Cy5.5 dans les poumons rapporteurs AT2. Des souris rapporteures AT2 ont reçu des injections intraveineuses rétro-orbitales, et les poumons ont été prélevés à 15 ou 60 minutes après l’injection pour la préparation monocellulaire. Un contrôle représentatif est montré pour un échantillon traité par véhicule PBS (Ctrl) et cR11A-Cy5.5 : (A) cellules ont été sélectionnées par FSC-A/SSC-A, (B, C) les singlets ont été déclenchés par exclusion de doublets par diffusion, (D) les cellules vivantes ont été identifiées par l’exclusion de colorant de viabilité, et (E) GFP (rapporteur AT2) versus. Cy5.5 a été utilisé pour quantifier les événements GFP⁺/Cy5.5⁺. Dans ce jeu de données représentatif, les événements AT2 de GFP⁺/Cy5,5⁺ étaient d’environ 8 % à la fois 15 minutes et 60 minutes après l’administration de cR11A-Cy5,5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Imagerie confocale et analyse de la colocalisation de l’imaris de la captation de cR11A-Cy5.5 dans les poumons rapporteurs AT2. (A) Des champs représentatifs sont affichés pour un poumon rapporteur AT2 traité par témoin non reporter (Ctrl) et traité par cR11A-Cy5.5, prélevé à 15 ou 60 minutes après injection pour cryosection et imagerie confocale z-stack. Le signal GFP (vert) marque les cellules AT2, et la fluorescence cR11A-Cy5.5 (rouge) indique le signal associé au peptide. Le panneau « Coloc » affiche les pixels ou objets classés comme colocalisés par Imaris (jaune), et les images fusionnées illustrent le chevauchement spatial entre les deux canaux. Le contrôle non rapporteur a été inclus pour évaluer la fluorescence de fond dans les canaux GFP et Cy5.5. (B) La quantification de la colocalisation dans le compartiment GFP⁺ AT2 montre que 89,6 % et 86,8 % du signal GFP se sont colocalisés avec cR11A-Cy5,5 respectivement à 15 min et 60 min. Ces données indiquent un chevauchement robuste avec les cellules GFP⁺ AT2 à chaque moment, soutenant un engagement préférentiel du compartiment AT2 in vivo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole identifie le ciblage peptidique de populations cellulaires spécifiques à l’aide de multiples lectures indépendantes fonctionnant à des résolutions complémentaires : cartographie au niveau du transcriptome (scRNA-seq en fraction appariée), mesure quantitative basée sur les événements (cytométrie en flux rapporteur) et confirmation spatiale (stacks z confocales). Ensemble, ces approches réduisent les ambiguïtés courantes inhérentes aux études basées sur la fluorescence ou la biodistribution en masse au niveau des organes, telles que la fluorescence vasculaire confondante ou la rétention extracellulaire, ainsi que l’incapacité d’attribuer un signal associé aux peptides à des populations cellulaires pulmonaires^{spécifiques 7}.

Plusieurs étapes nécessitent une attention particulière. La qualité de la perfusion influence fortement la fluorescence de fond et la performance de tri en aval ; une perfusion suffisante se caractérise par une apparence uniforme, ivoire et blanc de tous les lobes pulmonaires, tandis que la perfusion incomplète peut augmenter le signal Cy5.5 dans les compartiments non ciblés. Pour la dissociation tissulaire, une digestion à froid prolongée (4 °C, 20 h) est utilisée plutôt que les conditions digératives typiques (37 °C, 1–2 h) afin de préserver les populations épithéliales et d’améliorer la récupération des cellules fragiles, en particulier les cellules alvéolaires de type I (AT1^{) 10}. Les cellules AT1 sont facilement perdues lors de l’isolement car leur morphologie large et fine les rend très sensibles à la digestion mécanique. Au-delà des pratiques standard de laboratoire, incluant la digestion constante, la compensation, la fermeture et le seuil, l’analyse de la colocalisation 3D aide à déterminer si le signal peptidique chevauche le signal rapporteur AT2 plutôt que de se fier uniquement au chevauchement de fluorescence^{bidimensionnel 13}.

Une étape de déplétion cellulaire immunitaire CD45⁺ peut être envisagée avant la quantification de l’scRNA-seq ou de la cytométrie en flux. Les cellules immunitaires constituent une grande proportion des populations cellulaires pulmonaires et peuvent absorber les CPP dans le cadre d’une réponse immunitaire typique aux particules étrangères. Pour quantifier plus précisément l’absorption de la CPP dans les populations non immunitaires, y compris les compartiments endothéliaux, épithéliaux et mésenchymateux, la déplétion cellulaire CD45⁺ pourrait améliorer la sensibilité. Cela peut être réalisé par appauvrissement à base de billes avant le tri ou en excluant les cellules CD45⁺ lors de l’analyse de cytométrie^{en flux 12}. Cependant, cette modification doit être utilisée de manière sélective car elle élimine les informations d’absorption des cellules immunitaires et modifie la composition cellulaire de l’échantillon analysé.

Plusieurs limitations de ce flux de travail doivent être prises en compte. La fluorescence Cy5.5 identifie le signal associé au peptide mais ne distingue pas, à elle seule, le peptide intériorisé du signal adhérent à la membrane ou péricellulaire. Le scRNA-seq à fractions appariées est également affecté par la dissociation tissulaire, la récupération cellulaire, les seuils de tri et l’abondance relative de chaque population cellulaire pulmonaire. Par conséquent, des populations rares telles que les cellules basales ou les ionocytes peuvent être sous-représentées ou manquées. La cytométrie de flux de souris de type rapporteur offre une assignation plus forte des types cellulaires mais nécessite une ligne de rapporteur appropriée ou un panel d’anticorps validé. De plus, un contrôle de véhicule utilisant des souris reporters permettrait de mieux définir la colocalisation de fond dans les cellules GFP⁺ AT2 lors des essais d’imagerie. L’interprétation doit donc s’appuyer sur des preuves concordantes entre scRNA-seq, cytométrie en flux et imagerie confocale, plutôt que sur une lecture unique.

