Analyse quantitative micro-CT du parenchymateux pulmonaire et du remodelage des voies respiratoires dans un modèle de Ferret de mucoviscidosse pulmonaire

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour utiliser la micro-tomodensise afin d’évaluer quantitativement les caractéristiques de la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine dans un modèle de furet. Ce modèle de furet démontre un fort potentiel translationnel pour comprendre la fibrose pulmonaire et tester de nouvelles thérapies.

Résumé

La fibrose pulmonaire (PF) est une maladie pulmonaire chronique et progressive caractérisée par une lésion alvéolaire répétée entraînant un épaississement du parenchyme, des cicatrices et une insuffisance respiratoire. Les modèles actuels de rongeurs, en particulier ceux utilisant la bléomycine (BLEO), ont une pertinence translationnelle limitée pour la fibrose pulmonaire idiopathique humaine (IPF) en raison de différences anatomiques telles que l’absence de bronchioles respiratoires. Pour répondre à cette limitation, nous avons développé un modèle animal de grande fibrose pulmonaire chez les furets, qui possèdent des bronchioles respiratoires similaires à celles chez l’humain. Les furets sauvages de trois mois ont reçu une instillation intratrachéale de BLEO. Les poumons ont été prélevés 8 semaines après le traitement pour une micro-tomodensitométrie (micro-CT) et une évaluation histologique. En raison de la résolution spatiale limitée du scanner multidétecteur (MDCT) pour visualiser les petites voies respiratoires du furet, les poumons excisés ont été imagés ex vivo à l’aide d’un microscanner CT à des pressions contrôlées des voies respiratoires (0 cmH₂O et 25 cmH₂O) pour simuler des conditions expiratoires et inspiratoires.

L’imagerie micro-CT a révélé des différences structurelles distinctes entre les poumons de furet normaux et traités par BLEO. Les poumons normaux présentaient une faible atténuation et une architecture préservée, tandis que les poumons traités à la BLO présentaient une atténuation nettement accrue compatible avec la fibrose. Des caractéristiques caractéristiques de la maladie pulmonaire fibrosique humaine, notamment le réseautage en nid d’abeilles avec les espaces kystiques, l’épaisissement des septa interlobulaires et les opacités du verre dépoli indiquant des modifications fibrotiques ou inflammatoires précoces, étaient évidentes. Grâce à une analyse quantitative par micro-CT, il a été observé que les voies respiratoires dans les poumons de furets traités avec BLUO présentaient une expansion radiale significativement réduite, un étirement longitudinal et un changement de volume aux deux pressions d’air appliquées. De plus, une analyse par génération a révélé un épaississement significatif des parois des voies respiratoires dans les régions présentant une fibrose visuellement apparente. L’évaluation histologique, incluant la coloration trichrome de Masson, a confirmé un dépôt important de collagène et une fibrose.

Cette étude démontre que les furets traités par BLUO développent des caractéristiques radiologiques, mécaniques et histopathologiques ressemblant à la fibrose pulmonaire humaine. De plus, la micro-tomodensitomométrie permet une évaluation à haute résolution de la distribution des fibres, de la dynamique des voies respiratoires et des variations du volume pulmonaire. Ces résultats mettent en lumière le potentiel du furet comme modèle translationnel pour étudier la pathogenèse de la PF et évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Introduction

La fibrose pulmonaire (PF) est une maladie pulmonaire interstitielle chronique et progressive dans laquelle une lésion alvéolaire répétée entraîne un épaississement parenchymatose, une fibrose et une dysfonction respiratoire^{progressive 1}. La fibrose pulmonaire peut être induite par diverses expositions, notamment des médicaments, des toxines environnementales, des infections, des troubles auto-immuns sous-jacents, ou elle peut être^{idiopathique 1}. Bien que des médicaments aient été développés pour ralentir la progression de la maladie, en particulier chez les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique (IPF), la fibrose pulmonaire reste incurable, avec un taux de survie de 3 à 5 ans après le diagnostic ^1,2. Dans la plupart des cas, le seul traitement définitif est une greffe pulmonaire ; Il est donc urgent de développer de nouvelles options thérapeutiques plus efficaces.

La bléomycine est un médicament couramment utilisé chez l’humain pour le traitement des cancers ; Cependant, son utilisation est limitée par la toxicité pulmonaire, qui peut rapidement évoluer vers la fibrose^{pulmonaire 3}. Suite à la découverte de cet effet secondaire, la bléomycine a été utilisée dans la recherche pour développer des modèles animaux de fibrose pulmonaire. Les souris ont été couramment utilisées à cet effet ^4,5,6 avec diverses méthodes d’administration de la Bléomycine, notamment l’instillation intratrachéale^{et intratrachéale 7,8}. Bien que la fibrose se développe dans ces modèles, aucun d’eux n’englobe toutes les caractéristiques cardinales de la fibrose pulmonaire observée chez^l’humain. Les modèles de fibrose pulmonaire chez les rongeurs ne reflètent pas les caractéristiques clés de la maladie avancée, notamment la formation de kystes en nid d’abeille et la bronchiolisation des alvéoles^{distaux 9}. De plus, des études ont montré que les lésions pulmonaires induites par la bléomycine commencent à se résoudre spontanément chez les rongeurs environ 28 jours après le traitement^{à la bléomycine 10}. De plus, aucun des agents démontrés pour inhiber la fibrose dans ces modèles n’a eu un effet équivalent chez l’humain, limitant nos options^{thérapeutiques 11}.

