Immunolocalisation tridimensionnelle chez les méiocytes de maïs

Résumé

Ce protocole d’immunolocalisation chez les méiocytes de maïs mâles maintient l’intégrité tridimensionnelle des cellules pendant la méiose. Il permet le suivi dynamique de la localisation intracellulaire de jusqu’à trois anticorps indépendants dans du matériel paraformaldéhyde conservé, en plus du DAPI, qui colore l’ADN.

Résumé

Pendant la prophase méiotique I, la configuration physique des chromosomes varie considérablement selon les stades de développement ; heureusement, ces configurations spécifiques permettent d’identifier correctement chacun de ces stades méiotiques classiques, respectivement appelés leptotène (par exemple les « fils fins »), zygotène (par exemple les « fils couplés »), pachythène (par exemple les « fils épais »), diplotène (par exemple les « doubles fils ») et diakinésie (par exemple le « mouvement de répulsion »). L’analyse visuelle de plusieurs phénomènes cytogénétiques qui se produisent pendant la prophase I, tels que la recombinaison, l’appariement et la synapse, nécessite des techniques d’immunolocalisation très fiables. Contrairement aux techniques traditionnelles de propagation et d’écrasement qui suppriment toute information subcellulaire et subnucléaire, la procédure de conservation 3D décrite ici permet de préserver les protéines méiotiques clés dans leurs sites subcellulaires natifs (cytoplasmiques, nucléaires et subnucléaires : euchromatine, hétérochromatine et nucléolaire). Ainsi, ce protocole décrit comment fixer efficacement les anthères méiotiques, disséquer et libérer les méiocytes à partir des anthères, et effectuer une immunolocalisation simultanée de trois protéines clés dans les méiocytes mâles du maïs.

Introduction

La méiose est un processus clé qui régule la transmission des caractères chez les plantes et cultures modèles ; Ainsi, des méthodes microscopiques simples permettant une visualisation cohérente et fidèle de la localisation des protéines facilitent la compréhension de la manière dont ces traits pourraient être transmis plus efficacement. Malheureusement, la visualisation de la localisation des protéines à l’intérieur des méiocytes a beaucoup varié selon la technique^{utilisée 1,2}. Ainsi, l’objectif du protocole est de fournir une méthode simple et reproductible qui élimine les artefacts lors de l’observation des méiocytes. Par exemple, il est depuis longtemps reconnu que l’observation des chromosomes méiotiques est un processus délicat facilité par l’écrasement des cellules soit par un simple écrasement, soit par des techniques de propagation encore plus ^{perturbatrices 3,4,5}. Dans Arabidopsis thaliana, les chercheurs utilisent couramment des méthodes de propagation utilisant le fixateur de Carnoy (un mélange 3:1 d’éthanol et d’acide acétique) ainsi que divers détergents tels que Lipsol, Tween-20 et TritonX-100, ainsi que des mélanges enzymatiques contenant de la cellulase, de la pectinase et des cytohélicases, afin de décomposer les cellules et permettre une immunolocalisation efficace sur ses petits^{chromosomes 1,2}. Ces techniques transforment une conformation chromosomique 3D en une 2D, permettant une observation rapide de l’ensemble des chromosomes dispersés artificiellement dans une seule image. Certaines caractéristiques des chromosomes qui résistent à ces traitements sévères peuvent être apparentes ; Cependant, ils ne représentent souvent pas le comportement typique des cellules et des chromosomes in vivo⁶. Une détection rapide et très large de jusqu’à deux anticorps est possible grâce aux techniques de propagation 2D dans diverses espèces végétales, y compris^{le maïs} 7,8,9,10,11.

Néanmoins, malgré la commodité des techniques 2D traditionnelles, il est désormais reconnu que certains phénomènes sont sensibles aux méthodes perturbatrices et ne peuvent être observés si la cellule, le noyau ou les chromosomes sont endommagés lors de la propagation ou de l’écrasement. Par exemple, le déplacement de la protéine RAD50 du cytoplasme vers le noyau pendant le stade leptotène, ou lors du couplage centromère (lepttonème/zygoneme), n’a été détecté que dans des méiocytes 3D^{intacts 12}. Ici, les lecteurs disposent d’un protocole 3D détaillé de 4 jours utilisant des anthères fixées à 4 % de paraformdéhyde pour immunolocaliser trois protéines clés chez les méiocytes mâles du maïs, préservant ainsi leur intégrité structurelle. Comparé à une méthodologie similaire d’immunolocalisation 3D du^{maïs 8}, nous avons ajouté des notes pratiques et des conseils de dépannage pour les chercheurs. Ce protocole bénéficiera au travail des biologistes et des sélectionneurs de plantes intéressés par l’étude de divers processus méiotiques, tels que le contrôle de la recombinaison méiotique par le complexe synaptonémien.

