Manipulation de tunnels et enrichissement environnemental pour la pléthysmographie répétée de tout le corps chez la souris

Résumé

Ce protocole décrit des procédures de manipulation en tunnel et d’enrichissement environnemental pour la pléthysmographie répétée de l’ensemble du corps afin de réduire la variabilité respiratoire associée au stress lors d’études longitudinales chez la souris.

Résumé

La pléthysmographie répétée de tout le corps (PBB) est largement utilisée pour l’évaluation longitudinale de la fonction respiratoire chez la souris. Cependant, le stress induit par la manipulation peut introduire une variabilité physiologique qui brouille les effets du traitement et réduit la reproductibilité expérimentale. Les méthodes traditionnelles de manipulation de la queue peuvent provoquer des réponses de stress soutenues et une mauvaise habituation au fil des séances répétées, pouvant potentiellement affecter les résultats expérimentaux. Ce protocole décrit des méthodes de manipulation et d’hébergement affinées intégrant la gestion du tunnel et l’enrichissement environnemental pour des sessions WBP répétées. Six souris sauvages de type 129S1/SvImJ (3 mâles, 3 femelles) ont bénéficié d’une manipulation de tunnels et d’un enrichissement environnemental continu tout au long d’une étude de 10 semaines. Les animaux ont subi des séances répétées de WBP, et les périodes d’acclimatation ont été analysées au départ, au début de l’étude, au milieu et à la fin de l’étude. La fréquence respiratoire lors de la pose initiale de la chambre (initiale f, 0–2 min) et la référence de base stable (base f, 8–10 min) ont été quantifiées pour évaluer les schémas d’acclimatation longitudinale. Des changements progressifs ont été observés tout au long de la chronologie de l’étude dans les conditions mises en œuvre. La fréquence respiratoire moyenne initiale est passée de 345 ± 111 respirations SD/min au départ à 267 ± 43 respirations DS/min lors des sessions tardives de l’étude, accompagnée d’un coefficient de variation réduit (32 % à 16 %). Les mesures respiratoires de base ont également diminué de 255 ± 67 à 193 ± 43 respirations/min (p = 0,033), ce qui est cohérent avec une meilleure stabilité des mesures lors des séances ultérieures. Les observations comportementales ont montré une acclimatation calme avec un minimum de défécation, d’urination ou d’agitation. Ce protocole offre une approche pratique pour les laboratoires effectuant des évaluations respiratoires répétées chez la souris. La gestion des tunnels et l’enrichissement environnemental étaient associés à une acclimatation progressive et à une réduction de la variabilité respiratoire lors des études longitudinales de WBP.

Introduction

La pléthysmographie corporelle entière (WBP) permet une évaluation non invasive de la fonction respiratoire chez des rongeurs conscients et non retenus et est devenue un outil indispensable pour les études longitudinales en physiologie respiratoire, toxicologie inhalatoire et modélisation^{des maladies 1,2}. Les principaux avantages de la technique, notamment sa nature non invasive et son adéquation à des mesures répétées, la rendent particulièrement précieuse pour suivre les modifications respiratoires au fil de la progression de la maladie, les interventions thérapeutiques ou les périodes d’exposition. Glaab et Braun² ont souligné que la pléthysmographie non invasive tête-hors du corps est une méthode fiable pour les mesures répétées de la fonction pulmonaire chez des souris conscientes, fournissant des outils essentiels pour la recherche translationnelle dans les maladies des voies respiratoires, y compris les infections respiratoires émergentes. Cependant, la qualité et la reproductibilité des mesures de la BPA dépendent de manière cruciale de l’atteinte d’états de basse fréquence respiratoire compatibles avec la quiescence comportementale, qui peuvent être compromis par le stress induit par la manipulation. La gestion du stress représente une source bien reconnue mais souvent sous-estimée de variabilité expérimentale qui peut perturber les mesures physiologiques et compromettre la qualité des données. La pratique standard en laboratoire implique généralement la manipulation de la queue, où les souris sont saisies par la queue pour le transport et la^{manipulation 3,4}.