Les furets domestiques (Mustela putorius furo) sont de plus en plus utilisés dans la recherche biomédicale respiratoire en raison de leurs similitudes anatomiques avec le système respiratoire^{humain 12}. De plus, ils sont sensibles à des agents pathogènes respiratoires similaires infectant l’humain, notamment le virus syncytial respiratoire (VRS) et la grippe, ce qui montre leurs similitudes^{physiologiques 12}. Les modèles de bléomycine de furet démontrent la bronchiolisation, la formation de foyers fibrotiques et la présence de cellules aberrantes de type basaloïde (KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^–/TP63⁺)⁹. Une seule dose de bléomycine a induit une fibrose pulmonaire soutenue chez les furets, avec une physiologie restrictive et des anomalies pulmonaires fibrotiques persistant pendant au moins 22^{semaines 13}. Cette constatation diffère considérablement du modèle largement utilisé de la bléomycine chez la souris, où la fibrose est généralement auto-limitante et commence à se résoudre après environ 28 jours, avec une régression substantielle survenant vers 6 à 8 semaines, ce qui suggère que le modèle du furet pourrait mieux reproduire la nature chronique et progressive de la fibrose pulmonaire humaine. De plus, les furets ont récemment été utilisés dans la recherche sur la mucoviscidose, une maladie systémique qui affecte le plus couramment le système respiratoire, en raison de leur ressemblance avec^l’humain. Par conséquent, ces animaux peuvent servir de meilleurs modèles pour la PF que les modèles précédents chez les rongeurs.

Cette étude actuelle visait à développer un modèle animal de fibrose pulmonaire qui ressemble davantage à la condition humaine. Nous avons administré de la bléomycine intratrachéale à des furets domestiques. Après 8 semaines, ces furets ont montré des changements radiographiques et histologiques similaires à ceux observés chez les humains atteints de fibrose pulmonaire.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux directives et règlements du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’État du Michigan (Approbation du protocole animalier n° PROTO202300066). Les protocoles de soins et expérimentaux ont été approuvés par l’Université d’État du Michigan et réalisés conformément aux normes institutionnelles pour l’utilisation éthique des animaux en recherche.

1. Instillation bronchoscopique de bléomycine chez les furets

1. Adoptez des furets mâles âgés de 3 à 4 mois. Le poids moyen d’un mâle furet à cet âge devrait être d’environ 0,9 à 1,6 kg. Hébergez les animaux à 21 °C avec une humidité de 40 % à 50 %.
2. Administrez du gaz isoflurane à 3 % à 5 % au furet à l’aide d’une machine d’anesthésie vaporisatrice de précision.
3. Maintenir l’anesthésie en couvrant le nez du furet avec un cône nasale et continuer à administrer du gaz isoflurane à une concentration de 3 % à 5 %.
4. Lorsque le furet est suffisamment sédaté et couché, commencez la bronchoscopie à l’aide d’un bronchoscope de 2,7 mm de diamètre extérieur.
5. Injectez un mélange de bléomycine (2 U/kg de poids corporel) et de solution saline via le canal de travail dans la trachée distale pour permettre une dispersion diffuse de la bléomycine. Assurez-vous que le volume total injecté ne dépasse pas 1 mL. Ramenez les furets dans leurs logements respectifs et surveillez pendant 8 semaines.
   REMARQUE : L’installation ne doit pas prendre plus de deux minutes à être terminée.
6. Administrez de l’isoflurane à l’aide d’une machine d’anesthésie gazeuse vaporisatrice de précision. Couvrir le nez du furet avec un cône de nez et administrer 1 % à 5 % d’isoflurane jusqu’à ce que le furet soit couché. Continuez l’exposition au gaz jusqu’à ce qu’un décès clinique apparent soit confirmé. Administrez une solution d’euthanasie intraveineuse à une dose de 90 mg/kg et surveillez les constantes jusqu’à la confirmation du décès.
7. Prélèvez les poumons 8 semaines après le traitement pour une micro-tomodensitométrie (micro-CT) et une évaluation histologique.

2. Imagerie micro-CT haute résolution des poumons de furet

1. Préparez le tissu pulmonaire excisé pour l’imagerie en retirant les tissus et le sang superflus via l’incision de la veine cave inférieure afin de permettre le drainage sanguin. Effectuez le scanner immédiatement après avoir préparé les poumons.
2. Obtenir des images tomographiques micro-CT à l’aide d’un système micro-CT avec les réglages d’acquisition d’image suivants : 90 keV, 88 μA, réglage de puissance avec un filtre collimateur à rayons X en cuivre de 60 μm et 500 μm en aluminium, en utilisant un champ de vision (FOV) de 72 mm à une résolution isotrope de 144 μm.
3. Acquérir un total de 5 images à des temps standards de portique de 18 s en utilisant un protocole de couture automatisé pour chevaucher, assembler et rejeter des coupes en double afin de créer une image finale brodée pour l’analyse des voies respiratoires ; cela donnera un champ de vision cylindrique de 68 mm de diamètre x 186 mm de profondeur d’image cousue totale (plan Z) à une résolution voxel de 144 μm, permettant la capture complète de l’ensemble du bloc pulmonaire de furet ex vivo .
   1. Répétez ce protocole d’imagerie pour chaque paire de poumons de furet ex vivo à la fois à 0_{cmH 2}O et 25 cmH₂O.
   2. Utilisez un système de surveillance de la pression directement connecté au poumon pour contrôler et maintenir précisément la pression des voies respiratoires lors de l’imagerie.
   3. Couplez le pressiomètre à une source de débit d’air régulé pour permettre un ajustement continu de la pression intrapulmonaire.
   4. Avant l’imagerie, réglez le système au niveau de pression souhaité (soit 0 cmH₂O, soit 25 cmH₂O) et gonflez le poumon en utilisant un flux d’air constant.
   5. Lors de l’imagerie, utilisez le surmètre pour fournir un retour en temps réel sur la pression des voies respiratoires et compenser les fluctuations mineures de pression grâce à la source d’écoulement d’air.

