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Une méthode basée sur la fluorescence pour visualiser la dynamique des gouttelettes lipidiques et des organites lors de la mitose dans les cellules hépatomes

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DOI :

10.3791/71222

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15 mai 2026

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1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

Dans cet article

Résumé

Ce protocole permet la visualisation reproductible des gouttelettes lipidiques et de la dynamique des organites lors de la mitose en utilisant des cellules hépatomes synchronisées.

Résumé

Les gouttelettes lipidiques intracellulaires (LD) sont omniprésentes dans plusieurs types cellulaires. Les LD stockent des lipides neutres tels que le triacylglycérol et l’ester de cholestéryle et jouent un rôle important dans le métabolisme énergétique, la signalisation et les réponses au stress. Bien que les LD soient reconnus comme des organites intracellulaires, leur comportement au cours de la progression du cycle cellulaire reste incertain. Pendant la mitose, plusieurs organites, dont les mitochondries et l’appareil de Golgi, subissent une remodelation approfondie puis un réassemblage ultérieur, ce qui soulève la question de savoir si les LD subissent également des changements dépendants du cycle cellulaire. Puisque les LD peuvent servir de sources d’énergie et de centres de signalisation, clarifier leur dynamique pendant la mitose est particulièrement important. Pour y remédier, nous présentons un protocole qui combine la synchronisation du cycle cellulaire avec la coloration fluorescente du LD dans les cellules hépatomatomes. Les cellules sont synchronisées à la frontière G2/M en utilisant une approche basée sur un inhibiteur de la kinase 1 dépendante de la cycline, libérées dans le cycle cellulaire et collectées à des moments précis. Les lucides sont ensuite marquées avec un colorant lipidique neutre et visualisées par microscopie à fluorescence. Cette méthode offre une approche reproductible pour examiner la redistribution de la LD pendant la mitose et peut être appliquée de manière large aux études de biologie des organites, de régulation métabolique et de physiologie des cellules cancéreuses.

Introduction

Le cycle cellulaire est un événement hautement orchestré qui assure la duplication et la ségrégation précises de l’ADNchromosomique 1,2, durant lequel les organites intracellulaires sont réorganisésdynamiquement 3. Il se compose de quatre grandes phases : G1, S, G2 et M 1,2. Lors de la mitose, les chromosomes dupliqués s’alignent sur le plan équatorial du fuseau bipolaire et sont ensuite transférés à deux cellulesfilles 4. Les organites tels que les mitochondries et l’appareil de Golgi subissent une remodelation importante lors de lamitose 5,6,7,8. Ces organites se fragmentent en petites vésicules avant d’être distribués aux deux cellules filles, où ils se réassemblent au cours de la progression du cycle cellulairesuivant 3.

Les gouttelettes lipidiques (LD) sont des organites contenant des lipides neutres composés d’un noyau de lipides neutres entouré d’une monocouche de phospholipides. Ils sont associés à un ensemble diversifié de protéines et se retrouvent largement dans de nombreux types de cellules, y compris les cellulesproliférantes 9,10. La composition des protéines et des lipides des LD varie selon le type cellulaire ettissulaire 11. Parmi ces protéines, la famille périlipine (PLIN) a été largement étudiée, et PLIN2 stabilise les LD dans leshépatocytes 12,13. En plus de la stabilisation structurale, les protéines de la famille PLIN ont été impliquées dans la régulation de la dynamique de la LD et des interactions avec d’autres composantscellulaires 14. Les LD fonctionnent non seulement comme des dépôts de stockage pour le triacylglycérol et l’ester de cholestéryl, mais aussi comme des centres pour le métabolisme énergétique15, les voies designalisation 16 et l’adaptation austress 17. Dans les pathologies, telles que la stéatohépatite associée à un dysfonctionnement métabolique (MASH, anciennement appelée NASH), l’accumulation de la LD est nettement accrue par rapport au groupe témoinsain 18,19, ce qui souligne son importance dans la biologie des maladies. Cependant, seule une observation limitée de la localisation spatiale des LD dans les cellules en division était disponible, malgré des recherches approfondies sur la dynamique des mitochondries, du réticulum endoplasmique et de l’appareil de Golgi pendant la mitose. Nous avons analysé la localisation de la LD pendant la mitose, en utilisant la méthode présentée ici. Nous avons déjà rapporté que les LD présentaient des schémas de distribution spatiale différents de ceux des autres organitesintracellulaires 20.