La pratique standard en laboratoire implique généralement la manipulation de la queue, où les souris sont saisies par la queue pour les transporter et les manipuler. Gouveia et^{Hurst 3} ont démontré que la manipulation de la queue induit de l’anxiété chez la souris, les animaux manipulés montrant un comportement anxieux accru dans le labyrinthe plus élevé comparé aux témoins à poignée en tunnel. Cette réponse anxieuse est associée à des paramètres physiologiques modifiés. Rasid et ^al.4 ont utilisé la BPA pour quantifier les effets respiratoires des procédures de laboratoire de routine, constatant que la contention et la manipulation modifiaient significativement le volume minuscule de manière dépendante du sexe, avec des effets persistant jusqu’à 24 heures après la procédure. L’ampleur et la durée de ces effets induits par la manipulation soulignent que les mesures respiratoires obtenues peu après la manipulation de la queue peuvent refléter la physiologie du stress aigu plutôt que la stabilité d’une fonction de base.

La littérature plus large sur la contention et la gestion du stress révèle des impacts allant au-delà des réponses comportementales immédiates. Buynitsky et^{Mostofsky 5} ont passé en revue les effets étendus du stress de contrainte sur les processus physiologiques, immunologiques, endocriniens et développementaux, soulignant que les confondus liés au stress sont souvent insuffisamment documentés dans les articles de recherche. Pour les études respiratoires en particulier, le problème est aggravé par la nécessité de mesures répétées. Chaque événement de manipulation peut réinitialiser la réponse au stress, limitant l’habituation progressive et produisant des mesures de base incohérentes sur les points temporels longitudinaux. DeLorme et^{Moss 1} ont comparé les approches de pléthysmographie restreinte versus non contrainte chez des souris présentant des différences physiologiques entre les contraintes connues, constatant que, bien que les systèmes à chambre unique non contraint aient amélioré l’analyse de la réactivité des voies respiratoires, le défi d’obtenir des mesures de base reproductibles restait.

La manipulation en tunnel, dans laquelle des souris entrent volontairement dans un tunnel pour le transport, est apparue comme une alternative fondée sur des preuves qui réduit considérablement l’anxiété induite par la manipulation. L’efficacité de la méthode a été démontrée dans de multiples souches et contextes expérimentaux. Gouveia et Hurst³ ont montré que les souris à manche tunnel montraient une plus grande volonté d’interagir avec les manipulateurs et un comportement anxieux moindre lors des tests en labyrinthe élevé plus que les souris à poignée de queue, avec des bénéfices observés même lorsque les tunnels étaient inconnus. Il est important de noter que ces avantages vont au-delà de la période immédiatement post-manipulation. Sensini et ^al.6 ont examiné les effets de la technique de manipulation et de la fréquence de manipulation entre les sexes, constatant que la manipulation fréquente de la queue réduisait les comportements liés au bien-être, tels que le creusement, et augmentait les comportements de type désespoir chez les hommes, tandis que la manipulation en tunnel était préférée par les deux sexes et associée à des comportements d’approche plus positifs et à moins de réponses défensives. De plus, Davies et ^al.7 ont démontré que les bénéfices de la manipulation sans queue persistent lors de procédures complexes. Les souris exposées à la manipulation de la queue tout au long de leur expérience en laboratoire, y compris lors des procédures de contention, ont montré une réactivité accrue aux stimuli environnementaux et une facilité de manipulation réduite par rapport aux souris manipulées exclusivement par coupe ou tunnel.

