Une méthode semi-automatisée pour détecter les différences de groupe dans les nombres de neurones dopaminergiques du cluster médial antérieur protocérébral dans le cerveau de Drosophila

Résumé

Ce protocole présente une méthode semi-automatisée pour quantifier le nombre de neurones dopaminergiques dans le grand amas médial antérieur protocérébral de Drosophila . Conçue spécifiquement pour détecter et comparer les différences entre groupes expérimentaux et témoins, cette approche réduit la dépendance au comptage manuel et fournit un outil pratique pour les analyses au niveau des groupes.

Résumé

Drosophila melanogaster sert d’organisme modèle puissant pour étudier les maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson (MP), principalement par l’analyse de la dégénérescence des neurones dopaminergiques (DA) et des déficits de locomotion associés. Historiquement, la quantification de la perte des neurones DA dans le cerveau de la mouche s’est limitée à des clusters plus petits et facilement dénombrables, incluant les clusters protocérébraux postérieurs médiaux (PPM) et les clusters protocérébraux postérieurs latéraux (PPL). En revanche, le groupe protocérébral antérieur médial (PAM) beaucoup plus important, comprenant plus de 100 neurones, représente un défi important pour le comptage manuel, ce qui conduit à sa sous-représentation dans les études quantitatives. À ce jour, les enquêtes rapportées reposent encore sur des comptages manuels laborieux via des piles en Z confocales, qui sont longues et sujettes à la variabilité. Pour combler cette lacune méthodologique, nous avons développé un pipeline d’analyse d’images semi-automatisé à l’aide de l’outil open source Labkit. Ce protocole permet une quantification efficace relative au groupe des neurones positifs à la tyrosine hydroxylase (TH) dans le groupe PAM au sein du même lot expérimental. La méthode commence par une coloration par immunofluorescence standard et une imagerie confocale, suivies d’un guide détaillé étape par étape pour la segmentation et l’analyse. Cette approche répond au goulot d’étranglement de la quantification des clusters PAM et offre un flux de travail pratique pour détecter les différences intergroupes dans la vulnérabilité des neurones DA dans les modèles de neurodégénérescence. La rareté relative des études sur la MP sur le cluster PAM reflète une barrière technique historique plutôt qu’un manque de pertinence biologique. En surmontant cette barrière, notre méthode ouvre la porte à une étude systématique de la vulnérabilité des neurones PAM dans la MP et de son lien potentiel avec des symptômes non moteurs.

Introduction

La mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster, est un organisme modèle populaire pour étudier les fondements génétiques et moléculaires des maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson (MP)¹. Ses voies de signalisation neuronale conservées, sa boîte à outils génétiques sophistiquée et sa courte durée de vie en font une expérience exceptionnellement adaptée à l’étude de la vulnérabilité neuronale dépendante de l’âge et à la réalisation de criblages génétiques et pharmacologiques à haut débit ^2,3. Au cœur de ces recherches se trouve l’analyse des neurones dopaminergiques (DA), dont la dégénérescence sélective est une caractéristique pathologique de^{la 4}. Dans le cerveau de Drosophila, les neurones DA sont organisés en groupes distincts et génétiquement^{identifiables 5,6}. La perte progressive des neurones DA au sein de clusters spécifiques, visualisée par immunocoloration TH et quantifiée par microscopie, sert de lecture fonctionnelle principale pour évaluer la progression de la maladie et les interventions neuroprotectrices dans les modèles^{expérimentaux 7,8}. Ainsi, une quantification fiable de la perte des neurones DA est essentielle pour traduire la puissance de la génétique de Drosophila en résultats de recherche significatifs sur la MP.

Conventionnellement, l’analyse quantitative de la perte des neurones DA s’est concentrée sur l’immunocoloration par la tyrosine hydroxylase (TH) de petits groupes, y compris les groupes protocérébraux postérieurs médiaux (PPM) et les groupes protocérébraux postérieurs latéraux (PPL), chaque groupe contenant moins de 10 cellules facilement dénombrables par^{l’œil 7}. L’énumération manuelle par des piles en Z confocales, bien que laborieuse, a été la méthode établie pour ces groupes dans de nombreuses études sur la DP utilisant Drosophila ^9,10,11. En revanche, le comptage manuel du groupe protocérébral antérieur médial (PAM), le plus grand groupe de neurones DA dans le cerveau de la mouche, comprenant plus de 100 cellules, constitue un goulot d’étranglement méthodologique de longue date et empêche son inclusion dans la majorité des études sur la MP ^9,10,11. Malgré le rôle crucial des neurones PAM dans l’apprentissage, la mémoire et les circuits de motivation, cette limitation a conduit à leur relative sous-représentation dans les analyses quantitatives de la^{neurodégénérescence} 12,13,14,15. Notamment, même les enquêtes récentes continuent de s’appuyer sur cette approche inefficace de comptage manuel, soulignant un besoin persistant et non satisfait d’une solution standardisée et automatisée dans le domaine¹³.

Pour combler ce manque critique, nous avons développé un pipeline d’analyse d’images semi-automatisé qui permet une quantification efficace relative par groupe des neurones TH-positifs (TH⁺) dans le cluster PAM au sein d’une expérience. Ce protocole exploite le plugin open source basé sur l’apprentissage automatique Labkit sur la plateforme Fiji/ImageJ ainsi que le logiciel de traitement d’images^{3D 16,17}. Le flux de travail principal exige que l’utilisateur annote un sous-ensemble représentatif d’images pour entraîner un modèle de classification des pixels, qui est ensuite appliqué à des ensembles de données expérimentales de coloration TH en processus batch, suivi de la création et classification du noyau par rapport à la région TH⁺. Cette approche équilibre l’automatisation avec la supervision d’experts : elle réduit la charge et la variabilité des comptages entièrement manuels tout en conservant les contributions des chercheurs pour guider l’algorithme et examiner les résultats.

L’objectif de cet article est de fournir aux chercheurs un protocole étape par étape pour une quantification efficace des relatives relatives des neurones DA en grappes PAM pour des comparaisons relatives groupe au sein d’une expérience. Nous démontrons le flux de travail complet, de la dissection cérébrale, la coloration par immunofluorescence et l’imagerie confocale, jusqu’à la chaîne d’analyse détaillée d’images en utilisant la méthode semi-automatisée. En standardisant cette étape quantitative clé, ce protocole vise à permettre à la communauté de recherche d’intégrer de manière cohérente le grand cluster PAM dans ses analyses. Cette méthode semi-automatisée est spécifiquement conçue pour le cluster PAM et n’est pas applicable aux autres amas dopaminergiques ni aux neurones TH-positifs dans les lobes optiques. Cette méthode peut faciliter des études au niveau des batchs sur la vulnérabilité des neurones DA du cluster PAM ainsi que des recherches supplémentaires sur la plasticité synaptique, la neurodégénérescence et le criblage thérapeutique utilisant le modèle de Drosophila .