3. Traitement d’image et segmentation

1. Chargez les volumes d’images micro-CT reconstruits au format DICOM, qui sont convertis en format initiative technologique en informatique de neuroimagerie (NIfTI), dans la chaîne de segmentation des voies aériennes.
2. Définir la région d’intérêt (ROI) dans l’image micro-CT en recadrant manuellement les tranches axiales à l’extrémité supérieure pour exclure le tube et d’autres inserts trachéaux (voir Figure 1A).
3. Effectuez la segmentation des voies aériennes en utilisant l’algorithme automatisé Freeze-and-Grow^15,16 décrit dans les étapes principales suivantes.
   1. Placer une graine à l’intérieur de la trachée sur la tranche axiale la plus haute de l’image dans le ROI ; créer un tableau d’images vide de taille d’image d’entrée pour représenter le volume initial confiant des voies respiratoires (CAV) avec tous les voxels assignés à '0' ; et ajouter le voxel de départ à CAV en fixant sa valeur à '1'.
   2. Fixez un seuil d’intensité micro-CT conservateur initial t = -1000 HU pour la segmentation de la lumière des voies respiratoires.
   3. Créez un tableau d’images vide de taille d’image d’entrée pour représenter le volume interdit (FV) avec tous les voxels initialisés à '0'.
   4. Répétez la segmentation itérative jusqu’à la convergence de la segmentation du lumen des voies aériennes définie par l’un des deux drapeaux : 1) toute la plage de seuil (-1000 à -600 HU) est vérifiée, ou 2) tous les voxels « 0 » adjacents aux voxels « 1 » dans l’image CAV sont marqués comme « 1 » dans l’image FV.
      1. Calculez l’arbre central du^{CAV 17} et identifiez les extrémités terminales¹⁸.
      2. Appliquez un seuil binaire sur l’image micro-CT à la valeur actuelle de t et calculez^{le nouveau volume} 18 connecté au lumen avec le CAV comme graines sur la région seuillée (valeur voxel ≤ t), tout en excluant FV.
      3. Pour chaque extrémité CAV, calculez les voxels associés dans le nouveau volume de lumens, en excluant les CAV qui sont plus proches de ce point que de tout autre point final.
      4. Détecter l’extrémité CAV avec un grand volume de voxels associés (>150 voxels, équivalent à 0,5 mm³) comme sites potentiels de fuite dans le nouveau volume de lumens.
      5. Confirmer une fuite potentielle de lumen en utilisant les critères automatisés définis par Nadeem et ^al.15.
      6. Supprimez toute fuite de volume lumen en supprimant le volume du sous-arbre distal aux racines de fuite, et ajoutez des voxels autour des racines de fuite pour augmenter la FV en utilisant les algorithmes décrits^{précédemment 15}.
      7. Assigner le volume de lumens retirés par fuite pour mettre à jour le CAV en utilisant les algorithmes décrits^{précédemment 15}.
      8. Incrémentez le seuil t de '1'.
      9. Passe à l’étape 3.3.4.
4. Effectuez le calcul d’un arbre central de voie aérienne d’une épaisseur d’un voxel en utilisant un algorithme automatisé¹⁷ précédemment validé, décrit dans les étapes principales suivantes.
   1. Saisissez l’arbre segmenté des voies aériennes sous forme d’image binaire NIfTI.
   2. Calculez l’arbre initial de la ligne centrale des voies aériennes en utilisant une approche de chemin à coût minimum^{préférée en milieu 17} , décrite dans les étapes principales suivantes.
      1. Créer un tableau d’images squelettiques vide de taille d’image d’entrée avec tous les voxels assignés à '0' ; Ajoutez la graine automatisée de l’étape 3.3.1 comme voxel squelette initial avec la valeur '1'.
      2. Créez un tableau d’images vide de la taille de l’image d’entrée avec tous les voxels assignés à '0' pour représenter l’image du volume des voies respiratoires marquée.
      3. Identifiez le voxel dans le volume non marqué des voies respiratoires qui est le plus éloigné du squelette actuel et calculez le chemin à coût minimum médialement préféré reliant ce point au squelette actuel en utilisant l’algorithme décrit^{précédemment 17}.
      4. Ajoutez le chemin résultant comme une nouvelle branche squelettique à la matrice d’images du squelette, et mettez à jour le volume marqué par les voies aériennes en appliquant une dilatation locale adaptative à l’échelle le long de la branche, comme décrit^{précédemment 17}.
      5. Répétez les étapes 3.4.2.3–3.4.2.4 jusqu’à ce que le volume marqué des voies respiratoires soit rempli.
   3. Taillez les branches topologiques spuries tout en préservant les véritables lignes centrales des voies aériennes en utilisant une stratégie de sélection locale basée sur l’échelle sur la longueur des branches, comme décrit^{précédemment 17}.
   4. Éliminer les points^{simples 19} de la ligne centrale des voies aériennes qui ne sont pas des extrémités de branche (c’est-à-dire celles adjacentes à plus d’un voxel de ligne centrale) afin d’assurer la cohérence topologique et de maintenir une ligne centrale d’épaisseur d’un seul voxel.
5. Effectuer la segmentation du parenchyme pulmonaire dans des microimages des poumons de furet à 0_{cmH 2}O.
   1. Délimitez manuellement le parenchyme pulmonaire sur chaque cinquième tranche d’image coronale à l’aide d’algorithmes computationnels et d’interfaces graphiques intégrées dans^{ITK-SNAP 20}.
