Transfert mitochondrial exogène dans les adipocytes bruns différenciés et les préadipocytes déficients en AGPAT2

Résumé

Les mitochondries exogènes d’origine humaine et murine peuvent être intériorisées en différenciant les préadipocytes et suivies tout au long de la différenciation adipogénique à l’aide d’outils d’imagerie et génétiques. Bien que ces mitochondries interagissent physiquement avec le réseau mitochondrial endogène, elles n’augmentent pas l’expression des marqueurs associés aux adipocytes bruns matures.

Résumé

Les mitochondries sont des centres de signalisation clés ; cependant, la question de savoir si l’expansion de masse mitochondriale est mécaniquement nécessaire à la différenciation reste une question ouverte. AGPAT2 catalyse la conversion de l’acide lysophosphatidique en acide phosphatidique, et sa carence conduit à une carence en tissu adipeux et à une adipogenèse altérée associée à une masse mitochondriale réduite. L’impact de l’expansion de masse mitochondriale sur l’adipogenèse a été évalué en transférant des mitochondries exogènes dans des adipocytes bruns différenciateurs. On a également étudié si le transfert mitochondrial pouvait libérer l’adipogenèse altérée des cellules déficientes en AGPAT2. Les mitochondries humaines et murines ont été transférées avec succès et intégrées au réseau mitochondrial endogène des préadipocytes murins différenciateurs et ont persisté tout au long de l’adipogenèse brune. Une différenciation adipogénique était nécessaire pour la rétention des mitochondries transférées. Le transfert mitochondrial n’a pas modifié l’expression des marqueurs moléculaires des adipocytes bruns matures ni de la teneur en gouttelettes lipidiques, bien qu’il ait affecté la distribution relative de la taille des gouttelettes lipidiques de manière dépendante de l’espèce. Dans les préadipocytes Agpat2^-/- , le transfert mitochondrial n’a pas permis de sauver l’adipogenèse, ce qui indique que l’expansion de masse mitochondriale seule est insuffisante pour inverser les mécanismes conduisant à la lipodystrophie dans ce modèle. Ces résultats indiquent que, bien que les mitochondries humaines exogènes et murines puissent être incorporées dans le réseau mitochondrial des adipocytes différenciés, elles n’influencent pas directement le programme adipogénique.

Introduction

Au-delà de leurs rôles bioénergétiques primaires, les mitochondries servent de centres de signalisation dans plusieurs processus cellulaires, y compris la différenciation cellulaire 1,2,3,4. Le tissu adipeux brun (BAT) possède une masse mitochondriale notablement élevée pour soutenir son activité thermogénique, soulignant son rôle dans l’équilibre énergétique de l’ensemble du corps et dans la pathogenèse de^{l’obésité 5}. Bien que la masse mitochondriale soit régulée par l’équilibre entre la biogenèse et la mitophagie, il reste incertain si l’expansion de la masse mitochondriale lors de la différenciation des adipocytes bruns est fonctionnellement nécessaire à l’adipogenèse ou simplement une conséquence du processus.

Le transfert physiologique mitochondrial entre cellules a été documenté tant in vitro qu’in vivo, contribuant à l’adaptation tissulaire dans des conditions pathologiques, notamment un dysfonctionnement du tissu adipeux associé à l’obésité et à la résistance à^{l’insuline 6,7}. De plus, le transfert mitochondrial artificiel in vitro a démontré qu’il améliore la capacité respiratoire des cellules^{receveuses 8}. Ensemble, ces résultats soutiennent l’idée que le transfert mitochondrial peut modifier la fonction métabolique cellulaire et peut contribuer à l’adaptation tissulaire dans des conditions de stress bioénergétique ^9,10,11. Comparé aux stratégies pharmacologiques ou génétiques qui stimulent la biogenèse mitochondriale endogène en activant les programmes transcriptionnels nucléaires et mitochondriaux, le transfert mitochondrial livre directement les organites aux cellules réceptrices, permettant une modification rapide de la masse mitochondriale indépendamment des manipulations^{transcriptionnelles 12,13}. Cette approche est essentielle pour corriger les défauts des maladies mitochondriales, mais permet également d’étudier les actions mitochondriales sans les effets potentiels hors cible des approches pharmacologiques ou^{génétiques 14}.

Dans la présente étude, nous avons étudié l’effet de l’augmentation artificielle de la masse mitochondriale par transfert mitochondrial exogène dans la différenciation des adipocytes bruns. Cette approche a permis une évaluation directe de l’impact de la masse mitochondriale sur le programme adipogénique. Pour y parvenir, les protocoles de transfert mitochondrial initialement développés pour les cellules souches mésenchymateuses ont été^{adaptés 15} en utilisant à la fois des cellules hépatiques humaines et des préadipocytes murins comme donneurs mitochondriaux. Une méthode pour suivre les mitochondries humaines dans les cellules murinaires différenciées a été développée à l’aide d’outils génétiques combinés à des techniques d’imagerie, démontrant que les mitochondries des deux origines sont intégrées au réseau mitochondrial endogène et persistent tout au long de la différenciation adipogénique.