Protocole

1. Préparation de l’échantillon et imagerie confocale

1. Élevage et collecte de mouches
   1. Des mouches parentes croisées des génotypes désirés pour générer une progéniture expérimentale. Lors de l’éclosion, collectez 20 à 30 mouches par fiole de nourriture fraîche. Maintenir les mouches selon le plan expérimental de l’utilisateur jusqu’à ce que l’âge expérimental souhaité soit atteint.
2. Préparation à la dissection
   1. Préparez une plaque de dissection en remplissant le couvercle d’une boîte de Petri de 30 mm à moitié hauteur avec un élastomère en silicone Sylgard. Remplissez le plat avec 1x Solution Saline Tamponnée au Phosphate (PBS). Aliquote 450 μL de fixateur contenant 1x PBS et 4 % de paraformoldéhyde (PFA) dans un tube microcentrifuge de 0,6 mL, puis placez le tube sur de la glace.
   2. Anesthésiez 10 à 20 mouches avec une impulsion de CO₂ de 5 à 10 s, puis transférez-les immédiatement sur une boîte de Petri de 60 mm placée sur glace pour maintenir l’immobilité.
      ATTENTION : Le PFA est toxique et suspecté comme cancérigène. Manipulez une hotte avec des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. Éliminer les déchets conformément aux directives institutionnelles concernant les matières dangereuses.
3. Dissection et fixation du cerveau de la mouche
   1. Saisir une mouche par la racine de l’aile à l’aide de pinces et plonger sa partie ventral vers le haut dans la boîte de dissection remplie de PBS. Percez le thorax avec une fine goupille de dissection pour ancrer la mouche sur le coussinet Sylgard.
   2. Orientez le corps horizontalement (par exemple, tête à gauche, abdomen à droite). Maintenez la base de la trompe avec une pince tout en retirant toute la probosce avec l’autre, créant ainsi une ouverture entre les yeux composés.
   3. Saisir les bords oculaires exposés avec deux pinces et les écarter très lentement de façon symétrique, exposant le cerveau tout en préservant sa connexion au cordon nerveux ventral.
   4. Retirez les sacs trachéaux et le corps graisseux entourant le cerveau. Sectionner le cordon nerveux ventral pour libérer le cerveau et le laisser se poser sur la plaque, son côté antérieur tourné vers le haut.
      REMARQUE : Si le cerveau stabilisé montre que la moitié ventrale est positionnée plus haut que la moitié dorsale (Figure 1B,C), utilisez une pince pour appuyer doucement sur la partie surélevée.
   5. Préhumidifiez une pointe de pipette P10 contenant 0,1 % de Triton X-100 pour empêcher le cerveau disséqué d’adhérer à la paroi interne de la pointe. Avec cette pointe préhumidifiée, transférez chaque cerveau disséqué dans le tube contenant le fixateur, puis procédez à la dissection suivante. Après que tous les cerveaux ont été transférés, inversez le tube 5 fois et placez-le horizontalement sur de la glace pendant 30 minutes. Incubez le tube à température ambiante (RT) pendant 1 h avec agitation.
   6. Laissez le cerveau se déposer au fond pendant 1 minute. Lavez le cerveau pendant 3 x 10 minutes avec une solution de lavage contenant 1x PBS et 0,1 % de Triton X-100 (PBST) avec agitation. Stockez le cerveau dans des PBS contenant 0,1 % d’azide de sodium à 4 °C ou procédez à l’immunocoloration.
4. Immunocoloration
   1. Tachez les cerveaux dans 300 μL de solution primaire de coloration anticorps contenant 1x PBS, 0,1 % de Triton X-100, 5 % de sérum normal de chèvre, 0,1 % d’azide de sodium et un anticorps anti-TH de lapin (dilution 1:500) pendant 2 jours à 4 °C avec agitation. Lavez le cerveau pendant 3 x 10 minutes avec du PBST.
   2. Colorez le cerveau dans une solution secondaire d’anticorps contenant 1x PBS, 0,1 % de Triton X-100, 5 % de sérum normal de chèvre, 0,1 % d’azide de sodium et d’Alexa Fluor 635 anti-lapin pendant 2 jours à 4 °C. Lavez-vous le cerveau une fois avec du PBST.
   3. Incubez les cerveaux en PBST complétés avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (dilution 1:1 000) pendant 2 heures à la RT, puis lavez les cerveaux dans du PBST pendant 2 heures. Conservez les cerveaux à 4 °C toute la nuit ou montez-les.
5. Montage
   1. Chargez 0,5 mL de montage dans une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille de calibre fin. Créez une chambre de montage en fixant deux bandes parallèles de ruban adhésif transparent sur une culasse en verre, laissant un espace de 3 mm (Figure 1A,D).
      ATTENTION : Les aiguilles pointues présentent un risque de perforation. Manipulez toujours avec précaution, refaites le résumé avec une technique de cuillère à une main si nécessaire, et jetez immédiatement les aiguilles usagées dans un contenant approuvé pour objets tranchants.
   2. Transférez le cerveau dans une boîte de Petri propre à l’aide d’une pointe tronquée en P200. Retirez l’excès de liquide entourant le cerveau et administrez 10 μL de montant sur le cerveau. Mélangez doucement le cerveau avec le monteur.
   3. Distribuez trois gouttelettes de montage le long de l’espace sur la culasse et étalez-les uniformément sur l’espace. Transférez et positionnez les cerveaux le long de la ligne centrale de l’espace avec une pipette P10 (Figure 1A).
   4. Positionnez les cerveaux uniformément le long de la ligne centrale de l’espace, avec le côté antérieur vers le haut. Couvrez lentement l’espace avec une couche de couverture. Appuyez près des bords de la housse avec les pouces pendant 3 secondes pour assurer un contact ferme.
   5. Placez la lame horizontalement dans un plieur pour durcir toute la nuit à RT dans le noir, puis à 4 °C pour un stockage à long terme.
6. Imagerie confocale
   1. Allumez le système de microscope confocal et attendez 15 minutes pour la stabilisation laser. Localiser le cerveau en champ lumineux avec une lentille objectif 10x, puis passer à une lentille à immersion dans l’huile 100x et naviguer vers le cluster PAM en vue en direct.
   2. Ajustez le stade XY pour localiser un cluster PAM dans le centre d’imagerie. Aperçu à Z pour confirmer les limites et l’orientation. Ajustez le zoom numérique et l’orientation jusqu’à ce que le cluster PAM s’adapte à l’image d’imagerie en diagonale.
   3. Réglez la position supérieure et inférieure de la pile. Réglez la taille du pas Z à 0,34 μm et la résolution d’image à 512 x 512. Réglez le trou de goupille en mode automatique. Réglez la table de recherche d’affichage (LUT) sur indicateur de saturation.
   4. Ajustez la puissance du laser et le gain du détecteur du canal TH jusqu’à ce qu’une quantité minimale de points distincts diffusés dans les neurones PAM soit saturée. Ajustez les réglages du canal DAPI pour obtenir un signal nucléaire clair et clair sans saturation.
      REMARQUE : Le facteur de zoom optimal varie. Des différences de rétrécissement tissulaire peuvent survenir entre les lots expérimentaux et entre les cerveaux individuels d’un même lot.
   5. Acquérir et enregistrer des images au format brut avec 12 ou 16 bits dans le dossier d’entrée (par exemple, D :\Confocal\images). Revenez à la vue en direct, réinitialisez le zoom et parcourez l’espace pour trouver le cerveau suivant sans passer à un grossissement plus faible.
      REMARQUE : Ne sauvegardez, exportez pas et ne convertissez pas les fichiers de données primaires en format .tif traité à ce stade. La conservation des métadonnées brutes originales est essentielle pour le traitement d’image ultérieur.