Protocole

ATTENTION : Manipuler le formaldéhyde et l’acrylamide à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié et d’un capot chimique ; Les deux sont toxiques (l’acrylamide est aussi neurotoxique avant la polymérisation). Tous les matériaux utilisés dans l’étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Fixation des anthères de maïs pour préserver la structure intacte des méiocytes

1. Utilisez des plants de maïs au stade V13 avec des inflorescences encore en croissance à l’intérieur de la tige. Pendant la semaine de fixation des anthères méiotiques, portez des gants et appuyez doucement sur la tige agrandie au niveau de la bosse pour déterminer si elle est assez molle pour l’ouvrir.
   REMARQUE : Ce protocole de fixation et d’immunolocalisation peut être utilisé à la fois pour le maïs et les bourgeons floraux méiotiques d’Arabidopsis thaliana (moins de 400 μm). Mais dans le cas du maïs, selon la variété utilisée et la période de l’année (la croissance est plus rapide au printemps), il faut environ 8 semaines à partir de la plantation pour référence la lignée consanguine B73, mais seulement 6 semaines pour la lignée consanguine à floraison précoce A344.
2. Préparation des tampons.
   REMARQUE : La veille de la fixation chimique, préparez les solutions de travail suivantes, faites-le avec soin et étiquetez correctement toutes les bouteilles.
   1. Préparez 100 mL de 10x sels tampons A (BA), en ajoutant 4,53 g de PIPES (Pipérazine-N, N′-bis (acide 2-éthanassulfonique) à une concentration finale de 150 mM), 5,96 g de KCl (concentration finale 800 mM), 1,17 g de NaCl (concentration finale 200 mM), 0,74 g d’EDTA (concentration finale 20 mM), 0,19 g d’EGTA (concentration finale 5 mM) et 90 mL_H2O, ajustez d’abord le pH à 6,8–7 avec KOH, puis ajustez le volume à 100 mL.
   2. Enfin, stérilisez par filtre à l’aide d’une unité de filtration stérile jetable à flux rapide avec un PES de 0,45 μm (à conserver à 4 °C sans congeler ; vous pouvez la conserver pendant plusieurs mois).
   3. Préparez-vous :
      -50 mM PIPES (pH ajusté à 7 avec KOH).
      - stocks de spermine à une concentration de 0,4 M (précédemment dissous dans des PIPES de 50 mM, ajuster le pH à 7 avec KOH, maintenir des aliquotes de 50 μL à -20 °C).
      - stocks de spermidine à une concentration de 0,4 M (dissous dans 50 mM PIPES, pH ajusté à 7 avec KOH, maintenir des aliquotes congelées de 125 μL à -20°C).
      - stocks de Dithiothréitol (DTT) 1 M (dissous dans 0,01 M d’acétate de sodium, à pH 5,2, maintenir des aliquotes congelées de 100 μL à -20 °C).
      - sorbitol 2 M, maintenu à 4 °C.
3. Préparer 50 mL de 2x Buffer A (BA), sur glace, à l’aide de 10 mL de sels tampons 10x A (conservés à 4 °C), 50 μL de spermine (0,4 M dans 50 mM PIPES, pH ajusté à 7 avec KOH), 125 μL de spermidine (0,4 M dans 50 mM PIPES, pH ajusté à 7 avec KOH), 100 μL de DTT (1 M dans 0,01 acétate de sodium M, pH 5,2) se dissolvent vigoureusement ; Et ne chauffez pas.
   1. Ensuite, ajoutez 16 mL de 2 M sorbitol. Ajustez le volume final à 50 mL avec de l’eau stérile. Filtrez-stérilisez à l’aide d’un filtre stérile jetable à flux rapide et conservez à 4 °C.
4. Préparez une chambre humide composée de 5 à 10 essuie-tout humidifiés placés dans une boîte en plastique. Vérifiez que le couvercle est bien étanché. Éliminez tout excès d’eau.
5. Ensuite, placez dans un plateau les éléments suivants : la chambre humide, une lame de rasoir, des pinces fines (précédemment stérilisées à 70 % d’éthanol), une petite bouteille d’eau stérile et du ruban adhésif adhésif. Apportez le plateau et son contenu aux plants de maïs vérifiés à l’étape 1.1.
6. Utilisez une lame de rasoir pour ouvrir la tige bosselée au niveau de l’inflorescence. Les branches principales des pompons, ainsi que les branches latérales de l’inflorescence, peuvent être utilisées pour la récolte des florets méiotiques.