      REMARQUE : Le contraste d’intensité micro-CT entre le parenchyme pulmonaire et le fond environnant à l’état d’inflation_{25 cmH 2O}était insuffisant, empêchant une segmentation fiable du volume pulmonaire.
   2. Appliquez l’interpolation d’image pour générer une segmentation du parenchyme pulmonaire aux tranches intermédiaires de l’image.
   3. Effectuer un second contrôle qualité afin d’assurer la continuité structurelle de la segmentation parenchymatouse le long des directions axiale et sagittale.
   4. Excluez la lumière des voies respiratoires et les régions parois du parenchyme pulmonaire en utilisant une dilatation locale basée sur l’échelle du volume de la lumière, puis soustrayez le volume dilaté du parenchyme pulmonaire.
6. Quantifier les mesures mécaniques des voies^{aériennes 21}.
   1. Quantifier l’expansion radiale liée à la respiration des voies respiratoires individuelles en mesurant les variations de la section transversale spatiale (CSA) spatialement adaptée entre les volumes pulmonaires inspiratoires (inflation 25 cmH₂O) et expiratoires (_{0 cmH}2 O). Calculons l’expansion radiale à une branche des voies aériennes b, notée Δ_air-R(b), comme suit :
      (1)
      où,_{CSA ins}(b) et CSA_exp(b) désignent la lumière des voies respiratoires (CSA) aux volumes pulmonaires inspiratoires et expiratoires. La CSA à b est calculée en utilisant un tracé radial de ligne et des méthodes localement adaptatives de demi-max sur la moitié centrale de la branche b²².
   2. Quantifiez l’étirement longitudinal lié à la respiration des voies respiratoires individuelles comme suit :
      (2)
      où L_ins(b) et L_exp(b) désignent respectivement les longueurs de chemin géodésiques de la branche des voies respiratoires b aux volumes pulmonaires inspiratoires et expiratoires. La longueur du chemin géodésique d’une branche est calculée en suivant le chemin central de la carine jusqu’à l’extrémité distale de la^{branche 21}.
7. Quantifier les mesures basées sur l’intensité du parenchyme pulmonaire.
   1. Visualisez spatialement la répartition micro-CT de l’intensité du parenchyme pulmonaire chez les furets sains et fibrotiques en générant une « représentation volumique 3D à travers la vision » du volume du parenchyma pulmonaire dans le contexte de l’arbre des voies respiratoires. Réaliser l’effet de regard en utilisant une correspondance de transparence définie par l’intensité micro-CT et un codage couleur. Appliquez la même cartographie de transparence et le même codage par couleur des échelles pour les poumons de furet sains et fibreux. Les étapes suivantes sont appliquées pour générer la représentation volumique 3D à look-through.
      1. Utilisez le trancheur^{3D 23} pour ouvrir l’image tridimensionnelle (3D) du NIfTI de segmentation des voies aériennes à 0_{cmH 2}O d’inflation comme une « segmentation ».
      2. Générez une représentation 3D des voies aériennes à l’aide du module Segmentations . Sélectionnez le volume des voies respiratoires en entrée et, dans l’onglet Représentations , cliquez sur Créer sous l’option Surface fermée .
      3. Importez l’image d’intensité micro-CT avec le parenchyme pulmonaire séparé dans un trancheur 3D en volume. Sur cette image, les valeurs d’intensité micro-CT originales sont conservées pour les voxels pulmonaires, tandis que tous les voxels non pulmonaires ont une valeur de -2000 HU.
      4. Configurez la cartographie des couleurs et de la transparence pour les intensités parenchymateuses pulmonaires à l’aide du module Volume Rendering . Des valeurs d’intensité cartographiques de -1500 HU, -600 HU, 0 HU et 1500 HU vers noir, vert, jaune et rouge, avec des opacités de 0, 0,15, 0,3 et 1 respectivement.
   2. Utilisez l’algorithme développé dans cette étude pour estimer la fraction de tissu malade dans le parenchyme pulmonaire en analysant la distribution d’intensité observée grâce à l’imagerie micro-CT. La méthode suppose que les valeurs d’intensité des régions parenchymateuses saines suivent une distribution gaussienne. En revanche, les régions fibrotiques, présentant des intensités caractéristiquement plus élevées, déforment la gaussianité du côté droit de l’histogramme observé. Accomplissez cette tâche dans les étapes suivantes.
      1. Calculez l’histogramme pour une image isolée du parenchyme pulmonaire à l’étape 3.7.1.3 avec 50 bins sur la plage d’intensité de -1500 HU à 500 HU.
      2. Calculez la moyenne de la distribution gaussienne cible comme mode de l’histogramme et dérivez le paramètre d’écart-type à partir des valeurs d’intensité situées à gauche du mode sur l’histogramme.
      3. Quantifier le volume tissulaire fibrosique comme l’excédent de surface sur le côté droit de l’histogramme observé qui se situe au-dessus de la courbe de distribution gaussienne attendue définie par les paramètres moyens et d’écart-type obtenus à l’étape 3.7.2.2.
      4. Calculez la fraction tissulaire malade comme le rapport entre le volume du tissu fibreux et le nombre total d’histogrammes représentant le volume de la région parenchymateuse.