2. Traitement d’image et quantification

1. Conversion de fichier image et séparation du canal TH
   1. Convertir les images brutes situées dans le dossier d’entrée vers un format compatible avec le logiciel d’analyse d’images 3D en utilisant le convertisseur de fichiers associé (Table of Materials). Placez les fichiers convertis dans le dossier converti (par exemple, D :\Confocal\converted)
   2. Ouvrez Fidji et naviguez jusqu’à Fichier | Nouveau | Script. Dans l’éditeur de scripts, cliquez sur Fichier | Ouvrir pour charger le fichier macro ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm (Fichier supplémentaire 1). Cliquez sur Exécuter près du bas de la fenêtre de l’éditeur (si le bouton est caché, cliquez sur la petite icône triangulaire pour l’afficher).
   3. Dans la boîte de configuration de configuration, cliquez sur Parcourir et sélectionnez le dossier converti. Dans Convention de nommage, sélectionnez l’option 3. Dans Channel pour exporter, sélectionnez l’index du canal correspondant à TH. Cliquez sur OK pour diviser le canal TH en lot ; les piles TH exportées seront automatiquement sauvegardées dans un dossier se terminant par ChannelSplitOut.
2. Formation du classificateur Labkit
   1. Préparation de l’ensemble de données d’entraînement
      1. Sélectionnez 20 piles représentatives qui capturent une gamme d’intensités de signal et de variations de fond d’échantillons du dossier TH stack. Copiez les fichiers sélectionnés dans le dossier de sélection (par exemple, D :\Confocal\selection).
      2. Exécutez la macro fidjienne ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (Fichier Supplémentaire 2). Lorsque vous le demandez, sélectionnez le dossier contenant les images d’entraînement. La macro réduit chaque pile au même nombre de Z-tranches et concaténe les piles en un fichier TIFF en accéléré pour l’entraînement.
   2. Entraînement interactif du classificateur de pixels
      1. Lancement du Labkit via Fiji Plugins | Labkit | Image ouverte avec Labkit (tableau des matériaux). Dans la barre d’outils, cliquez sur le bouton 3D Box pour passer en mode Slice View afin de naviguer à travers les Z-slices (curseur à droite) et à travers les échantillons (curseur en bas).
      2. Appuyez sur S pour ouvrir le panneau Brillance et Contraste et ajustez le curseur Max pour une visualisation optimale des neurones TH⁺ . Définissez une taille de pinceau appropriée (par exemple, 5 pixels). Cliquez sur Paramètres pour agrandir le panneau d’outils. Conservez les modes d’affichage par défaut (fusionné, source, le plus proche).
      3. Cliquez sur Dessiner. Dans le panneau d’étiquetage, sélectionnez Arrière-plan et utilisez quelques régions non cellulaires ; surlignez le premier plan et puisez dans l’intérieur de quelques neurones ^TH+.
      4. Zoomez et dézoomez sur le champ avec Ctrl + Shift + Défilement. Naviguez vers d’autres Z-slices en utilisant le curseur vertical et vers d’autres échantillons d’entraînement avec le curseur inférieur. Répétez le dessin plusieurs fois pour assurer une formation robuste des classificateurs.
      5. Cliquez sur la classification des pixels. Cliquez sur le triangle Start Training pour lancer l’entraînement et la prédiction paresseuse, qui fournissent ensuite un retour de segmentation en temps réel tout en naviguant entre échantillons, tranches ou positions (clic droit et glisser) à tout moment.
      6. Cliquez sur Dessiner pour ajouter des annotations correctives lorsque la prédiction est inexacte, avec possibilité d’activer la visibilité de la prédiction et de l’étiquette dans le panneau Sources et de réentraîner. Itère jusqu’à ce que le classificateur distingue de manière fiable les neurones ^TH+ du fond de fond, puis sauvegarde le classificateur via Segmentation | Sauvegardez le classificateur avant de fermer Labkit.
3. Segmentation par lots de Labkit
   1. Ouvre une image aléatoire depuis le dossier TH stack aux Fidji. Lancez Labkit et cliquez sur Supprimer tout, puis chargez le classificateur pré-entraîné via Segmentation | Ouvrez le classificateur pour segmenter l’image. Inspectez visuellement la qualité pour valider la généralisation du classificateur, puis fermez la fenêtre.
   2. Répétez 2.3.1 sur plusieurs autres images aléatoires. Fermez la fenêtre après chaque inspection sauf la dernière.
   3. Créez un dossier de sortie Labkit (par exemple, D :\Confocal\LabkitOut). Commencez le traitement par lots via Autres > images de segments par lot. Définissez le directeur d’entréey sur le dossier TH stack et définissez le répertoire de sortie sur le dossier Labkit, puis cliquez sur OK pour commencer le traitement en lot.
   4. Pour de futures expériences utilisant le même anticorps TH et des réglages confocaux comparables, sauter la version 2.2 et réutiliser le classificateur précédent.
      REMARQUE : Nous fournissons également un classificateur pré-entraîné à des fins de test (Fichier Supplémentaire 3).
4. Création de spots DAPI et TH⁺ Quantification des neurones
   1. Placez XT_Jove_Labkit_TH.m (Fichier Supplémentaire 4) dans un dossier script (par exemple, D :\scripts). Ouvre un logiciel 3D et navigue dans Fichier | Préférences, puis sélectionnez Outils personnalisés. Dans le panneau du dossier XTenson , cliquez sur Ajouter... pour sélectionner le dossier script et cliquer sur OK.
   2. Pour chaque fichier converti, le script exécutera automatiquement les opérations séquentielles suivantes.
      REMARQUE : Cette section explicative ne contient pas d’actions pour l’utilisateur mais est essentielle pour passer aux étapes suivantes.
      1. Le canal DAPI est traité par soustraction de fond et filtre gaussien pour faciliter une identification optimale des points DAPI.
      2. Le masque de segmentation Labkit est affiné par réduction du bruit et le remplissage de trous, puis attaché comme canal de masque au jeu de données. Un objet de surface TH raffiné est construit à partir du canal masque. L’objet de surface TH génère en outre un masque raffiné pour écraser le canal du masque.
      3. Un canal de transformation de distance est créé à partir de la surface TH, où les voxels à l’intérieur de la surface sont fixés à 0 et ceux à l’extérieur de la surface sont attribués à des valeurs en virgule flottante représentant leur distance euclidienne à la surface TH la plus proche.
      4. Utilisez le profil d’intensité de chaque point DAPI dans le canal de transformation de distance comme mesure pour identifier le neurone ^TH+ . Les points DAPI situés dans ou près des régions TH⁺ ont de faibles valeurs de distance. Ce critère aide à sauver les faux négatifs, comme les noyaux réels des neurones DA situés juste à l’extérieur mais immédiatement adjacents à une région imparfaite du premier plan prédite par Labkit.
   3. Optimisation manuelle de la qualité pour la création de spots DAPI