   REMARQUE : Ces branches de pompons contiennent les florets d’intérêt pour collecter les anthères méiotiques. Chaque fleur contient six anthères, et les 3 plus grandes du haut sont généralement utilisées pour l’analyse. La taille approximative et la couleur des anthères correspondent à chaque stade méiotique. Des anthères presque transparentes d’environ 1 mm de long se trouvent au stade leptotène, des anthères translucides de 1,5 mm de long au stade zygotène, des anthères blanchâtres de 2 mm de long au stade pachytène, et des anthères jaunâtres de > 2 mm de long peuvent contenir des méiocytes au diplotène, des tétrades et des grains de pollen qui terminent la gamétogenèse. Notez qu’une autre corrélation longueur-stade peut varier selon les origines génétiques du maïs, et que des facteurs environnementaux (par exemple, la température élevée) peuvent accélérer la progression méiotique et modifier cette relation. Il est recommandé que les chercheurs valident les corrélations entre les stades taille et les autres stades pour chaque génotype spécifique de maïs et conditions de croissance (via le squashing par acétocarmine, cf. 1.6).
7. Utilisez des pinces fines pour disséquer et recueillir soigneusement les branches latérales des inflorescences et les envelopper dans le papier essuie-tout de la chambre humide.
   REMARQUE : Avec un peu de pratique, seule une incision linéaire courte de 3 à 4 cm dans la tige est nécessaire pour extraire les branches du pompon méiotique. Vous pouvez fermer cette incision en l’enveloppant trois à quatre fois avec du ruban adhésif standard, ce qui vous permet de récolter ensuite la même plante en utilisant l’inflorescence restante non disséquée. Les tissus continueront de croître et pourront ensuite être utilisés pour la pollinisation.
8. Gardez la chambre à température ambiante. Utilisez uniquement les branches de l’inflorescence qui contiennent des florets portant des anthères au stade méiotique. Veillez à couvrir les branches avec la moitié des serviettes humides, mais ne les immergez pas dans l’eau.
9. Humidifie à nouveau si les serviettes sèchent. Fermez la boîte jusqu’à la dissection des anthères, de préférence jusqu’à 30 minutes avant le début de la collecte des autres.
10. À l’aide d’un stéréomicroscope binoculaire avec une balance calibrée, collectez des anthères fraîches des florets dans 2 mL de 1x BA dans une boîte de Petri de 35 mm, assurant une identification précise des stades méiotiques en utilisant le proxy de la taille et de la couleur des autres.
    REMARQUE : Pour déterminer avec précision le stade du méiocyte dans les anthères échantillonnées, l’une des trois anthères synchronisées par fleur est rapidement analysée à l’aide d’une fixation 3:1 à l’acide éthanol-acétique, de la coloration à l’acétocarmine et de la microscopie traditionnelle de la^{courge 13}.
11. Préparez le fixateur à 4 % de formaldéhyde en 1x BA et 0,0025 % Tween-20
    REMARQUE : Pour 3 mL, ajoutez 750 μL de formaldéhyde 16 %, 750 μL H₂O, 1,5 mL 2x BA et 7,5 μL Tween-20 à 1 %.
12. Retirez le tampon BA initial et ajoutez les 3 mL de cette solution fixative fraîche aux anthères en phases et fixez-les pendant 45 minutes dans une nouvelle boîte de Petri de 35 mm, scellée par un parafilm pour éviter l’évaporation du formaldéhyde, puis placez-la sur une plus grande boîte de Petri placée sur un shaker rotatif (réglé à 40–60 tr/min, ou 0,2 x g). Faites-le à température ambiante. Les anthères doivent tourner légèrement pour une bonne fixation. Ils flottent généralement à la surface.
13. Rincez avec 3 mL de 1x BA, puis transférez l’échantillon dans une petite boîte de Petri et placez-le sur un shaker rotatif (40–60 tr/min) à température ambiante pendant 45 minutes.
14. À l’aide de pinces propres, transférez les anthères dans une petite boîte de Petri de 35 mm contenant 3 mL frais de 1X BA. Scellez la boîte de Petri avec du parafilm hermétiquement. Ensuite, rangez la petite boîte de Petri dans une boîte de Petri, en la recouvrant de papier aluminium pour la garder dans l’obscurité, puis placez-la à 4 °C jusqu’à utilisation. Vous pouvez le conserver plusieurs mois si besoin.