Résultats

Parmi les cinq furets, les poumons excisés d’un furet sain et d’un furet fibrotique ont été imagés à l’aide d’un microscanner CT à des pressions contrôlées des voies respiratoires de 0_{cmH 2}O et 25 cmH₂O pour simuler respectivement les inflations pulmonaires expiratoires et inspiratoires.

La Figure 1 illustre les résultats intermédiaires du pipeline de traitement d’image pour l’image micro-CT (Figure 1A) d’un poumon de furet ex vivo à_{0 cmH}2 O de pression. La figure 1B présente des résultats intermédiaires de segmentation du volume des voies respiratoires sur les itérations et les paramètres seuils correspondants sur une image micro-CT d’un poumon de furet excisé gonflé à 0_{cmH 2}O. La figure 1B montre l’efficacité de l’algorithme FG pour capturer les voies respiratoires plus petites via la relaxation des paramètres dans les itérations ultérieures. La figure 1C illustre les résultats de la détection des arbres centraux des voies respiratoires avant et après la taille des branches parasites.

Il a été observé qu’au-delà de la cinquième génération, le nombre de voies respiratoires détectées dans les poumons fibrostiques est nettement inférieur à celui détecté lors de la génération correspondante dans le poumon sain (Figure 2A). Plus précisément, 161 branches des voies respiratoires ont été détectées dans le poumon sain au-delà de la cinquième génération, tandis que seulement 91 voies respiratoires ont été détectées dans les poumons fibrostiques sur les générations correspondantes. En général, les parois des voies respiratoires étaient plus épaisses dans les poumons fibreux que dans les poumons sains (Figure 2B). L’analyse computationnelle a révélé une augmentation significative de l’épaisseur de la paroi des voies respiratoires normalisée par le diamètre du lumen dans les régions présentant une fibrose visuellement apparente par rapport aux régions compatibles du poumon sain.

Les poumons fibrostiques ont montré de petits espaces d’air kystiques à parois épaisses, compatibles avec le trissage du miel, l’épaississement des septas interlobulaires et des régions d’opacité du verre dépoli. Les opacités du verre poli désignent des régions du poumon où un tissu pulmonaire épaissi et des espaces aériens partiellement remplis font apparaître la zone brumeuse et grise sur les images CT. Il a été observé que les poumons fibrostiques présentaient des valeurs d’intensité CT plus élevées dans le parenchyme correspondant aux régions fibrotiques. La figure 3A présente une « représentation volumique 3D à travers la vue » du volume segmenté du parenchyma pulmonaire ainsi que de l’arbre segmenté des voies respiratoires. Les valeurs d’intensité micro-CT sur le parenchyme dans les poumons de furet fibrotiques (-502 ± 238 HU) étaient significativement plus élevées (p < 0,001) que celles du poumon de furet sain (-588 ± 167 HU). L’analyse d’élévation de l’intensité régionale (Figure 3B) a montré que le poumon fibrosique présente un volume parenchymateux de 27,8 % avec une intensité CT élevée (indiquée par la zone violette dans l’histogramme). En comparaison, le poumon sain ne présente que 1,24 % de son volume parenchymateux avec une intensité CT élevée.

Une comparaison visuelle de la mécanique des voies respiratoires entre des poumons normaux et malades illustre la répartition des biomarqueurs mécaniques respiratoires des voies respiratoires dans les poumons de furets sains et fibreux à travers les branches des voies respiratoires (Figure 4). Une expansion radiale des voies respiratoires de 66,8 % ± 9,8 % a été observée chez les poumons de furet en bonne santé, ce qui était significativement plus élevé (p < 0,001) que dans les poumons de furet fibrotiques (32,4 % ± 7,6 %). Une différence significative (p < 0,001) dans l’étirement longitudinal des voies respiratoires a également été observée entre les poumons de furet sains (35,7 % ± 5,3 %) et les poumons de furet en bonne santé (35,7 % ± 4,9 %).

Des images CT représentatives ont été prises à l’aide d’un microscanner CT à deux pressions différentes des voies respiratoires (0 cmH₂O et 25 cmH₂O) pour chaque poumon. La figure 5 illustre les différences entre les poumons de furet normaux (figure 5B,C) et traités par BLUO (figures 5E,F). Dans les poumons normaux, les scanners montrent une architecture pulmonaire typique avec une faible atténuation et aucun signe de fibrose (Figure 5B,C). En revanche, les poumons de furet traités par BLEO présentent des changements pathologiques significatifs, notamment une atténuation pulmonaire accrue, indiquant une fibrose tissulaire (Figure 5E,F). De plus, un nid de miel prononcé est observé, caractérisé par des espaces kystiques et un épaississement des septa interlobulaires (Figure 5E,F). Les opacités du verre dépoli (GGO), représentant des zones d’inflammation ou de modifications fibrotiques précoces, sont également visibles dans les poumons traités par BLEO (Figure 5E,F).