Pour modéliser une adipogenèse défectueuse associée à une faible masse mitochondriale, des adipocytes bruns différenciés dérivés de souris déficientes en 1-acylglycérol-3-phosphate-O-acyltransférase 2 (AGPAT2) (AGPAT2^-/-) ont été utilisées. AGPAT2 est fortement exprimé dans le tissu adipeux, où il catalyse la formation d’acide phosphatidique dans la voie de biosynthèse des glycérolipides. La carence en AGPAT2 provoque une lipodystrophie sévère chez l’humain comme chez la souris et altère l’adipogenèse chez les modèles d’adipocytes blancs et bruns en association avec une masse mitochondriale^réduite 16,17,18. L’incorporation de mitochondries exogènes dans les préadipocytes différenciés a légèrement modifié la taille des gouttelettes lipidiques, mais n’a pas augmenté l’expression des marqueurs adipocytaires bruns matures ni permis de sauver l’altération adipogénique des préadipocytes Agpat2^-/-.

Protocole

Les procédures animales ont été approuvées par le Comité Institutionnel de Soins et d’Utilisation des Animaux de la Pontificia Universidad Católica de Chile, protocole 210609003. Des souris néonatales de type sauvage et Agpat2^-/- P0,5 des deux sexes, issues d’un fond génétique mixte C57BL/6J et 129J, ont été utilisées dans cette étude. Équipement de protection individuelle (EPI) : Portez une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants en nitrile. Voir le fichier supplémentaire 1 pour des détails supplémentaires sur le protocole et le tableau 1 pour les tampons nécessaires à ce protocole.

Tous les déchets chimiques toxiques générés lors de la préparation à la microscopie électronique, de la fixation du paraformodéhyde et de l’extraction des acides nucléiques doivent être strictement séparés en flux désignés et clairement étiquetés, conformément aux réglementations institutionnelles sur la santé et la sécurité environnementales (EHS). En aucun cas aucun de ces réactifs ne doit être rejeté dans l’évier du laboratoire ou dans le système d’égouts public. Tous les déchets chimiques dangereux générés doivent être séparés selon les classifications institutionnelles des EHS.

1. Culture cellulaire

1. Isolement, différenciation et maintien des adipocytes primaires (iBAT)
   REMARQUE : Voir le Fichier Supplémentaire 1 pour une brève description des procédures et le Tableau 1 pour la composition des solutions requises. Une explication complète et détaillée de notre protocole de différenciation adipogénique brune in vitro se trouve dans Figueroa et ^al.19.
   1. Isoler les préadipocytes du tissu adipeux brun interscapulaire (iBAT) des souris néonatales (P0,5) à l’issue des procédures chirurgicales et enzymatiques de digestion décrites par Figueroa et ^al.19.
   2. Différenciez et maintenez la culture des adipocytes bruns selon le calendrier de cocktails de différenciation et d’échange médiatique.
      REMARQUE : Pour une différenciation adipogénique réussie, il est crucial que les cultures atteignent une confluence de 90 à 100 % avant d’initier l’induction adipogénique.
2. Culture HepG2
   1. Cultivez les cellules HepG2 dans le DMEM complétées avec 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 0,25 μg/mL d’amphotéricine B. Maintenez les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de_CO-2.
      REMARQUE : Ces cellules se développent en grappes et peuvent sembler subconfluentes malgré une forte densité due à une croissance multicouche.

2. Isolement et transfert mitochondriaux

1. Isolement mitochondrial
   REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un cabinet de biosécurité à 4 °C ou sur la glace. Utilisez la préparation dans les 2 heures.
   1. Graines 2 × 10⁶ cellules donneuses (HepG2 ou préadipocytes) dans des plats de culture de 100 mm. Faites croître les cellules jusqu’à atteindre 80 % (HepG2) ou 100 % (préadipocytes) de confluence.
   2. Faites passer des cellules de donneurs de teinte avec 100 nM MitoTracker Deep Red FM dans un milieu sans FBS pendant 30 minutes à 37 °C dans un incubateur à 5 % de_CO-2 .
   3. Lavez les cellules deux fois avec un substrat de croissance pour éliminer l’excès de colorant.
   4. Détacher les cellules à l’aide de trypsine, collecter la suspension et centrifuger à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
   5. Resuspendez la pellete dans 1 mL de tampon d’isolement mitochondrial (MIB) complété avec des BSA, des inhibiteurs de protéases et des inhibiteurs de phosphatase. Perturbez la membrane plasmique en faisant passer la suspension à travers une seringue à tuberculine 5 fois. Homogénéisez la suspension en la faisant passer à travers une seringue d’insuline au moins 10 fois jusqu’à ce que la solution devienne brun clair et ne présente pas de grappes visibles.
      REMARQUE : Pour l’analyse western blot, il faut alyter 50 μL du lysat total et stocker à -20 °C.
2. Centrifugez l’homogénéat à 900 × g pendant 11 minutes à 4 °C.
   REMARQUE : Si le surnageant après le spin de 900 × g n’est pas trouble, la lyse cellulaire est probablement incomplète.
   1. Collectez le surnageant et centrifugez à 10 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour pelleter les mitochondries. Lavez la granule mitochondriale 3 fois avec un MIB complété par du BSA.
   2. Effectuer une resuspension finale à 100 μL de MIB sans BSA. Quantifiez la concentration en protéines à l’aide d’un test de protéines BCA.
3. Essai de transfert mitochondrial (MTA) dans les préadipocytes
   1. Préadipocytes receveurs de graines à 5 × 10 cellules de⁵ puits dans des plaques à 12 puits (avec des couvercles de 18 mm pour la microscopie) 24 heures avant le test.
   2. Ajouter directement des mitochondries donneuses isolées au milieu receveur avec un ratio de 10 μg de protéine mitochondriale pour 10⁵ cellules. Balancez doucement les plaques pour répartir les mitochondries. Incuber les cellules pendant 24 à 120 heures (correspondant aux jours 1, 3 et 5 de différenciation) à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ avant analyse.