      1. Ouvrez un échantillon aléatoire du dossier converti dans un logiciel 3D. Naviguer pour modifier | Propriétés de l’image et vérifier si la taille du voxel Z dans le panneau Coordonnées est de 0,340 μm. Sinon, changez-la manuellement à 0,340 μm.
      2. Appliquez la soustraction en arrière-plan sur le canal DAPI en cliquant sur Traitement d’image | Seuil | Soustraction de fond. Dans la boîte de dialogue, cochez seulement le canal DAPI, réglez la largeur du filtre à 3, puis cliquez sur OK. Répétez cette étape une fois de plus, puis effectuez une troisième répétition avec une largeur de filtre de 1.
      3. Appliquez le lissage gaussienne en cliquant sur Traitement d’image | Lissage | Filtre gaussienne. Cochez uniquement le canal DAPI, réglez la largeur du filtre à 0,2, puis cliquez sur OK.
      4. Dans la Scène Surpass, cliquez sur Ajouter de nouveaux spots pour lancer l’assistant de création des spots. Sélectionnez le canal DAPI et entrez un diamètre XY estimé de 1,2 μm. En suivant l’assistant, ajoutez un filtre « Qualité au-dessus » et ajustez le seuil jusqu’à ce qu’il donne robustement un point précis unique pour chaque noyau.
      5. Répétez les étapes 2.4.3.1–2.4.3.3.4 sur plusieurs échantillons sélectionnés au hasard, et finalisez la ou les valeurs seuil qui fonctionnent de manière fiable entre les échantillons.
   4. Ouvrez le script XT_Jove_Labkit_TH.m (Fichier supplémentaire 4) dans l’éditeur de texte pour modifier les paramètres suivants définis par l’utilisateur.
      1. Régler ims_Folder sur le chemin du dossier converti ; réglez LabkitOut_Folder sur le chemin du dossier de sortie Labkit. Définissez Ch_DAPI à l’index du canal DAPI pour tous les fichiers du dossier converti (par exemple, 1 si DAPI est le premier canal, 2 si DAPI est le second canal).
      2. Définir reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. Si les tailles des voxels sont correctes dans les Propriétés d’image (voir l’étape 2.4.3.1), laissez les réponses entre crochets vides []. Sinon, il faut entrer manuellement les valeurs appropriées (par exemple, 0,130, 0,130, 0,340, respectivement) qui seront appliquées à tous les fichiers du dossier converti.
   5. Finaliser les paramètres de création des spots.
      1. Personnalisez plusieurs versions des paramètres dans la matrice de cellules SpotsParameterAss , où chaque ligne spécifie une version. Cela inclut la définition d’un diamètre XY estimé (μm) pour la détection de points DAPI dans la partie gauche de chaque ligne, et la définition d’une chaîne de filtres composée de filtres critères dans la partie droite de chaque ligne, contenant le (s) seuil(s) de qualité de l’étape 2.4.3.4 et/ou le seuil d’intensité sur le canal de masque raffiné de l’étape 2.4.2.2 ou du canal de transformation de distance de l’étape 2.4.2.3.
      2. Placez « Centre d’intensité Ch = aSizeC+1 » au-dessus de 0,5 pour ne conserver que les zones dont le centre géométrique se situe dans le canal de masque TH raffiné à partir de 2.4.2.2 (valeur du voxel > 0,5). C’est le critère le plus direct et strict pour le filtrage spot TH⁺ DAPI.
      3. Réglez « Intensity Mean Ch = aSizeC+2 » en dessous de [seuil] pour conserver les points dont l’intensité moyenne dans le canal de la transformation de distance à partir de l’étape 2.4.2.3 descend en dessous d’un seuil spécifié. Les seuils plus bas sélectionnent des endroits situés à l’intérieur ou extrêmement près de la surface TH ; Des seuils plus élevés incluent des endroits progressivement plus éloignés. Cela permet un étalonnage empirique de la proximité acceptable pour l’attribution ^TH+ .
      4. Exemple préconfiguré :
         SpotsParameterAss = {
         1.2, [« Qualité » au-dessus de 94,5,"Centre d’intensité Ch=aSizeC+1 » au-dessus de 0,5'] ;
         1,2, [« Qualité » au-dessus de 94,5,« Moyenne d’intensité Ch = aTailleC+2 » inférieure à 0,0001'] ;
         1.2, [« Qualité » au-dessus de 94,5,« Moyenne d’intensité Ch = aTailleC+2 » inférieure à 0,001'] ;
         1,2, [« Qualité » au-dessus de 94,5,« Moyenne d’intensité Ch = aTailleC+2 » inférieure à 0,01'] ;
         ... d’autres combinaisons de filtres sont fournies en script.
         };
      5. Pour de futures expériences utilisant les mêmes réglages d’anticorps TH et confocaux, réutilisez les combinaisons de paramètres précédentes. Supprimez ces mauvaises combinaisons qui entraînent des dégâts ponctuels substantiellement différents des chiffres réels, réduisant ainsi la charge computationnelle inutile.
   6. Création de taches par lots
      1. Sauvegardez toutes les modifications ci-dessus du script XT_Jove_Labkit_TH matin. Ouvrez une nouvelle fenêtre de logiciel 3D. Cliquez sur le menu Traitement d’image | PAM_TH_processing exécuter le script par lot.
      2. Au début, observez pendant quelques minutes que pour chaque combinaison de filtres, le script crée un objet Spots nommé pour refléter ses paramètres, et que les fichiers du dossier converti sont traités et sauvegardés comme copies dans un nouveau dossier de sortie avec le suffixe « traité ». Puis laissez l’ordinateur sans surveillance.
      3. Une fois terminé, un tableau sera généré. Observez la première colonne contenant les noms de fichiers, et les colonnes suivantes contenant les comptes de points DAPI correspondant à chaque combinaison de filtres, avec des en-têtes de colonne indiquant le diamètre XY estimé et la chaîne de filtres utilisée.
   7. Validation du post-traitement
      1. Après l’étape 2.4.6, ouvrez manuellement quelques fichiers aléatoires du dossier « traité » et examinez les différents objets Spots en superposition avec le canal TH original. Sur la base d’une inspection visuelle, sélectionnez un ou deux filtres optimaux qui fournissent la représentation la plus fidèle des vrais décomptes de neurones TH⁺ . Exportez les colonnes correspondantes du tableau pour l’analyse statistique en aval et la préparation des chiffres.
      2. Pour corriger les erreurs de comptage de points dans la ou les combinaisons de filtres préférées, sélectionnez l’objet Spots correspondant dans la scène Surpass et cliquez sur l’onglet Éditer . Retirez manuellement les taches erronées ou ajoutez les zones manquées selon les besoins en appuyant sur Maj et en cliquant sur l’écran. Sauvegardez les mises à jour en utilisant Store as/Export as/Save afin de remplacer le fichier correspondant dans le dossier « processed » avec le même nom de fichier.
         REMARQUE : Ne supprimez, ajoutez pas, ne renommez pas ou ne repositionnez aucun objet Spots — modifiez seulement les spots préférés. Aucune modification du script n’est requise ; Il suffit de relancer le script pour générer instantanément un tableau mis à jour et reflétant les raffinements manuels. Pour la cohérence, soit ne laissez aucun modifié, soit modifiez l(s) object(s) Spots préféré(s) pour tous les échantillons d’une expérience.