L’analyse histologique (Figure 6) a confirmé un remodelage tissulaire important et une fibrose dans les poumons de furets traités à la bléomycine. La coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (HE) a révélé une architecture alvéolaire préservée dans des poumons normaux (Figure 6A, C), tandis que les poumons fibrotiques présentaient une distorsion structurelle étendue, une cellularité accrue, un épaississement de la paroi des voies respiratoires et des lésions fibrotiques proéminentes (Figure 6B,D). La coloration trichrome de Masson a également démontré un dépôt minimal de collagène dans les voies respiratoires et le parenchyme des poumons normaux (Figure 6E,G), tandis que les poumons fibrostiques ont montré une accumulation marquée de collagène dans les voies respiratoires (Figure 6F) et dans les régions parenchymateuses (Figure 6H). L’analyse quantitative de l’image (Figure 6I,J) a confirmé une augmentation significative de la surface positive au collagène dans les poumons fibrosiques par rapport aux témoins normaux dans les voies respiratoires et les compartiments parenchymaux (P < 0,0001), indiquant un dépôt étendu de la matrice extracellulaire et un remodelage progressif des tissus.

Figure 1 : Traitement d’image CT et segmentation. (A) Sélection de la région d’intérêt (ROI) dans une image micro-CT. La ligne de recadrage a été sélectionnée manuellement pour exclure le tube et les autres inserts trachéaux utilisés pour gonfler les poumons de furet excisés. (B) Résultats intermédiaires de la segmentation des voies respiratoires de l’arbre dans une image micro-CT d’un poumon de furet excisé gonflé à 0_{cmH 2O}à l’aide de l’algorithme de congélation (FG). (C) Résultats de détection de ligne centrale avant et après la taille des branches squelettiques spuries appliquées sur le volume de segmentation des voies respiratoires à partir d’une image micro-CT d’un 0_{cmH 2O}. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse computationnelle de la génération d’arbres des voies respiratoires. (A) Le nombre de voies respiratoires détectées dans les poumons sains par rapport aux poumons fibrostiques. (B) Différences dans l’épaisseur de la paroi des voies respiratoires entre des poumons sains et des poumons fibrostiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Visualisation de l’intensité micro-CT codée par couleur. (A) Une visualisation 3D des distributions d’intensité micro-CT codées par couleur à travers le parenchyme pour les poumons de furet sains et fibrotiques à 0 cmH2O d’inflation. (B) Histogrammes d’intensité micro-CT de poumons de furet sains et fibrotiques, avec la zone d’histogramme marquée en violet indiquant des régions d’intensité CT élevées selon la modélisation gaussienne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Biomarqueurs mécaniques respiratoires des voies respiratoires pour les poumons de furet sains et fibrotiques. Pour chaque biomarqueur (A montre l’expansion radiale des voies respiratoires, B montre l’étirement longitudinal des voies respiratoires), un schéma de codage couleur normalisé couvrant la plage de μ_x ± 3σ_x a été appliqué, où la moyenne (μ_x) et l’écart-type (σ_x) de chaque métrique ont été calculées sur toutes les branches du poumon sain du furet. Voir le texte pour des résultats comparatifs quantitatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : L’imagerie micro-CT montre un remodelage structurel étendu et une perte de volume pulmonaire aéré dans les poumons de furets fibrotiques induits par la bléomycine. (A–F) Images micro-CT représentatives acquises à une pression de gonflage de 25 cm H₂O comparer les furets témoins sains (A–C) avec les furets fibrotiques traités à la bléomycine (D–F). Les reconstructions volumique tridimensionnelles (3D) (A,D) montrent une architecture pulmonaire préservée et une expansion homogène dans des poumons sains (A), tandis que les poumons fibrotiques (D) présentent une expansion pulmonaire réduite et une distorsion parenchymatouse marquée. Les césariennes CT transverses (B,E) et coronales (C,F) mettent en lumière davantage les différences entre les groupes. Les poumons sains présentent un parenchyme uniformément aéré avec une ramification normale des voies respiratoires et une densité tissulaire minimale (B,C). En revanche, les poumons fibrostiques présentent une opacification bilatérale subpleurale et prédominante basilaire, une densité parenchymatose accrue, une distorsion architecturale et un élargissement de l’espace aérien kystique, compatible avec un remodelage en nid d’abeille (flèches rouges) (E,F). Des lignes jaunes pointillées délimitent les limites pulmonaires. Ces résultats d’imagerie indiquent un remodelage fibrosique sévère et une réduction substantielle du volume pulmonaire aéré fonctionnel après l’exposition à la bléomycine chez les furets. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Validation de la fibrose pulmonaire de furet induite par BLEO. (A–H) Des sections représentatives colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) en champ clair montrent des différences entre les poumons normaux (A,C) et les poumons fibrotiques (B,D). Les images HE à faible grossissement montrent une architecture alvéolaire préservée dans les poumons normaux (A) ainsi qu’un remodelage tissulaire étendu ainsi que des lésions fibrotiques dans les poumons fibrostiques (B). Les images HE à plus grand grossissement mettent en lumière une structure alvéolaire normale dans les poumons (C) normaux ainsi qu’une cellularité accrue, un épaississement des parois des voies respiratoires et une distorsion architecturale dans les poumons fibrosés (D). Des images représentatives en champ lumineux de sections pulmonaires de furet colorées avec le trichrome de Masson montrent un dépôt minimal de collagène dans les voies respiratoires pulmonaires normales (E) et le parenchyme (G), ainsi qu’une augmentation du dépôt de collagène (bleu) dans les voies respiratoires pulmonaires fibrotiques (F) et le parenchyme (H). (I,J) La quantification de la zone positive au collagène a révélé une augmentation significative du dépôt de collagène dans les poumons fibrosiques par rapport aux poumons normaux dans les deux régions des voies respiratoires (I) et du parenchyme pulmonaire. P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Cette étude décrit un protocole combinant l’administration intratrachéale de bléomycine chez des furets avec une micro-tomodensitométrie ex vivo à haute résolution (micro-CT) afin de caractériser les caractéristiques structurelles et mécaniques de la fibrose pulmonaire. La micro-tomodensitométrie peut détecter de petites voies respiratoires aussi petites que 0,2 mm et mesurer les volumes, l’épaisseur des voies respiratoires, la densité et la morphologie. L’augmentation de la densité tissulaire, la perte de volume et l’hétérogénéité régionale correspondent étroitement à l’histopathologie. L’objectif principal était d’établir la faisabilité et de démontrer que ce modèle animalier de grande taille, combiné à des analyses d’imagerie avancées, peut capturer des caractéristiques radiologiques, des voies respiratoires et histopathologiques ressemblant à la fibrose pulmonaire humaine. Plusieurs étapes du protocole sont cruciales pour la reproductibilité et l’interprétabilité. Premièrement, l’instillation de bléomycine intratrachéale guidée par la bronchoscopie permet une exposition diffuse des poumons tout en minimisant l’accumulation des voies respiratoires proximales, une limitation connue des modèles de petits^{animaux 4,7,11}. Cette approche réduit probablement la variabilité de la répartition régionale des blessures, ce qui est particulièrement important dans les poumons plus grands avec des branches plus complexes des voies respiratoires. Deuxièmement, choisir un point de temps post-insomnation de 8 semaines favorise la fibrose établie plutôt que l’inflammation aiguë. Dans les modèles murins, la fibrose induite par la bléomycine se résout souvent partiellement avec le temps, limitant la pertinence^{translationnelle 4,8,11}. En revanche, les poumons de furet dans cette étude ont montré des caractéristiques fibrotiques radiologiques et histologiques persistantes.