3. Consommation mitochondriale d’oxygène et efficacité de la MTA

1. Respirométrie mitochondriale
   1. Réglez le bain-marie circulant externe à 25 °C et assurez un équilibre thermique stable dans la chemise de chambre avant d’initier toute mesure.
   2. Effectuer une calibration en phase liquide en deux points à l’aide du logiciel d’acquisition de l’instrument.
      1. Calibration de la saturation d’air (High Point) : Ajouter 500 μL d’eau déminéralisée saturée en air dans la chambre. Réglez l’agitateur magnétique à 60 tr/min et enregistrez le signal jusqu’à ce qu’il se stabilise à un plateau (>1 500 mV).
      2. Calibration zéro oxygène (Point bas) : Ajouter une petite quantité (~3 mm de diamètre) de sulfite de sodium à la chambre pour déplacer tout air restant. Enregistrer jusqu’à ce que le signal descende à un plateau de base stable (~1 % du signal basal, ~20 mV).
   3. Lancer l’enregistrement en temps réel (durée totale : ~10 min).
   4. Enregistrer pendant 3 minutes jusqu’à obtenir une lecture linéaire stable.
   5. Resuspendez les mitochondries isolées dans 200 μL de tampon d’analyse mitochondriale (MAS⁾²⁰ complétés par 5 mM de glutamate et 2,5 mM de malate.
      REMARQUE : Pour le présent travail, la pellete de mitochondries totales a été extraite de deux plaques cellulaires de 100 mm.
   6. Transférez la suspension dans la chambre d’oxygraphe et fermez fermement le plunger d’étanchéité de la chambre, en veillant à ne pas laisser de bulles d’air.
   7. Enregistrez la consommation d’oxygène pendant 3 minutes.
   8. Ajoutez 150 μM d’ADP pour déclencher la respiration couplée mitochondriale et mesurez la respiration couplée par synthèse d’ATP pendant 3 minutes.
   9. Définissez manuellement les segments stables et linéaires correspondant à chaque phase respiratoire. Extraire les valeurs automatisées des pentes calculées par le logiciel, exprimées en taux de consommation d’oxygène en nmol∙^mL-1∙^min-1.
      REMARQUE : Pour le nettoyage inter-plaques, rincez la chambre deux fois avec 1 mL d’eau déminéralisée et assurez-vous que l’intérieur est complètement sec. Ajoutez 100 μL de PBS dans la chambre avant de passer à la plaque suivante.
2. Cytométrie en flux
   REMARQUE : Conservez tous les échantillons sur glace tout au long de la procédure afin de préserver l’intégrité cellulaire et bioénergétique.
   1. Isoler les mitochondries et effectuer un test de transfert mitochondrial (MTA), comme décrit respectivement dans les sections 2.1 et 2.2, dans des vases de culture de 35 mm, en utilisant des cellules donneuses précédemment marquées avec MitoTracker Deep Red FM.
   2. Aspirez le milieu de culture et lavez la monocouche cellulaire une fois avec 1 mL de PBS stérile.
   3. Ajoutez 500 μL de Trypsine-EDTA à 0,25 % et incubez les plats à 37 °C jusqu’à ce qu’un décollement cellulaire complet soit observé au microscope.
   4. Neutralisez la trypsine en ajoutant 1 mL de milieu de croissance complet (DMEM avec 10 % de FBS). Transférez tout le volume dans un tube conique de 15 mL et centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
   5. Éliminez le surnageant par aspiration et conservez la pellete cellulaire. Resuspendez la pellete dans 500 μL de PBS glacé par pipetage doux.
   6. Analysez les échantillons à l’aide d’un cytomètre en flux équipé d’un laser de 640 nm (voir le Fichier Supplémentaire 1 pour les détails sur l’acquisition et l’analyse de la cytométrie en écoulement).
      1. Définir la population cellulaire à l’aide de graphiques de diffusion directe (FSC) versus de dispersion latérale (SSC) et appliquer une stratégie de filtrage pour exclure les débris et les doublets cellulaires.
      2. Quantifier l’intensité de fluorescence dans le canal rouge lointain (filtre d’émission 670/30 nm) pour détecter les mitochondries intériorisées marquées par MitoTracker.
      3. Effectuer une analyse en utilisant Floreada.io (voir Fichier Supplémentaire 1 pour les détails du protocole de gating).
         REMARQUE : Inclure un contrôle négatif (cellules réceptrices sans MTA) pour définir la base de l’autofluorescence de fond.
3. Microscopie confocale et électronique
   1. Analyse d’imagerie cellulaire vivante