Résultats

Les données brutes collectées à partir du logiciel ont été déposées dans un dépôt public et sont accessibles au DOI suivant : 10.5281/zenodo.19814348. Pour démontrer l’utilisation de ce pipeline de quantification semi-automatisé, nous l’avons appliqué à un modèle bien établi de DP par Drosophila utilisant l’expression panneuronale de la α-synucléine humaine (nSyb-QF2>QUAS-SNCA). Les mouches de contrôle abritaient uniquement le pilote nSyb-QF2 . Les deux génotypes ont été vieillis à 29 °C pendant 3 semaines, après quoi les cerveaux ont été disséqués, immunocolorés pour la TH et imagés pour le cluster PAM. Comme montré à la Figure 3E, le pipeline semi-automatisé a détecté une réduction significative du nombre de neurones PAM TH⁺ chez les mouches exprimant α-synucléine par rapport aux témoins (test t de Student, p < 0,0001), démontrant que la méthode peut capturer des différences dépendantes du génotype au sein d’un même lot expérimental. Les sections suivantes décrivent la configuration de montage (Figure 1), l’interface d’entraînement Labkit (Figure 2) et les étapes de traitement d’image (Figure 3) qui permettent cette quantification.

La Figure 1 illustre la configuration de montage des cerveaux disséqués de Drosophila et son impact sur l’imagerie des grappes de PAM. Après la dissection, le cerveau présente parfois une flexion ou un inclinaison vers le haut du tissu adjacent à la moelle nerveuse ventrale sectionnée. Ce soulèvement dans la partie ventrale du cerveau modifie la perspective sous le stéréoscope, entraînant une projection modifiée du sillon stéréotypé dans le contour dorsal et une différence dans la perspective relative des repères ventraux. (Figure 1B,C). Cette déformation survient souvent au moment où le cerveau est détaché du corps. Une telle déformation affecte l’orientation du cluster PAM lors du montage, ce qui influence ainsi la profondeur requise de la pile Z (Figure 1C,D). Dans des conditions de montage optimales, l’espaceur du ruban Scotch à une seule couche crée une compression adéquate sur la région centrale du cerveau, faisant que le groupe de PAM situé dorsalement prend une orientation horizontale immédiatement adjacente à la gaine de revêtement. Cette configuration donne des Z-stacks de 15 à 25 tranches à des intervalles de 0,34 μm (Figure 1D). Dans l’autre condition, le cluster PAM reste incliné, nécessitant des piles Z plus profondes (Figure 1D). De même, l’utilisation d’un entretoiseur de bande double couche ne fournit pas une compression adéquate, laissant le cluster PAM dans sa conformation native inclinée et augmentant également la profondeur de la pile Z (Figure 1D). La figure 1E présente des vues latérales représentatives des piles en Z colorées en TH dans des conditions optimales et inclinées.

La figure 2 présente l’interface utilisateur Labkit et un flux de travail de formation représentatif. Avec seulement quelques annotations de gribouillis clairsemées sur un seul échantillon (Figure 2A), le classificateur de pixels initial produit déjà une segmentation remarquablement raisonnable (Figure 2B). Cependant, il est crucial de souligner qu’une telle annotation minimale est insuffisante pour une performance robuste et généralisable sur l’ensemble d’un ensemble de données. Un marquage beaucoup plus itératif — couvrant plusieurs tranches Z, échantillons et variations de coloration — est nécessaire pour générer un classificateur qui segmente de manière fiable les neurones ^TH+ à travers l’ensemble de l’ensemble des données. Notamment, les images d’entraînement multiples sont concaténées selon la dimension temporelle (image) plutôt que empilées selon l’axe Z. Cette conception préserve l’intégrité spatiale de chaque volume cérébral individuel, garantissant que les grains de filtre 3D fonctionnent exclusivement à l’intérieur — et non à travers — des spécimens biologiques. Si les échantillons étaient plutôt empilés verticalement en une seule pile Z épaisse, les tranches Z aux frontières entre échantillons adjacents deviendraient spatialement contiguës, ce qui ferait que les voxels de différents cerveaux seraient traités comme des structures voisines, augmentant ainsi le risque de corrections manuelles inutiles (Figure 2C). La concaténation selon l’axe temporel évite cette contamination par échantillons croisés tout en permettant un entraînement efficace multi-échantillons lors d’une seule session Labkit.

La figure 3 illustre le pipeline de post-traitement et la quantification finale. Les masques de segmentation bruts du Labkit (Figure 3A) contiennent de nombreux petits faux positifs et trous internes. Après application d’opérations de débruisement morphologique et de remplissage de trous (Figure 3B), une surface TH lissée est construite et utilisée pour générer un masque binaire affiné (Figure 3C). L’amélioration obtenue par ce raffinement est visualisée sous forme d’une superposition comparant les masques initiaux et finaux (Figure 3D, supérieur). Notamment, certaines régions neuritiques riches en TH sont parfois conservées dans le masque final ; cependant, ces zones sont presque toujours dépourvues de noyaux colorés par DAPI et contribuent donc négligemment au nombre final de neurones. Les utilisateurs avancés peuvent encore ajuster les paramètres morphologiques dans le script de traitement par lots fourni afin d’affiner l’élimination de ces artefacts résiduels. La figure 3D (en bas) montre les taches DAPI finales (magenta) superposées sur le canal TH (vert) à partir d’une projection d’intensité maximale. La figure 3D révèle également un type rare de faux positif observé occasionnellement dans notre pipeline : un noyau coloré en DAPI situé dans une région de neurite riche en TH peut être incorrectement classé comme un point TH⁺ lorsque le signal de neurite chevauche fortement le noyau. Cependant, comme le montre la Figure 3C, les noyaux DAPI positifs à proximité des neurites sont généralement clairsemés. De plus, les rares signaux DAPI présents près de ces régions neuritiques restent souvent correctement classés comme véritables négatifs (c’est-à-dire non comptabilisés comme TH⁺), car ils ne sont pas mal identifiés par le pipeline. La figure 3E démontre l’utilité pratique de la méthode : les mouches nSyb-QF2>SNCA âgées de 3 semaines présentent une réduction significative du nombre de neurones TH⁺ PAM comparées aux contrôles nSyb-QF2 à travers plusieurs filtres (test t de Student, p < 0,0001). Bien que les décomptes absolus de points puissent varier selon différentes combinaisons de filtres et que la méthode n’atteigne pas une précision parfaite en un seul point, la différence relative entre les groupes expérimental et contrôle reste robuste. Pour plusieurs filtres testés, le résultat statistique de la comparaison de groupes est largement préservé entre les filtres du même lot expérimental. En conséquence, la sortie doit être interprétée comme une lecture comparative intra-lot plutôt qu’un décompte absolu sans erreur des neurones PAM.