Au-delà de la sélection de la méthode, l’habituation systématique aux procédures expérimentales peut encore réduire la variabilité induite par le stress. Sorli et ^al.8 ont étudié l’entraînement des souris pour la pléthysmographie head-out, un système basé sur la contention, et ont constaté que cinq jours consécutifs d’entraînement amélioraient la tolérance, les souris montrant une meilleure stabilité comportementale dès le deuxième jour, bien que les paramètres respiratoires se soient stabilisés en moins de 5 minutes pendant toutes les séances. De même, Ueno et ^al.9 ont démontré que la manipulation répétée et douce des souris mâles C57BL/6 avant les tests comportementaux réduisait le comportement anxieux dans les tests de labyrinthe élevés et améliorait la cognition spatiale, indiquant que les contacts répétés avec les manipulateurs pouvaient produire des effets d’habituation mesurables. Ces résultats suggèrent que la combinaison de méthodes de manipulation non aversives avec des protocoles d’habituation systématique peut apporter des bénéfices cumulatifs pour réduire la variabilité physiologique lors de mesures répétées.

L’enrichissement environnemental représente un facteur supplémentaire pouvant influencer la réactivité au stress et la physiologie de base, bien que ses effets soient complexes et dépendent du contexte. Bien que l’enrichissement favorise généralement un bien-être positif, un enrichissement excessif ou imprévisible peut paradoxalement augmenter la variabilité physiologique et les comportements associés au stress dans certains contextes^{expérimentaux 10,11}. Une approche équilibrée qui maintient des éléments centraux stables, tels que le matériau imbriqué, tout en offrant une nouveauté gérable grâce à une rotation périodique des éléments d’enrichissement, peut optimiser le bien-être sans introduire une variation^{confuse 12}. L’interaction entre enrichissement, méthode de manipulation et protocoles d’habituation reste peu étudiée dans le contexte des mesures respiratoires répétées, soulignant la nécessité de protocoles intégrés qui prennent en compte les trois facteurs simultanément.

Malgré la reconnaissance croissante des effets de la manipulation sur les mesures physiologiques, les protocoles standardisés spécifiquement conçus pour minimiser le stress lors des séances répétées de WBP restent limités. Les protocoles WBP existants reposent généralement sur des périodes d’acclimatation prolongées (10 à 30 minutes par séance) pour permettre à la tachypnée induite par le stress de diminuer, mais abordent rarement la méthode de manipulation sous-jacente ou évaluent systématiquement si une habituation progressive se produit entre les séances. De plus, la plupart des études n’évaluent pas si les animaux atteignent des états physiologiques compatibles avec une quiescence comportementale, comme des fréquences respiratoires approchant des plages rapportées dans la littérature comme étant associées à des états de repos ou liés au sommeil, ou plutôt s’ils passent d’un stress aigu à un éveil chronique de faible intensité. Ici, nous présentons un protocole intégrant la gestion des tunnels, l’enrichissement équilibré de l’environnement et des sessions répétées de la PBM sur une étude longitudinale de 10 semaines. Nous décrivons une approche associée à des changements progressifs de la fréquence respiratoire compatibles avec l’habituation, incluant la diminution des fréquences respiratoires initiales sur les séances et des mesures de base approchant les plages rapportées dans la littérature comme étant associées à des états de repos ou liés au sommeil. Il est important de noter que ce protocole est présenté non seulement comme un raffinement du bien-être animal, mais aussi comme une considération du plan expérimental pouvant aider à réduire la variabilité et à améliorer la cohérence lors des mesures respiratoires longitudinales.

Protocole

Effectuer toutes les procédures conformément aux protocoles approuvés par le Comité de Soins et d’Utilisation Institutionnels des Animaux (Protocole IACUC #23-103) de l’Université de Miami. Souris d’intérieur dans un vivarium accrédité par l’AAALAC, avec des conditions environnementales maintenues selon les normes institutionnelles.