      1. Semez les préadipocytes primaires dérivés de souris néonatales P0,5 dans des plaques à 12 puits contenant des caches de 18 mm, suivant les exigences spécifiques en densité cellulaire et en milieu détaillées à la Section 1.
      2. Isoler les mitochondries et effectuer le test de transfert mitochondrial (MTA) en utilisant des cellules donneuses précédemment marquées avec MitoTracker Deep Red FM, comme spécifié à la Section 2.
      3. Maintenir les cultures receveuses dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 24 heures afin de permettre l’absorption mitochondriale.
      4. Préparez une solution de travail MitoTracker Green de 70 nM en diluant la crosse dans un milieu de culture sans FBS.
      5. Aspirez le milieu de croissance des plaques à 12 puits et remplacez-le par la solution verte MitoTracker à 70 nM. Incubez les plaques pendant 25 minutes à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de_CO-2 pour contre-colorer l’ensemble du réseau mitochondrial.
      6. Retirez la solution de tache et lavez les bâtons de couverture deux fois avec 1 mL de milieu de culture tiède et complet.
      7. Remplacez le volume final par un milieu complet sans rouge de phénol pour minimiser l’autofluorescence de fond lors de l’acquisition.
      8. Transférez les couvertures ou la plaque sur l’étage du microscope confocal. Réglez la chambre d’incubation du microscope pour maintenir un environnement constant de 37 °C et 5 % de_CO2.
      9. Capturez immédiatement les images en utilisant les réglages appropriés d’excitation/émission pour les canaux rouge lointain (MitoTracker Deep Red FM) et verts (MitoTracker Green). Voir le Fichier Supplémentaire 1 pour plus de détails.
         REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de coloration et de manipulation dans des conditions de faible luminosité pour éviter le photoblanchiment des fluorophores. Utilisez un objectif d’immersion en huile à haute ouverture numérique (NA) (60x ou 100x) pour une résolution optimale de la morphologie mitochondriale.
   2. Essai d’immunofluorescence confocal avec cellules fixes
      REMARQUE : Après fixation cellulaire, les solutions toxiques de paraformaldéhyde et de glutaraldéhyde sont classées comme organiques non halogénées. Les sous-produits d’extraction d’acides nucléiques nécessitent une séparation stricte : les mélanges phénol/chloroforme doivent être éliminés sous forme d’organiques halogénés, tandis que les tampons à base de guanidinium sont classés comme organiques corrosifs.
      1. Préadipocytes primaires de graines dérivés de souris néonatales P0,5 dans des plaques à 12 puits contenant des caches de 12 mm, comme décrit à la Section 1.
      2. Isoler les mitochondries et effectuer le test de transfert mitochondrial (MTA) en suivant les procédures spécifiées à la Section 2.
      3. Incubez les cultures pendant 24 heures pour permettre l’absorption mitochondriale.
      4. Induire la différenciation adipogénique brune en suivant le protocole décrit dans le fichier supplémentaire 1 et se référer au Tableau 1 pour la composition des tampons requis.
      5. Fixez les cellules au jour 7 de différenciation (168 h). Aspirez le milieu de culture et ajoutez 500 μL de paraformoldéhyde (PFA) à 4 % par puits. Incubez pendant 20 minutes à température ambiante.
      6. Lavez les couvertures deux fois en ajoutant 1 mL de PBS bien froid par puits. Perméabiliser et bloquer les cellules en incubant les couches de couverture dans des PBS contenant 0,05 % de saponine et 0,2 % de BSA pendant 1 heure à température ambiante. Placez la plaque sur un shaker orbital sous une légère agitation.
      7. Lavez les cellules deux fois avec 1 mL de PBS. Colorez simultanément les noyaux et les gouttelettes lipidiques. Appliquez 1 μg/mL de Hoechst 33342 et 1 μg/mL de BODIPY préparé dans le tampon de blocage/perméabilisation. Faites couver pendant 30 minutes à température ambiante, en veillant à protéger la plaque de la lumière.
      8. Lavez les habilles deux fois avec 1 mL de PBS bien froid. Montez les couvertures sur des lames en verre propres. Versez 10 μL de montage sur la culasse et placez la couverture côté cellule vers le bas sur le support de montage. Laissez les échantillons sécher toute la nuit dans un environnement sombre à température ambiante avant l’imagerie.