Nous fournissons ici un protocole détaillé pour étudier la distribution des LD et autres organites intracellulaires lors de la mitose dans les cellules hépatométiques. La méthode inclut la synchronisation du cycle cellulaire et la coloration fluorescente, permettant une visualisation reproductible de la dynamique de la LD pendant la mitose. Des résultats représentatifs montrent que les LD présentent des variations spatiales dépendantes du cycle cellulaire dans la distribution spatiale entre interphase et mitose, facilitant une analyse comparative de la localisation des LD lors de la division cellulaire. Cette approche peut être largement appliquée à l’étude de la localisation, de la dynamique et de la régulation métabolique des organites, tant dans des contextes physiologiques que pathologiques.

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Protocole

1. Solutions d’origine requises pour ce protocole

  1. Préparez une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 24 % (p/v) dissoute dans 150 mM de NaCl.
  2. Préparez une solution de stock de RO-3306 de 10 mM (un inhibiteur sélectif de la kinase 1 dépendante de la cycline 1 (CDK1)) dissous dans le DMSO dans des conditions stériles.
    REMARQUE : D’autres solutions couramment utilisées, telles que le NaOH, le NaCl et le sérum tamponné phosphate (PBS), ont été préparées selon la pratique standard du laboratoire. Le PBS a été préparé en dissolvant 2,6 g de NaH₂PO₄·2H₂O, 29 g de Na₂HPO₄·12H₂O, 80 g de NaCl et 2,0 g de KCl dans de l’eau distillée, puis en ajustant le volume final à 1 L.

2. Préparation de l’acide oléique conjugué avec le BSA

  1. Placez 90 mg d’acide oléique dans un bécher de 50 mL et ajoutez 2 mL d’éthanol (99,5 %) pour le dissoudre.
  2. Ajoutez 100 μL de 5 N NaOH à la solution et remuez jusqu’à ce qu’ils soient complètement mélangés.
  3. Évaporer l’éthanol sous un jet d’azote.
  4. Ajoutez 10 mL de NaCl à 150 mM et faites couver le mélange à 60 °C pendant 5 minutes.
  5. Ajoutez lentement 12,5 mL de solution de stock BSA refroidie à 24 % (p/v) à la solution d’acide oléique (2,4) et remuez doucement le mélange en continu pendant 10 minutes pour permettre un mélange progressif et homogène à température ambiante.
  6. Ajustez le pH à 7,4 et portez le volume final à 25 mL avec 150 mM de NaCl. La concentration finale d’acide oléique sera de 12,8 mM.
  7. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 μm en conditions stériles et conservez les aliquotes à 4 °C pendant jusqu’à 2 semaines ou à -20 °C pour un stockage plus long.