Le contrôle de l’inflation pulmonaire lors de l’imagerie ex vivo représente un autre élément crucial. L’imagerie à des pressions standardisées des voies respiratoires (0 cmH₂O et 25 cmH₂O) a permis de quantifier l’expansion radiale des voies respiratoires et l’étirement longitudinal, réduisant ainsi les effets de confusion liés à la variation du volume pulmonaire et à la complaisance. Ces biomarqueurs mécaniques des voies respiratoires, dérivés à l’aide d’algorithmes automatisés et adaptés à la génération, fournissent des mesures objectives du dysfonctionnement des voies respiratoires difficiles à évaluer uniquement en histologie^{conventionnelle 15,21}.

Plusieurs modifications du protocole pourraient encore renforcer la robustesse. Le dosage de bléomycine pourrait être ajusté ou administré à de basses doses répétées afin de mieux modéliser la lésion épithéliale chronique, qui est centrale dans les paradigmes actuels de la pathogenèse de la fibrose^{pulmonaire 1,3}. Les stratégies d’instillation segmentaire peuvent permettre des comparaisons internes entre les régions fibreuses et relativement préservées. D’un point de vue imagerie, une standardisation rigoureuse de la pression des voies respiratoires, des conditions de fixation et de la température est essentielle pour minimiser la déformation tissulaire lors de l’échographie ex vivo. Une fibrose sévère peut compliquer la segmentation automatisée des voies respiratoires en raison de l’oblitération des voies respiratoires et d’une densité tissulaire élevée ; Par conséquent, le seuil adaptatif et le contrôle qualité manuel restent des compléments essentiels aux pipelines^{automatisés 15}.

Cette méthode présente plusieurs limites. Notamment, le faible nombre d’animaux imagés par la micro-CT limite l’inférence statistique, et les résultats doivent être interprétés de manière descriptive. Ce travail a été conçu comme une étude pilote pour déterminer la faisabilité de caractériser un modèle de mucoviscidosse pulmonaire induit par la bléomycine à l’aide de micro-CT quantitatif. De futures études avec des cohortes plus importantes seront nécessaires afin de valider ces résultats et d’améliorer la puissance statistique. Cependant, la description montre une différence notable dans les biomarqueurs d’imagerie et les mesures.