      9. Prenez des images à l’aide d’un microscope confocal. Utilisez deux canaux de fluorescence calibrés pour les spectres d’émission de Hoechst et BODIPY. Voir le Fichier Supplémentaire 1 pour plus de détails d’imagerie.
      10. Effectuer une analyse des gouttelettes lipidiques à l’aide d’ImageJ v1.54s. Ouvrir le canal des gouttelettes lipidiques, identifier manuellement les gouttelettes individuelles à l’aide des outils de sélection à main levée et de gestion du ROI , et calculer la surface des gouttelettes à l’aide de l’outil Analyse | Mesurer la commande.
      11. Traiter et analyser les données résultantes à l’aide des scripts R fournis dans le Fichier Supplémentaire 2 au sein de l’environnement RStudio v4.5.2.
          REMARQUE : Prenez exactement cinq images par enveloppe à un grossissement 10x pour garantir un échantillonnage représentatif. Utilisez la version R 4.5.2 ou supérieure pour la compatibilité avec les scripts fournis.
   3. Microscopie électronique en transmission (TEM)
      REMARQUE : Pour les sous-produits de la microscopie électronique, les tampons hautement toxiques contenant du tétraoxyde d’osmium et de l’arsenic contenant de l’arsenic doivent être collectés comme déchets toxiques de métaux lourds, tandis que l’acétate d’uranyle est géré séparément comme déchets radioactifs de métaux lourds selon les protocoles institutionnels de sécurité radiologique.
      1. Centrifugez les mitochondries isolées, de la section 2, à 10 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour obtenir un pellet compact.
      2. Fixez le granule en ajoutant 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,0). Couver pendant 2 heures à 4 °C.
         REMARQUE : Manipulez toujours les solutions de glutaraldéhyde et effectuez les premières étapes de fixation à l’intérieur d’une hotte chimique. Portez des gants et lunettes en nitrile pour protéger les yeux. Évitez tout contact avec des sources de chaleur, car le glutaraldéhyde chauffé libère des vapeurs très irritantes.
      3. Lavez la préparation mitochondriale pendant 3 × 10 minutes avec un tampon de cacodylate de sodium 0,05 M, puis centrifugez brièvement pour conserver la pellete entre les changements de tampon.
      4. Fixez l’échantillon après 1 % en ajoutant du tétroxyde d’osmium aqueux (_{OsO 4}). Incubez pendant 15 minutes à température ambiante.
         REMARQUE : Le tétroxyde d’osmium ne doit être ouvert et manipulé qu’à l’intérieur d’une hotte chimique certifiée et entièrement fonctionnelle. Portez une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité ou une visière intégrale, ainsi que des gants épais ou doubles en nitrile (changez immédiatement de gants en cas d’éclaboussure, car_{l’OsO 4} peut pénétrer le nitrile fin avec le temps).
      5. Lavez l’échantillon pendant 3 × 5 minutes avec de l’eau double distillée. Colorez le pellet avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 1 % pendant 15 minutes.
         REMARQUE : Travaillez sur du papier d’établi jetable à fond plastique. Réservez une zone spécifique du laboratoire à la coloration radioactive. Portez des gants doubles, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. Lavez-vous bien les mains après avoir terminé la procédure.
      6. Déshydratez la préparation à l’aide d’une série d’éthanol graduée. Incubez le pellet à 30 %, 50 %, 70 %, 95 % et 100 % d’éthanol pendant 5 minutes à chaque concentration.
      7. Encastrez les fractions mitochondriales. Incubez dans une solution 1:1 d’Epon/éthanol pendant 30 minutes, puis une résine pure d’Epon pendant 1 heure.
      8. Transférez les échantillons dans des moules d’immersion et polymérisez dans un four à 60 °C pendant 48 heures.
      9. Fixez les blocs de résine à l’ultramicrotome et découpez des sections ultrafines (80 nm).
      10. Collectez des sections sur des grilles. Colorez les grilles avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 1 % pendant 4 minutes. Rincez avec de l’eau double distillée.
      11. Tache avec du citrate de plomb pendant 5 minutes selon la méthode²¹ de Reynolds. Rincez soigneusement. Visualisez les grilles à l’aide du TEM. Voir le fichier supplémentaire 1 pour plus de détails sur la méthode de Reynolds et l’acquisition d’images TEM.