3. Synchronisation des frontières G2/M des cellules

  1. Préparez les commandes nécessaires.
    1. Préparez des cellules asynchrones non traitées sans traitement à RO-3306 comme contrôle de base.
    2. Pour les conditions traitées à l’acide oléique, préparez les cellules traitées uniquement à l’acide oléique sans synchronisation comme point de départ.
    3. Pour la coloration par fluorescence, effectuer des contrôles de coloration unique pour chaque fluorophore afin de vérifier la spécificité du signal et d’exclure le chevauchement spectrale entre les canaux (Figure supplémentaire 1).
    4. Acquérir des images en utilisant des réglages d’acquisition séquentielle ou des configurations de filtres appropriées pour minimiser le chevauchement spectral et la diaphonie du canal.
      REMARQUE : Ces témoins sont essentiels pour distinguer les changements dépendants du cycle cellulaire de la distribution initiale des organites et pour valider la spécificité de fluorescence.
  2. Maintenir les cellules HuH7 dans le milieu modifié d’Eagle de Dulbecco, complétés avec 10 % de sérum fœtal bovin, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂.
  3. Placez les gaines de verre dans un bol de culture de 35 mm. Semez 2 × 105 cellules par plat de 35 mm dans le milieu décrit ci-dessus et incubez les cellules toute la nuit à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂.
  4. Laver les cellules deux fois avec du PBS puis incuber avec un milieu frais contenant 9 μM RO-3306 et 0,5 mM d’acide oléique.
  5. Incubez les cellules pendant 20 heures dans des conditions de culture standard.

4. Élimination du réactif RO-3306 des cellules synchronisées pour entrer dans la phase mitotique

  1. Laver les cellules (étape 3.4) trois à cinq fois avec PBS.
  2. Lavez les cellules une fois avec un milieu de culture frais.
  3. Incuber les cellules dans un milieu frais pendant 1 heure à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pour permettre l’entrée dans la mitose.
    REMARQUE : Le retrait du RO-3306 permet aux cellules synchronisées d’entrer dans la phase mitotique à partir de la frontière G2/M. Après avoir lavé le réactif, une proportion importante de cellules entre en phase mitotique en environ 1 heure, période durant laquelle les cellules mitotiques peuvent être identifiées par l’arrondi cellulaire et la condensation chromosomique. Le moment optimal pour observer une phase spécifique de la mitose peut varier selon le type cellulaire et les conditions de la culture.

5. Préparation de l’échantillon de cellules mitotiques

  1. Fixez les cellules avec 4 % de paraformoldéhyde dans le PBS pendant 10 minutes à température ambiante.
    ATTENTION : Les cellules mitotiques ont tendance à se détacher du plat ; Évitez de vous laver avant de fixer.
    REMARQUE : Pour la coloration par PLIN3, les cellules ont été fixées avec une combinaison de 2 % de paraformoldéhyde et 2 % de glutaraldéhyde.
  2. Perméabiliser les cellules fixes contenant 0,1 % (p/v) de Triton X-100 en PBS pendant 10 minutes à température ambiante.
  3. Bloquez les cellules avec 1 % (v/v) de BSA dans le PBS pendant 1 heure à température ambiante.

6. Coloration des LD et autres organites cellulaires

  1. Retirez soigneusement les bâtons de verre de la cuvette à l’aide de pinces fines et placez-les côté cellulaire vers le haut dans une chambre humidifiée pour éviter le séchage.
    REMARQUE : Effectuer toutes les étapes suivantes de coloration dans un environnement humidifié et protégé par la lumière afin de préserver les signaux de fluorescence.
  2. Laver les cellules deux fois avec du PBS et incuber avec des anticorps primaires dilués dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
  3. Laver les cellules deux fois avec du PBS et incuber avec des anticorps secondaires dilués dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante.
  4. Lavez les cellules deux fois avec du PBS et colorez avec un colorant fluorescent lipidique neutre pendant 10 minutes à température ambiante.
    REMARQUE : Des colorants aux propriétés spectrales distinctes ont été sélectionnés pour permettre une imagerie multicolore flexible et minimiser le chevauchement spectral avec d’autres marqueurs d’organites.
  5. Laver les cellules deux fois avec PBS et colorer les noyaux avec un colorant fluorescent liant l’ADN (DAPI : excitation, 350–410 nm ; émission, 420–450 nm) dilué à 1:1 000 dans PBS pendant 5 minutes.
  6. Lavez les cellules deux fois avec du PBS, puis montez les gaines sur des lames en verre à l’aide d’un support antifondu pour préserver la fluorescence lors de l’imagerie.
  7. Scellez les bords des gaines avec du vernis transparent pour éviter le séchage et le mouvement lors de l’imagerie.
    REMARQUE : Comme les signaux fluorescents s’estompent progressivement, prenez des images dans la semaine suivant la coloration.