Figure 1. Dissection cérébrale et configuration de montage par Drosophila. (A) Schéma de l’ensemble de montage du cerveau. Les barres jaunes représentent les entretoises du ruban Scotch. Un schéma cérébral agrandi indique l’emplacement approximatif de l’amas PAM (violet). (B) Schémas en section transversale latérale correspondant au plan pointillé dans A représentant deux morphologies cérébrales courantes après dissection : positionnées de façon optimale (supérieure) et inclinées (plus bas). (C) Deux cerveaux de mouche disséqués observés sous stéréoscope : positionnés de façon optimale (à gauche) versus inclinés (à droite). Des flèches jaunes indiquent le sillon stéréotypé le long du contour dorsal. Des lignes bleues pointillées relient deux repères correspondants sur les côtés gauche et droit de la moitié ventrale. Les flèches bleues mettent en évidence le changement de perspective relative résultant de ces repères ventraux. Barre d’échelle = 500 μm. (D) Illustration schématique montrant comment la morphologie du cerveau et l’épaisseur des espaceurs de bande (simple ou double couche) influencent le positionnement vertical du cluster PAM et par conséquent la profondeur requise de la pile Z. (E) Vues latérales représentatives (projection en Y) des piles confocelles en Z colorées en TH à partir de conditions de montage optimalement positionnées (supérieures) et déformées (inférieures). Barre-échette = 5 μm. Abréviation : PAM = protocérébral antérieur médial. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2. Formation en labkit et segmentation interactive. (A) Interface graphique Labkit. Les annotations (gribouillis) sont indiquées en deux catégories : au premier plan (rouge) et arrière-plan (bleu). (B) Résultat de segmentation généré immédiatement après l’entraînement sur les gribouillis montrés dans A. Le rouge indique la couleur du premier plan ; Le bleu indique la couleur de fond. Barre-échelle = 5 μm. (C) Diaphonie entre les tranches Z adjacentes. Des images en tranche unique de mitochondries fluorescentes marquées par des protéines provenant de différents cerveaux de mouches ont été concaténées le long de l’axe Z. Les tranches 1 et 3 sont des copies identiques de la même image, tandis que les tranches 2 et 4 proviennent de cerveaux différents. Flèches jaunes, prédiction qui traverse de la tranche 2 vers la tranche 1. Flèches vertes, prédiction filtrant de la tranche 4 à la tranche 3. Barre d’échelle = 3 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3. Post-traitement des masques de segmentation Labkit et de la quantification des neurones TH⁺. (A) Masque binaire Raw Labkit (cyan, supérieur) et superposition avec le canal TH original (inférieur). Notez l’abondance de petites taches et un remplissage incomplet des corps cellulaires neuronaux. (B) Masque après débruisement morphologique et remplissage de trous (magenta, supérieur) ; superpose avec le canal TH (inférieur). (C) Masque binaire raffiné (rouge, supérieur) à partir d’une surface TH lisse pour B et re-masquage ; superpose avec le canal TH (inférieur). (D) Upper : Superposition de masques bruts (cyan) et raffinés (rouges), mettant en évidence les régions corrigées par post-traitement. Plus bas : projection d’intensité maximale montrant les taches finales DAPI (magenta) superposées au canal TH (vert). Notez que les deux points dans le coin supérieur droit proviennent du groupe controlatéral de PAM. Le filtre 4 était utilisé pour l’illustration. (E) Validation quantitative dans un modèle de la maladie de Parkinson utilisant plusieurs combinaisons de filtres. Les mouches nSyb-QF2>SNCA (modèle) âgées de trois semaines présentent une réduction significative du nombre de neurones TH⁺ PAM par rapport aux contrôles nSyb-QF2 dans plusieurs filtres (haut). Les données brutes sont fournies dans un tableau Excel (en bas). filtre 1 : 1,2, [« Qualité » au-dessus de 94,5, « Moyenne d’intensité Ch = aTailleC+2 » inférieure à 0,0001'] ; filtre 2 : 1,2, [« Qualité » au-dessus de 94,5, « Moyenne d’intensité Ch = aSizeC+2 » inférieure à 0,001'] ; filtre 3 : 1,2, [« Qualité » au-dessus de 94,5,« Moyenne d’intensité Ch = aTailleC+2 » inférieure à 0,01'] ; filtre 4 : 1,2, [« Qualité » au-dessus de 94,5, « Moyenne d’intensité Ch = aTailleC+2 » inférieure à 0,05'] ; filtre 5 : 0,6, [« Qualité » au-dessus de 94,5, « Moyenne d’intensité Ch = aSizeC+2 » en dessous de 0,001'] ; filtre 6 : 0,6, [« Qualité » au-dessus de 94,5,« Moyenne d’intensité Ch = aTailleC+2 » inférieure à 0,01'] ; filtre 7 : 0,9, [« Qualité » au-dessus de 94,5,« Moyenne d’intensité Ch = aTailleC+2 » inférieure à 0,01'] ; n = 57 cerveaux (témoins), n = 65 cerveaux () ; Test t de l’étudiant, p < 0,0001 (****). Les mouches étaient cultivées à 29 °C. Barres d’échelle = 5 μm (A–D). Les données sont présentées en moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dossier supplémentaire 1. Macro Fiji pour séparer le canal TH des fichiers image convertis et sauvegarder les piles de sortie.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2. Macro Fiji pour recadrer les piles Z d’entraînement à une profondeur de tranche Z commune et les concaténer en un fichier TIFF en accéléré pour l’entraînement du classificateur Labkit.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3. Classificateur Labkit pré-entraîné utilisé pour tester le flux de travail de segmentation PAM TH.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 4. Le script MATLAB pour le traitement par lots des masques Labkit, la génération de spots DAPI, l’application de combinaisons de filtres et l’exportation des comptes de neurones TH⁺ .Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La quantification des neurones DA dans le groupe PAM de Drosophila a historiquement été un défi de taille. Ici, nous présentons un flux de travail semi-automatisé qui intègre la classification des pixels basée sur l’apprentissage automatique avec un logiciel d’analyse d’images pour résoudre ce problème de longue date. Cette méthode permet la détection au niveau des lots des variations des neurones ^TH+ dans le groupe PAM entre groupes au sein d’une même expérience, soutenant des études comparatives dans les modèles atteints de la maladie de^{Parkinson 18}.

Lors du choix du filtre optimal pour une expérience donnée, les utilisateurs peuvent soit choisir le filtre qui correspond le mieux à l’inspection visuelle des images brutes, soit se référer à la plage et/ou à la moyenne rapportée du nombre de neurones PAM de type sauvage dans la^{littérature 12,13}. Cependant, la prudence est de fait : seules deux études ont rapporté le nombre de grappes de PAM, aucune n’étant liée à la MP, et les valeurs rapportées montrent une incohérence considérable. De plus, l’écart-type peut augmenter avec l’âge, compliquant encore davantage les comparaisons croisées. Par conséquent, la référence basée sur la littérature doit être utilisée uniquement comme guide approximatif, et non comme norme absolue. Nous reconnaissons que ce pipeline ne produit pas de comptages absolus sans erreur (Figure 3D). Cependant, tant que les comparaisons sont limitées à des groupes au sein d’un même lot expérimental (c’est-à-dire qu’ils ne regroupent pas les données entre différents lots dans un seul plot), la méthode peut être utilisée pour détecter des différences relatives entre les génotypes ou les conditions de traitement au sein d’un lot.

D’après notre expérience, les anticorps secondaires conjugués à AF488 doivent être évités en raison d’un fond élevé et AF546 doivent être évités en raison d’une atténuation plus élevée du signal sur l’axe Z. Nous avons également constaté qu’une incubation et un lavage DAPI approfondis sont essentiels pour obtenir un rapport signal sur bruit élevé et des signaux nucléaires clairs, ce qui impacte directement la performance de la segmentation automatisée. DAPI est préférable à Hoechst pour cette application, car sa coloration préférentielle de l’hétérochromatine génère des taches nucléaires plus brillantes et plus nettement définies, facilitant une détection plus précise.