4. Quantification moléculaire

1. Courbe standard de l’ADN mitochondrial (ADNmt)
   1. Semez les cellules HepG2 en cinq plaques de culture de 100 mm. Incubez les cultures jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de la confluence.
   2. Isoler les mitochondries des cellules prélevées en suivant la procédure technique détaillée à la Section 2.
   3. Extraire l’ADN total du pellet mitochondrial résultant en utilisant la méthode acide-guanidinium-phénol-chloroforme comme décrit à la Section 4.2.6. Mesurez la concentration d’ADN et évaluez la pureté ((rapports A₂₆₀/_{A 280} et (A₂₆₀/_{A 230} )) à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis à microvolume.
   4. Préparez une série de dilution en série en utilisant de l’eau sans nucléase comme diluant. Diluez le stock d’ADN pour obtenir des quantités finales de 1, ^10-1, ^10-2, ^10-3, ^10-4 et ^10-5 ng par volume de réaction. Alternez chaque dilution pendant 5 s pour assurer une homogénéité complète avant de passer à l’étape suivante de la série.
      REMARQUE : Ajustez la plage de concentration de la courbe standard en fonction de la concentration spécifique de l’échantillon et du volume final de la réaction PCR.
2. Détection de l’ADNmt humain dans les cellules réceptrices
   1. Préadipocytes primaires de graines dérivés de souris néonatales P0,5 dans des pots de culture de 60 mm, suivant les conditions de densité et de milieu spécifiées à la Section 1.
   2. Isoler les mitochondries des cellules HepG2 donneuses et exécuter le test de transfert mitochondrial (MTA) comme détaillé dans la Section 2.
   3. Incubez les cultures pendant 24 heures à 37 °C et 5 % de CO₂.
   4. Induire la différenciation adipogénique brune pendant 24 à 120 heures (aux jours 1, 3 et 5) en suivant le protocole d’échange de médias décrit à la Section 1.
   5. Aspirez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec 2 mL de PBS glacé.
   6. Extraire l’ADN total en utilisant la méthode acide-guanidinium-phénol-chloroforme²².
      REMARQUE : Toujours aliquoter et effectuer une séparation de phase à l’intérieur de la hotte pour éviter d’inhaler des vapeurs toxiques de phénol. Utilisez des gants doubles en nitrile ou des gants résistants aux produits chimiques très résistants.
   7. Effectuer la séparation des phases et éliminer toute la phase aqueuse située au-dessus de l’interphase.
      ÉTAPE CRITIQUE : Retirer complètement la phase aqueuse pour prévenir la contamination et garantir une haute pureté de l’ADN pour la qPCR en aval.
   8. Ajoutez 0,3 mL d’éthanol à 100 % par 1 mL du réactif d’extraction initial. Bouchez le tube et mélangez vigoureusement par inversion.
   9. Laissez reposer 3 minutes à température ambiante et centrifugez à 2 000 × g pendant 5 minutes à 4 °C pour pelleter l’ADN.
   10. Transférer le surnageant phénol–éthanol dans un tube séparé pour une éventuelle isolation protéique. Résuspendez la granule d’ADN dans 1 mL de 0,1 M de citrate de sodium (dans 10 % d’éthanol, pH 8,5) pour 1 mL de réactif d’extraction utilisé.
   11. Laissez reposer 30 minutes à température ambiante, en inversant doucement plusieurs fois, puis centrifugez à 2 000 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant.
   12. Répétez les étapes de lavage au citrate de sodium deux fois supplémentaires.
   13. Rinçez la granule résultante avec 2 mL d’éthanol à 75 % pour 1 mL de réactif d’extraction initiale.
   14. Laissez reposer 20 minutes à température ambiante puis centrifugez à 2 000 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
   15. Jetez le surnageant et laissez sécher la pastille à l’air pendant 10 minutes. Solubiliser l’ADN en ajoutant 0,3 à 0,6 mL de NaOH 8 mM et en pipettant plusieurs fois jusqu’à ce que la pellete disparaisse.
   16. Centrifugez à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour éliminer tout débris insoluble. Transférez le surnageant dans un tube stérile et ajustez le pH à 7–8 avec HEPES.
   17. Mesurez la concentration et la pureté de l’ADN ((rapports A(260)/A(280) et (A(260)/A(230)) à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis en microvolume.
   18. Diluez le modèle jusqu’à une quantité finale de 15 ng d’ADN total dans de l’eau sans nucléase. Effectuer une PCR quantitative en temps réel (qPCR) pour l’ADN mmt humain à l’aide de plaques optiques à 96 puits comme spécifié à la Section 4.3.
   19. Analysez les résultats de l’amplification en appliquant un modèle de régression logarithmique.
       REMARQUE : Effectuez l’analyse de régression logarithmique en utilisant la concentration d’ADN et les valeurs du cycle seuil (Ct) correspondantes comme variables.
3. RT-qPCR pour l’expression génique
   1. Préparation et différenciation cellulaires
      1. Préadipocytes primaires de graines dérivés de souris néonatales P0,5 dans des vases de culture de 60 mm comme détaillé dans la section 1.1.
      2. Isolez les mitochondries et effectuez le test de transfert mitochondrial (MTA) en suivant les procédures de la Section 2. Incubez les cultures pendant 24 heures.
      3. Induire l’adipogenèse brune pendant 24 à 120 heures (échantillonnage aux jours 1, 3 et 5 de différenciation) selon le protocole de la Section 1.
   2. Isolation totale de l’ARN
      1. Retirez le milieu de culture et ajoutez 1 mL de réactif extracteur acide-guanidinium-phénol-chloroforme par 1 × 10⁶ cellules directement dans la plaque. Homogénéisez les échantillons par pipetage répété jusqu’à ce que le lysat soit uniforme.
         REMARQUE : Toujours aliquoter et effectuer une séparation de phase à l’intérieur de la hotte pour éviter d’inhaler des vapeurs toxiques de phénol. Utilisez des gants doubles en nitrile ou des gants résistants aux produits chimiques très résistants.
      2. Ajoutez 0,2 mL de chloroforme pour 1 mL de réactif extracteur utilisé. Bouchez bien les tubes et secouez vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Laissez reposer 3 minutes à température ambiante et centrifugez à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C.