Ce flux de travail est modulaire et peut être adapté à des fluorophores alternatifs, des lignées de souris rapporteures, des schémas de dosage ou des moments de prélèvement. Pour les études développant des CPP spécifiques à des cellules ou organes, la conception par fractions de scRNA-seq appariée peut être appliquée avec des modifications à d’autres organes (par exemple, foie, rein ou cerveau). Ce protocole offre une approche efficace pour comparer les populations associées aux peptides au sein d’un même organe provenant d’un même animal, améliorant ainsi l’interprétabilité tout en réduisant la variabilité entre animaux. Les applications futures incluent le dépistage de CPP supplémentaires, le test des conjugués CPP–cargo, la comparaison des conceptions linéaires et cycliques de peptides, et l’application de ce flux de travail à des modèles de maladies dans lesquels l’architecture tissulaire ou l’abondance cellulaire cible est modifiée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-mouse CD45-BV605 antibody	BioLegend	103140	Utilisé pour l'identification ou l'exclusion des cellules CD45+
Souris C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Strain #000664	Souris de type sauvage utilisées pour les expériences
CD45 MicroBeads, souris	Miltenyi Biotec	130-052-301	Utilisé pour la dépletion magnétique des cellules CD45+
Compteur de cellules	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	Compte automatisé des cellules
Incubateur CO2	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	Incubation cellulaire
Microscope confocal	Zeiss	LSM 980; 1872-551	Utilisé pour l'acquisition d'images z-stack
Peptide cR11A-Cy5.5	Mayo Clinic Proteomics Core	Synthèse personnalisée; pas de numéro de catalogue	CPP fluorescentement marqué utilisé pour la livraison in vivo
Cryostats	Leica Biosystems	Leica CM1950	Utilisé pour la découpe des tissus
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	Enzyme utilisé pour la digestion des tissus pulmonaires
DMEM/F12	Gibco	11330-032	Tampon de dissociation et de lavage cellulaire
DNase I	Roche	10104159001	Réduit l'aggrégation cellulaire médiée par l'ADN
Trieur cellulaire FACS	BD Biosciences	BD FACSAria II, système 4 lasers	Utilisé pour le tri des cellules Cy5.5+ et Cy5.5-
FBS	Gibco	A52567-01	Ajouté aux tampons pour améliorer la viabilité cellulaire
Logiciel FlowJo	FlowJo	Version 10.10.0	Analyse de données de cytométrie en flux
Logiciel GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 10	Analyse statistique et tracé
Logiciel Imaris	Oxford Instruments	Version 9.9.1	Visualisation 3D et analyse de colocalisation
Agitateur orbital incubé	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	Utilisé pour la digestion des tissus
Kétalamine	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
Colonnes LD	Miltenyi Biotec	130-042-901	Utilisé pour la séparation cellulaire magnétique (MACS)
Colonnes LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
Kit de coloration des cellules mortes jaune fixable Live/dead	Invitrogen	L34968	Utilisé pour la coloration de viabilité en cytométrie en flux
Kit de coloration des cellules mortes jaune fixable Live/dead	Invitrogen	L34968
Souris rapporteures LSL-GFP	The Jackson Laboratory	Strain #007906	Ligne rapporteure GFP inductible par Cre
Souris rapporteures LSL-GFP	The Jackson Laboratory	Strain #007906
Microcentrifugeuse	Eppendorf	EPP-5427R	Centrifugation des échantillons
Microcentrifugeuse	Eppendorf	EPP-5427R
Milieu de montage avec DAPI	Abcam	AB104139	Contre-coloration nucléaire pour l'imagerie
Milieu de montage avec DAPI	Abcam	AB104139
Eau sans nucléase	Qiagen	175034992
Aiguille pour gavage oral	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	Tampon de lavage général
PBS	Gibco	10010-023
Pénicilline-Stréptomycine	Gibco	15140-122	Prévient la contamination bactérienne
Pénicilline-Stréptomycine	Gibco	15140-122
Centrifugeuse réfrigérée	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	Pétrissage cellulaire à température contrôlée
Centrifugeuse réfrigérée	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
Sérum physiologique	Baxter	2F7124
Souris Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Strain #028054	Ligne inductible spécifique aux AT2
Souris Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Strain #028054
Souris rapporteures Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2	Élevage interne	Générées par croisement de souris Sftpc-CreERT2(+/+) avec des souris LSL-GFP(+/+)	Utilisé pour le marquage GFP spécifique aux AT2
Souris rapporteures Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2	Élevage interne	Générées par croisement de souris Sftpc-CreERT2(+/+) avec des souris LSL-GFP(+/+)
Fil de soie	Look	SP117
Service de séquençage d'ARN d'une cellule	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services	Préparation de la bibliothèque et séquençage
Service de séquençage d'ARN d'une cellule	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services
Tamoxifène	Sigma-Aldrich	T5648
Incubateur à bain d'eau	Fisherbrand	Isotemp GPD 28	Incubation à température contrôlée
Incubateur à bain d'eau	Fisherbrand	Isotemp GPD 28
Xylazin (Rompun)	Dechra	NADA #047-956