1. Sélection des animaux et conditions d’hébergement

1. Sélectionner et préparer les animaux pour l’étude
   1. Sélectionnez des animaux issus d’une colonie de reproduction établie ou procurez-les auprès d’un vendeur commercial. Pour cette étude, utilisez six souris sauvages de type 129S1/SvImJ (3 mâles, 3 femelles).
   2. Maintenir les animaux sous conditions SPF (exempts de pathogènes spécifiques) dans un établissement accrédité par l’AAALAC, avec une surveillance de santé régulière réalisée selon les normes institutionnelles.
   3. Confirmez que les animaux ont environ 6 mois (jeunes adultes) au début de l’étude.
      REMARQUE : Les souris de cette étude avaient déjà été exposées à la manipulation de tunnels dans le cadre de l’entretien routinier. Pour les souris naïves, mettez en place une période de conditionnement avant de commencer les séances de WBP (voir Étape 3.2).
2. Commencez les procédures expérimentales lorsque les souris atteignent l’âge approprié aux objectifs de l’étude. Dans cette étude, les souris avaient environ 6 mois (jeunes adultes) au début des séances de WBP. Pour la reproductibilité, utilisez des souris dans une tranche d’âge définie (par exemple, ±1 mois) et signalez les âges spécifiques utilisés, car l’âge peut influencer les paramètres respiratoires de base et la cinétique d’habituation.

2. Protocole d’enrichissement environnemental

1. Fournir un matériau de nidification constant
   1. Placez un carré de coton comprimé (environ 5 cm × 5 cm, ~2,5 g) dans chaque cage à chaque changement de cage.
   2. Transférez la majeure partie de la structure du nid existante intacte dans la nouvelle cage lors des changements de cage en utilisant les deux mains.
   3. Si le matériau accumulé dépasse environ 10 g (environ le double de la masse initiale), retirez les parties les plus anciennes et les plus compactées du fond tout en préservant la structure externe du dôme.
   4. Ajoutez un carré en coton frais (5 cm × 5 cm) à la cage propre pour soutenir la construction et l’entretien du nid.
   5. Remplacer le matériau de nidification uniquement s’il est visiblement humide (contamination urinaire couvrant >25 % de la surface) ou si le nid a été détruit et non reconstruit dans les 48 heures (figures 1A et 1C).
      REMARQUE : Préserver la structure du nid afin de minimiser le stress lié aux changements de cage et maintenir des signaux olfactifs et tactiles cohérents tout au long de l’étude. La qualité du nid sert d’indicateur du bien-être animal et de l’état de santé¹³.
2. Évaluez la construction du nid chaque semaine selon la procédure standardisée suivante
   1. À chaque changement de cage, transférez soigneusement le nid intact sur une surface propre avec les deux mains sans déranger la structure.
   2. Photographiez le nid directement au-dessus avec la caméra positionnée à 30–40 cm perpendiculaire à la surface pour visualiser la structure globale et la formation du cratère.
   3. Photographiez le nid de côté à hauteur de nid pour documenter l’intégrité des murs et les caractéristiques du dôme.
   4. Notez le nid en utilisant l’échelle standardisée de 5 points de Deacon¹³, où 1 = matériau de nidification largement intact et 5 = nid en forme de dôme avec un cratère clair. Voir la figure 1A–1C pour des exemples de nids de score 5.
   5. Ramène le nid avec précaution dans la cage propre.
      REMARQUE : Les photographies hebdomadaires du nid fournissent une documentation objective de la qualité du nid tout au long de l’étude. La détérioration de la construction du nid peut indiquer une maladie, un stress ou d’autres préoccupations de bien-être nécessitant une attention vétérinaire.
3. Fournir un enrichissement rotatif modifié chaque semaine
   1. Sélectionnez un élément d’enrichissement et placez-le dans la cage. Utilisez du papier déchiqueté (papier blanc nature, portion de quelques poignées), des essuie-tout (2–3 feuilles, sans parfum, blancs, pliés ou froissés), ou des abris en papier (tubes en carton ou petites boîtes).
   2. Faire tourner les éléments d’enrichissement chaque semaine selon un calendrier prédéterminé (par exemple, semaine 1 : papier déchiqueté ; Semaine 2 : essuie-tout ; Semaine 3 : tube en carton ; Semaine 4 : répéter) pour maintenir une nouveauté gérable.
      REMARQUE : La rotation hebdomadaire apporte de la nouveauté sans submerger les souris. Évitez les objets d’enrichissement en plastique, tels que les huttes en plastique, les balles ou les structures rigides, qui peuvent augmenter la variabilité physiologique¹¹. Remplacez tous les éléments d’enrichissement à chaque changement de cage.