Discussion sur le dépannage des modes de défaillance courants

Défaillances liées à la tache. La compétence en dissection est un facteur majeur de la qualité des données. Le groupe de PAM est situé en surface et est facilement endommagé lors du retrait des deux sacs trachéaux et du corps adipeux dorsal à cette région. Les pinces doivent être manipulées avec précaution pour éviter de percer ou de comprimer la zone du PAM. La déformation ventrale survient souvent au moment où la moelle nerveuse ventrale est sectionnée, provoquant une inclinaison ou une courbure du cerveau lorsqu’elle est placée sur une lame en verre ; cette déformation peut devenir définitivement fixée après l’incubation avec la PFA. Les utilisateurs devraient expérimenter les angles des pinces lors de la coupure afin de trouver une technique optimale. Si une inclinaison est observée après la dissection, une pression douce sur la région élevée peut inverser la déformation (acceptable si la zone comprimée n’est pas la région d’intérêt).

Échecs de segmentation. Une mauvaise segmentation provient généralement de données d’entraînement insuffisamment diverses. Le classificateur Labkit doit être entraîné sur un ensemble représentatif d’images couvrant toute la gamme de la qualité de coloration au sein du lot, incluant la meilleure, la moyenne et la plus faible. Lors de la correction itérative, priorisez l’annotation des faux positifs et des faux négatifs dont vous êtes sûr. Évitez de corriger des régions ambiguës ou incertaines, car cela pourrait induire le classificateur en erreur et dégrader les performances.

Défaillances de détection localisée. L’optimisation des paramètres nécessite une exploration systématique sur un petit sous-ensemble d’échantillons représentatifs. Testez différents diamètres de points estimés et un seuil de filtre de qualité, voire des types de filtres au-delà du filtre « Qualité au-dessus » utilisé dans ce protocole. L’assistant de création de spots offre diverses options de filtrage (par exemple, l’intensité). Les utilisateurs sont encouragés à adapter les seuils et types de filtres à leur jeu de données spécifiques, et à effectuer un ajustement empirique avant le traitement par lots.

Pourquoi le comptage manuel des neurones en grappe PAM reste-t-il particulièrement difficile ? Le groupe PAM présente des caractéristiques anatomiques et de coloration uniques qui rendent les méthodes traditionnelles de comptage manuel insuffisantes. Premièrement, l’immunofluorescence TH dans le cytosol des neurones dopaminergiques de Drosophila marque principalement un mince anneau cytoplasmique entourant un grand vide nucléaire non coloré. Par conséquent, le noyau coloré à DAPI et le compartiment cytoplasmique ^TH+ présentent un chevauchement spatial minimal. Ce manque fondamental de localisation exclut la politique directe de classification « DAPI dans le masque TH ». Deuxièmement, le groupe PAM comprend plus de 100 neurones densément compactés disposés selon une architecture tridimensionnelle ressemblant à un raisin. En naviguant à travers les piles Z confocales, les neurones apparaissent et disparaissent progressivement — certains entrant dans le plan, d’autres en sortant — créant une charge cognitive élevée et une variabilité importante entre les observateurs. La dernière étude quantifiant les neurones PAM DA reposait sur le comptage manuel à l’aide du plugin de compteur cellulaire d’ImageJ. Bien que tout à fait appropriée pour des groupes plus petits comme PPM1/2 ou PPL1, cette approche devient excessivement laborieuse lorsqu’elle est appliquée au groupe PAM, en particulier dans les études nécessitant des dizaines voire des centaines d’échantillons.

Pourquoi l’architecture de forêt aléatoire de Labkit est-elle particulièrement adaptée à la segmentation des neurones TH ? Labkit implémente un classificateur de pixels basé sur la forêt aléatoire, exceptionnellement bien adapté aux défis spécifiques des images de cluster PAM colorées en TH. L’algorithme calcule un vecteur de caractéristiques complet pour chaque pixel en appliquant une cascade de filtres de transformation, incluant le flou gaussienne, la différence de gaussiennes, la magnitude du gradient gaussien, le laplacien de Gaussienne et les valeurs propres de Hesse — chacun évalué à plusieurs échelles sigma (1, 2, 4, 8). Cette extraction de caractéristiques à plusieurs échelles capture efficacement les caractéristiques texturales et de contours qui distinguent l’intérieur nucléaire du fond extracellulaire. Il est important de noter que, comme les forêts aléatoires nécessitent des ordres de grandeur moins de données d’entraînement que les approches d’apprentissage profond, les utilisateurs peuvent affiner de manière itérative le classificateur avec des annotations de gribouillis clairsemées sur seulement 20 à 40 images représentatives. Chaque itération ajoute de nouveaux arbres de décision à l’ensemble, qui votent collectivement pour classer chaque pixel. Ce processus permet intrinsèquement d’accommoder la variabilité des lots à lot dans les conditions de coloration et d’imagerie — un avantage crucial compte tenu de la variabilité biologique inhérente aux croisements génétiques et aux études sur le vieillissement de Drosophila . Grâce à cette approche, la perte de neurones ^TH+ dans les modèles de Parkinson exprimant α-synucléine peut être détectée, et les effets des amplificateurs et suppresseurs génétiques sur le nombre de neurones en grappes de PAM peuvent être comparés dans un lot expérimental.

Il est important de noter que, pour l’entraînement, les piles recadrées sont concaténées selon la dimension temporelle plutôt que empilées selon l’axe Z. Ce choix de conception est essentiel pour un entraînement optimal des classificateurs. La classification des pixels 3D de Labkit prend en compte les informations des voxels à travers des tranches Z consécutives, ce qui est essentiel pour résoudre avec précision le mince anneau TH cytoplasmique qui définit la morphologie des neurones PAM. Si les échantillons individuels étaient empilés verticalement en une seule pile Z ultra-épaisse, les tranches Z aux frontières entre les échantillons adjacents deviendraient spatialement contiguës dans la pile. Par conséquent, les voxels appartenant à différents échantillons biologiques seraient traités comme des structures voisines au sein d’un même volume tridimensionnel. Lors d’un entraînement interactif, un gribouillis dessiné près d’une telle frontière peut involontairement capturer des caractéristiques de deux échantillons différents simultanément, ce qui embrouille le classificateur (Figure 2B, flèches). De plus, des signaux faux positifs provenant d’un échantillon pouvaient se projeter dans le volume de l’échantillon adjacent, entraînant des gribouillis correctifs erronés qui se propagent à travers les itérations d’entraînement ultérieures, générant des arbres de décision codant des règles biologiquement dénuées de sens. La concaténation des échantillons selon l’axe temporel préserve l’intégrité spatiale de chaque volume individuel, permettant aux noyaux du filtre 3D de fonctionner exclusivement à l’intérieur — et non à travers — des échantillons biologiques, tout en permettant un entraînement efficace et multi-échantillons lors d’une seule session Labkit.