2. Incorporation des méiocytes de maïs dans les tampons sandwich en polyacrylamide

JOUR 1 : Préparation des diapositives 3D

1. Préparez 2 mL de solution d’acrylamide en mélangeant des volumes égaux (1:1) d’acrylamide et 2x BA. Avant d’ajouter du sulfite de sodium (NaS) et du persulfate d’ammonium (APS), dégazez la solution d’acrylamide sous vide pendant 5 à 10 minutes.
2. Aliquote, l’acrylamide et le ratio 1:1 de 2x BA se mélangent en pipettant 100 μL dans des tubes de 1,5 mL.
   Le nombre de tubes que vous préparez dépend du nombre de lames que vous préparez.
3. Fais 1 mL 1x BA.
4. Placez des morceaux de parafilm de 2 cm x 2 cm sur une boîte de Petri, puis placez-les sous un microscope de dissection. Pipettez 50 μL de solution BA avec anthères sur un parafilm. Coupez la pointe de la pipette avec des ciseaux pour faciliter l’autre livraison.
   1. Pipeter 25 μL de solution BA sur un parafilm ailleurs.
5. En utilisant des pinces pour maintenir les anthères, coupez la pointe des anthères avec un scalpel, puis pressez doucement les méiocytes. Avec une pipette, transférez doucement les méiocytes sur la goutte de 25 μL de BA et mélangez délicatement.
6. Pipeter 10 μL du mélange de méiocytes sur une gaine de couverture séparée.
7. Rapidement, pipettez 5 μL de 20 % (0,2 g/1 mL) de NaS et 5 μL de 20 % (0,2 g/1 mL) d’APS dans un tube de 1,5 mL avec acrylamide/2x tampon A.
8. Rapidement, pipettez 5 μL de ce qui précède sur un manteau de couverture et mélangez avec des méiocytes. Placez une housse à couverture en poly-L-lysine par-dessus, mais faites-la pivoter de 45 degrés. Utiliser un seul cache-cache en poly-L-lysine (soit obtenu commercialement, soit en immergeant les cache-couches dans une solution de poly-L-lysine dans une boîte de Petri pendant quelques minutes et en les laissant sécher, sur le bord d’une nouvelle boîte de Petri propre) permet de libérer un tampon complet après polymérisation. La gaine de couverture est rapidement retirée de la solution et séchée avant utilisation. Pour la microscopie à super-résolution, des cache-lames haute performance avec une épaisseur standardisée (≤170 nm) doivent être utilisées¹⁴.
9. Veuillez ne pas toucher les bâtons de couverture pendant 30 à 50 minutes pour permettre la polymérisation complète de l’échantillon à température ambiante (un processus de polymérisation plus rapide réduit la période de séchage du tampon et la qualité obtenue est inférieure à l’optimalité).
10. Répétez les étapes « 2,6–2,9 » pour chaque diapositive que vous souhaitez préparer.
11. Séparez soigneusement toutes les housses avec une lame de rasoir. Placez tous les couverres, côté coussin vers le haut, sur un tampon en polyacrylamide (ou la majeure partie du tampon), dans une plaque à 6 puits.
12. Lavez chaque embout avec un tampon contenant 2 mL de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) pendant 10 minutes. Répétez ce lavage une fois, pour un temps total de lavage de 20 minutes à température ambiante.
13. Préparez 50 mL en mélangeant 49,4 mL PBS 1x, 100 μL EDTA 0,5 M, et 500 μL Triton.
14. Rincez chaque enveloppe avec un tampon dans 1 mL de ce PBS 1x complété avec 1 mM d’EDTA et 1 % de Triton pendant 2 h à température ambiante.
15. Préparez un nouveau lot de tampon de blocage contenant 1x PBS, 1 mM d’EDTA, 0,1 % Tween-20 et 3 % de BSA (1 mL par lame). Pour 50 mL de tampon de blocage, mélangez 44 mL de PBS 1x, 100 μL d’EDTA 0,5 M, 5 mL de solution Tween-20 à 1 % et 1,5 g de BSA. Le BSA est préféré au sérum d’âne comme agent bloqueant car il aide à minimiser les signaux non spécifiques lors de l’utilisation de plusieurs anticorps primaires et secondaires.