7. Observation des organites intracellulaires et de leur localisation subcellulaire

  1. Acquérir des images de fluorescence à l’aide d’une microscopie à large champ pour filtrer rapidement plusieurs cellules et sélectionner des cellules interphases et mitotiques représentatives, en utilisant une faible intensité d’excitation et des réglages d’acquisition rapide pour minimiser le photoblanchiment.
  2. Acquérir des images des cellules sélectionnées au gros grossissement approprié pour l’analyse de coloration par fluorescence.
    REMARQUE : Les cellules interphasées présentent généralement un noyau unique intact positionné au centre du cytoplasme. En revanche, les cellules mitotiques présentent des chromosomes condensés alignés dans le plan équatorial du fuseau bipolaire. Ces caractéristiques morphologiques peuvent servir de critères visuels pour distinguer les cellules interphasées et mitotiques.
  3. Visualisez les LD et la morphologie nucléaire en utilisant des ensembles de filtres appropriés pour les colorants fluorescents lipidiques neutres et un colorant fluorescent liant l’ADN par microscopie à fluorescence à champ large.
    REMARQUE : Sélectionnez les ensembles de filtres selon les spécifications du système de microscope utilisé.
  4. Pour une validation à plus haute résolution, acquérir des images de fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale équipée d’une lentille objectif à haute ouverture numérique (par exemple, 60×, NA ≥1,2). Détectez les signaux de fluorescence pour les colorants fluorescents lipidiques neutres et un colorant fluorescent liant l’ADN à l’aide de lasers d’excitation appropriés et des réglages de filtre d’émission. Traiter les images en utilisant des logiciels d’acquisition et d’analyse d’images courants disponibles.
    REMARQUE : Selon le système de microscope, des objectifs à immersion dans l’eau ou à l’huile peuvent être utilisés. Le choix du milieu d’immersion doit suivre les recommandations du fabricant et l’objectif expérimental. La microscopie à fluorescence à grand champ convient à l’observation et à la comparaison de la distribution de la LD entre les cellules interphasées et mitotiques, tandis que la microscopie confocale est recommandée lorsqu’une résolution spatiale plus élevée est requise.

8. Quantification du nombre et de la taille des LD

  1. Acquérir des images de fluorescence des cellules sous des paramètres d’imagerie identiques pour toutes les conditions.
  2. Ouvrez les images acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image.
  3. Fixer des seuils appropriés pour identifier les LD et effectuer une analyse des particules afin de quantifier le nombre et la surface de gouttelettes lipidiques.
    REMARQUE : Les paramètres d’imagerie doivent être maintenus constants dans toutes les conditions afin d’assurer une comparaison précise du nombre de lumière et de la surface.

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Résultats

Synchronisation des cellules hépatomes à la frontière G2/M à l’aide de RO-3306

Pour étudier la dynamique des organites intracellulaires lors de la mitose, RO-3306, un inhibiteur sélectif de CDK1, a été utilisé pour synchroniser les cellules à la frontière G2/M 20,21. Lorsque les cellules ont été traitées avec l’inhibiteur CDK1 pendant 20 heures suivies d’une heure supplémentaire dans un milieu frais, plus de 50 % des c...