      3. Transférez soigneusement la phase aqueuse supérieure vers un nouveau tube sans nucléase. Évitez le contact avec l’interphase. Gardez les échantillons sur glace.
      4. Ajoutez 0,5 mL d’isopropanol pour 1 mL de réactif extracteur utilisé. Mélangez doucement par inversion et faites éclore pendant 10 minutes à température ambiante.
      5. Centrifugez à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour pelleter l’ARN. Écartez le surnageant par inversion.
      6. Lavez la pellete d’ARN avec 1 mL d’éthanol à 75 %. Vortex brièvement et centrifugeuse à 7 500 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
      7. Jetez le surnageant et laissez sécher à l’air la pellete d’ARN pendant 10 minutes à température ambiante. Resuspendez la pellete dans 30 μL d’eau sans nucléase. Incubez les échantillons à 60 °C pendant 15 minutes pour assurer une solubilisation complète.
      8. Déterminez la concentration et la pureté de l’ARN (rapports A₂₆₀/_{A 280} ) à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis à microvolume.
      9. Vérifiez l’intégrité de l’ARN par électrophorèse sur gel d’agarose.
   3. Traitement de la DNase
      1. Ajoutez 0,1 volume de 10× tampon de DNase et 1 μL d’enzyme DNase à chaque échantillon d’ARN. Mélangez doucement en pipotette. Incubez les réactions à 37 °C pendant 30 minutes.
      2. Resuspendez le réactif d’inactivation de la DNase en faisant un mouvement de mouvement ou en vortex jusqu’à ce que la boue soit homogène. Ajoutez le réactif d’inactivation (0,1 volume de l’échantillon d’ARN ou 2 μL, selon le plus grand) et mélangez soigneusement. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante. Faites un coup de fouet des tubes trois fois pendant cette période pour maintenir le réactif en suspension.
      3. Centrifugez à 10 000 × g pendant 1,5 min. Transférez le surnageant contenant de l’ARN dans un nouveau tube.
         ÉTAPE CRITIQUE : Veillez à ce qu’aucun réactif d’inactivation de la DNase ne soit transporté, car il inhibe la synthèse ultérieure de l’ADNc.
   4. Transcription inverse (RT)
      1. Quantifier l’ARN traité et diluer dans de l’eau sans nucléase pour utiliser jusqu’à 2 μg d’ARN total par réaction de 20 μL.
      2. Préparez le master mix RT sur glace en suivant les instructions du fabricant. Distribuez le mélange dans des tubes de réaction et ajoutez les échantillons d’ARN.
      3. Chargez dans un thermocycleur et exécutez le programme de transcription inverse comme spécifié par le fabricant du kit.
   5. PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)
      1. Utilisez l’ADN intégré généré dans la Section 4.3.4 comme modèle PCR. Diluez l’ADNc dans de l’eau sans nucléase à une concentration de travail de 20 ng par réaction de 10 μL. Gardez tous les réactifs sur la glace.
      2. Préparez un mélange maître contenant du SYBR Green, des amorces et de l’eau sans nucléase. Inclure un volume excédentaire pour la perte par pipetage. Distribuez 10 μL du mélange réactionnel dans chaque puits d’une plaque qPCR optique.
      3. Scellez la plaque avec un film adhésif optique et centrifugez brièvement pour recueillir le liquide au fond. Chargez la plaque dans un instrument PCR en temps réel et effectuez l’amplification en mode cycle rapide.
      4. Déterminer les valeurs du cycle seuil (Ct) et effectuer la quantification relative en utilisant la méthode ΔΔCt. Inclure une analyse de la courbe de fusion à la fin de la course pour vérifier la spécificité de l’amplification.
         REMARQUE : Normaliser l’abondance cible de l’ARNm à 36B4 comme gène endogène de maintien de la maison. Faites passer les plaques qPCR dans les 2 heures suivant la configuration ; sinon, stockez les plaques scellées à 4 °C.
4. Tache occidentale
   1. Quantifier la concentration de protéines à partir d’extraits de cellules entières et mitochondriaux (voir les sections 2.1.8 et 2.1.12) à l’aide d’un test BCA.
   2. Préparez 30 μg de protéines par échantillon et ajoutez le volume approprié de tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE (par exemple, tampon de Laemmli).
   3. Dénaturez les échantillons en chauffant à 95 °C pendant 5 minutes (ou suivez les exigences de température spécifiques pour les protéines membranaires).
   4. Chargez les échantillons dans les puits d’un gel de polyacrylamide. Séparer les protéines par électrophorèse du gel de dodécyle de sodium et polyacrylamide (SDS-PAGE) à une tension constante (par exemple, 80–120 V) jusqu’à ce que le front de colorant atteigne le fond du gel.
   5. Activez une membrane PVDF en l’immergeant dans 100 % de méthanol pendant 1 minute, suivie d’un équilibre dans le tampon de transfert.
   6. Assemblez le sandwich de transfert, en veillant à l’absence de bulles d’air entre le gel et la membrane.
   7. Transférez les protéines sur la membrane PVDF en électroblottant à 400 mA pendant 2 heures. Maintenez le système à 4 °C tout au long du processus.
   8. Bloquez les sites de liaison non spécifiques en incubant la membrane dans un lait écrémé à 5 % préparé dans une solution séline Tris-bufferée contenant 0,1 % Tween 20 (TBS-T) pendant 1 h à température ambiante.
   9. Incubez la membrane avec des anticorps primaires (dilués à 1:1 000 en solution bloquante) pendant la nuit à 4 °C sous une agitation douce.
   10. Lavez la membrane 3 × 15 minutes avec TBS-T.
   11. Incubez avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 2 heures à température ambiante.
   12. Lavez la membrane 3 fois avec du TBS-T, puis un dernier lavage de 5 minutes avec 1× cuillère à soupe.
   13. Visualisez les bandes protéiques à l’aide d’un substrat à chimiluminescence améliorée (ECL). Capturez le signal à l’aide d’un système d’imagerie numérique.
       REMARQUE : Ajustez le pourcentage de gel de polyacrylamide (par exemple, 8 %, 10 % ou 12 %) en fonction du poids moléculaire des protéines cibles. Si l’appareil d’électrotransfert ne dispose pas d’un système de refroidissement actif, remplacer les récipients de glace toutes les heures et maintenir la chambre immergée dans un bain de glace. Stockez les membranes dans 1× TBS à 4 °C si la visualisation est retardée.