3. Immunolocalisations

1. Préparez l’anticorps primaire (ou les anticorps) à la dilution souhaitée en utilisant un tampon bloquant. Combinez les anticorps primaires en fonction de leur capacité à produire des signaux distincts lorsqu’ils sont utilisés ensemble. Ils doivent provenir de différents organismes, tels que le lapin, le rat, le cochon d’Inde ou le poulet, qui peuvent être reconnus par des anticorps secondaires spécifiques marqués fluorescentement. L’utilisation d’anticorps contre l’âne ou la chèvre est évitée car ils sont destinés à servir d’anticorps secondaires. Nous recommandons d’utiliser une seule espèce d’anticorps secondaire (par exemple, la chèvre dans l’expérience présentée à la Figure 1).
2. Ajoutez 50 μL de cet anticorps primaire dilué au centre de chaque couche de couverture avec un coussinet.
   Ajoutez de l’eau entre les puits pour ralentir l’évaporation. Placez la plaque dans une chambre humide (une boîte en plastique avec un couvercle). Pars pour la nuit.

JOUR 2 : Lavage

3. Préparez 500 mL de tampon de lavage (1x PBS + 0,1 % Tween-20 + 1 mM EDTA).
4. Retirez la solution nocturne des puits par aspiration avec votre pipette.
5. Lavez rapidement chaque couvercle à l’aide d’un tampon deux fois avec 1 mL de tampon de lavage, puis retirez-le des puits.
6. Pipeter un autre 1 mL/ de couverture avec un tampon et laisser reposer 1 heure à température ambiante.
   Répétez 7 fois de plus. (8 h au total)
7. Après le lavage final, ajoutez de l’eau entre les puits, couvrez la plaque, puis laissez-la toute la nuit dans une chambre humide.

JOUR 3 : Anticorps secondaire, lavages et diapositives de montage

8. Préparez les anticorps secondaires en diluant chacun à un ratio de 1:50 dans le tampon de blocage.
   Aspirez la solution de lavage. Dispensez 50 μL de l’anticorps secondaire dilué sur le centre de chaque tampon à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : Chaque anticorps secondaire doit être utilisé en association avec des colorants fluorescents distincts ayant des longueurs d’onde d’émission non superposées. Par exemple, un anticorps secondaire doit être marqué avec AlexaFluor488 (vert), le suivant avec AlexaFluor555 (orange), et le troisième avec AlexaFluor647 (rouge lointain), qui peut être combiné avec DAPI (excitation à 461 nM, bleu). D’autres colorants fluorescents, comme DyLight (par Dyomics GmbH), sont également utilisables. De plus, tous ces anticorps secondaires ne devraient pas réagir en croisement avec d’autres espèces utilisées dans le mélange d’anticorps primaires. Par exemple, l’anticorps secondaire anti-lapin doit être adapté de façon croisée pour être sélectif pour les anticorps du lapin et ne pas reconnaître ni les anticorps des rats ni des cochons d’Inde. Il en va de même pour tous les anticorps secondaires. Une expérience bien conçue doit être utilisée pour valider simultanément toutes ces exigences lors de la co-immunolocalisation.
9. Ajoutez de l’eau entre les puits, placez une plaque dans la chambre humide, puis laissez reposer 2 heures à température ambiante.
10. Aspirez la solution des puits.
11. Effectuez quatre lavages en utilisant 1 mL par puits, 1 h chacun à température ambiante (4 h au total).
12. Lavez chaque puits avec 1 mL de 1x PBS pendant 10 minutes à température ambiante et répétez ce processus deux fois de plus. (30 min au total)
13. Diluez le DAPI en 1x PBS.
14. Colorez avec une concentration finale de 1 μg/mL de dapi (poudre de dapi dissoute dans l’eau) pendant 30 minutes à température ambiante, puis placez 500 μL/puits.
15. Retirez l’antifondu ProLong™ Gold du congélateur à 4 °C pour le laisser dégeler et atteindre la température ambiante.
16. Laver les lames à 1x PBS pendant 30 minutes à température ambiante, avec 1 mL/puits. Refais-le deux fois. (1 h 30 au total)
17. Enlève le dernier lavage.
18. Ensuite, ajoutez deux gouttes d’antifondu ProLong™ Gold au centre de chaque coussinet.
19. Montez les coulisses sur chaque cousse, étiquetez chaque culise, soulevez les couvercles du puits à l’aide de pinces fines, puis placez-les lentement sur la glisse. À l’aide de pinces fines, descendez lentement une seconde housse sur la première. À l’aide d’un vide sous vide, retirez l’excès de glycérol sur les bords des couvertures de l’eau. Scellez les bords des gaines de couverture avec deux couches de vernis à ongles.
20. Si les lames ne sont pas immédiatement examinées au microscope fluorescent. Conservez-les dans un congélateur à -20 °C, protégés de la lumière, jusqu’à leur observation. Ensuite, laissez les lames reposer à température ambiante pendant 1 heure dans une boîte à diapositives, horizontalement et dans le noir, pour éviter la condensation.