De plus, bien que largement utilisée, la fibrose induite par la bléomycine reste un modèle de lésion causée par des toxines et ne reflète pas entièrement l’étiologie multifactorielle de la fibrose pulmonaire idiopathique, incluant le vieillissement, la susceptibilité génétique et les expositions^{environnementales 3,6,11}. L’imagerie a été réalisée ex vivo, empêchant l’évaluation directe de l’échange gazeux, des contributions vasculaires et de la progression longitudinale de la maladie. Néanmoins, la micro-CT ex vivo offre une résolution spatiale supérieure et permet une analyse tridimensionnelle détaillée des petites voies respiratoires, ce qui n’est actuellement pas possible avec la tomodensitométrie multidétecteur clinique chez les furets.

Malgré ces limitations, ce protocole offre plusieurs avantages par rapport aux modèles existants. Les furets possèdent des bronchioles respiratoires et des schémas de ramification des voies respiratoires qui ressemblent davantage à ceux des humains qu’à ceux des rongeurs, ce qui les rend particulièrement adaptés à l’étude des aspects centrés sur les voies respiratoires de la^{fibrose 6,12}. La combinaison d’une anatomie des voies respiratoires pertinente pour l’humain avec une imagerie quantitative basée sur la micro-tomodensitométrie permet une évaluation simultanée de la densité parenchymateuse, de l’épaisseur de la paroi des voies respiratoires, de la perte des voies respiratoires et de la mécanique altérée des voies respiratoires. Ces caractéristiques reflètent les schémas radiologiques observés dans les maladies pulmonaires fibrotiques humaines, notamment le peigne d’odeur, l’épaississement du septum et l’hétérogénéité^{régionale 1,2}.

La tomodensitométrie haute résolution (TCH) est une modalité d’imagerie fondamentale pour le diagnostic et le suivi longitudinal de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) en pratique clinique. La TCH repose sur des principes similaires à la micro-tomodensitométrie (micro-CT) et a été optimisée pour détecter les anomalies pulmonaires parenchymiques tout en minimisant l’exposition aux radiations chez^{les patients 24}. Il est important de noter que les avancées dans la HRCT ont amélioré la précision diagnostique au point que la biopsie pulmonaire chirurgicale n’est souvent plus nécessaire pour le diagnostic IPF lorsque des caractéristiques d’imagerie caractéristiques sont^{présentes 25}. Les résultats radiographiques caractéristiques de la FPI, notamment la distorsion architecturale, la bronchiectasie de traction, le dépeignage et les espaces aérateurs kystiques, peuvent être identifiés par HRCT chez les patients. Conformément à ces observations cliniques, notre modèle de furet démontre une distorsion des voies respiratoires et la formation de l’espace kystique détectables par micro-CT, fournissant un phénotype d’imagerie qui ressemble étroitement à la maladie humaine.

En plus de la TCH, la tomographie par cohérence optique endobronchique (EB-OCT) s’est imposée comme une approche d’imagerie précieuse pour l’évaluation de la^{FPI 26}. L’EB-OCT est une technique peu invasive qui utilise les ondes lumineuses pour générer des images en haute résolution et tridimensionnelles du poumon périphérique in vivo à l’aide d’un bronchoscope^{standard 26}. À l’instar de la CRS, l’EB-OCT a montré des promesses pour identifier le remodelage fibrosique sans nécessiter de biopsie chirurgicale. La capacité de notre modèle de furet à développer des anomalies structurelles détectables par imagerie par scanner basé sur le scanner suggère qu’il pourrait également être bien adapté à une évaluation future utilisant des modalités d’imagerie clinique émergentes telles que l’EB-OCT.

Il est important de noter que de nombreuses thérapies atténuant la fibrose chez les modèles de rongeurs n’ont pas démontré une efficacité similaire chez^{l’humain 11}. L’approche décrite ici peut aider à combler ce fossé translationnel en fournissant des biomarqueurs d’imagerie sensibles et spatialement résolus, reflétant à la fois la structure et la fonction. De tels biomarqueurs pourraient être utilisés pour évaluer la réponse thérapeutique au-delà de la charge globale de collagène, en capturant des améliorations régionales dans la mécanique des voies respiratoires ou le remodelage parenchymeux.

En conclusion, cette étude établit un protocole réalisable pour modéliser la fibrose pulmonaire chez les furets et pour évaluer quantitativement les modifications structurelles et mécaniques liées à la maladie à l’aide de micro-CT. Bien que préliminaire, cette approche met en lumière le potentiel de combiner des modèles de grands animaux avec des analyses d’imagerie avancées afin d’améliorer la pertinence translationnelle, d’améliorer la compréhension mécaniste de la fibrose pulmonaire et de soutenir l’évaluation préclinique de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 mL Luer locking syringe	BD	309628
10 mL Luer locking syringe	BD	303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet catheter	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL Luer locking syringe	BD	309657
30 mL Luer locking syringe	BD	302832
5 mL Luer locking  syringe	BD	309647
BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide needle 20 G ´ 1"	BD	305175
BD Precision glide needle 23 G ´ 1"	BD	305145
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-)	Gibco	14190250
Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheter	Caphstion	2.0MM
ET Tube, Uncuffed, 2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater stabilization solution	Fisher Scientific	AM7021
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Lubricant PM ointment	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	Pommade pour les yeux
MADgic 700 atomizer	Teleflex	MAD700
Manometer, Professional air pressure meter	Leaton	T168
Rodent ventilator model 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
Sterile saline, 0.9%	CellPro	DS0329
Veterinary pulse oximeter	uPM60V	UVMI