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Discussion

La redistribution observée des LD pendant la mitose suggère que leur positionnement n’est pas aléatoire mais est en coordination avec la réorganisation du cytosquelette et la progression du cycle cellulaire. En particulier, l’exclusion des LD de la région du fuseau peut refléter des contraintes spatiales imposées par l’assemblage mitotique du fuseau ou par des mécanismes de transport actifs qui maintiennent la ségrégation des organites lors de la division cellulaire. Dans cette étude, no...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts concernant le contenu de cet article.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la bourse de l’Université Showa pour les jeunes chercheurs et la subvention JSPS KAKENHI numéro 24K10084.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % Trypsin/EDTAWako201-16945Dissociation cellulaire
Plaque de 10 cmCorning430167Culture cellulaire
Plaque de culture cellulaire de 35 mmIWAKI3000-035Culture cellulaire
Plaque de culture cellulaire de 6 cmIWAKI3010-060Culture cellulaire
Anticorps anti-PLIN2 (ADRP)Proteintech15294-1-APMarqueur de gouttelettes lipidiques
Anticorps anti-PLIN3 (TIP47)Proteintech10694-1-APMarqueur de gouttelettes lipidiques
Anticorps anti-α-tubulineSigma-AldrichT6199Marqueur du fuseau mitotique
BODIPY 493/503InvitrogenD3922Coloration des lipides neutres
Filtre de bouteille (0,22 µm)NESTWNB343001Filtration stérile de la solution OA-BSA
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA8022Réactif de blocage
Vernis à ongles transparentDisponible dans le commerceNe s'applique pasScellage des lamelles
Microscope confocalOlympusFV1200Imagerie haute résolution
DAPIDojindo340-07971Coloration nucléaire
D-PBS (–)Wako049-29793Culture cellulaire
Milieu de Dulbecco modifié d’Eagle (DMEM)Wako041-30081Milieu de culture cellulaire
Éthanol (99,5 %)Wako057-00456Solvant pour l’acide oléique
BSA sans acides grasSigma-AldrichA7030Protéine porteuse pour l’acide oléique
Sérum bovin foetalGibco10270-106Supplément de milieu
Anticorps secondaires fluorescents (conjugués à l’Alexa Fluor)Disponible dans le commerceNe s'applique pasAnticorps secondaires spécifiques à l’espèce pour l’immunofluorescence
Logiciel FV10-ASWOlympusNe s'applique pasAcquisition et traitement d’images
Lamelles de verre (Ø 15 mm)Matsunami2-176-03Semis cellulaire pour microscopie
Lamelles de microscope en verreMatsunamiSFF-001Lamelles de verre pour montage des lamelles
Glutaraldéhyde (solution à 25 %)Wako073-00536Fixation alternative pour PLIN3
Cellules HuH7Banque de cellules JCRBJCRB0403Ligne cellulaire d’hépatome humain
LipidTOX Red Neutral Lipid StainInvitrogenH34476Coloration alternative des gouttelettes lipidiques
Gaz d’azote (N2)Disponible dans le commerceNe s'applique pasÉvaporation de l’éthanol
Acide oléiqueSigma-AldrichO1383Pour la préparation de conjugués d’acide oléique-BSA
Paraformaldéhyde, 4 % dans PBSNacalai Tesque09154-85Fixation
Pénicilline-streptomycineGibco15140-122Antibiotiques
Tampon de phosphate (×10)Ne s'applique pasNe s'applique pasPeut être remplacé par n’importe quel fournisseur
RO-3306Sigma-AldrichSML0569Inhibiteur de CDK1 pour la synchronisation G2/M
SlowFade Diamond Antifade MountantInvitrogenS36963Milieu de montage
Chlorure de sodium (NaCl)Wako191-01665Préparation de NaCl à 150 mM
Hydroxyde de sodium (NaOH)Wako080-01061Utilisé pour la saponification de l’acide oléique
Lamelles d’analyse cellulaire TaliThermoT10794Utilisées pour l’analyse du cycle cellulaire
Cytomètre à imagerie TaliThermoNe s'applique pasUtilisé pour l’analyse du cycle cellulaire
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Perméabilisation cellulaire
Microscope à fluorescence à champ largeKEYENCEBZ-9000Dépistage rapide des cellules mitotiques

Références

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Mots-clés

Dynamique des gouttelettes lipidiquesmicroscopie fluorescencesynchronisation du cycle cellulairevisualisation de la mitosemarquage des lipides neutresremodelage des organitesm tabolisme nerg tiqueprogression du cycle cellulaire

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