JOUR 4 : Observations microscopiques

21. Observe la glissée sous les bonnes longueurs d’onde d’excitation et filtre. La microscopie confocale standard est suffisante, mais il est conseillé d’utiliser un microscope avec un objectif 60x pour permettre l’imagerie tridimensionnelle de l’ensemble de la cellule à l’aide d’une pile z tous les 0,2 μm, avec des acquisitions d’images séquentielles et un traitement de déconvolution à l’aide du logiciel Applied Precision SoftWoRx^® .

Résultats

Grâce à ce protocole, nous pouvons observer simultanément les schémas de localisation des trois protéines méiotiques clés dans le maïs (Figure 1). La protéine méiotique ABSENCE DE PREMIÈRE DIVISION 1 (AFD1) est un homologue de la sous-unité alpha-Kleisin REC8 du complexe cohésine méiotique. L’ASYNAPTIQUE 1 (ASY1) est un élément axial crucial, tandis que le ZYPPER1 (ZYP1) est l’élément transversal du complexe^{synaptonémial 15}. La colora...

Discussion

Ce protocole offre un avantage clé par rapport aux autres en préservant des données tridimensionnelles essentielles sur la charge en protéines chromosomique méiotiques. Ces caractéristiques ne peuvent pas être préservées avec des techniques d’étalement^{classiques 1,2}. Néanmoins, ce protocole présente deux limites : il est lent et techniquement exigeant comparé aux techniques de propagation classiques réalisées en une seule journée...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6 well plate Falcon polystyrene microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Acetic acid, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Acrylamide 30%  and bis-acrylamide solution, 29:1	Biorad	1610157
Aluminum fold	Reynolds	U07211R0
Amonium Persulfate (APS)	Merck	A3678
Binocular stereomicroscope	NA	NA
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
DelltaVision microscope	Olympus	NA
Distilled H2O	NA	NA
Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 μm pore	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Fine forceps FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed  anti-rat labelled by AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Gloves	Merck	Z412392
Growing chambers / greenhouse / or field	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Masking tape 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Maize seeds	NA
Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope 22 x 22 mm-H coverslips	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Microscopic glass slides	Fisher Scientific	22-230-900
Microscope slide box	Fisher Scientific,	03-448-9
Micropipets P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Nail polish	Electron Microscopy Science	72180
Paper towels	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Plastic box with lid	Tupperware	NA
Poly-L-Lysine	Merck	P4707
Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Petri dish regular size	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Pipet tips (0.5-10 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT300
Pipet tips (200 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT200Y
Pipet tips (1000 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Razor blade - single edged	Fisher Scientific	12-640
Rocking platform shaker	NA	NA
Spermine	Merck	85590
Spermidine	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultra pure Acrylamide	Invitrogen	15512023
Vacuum