Résultats

Extraction mitochondriale ainsi que intégrité structurelle et respiratoire

Pour évaluer l’impact de l’augmentation de la masse mitochondriale sur l’adipogenèse brune, un test de transfert mitochondrial (MTA) a été réalisé sur des préadipocytes non différenciés (Figure 1A). Les mitochondries ont été isolées à partir de préadipocytes murins primaires (mMito) et de la lignée cellulaire hépatique humaine HepG2 (hMito)...

Discussion

Implications biologiques du transfert mitochondrial dans l’adipogenèse

Nos résultats montrent que, bien que des mitochondries exogènes, issues de sources humaines et murines, puissent être intégrées au réseau mitochondrial endogène des préadipocytes différenciés, une augmentation artificielle de la masse mitochondriale est insuffisante pour alimenter le programme adipogénique brun. Ces résultats suggèrent que l’expansion mitochondriale caract...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100 mm plate	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 mm glass coverslips	Marienfeld	111520
12-well plate	SPL Life Science	30012SPL
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Invitrogen	28908
18 mm glass coverslips	HART	-
24-well plate	SPL Life Science	30024SPL
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610158
35 mm plate	SPL Life Science	20035SPL
6-well plate	SPL Life Science	30006SPL
60 mm culture dish	SPL Life Science	20060SPL	Utilisé pour les expériences de préadipocytes primaires et d'ADN/qPCR ; fournisseur/référence non fournis
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulin)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	Utilisé pour la vérification de l'intégrité de l'ARN ; fournisseur/référence non fournis
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7077
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Axio Observer inverted microscope stand	Carl Zeiss	431007-9901-000	Ajouté à partir des méthodes supplémentaires
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	Ajouté à partir des méthodes supplémentaires ; référence non fournie
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	Ajouté à partir des méthodes supplémentaires
BD LSRFortessa X-20 cell analyzer	BD Biosciences	-	Entrée existante standardisée pour correspondre au fichier supplémentaire
BioRender	BioRender	-	Utilisé pour créer le flux de travail de la Figure 1
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transcription Kit	Invitrogen	4374966
Cell Strainer 100 µm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 µm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM Powder, High Glucose, Pyruvate	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, no phenol red	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	Solvant pour le milieu d'induction ; fournisseur/référence non fournis
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	Logiciel d'analyse de cytométrie en flux
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antibody	Santa Cruz	sc-32233
Glucose	Gibco	15023-021
Glutamate	Sigma	G1626
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	Logiciel d'analyse statistique/régression logarithmique
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	Logiciel d'analyse d'images de gouttelettes lipidiques
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin syringe	Cranberry	AAJECIN3	Utilisé pour l'homogénéisation cellulaire ; fournisseur/référence non fournis
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
LAMP-1 Antibody	Abcam	ab25245
Lane Marker Reducing Sample Buffer	Thermo Scientific	39000
Malate	Sigma	M1000
MgCl2	Calbiochem	208291