Considérations méthodologiques et limites

Plusieurs mises en garde importantes méritent d’être discutées. Premièrement, ce protocole est optimisé spécifiquement pour le cluster PAM et peut ne pas se généraliser aux autres clusters DA (par exemple, PPM1/2/3, PPL1) ni aux neurones ^TH+ dans les lobes optiques. La région PAM bénéficie d’une densité DAPI relativement clairsemée, avec des noyaux bien séparés dans l’espace tridimensionnel, permettant une détection robuste et sans ambiguïté des points DAPI. En revanche, ce flux de travail n’est pas facilement transférable vers d’autres clusters DA tels que PPL1 ou PPM1/2. Dans ces régions, les neurites sont plus susceptibles d’être juxtaposées ou de chevaucher les noyaux colorés à DAPI des cellules non DA. Étant donné le très faible nombre de neurones DA dans ces petits groupes (souvent moins de 10 cellules par groupe), même quelques erreurs de classification peuvent entraîner des erreurs proportionnellement importantes, rendant la méthode moins fiable pour de telles applications. Deuxièmement, l’immunocoloration TH marque également les neurites et les projections axonales au sein du neuropil. Malgré des annotations correctives pendant l’entraînement, ces filaments fibreux produisent parfois de forts signaux TH et peuvent être mal classés comme au premier plan par le classificateur. Cependant, ces régions dans le groupe PAM sont presque toujours dépourvues de noyaux colorés par DAPI ; ainsi, les voxels faussement positifs dans la région riche en neurites du groupe PAM contribuent minimement au nombre final de neurones. Troisièmement, la classification des pixels de Labkit fonctionne sur des caractéristiques de textures locales dans un voisinage fini (les noyaux de filtres par défaut répondent à environ 16 × 16 fenêtres de pixels). Cette conception assure l’efficacité computationnelle et permet une segmentation interactive en temps réel, mais cela signifie aussi que le classificateur ne peut pas exploiter le contexte anatomique global. Par conséquent, des artefacts rares ou des irrégularités de coloration qui s’écartent substantiellement de l’ensemble d’entraînement peuvent nécessiter une curation au cas par cas. Enfin, le pipeline de traitement batch décrit ici — intégrant la segmentation Labkit avec la détection de points DAPI et la transformation de distance — génère plusieurs canaux de sortie et combinaisons de filtres. Les utilisateurs doivent valider systématiquement les paramètres optimaux du filtre pour leurs conditions expérimentales spécifiques plutôt que d’adopter sans esprit critique les seuils par défaut présentés dans ce protocole.

Applications futures

Au-delà du modèle démontré ici, ce pipeline semi-automatisé peut être appliqué directement à tout modèle Drosophila impliquant la quantification des neurones DA en cluster PAM, y compris des études sur l’apprentissage et la mémoire, la motivation, la régulation du sommeil et la neurodégénérescence liée à l’âge. Plus précisément, la capacité de traitement par lots de cette méthode peut la rendre adaptée à : (1) Des criblages de médicaments à débit moyen à élevé : Tester plusieurs composés neuroprotecteurs entre doses devient plus réalisable sans augmentation proportionnelle de l’effort manuel de comptage. (2) Criblages modificateurs génétiques : Quantification du nombre de neurones PAM dans des centaines de croisements génétiques (par exemple, lignées ARNi, lignes de surexpression) afin d’identifier des améliorateurs ou des suppresseurs de la toxicité α-synucléine. (3) Études longitudinales de vieillissement : Suivi de la perte des neurones PAM sur plusieurs moments avec une charge de comptage manuelle réduite. De plus, le flux de travail de segmentation basé sur Labkit ne se limite pas à la coloration TH ; avec un réentraînement approprié, il peut être adapté pour quantifier d’autres populations neuronales dans le cerveau de Drosophila , à condition qu’elles partagent deux caractéristiques clés avec le groupe PAM : une densité relativement faible de noyaux colorés à DAPI et une interférence minimale due à la coloration de neurites. Au-delà de Labkit et du logiciel 3D utilisé ici, la logique globale de ce pipeline — classification des pixels basée sur l’apprentissage automatique suivie de détection ponctuelle et de transformation de distance — peut être implémentée sur d’autres plateformes d’analyse d’images 3D prises en charge, augmentant ainsi son accessibilité et sa flexibilité pour la communauté de recherche au sens large.

En résumé, nous présentons un flux de travail semi-automatisé pour détecter les différences de groupes dans les nombres de neurones TH⁺ du cluster PAM. En combinant la classification des pixels basée sur Labkit avec la détection ponctuelle et la transformation de distance, cette méthode permet de comparer le nombre de neurones TH⁺ entre groupes expérimentaux et témoins au sein d’un même lot, tout en réduisant la charge du comptage manuel à mesure que la taille de l’échantillon augmente. L’échelle de dizaines à centaines d’échantillons augmente proportionnellement le temps de calcul, mais l’effort manuel supplémentaire se limite principalement à l’organisation des fichiers et à la vérification ponctuelle de la qualité. Bien que le cluster PAM ait reçu peu d’attention dans la recherche sur la maladie de Parkinson à ce jour, cela est principalement dû à des limitations techniques plutôt qu’à une insignifiance biologique. En fournissant un outil de quantification pratique, notre protocole facilitera, à l’avenir, l’étude de la dégénérescence des neurones PAM dans les modèles de MP et explorera leur contribution potentielle aux symptômes non moteurs, tels que les déficits olfactifs et le déclin motivationnel. Nous anticipons que ce protocole facilitera des études comparatives au niveau des lots sur la neurodégénérescence dopaminergique, la plasticité synaptique et le dépistage neuroprotecteur des médicaments dans le système modèle de Drosophila .

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Logiciel de traitement d’image 3D - Bitplane Imaris 8.0+	Oxford Instruments	http://www.bitplane.com/	Logiciel d’analyse d’images 3D utilisé dans cette étude
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	62248
D. melanogastre : nSyb-QF2  ;	Centre de Stock Drosophila de Bloomington	51960
D. melanogastre : nSyb-QF2>QUAS-SNCA	Centre de Stock Drosophila de Bloomington	600605
DOWSIL SYLGARD 184	Tat Lee Engineering Pte Ltd	https://www.tatlee.com.sg/
Pince à épiler Dumont Styple 3C Dumoxel, 0,04/0,08 mm	Sciences de la microscopie électronique	72680-D (0203-3C-PO)
FV3000 confocal	Olympe	https://www.olympus-global.com/
Anticorps secondaire anti-lapin IgG (H+L) croisé adsorbé chez la chèvre, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244
ImageJ/Fiji (1.53q)	Fidji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Labkit	Fidji/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
Broches Minutien, acier inoxydable, diamètre de 0,15 mm	Austerlitz	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
Sérum de chèvre normal, solide lyophilisé	Sigma-Aldrich	566380
Logiciels de calcul numérique - Python	Python	3.8+
Logiciel de calcul numérique - Matlab	Travail en mathématiques	R2016a+	Logiciels de calcul numérique utilisés dans cette étude
Octylphénol Ethoxylate (Triton X-100)	Bio-rad	1610407
Solution de paraformaldéhyde à 4 % dans le PBS	Santa Cruz Biotechnologie	SC-281692
Plat de culture cellulaire en polystyrène	Nest Scientific	706001
Montage antifade en or ProLong	Thermo Fisher Scientific	P36934
Hydroxylase anti-tyrosine du lapin (TH)	Pel Freeze	P40101-0
Azidée de sodium	Sigma-Aldrich	S2002
Stéréoscope	Olympe	SZ51
Sterican Einmalkanü ; len 27 G grau 0,40 x 12 mm   ;	Stérican	D-34209
Seringue, 1 mL	Terumo	DVR-5175
Ruban adhésif transparent	3M Scotch 600, dégagé	600