Figure 1. Mise en œuvre du protocole et indicateurs de bien-être lors des études longitudinales de pléthysmographie corporelle entière (WBP). (A) Nid représentatif de haute qualité (score Deacon 5) d’une cage féminine montrant une structure de dôme bien formée avec un cratère défini. (B) Tunnel de manipulation en polycarbonate transparent (environ 10 cm de longueur × 5 cm de diamètre interne) intégré au matériau de nidification dans la cage de la maison. Les tunnels sont restés en permanence dans des cages servant d’enrichissement et de manipulation tout au long de l’étude. (C) Qualité représentative du nid en fin d’étude (semaine 10) montrant une construction soutenue de nid de score 5 dans les cages mâles et femelles. (D) Les scores de qualité de Nest tout au long de la période d’étude de 10 semaines. Chaque point de données représente le score hebdomadaire de nid d’une cage en utilisant l’échelle standardisée de 5 points de diacre¹³, où 1 = matériau de nidification intact et 5 = nid complet en forme de dôme avec un cratère. Les deux cages ont maintenu une qualité de nid constante de score 5 tout au long de toutes les phases d’étude. La région verte ombragée indique les scores associés à des conditions de bien-être optimales (scores 4–5). Les phases de l’étude sont indiquées par des régions de fond colorées correspondant à la Base (Semaine 0), Début d’étude (Semaines 2–3), Mi-étude (Semaines 5–7) et Étude tardive (Semaines 8–10). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Implémentation de la gestion du tunnel

1. Préparer les tunnels de manutention
   1. Utilisez des tunnels en polycarbonate transparent (100 mm ou 130 mm de longueur × 50 mm de diamètre interne) avec des bords lisses et arrondis (Figure 1B).
   2. Placez un tunnel de façon permanente dans chaque cage domestique dans le cadre de l’enrichissement de la cage.
   3. Ne retirez pas les tunnels entre les événements de manipulation.
      REMARQUE : Garder le tunnel dans la cage domestique lui permet d’acquérir des odeurs familières de la cage et de s’associer à l’environnement domestique plutôt qu’aux procédures de manipulation. Les souris utilisent souvent les tunnels comme refuges ou sites de nidification.
   4. À chaque changement de cage, essuyez l’intérieur du tunnel avec une petite quantité de litière usagée de la cage précédente avant de la placer dans la cage propre.
   5. Autoclave ou lavez-les avec le même agent désinfectant utilisé pour la désinfection des cages si une désinfection est nécessaire entre deux utilisations. Rincez soigneusement et laissez les tunnels sécher à l’air avant de les remettre dans la cage.
      REMARQUE : Maintenir la continuité olfactive aide à minimiser le stress lié à des odeurs inconnues. Les tunnels sont autoclavables et réutilisables.
2. Conditionnement des souris à la manipulation en tunnel
   1. Pour les souris adultes naïves, mettez en place une période de conditionnement d’au moins 1 à 2 semaines avant d’entamer les séances de^{WBP 14 et 15}.
   2. Placez de façon permanente des tunnels en polycarbonate transparent (voir Étape 3.1) dans la cage de la maison et laissez 3 à 7 jours pour une familiarisation passive.
   3. Après une exposition passive, effectuez des séances quotidiennes de manipulation douce. Encouragez les souris à entrer volontairement dans le tunnel, puis soulevez le tunnel horizontalement pendant 30 à 60 secondes avant de la remettre dans la cage.
   4. Évaluer l’habituation réussie en utilisant les critères suivants : entrée volontaire dans le tunnel dans un délai de 10 à 30 s, comportement calme à l’intérieur du tunnel sans tentatives d’évasion ni vocalisation, et utilisation spontanée du tunnel pour le repos ou l’exploration lors des observations de routine en^{cage 14,15}.
   5. Commencez les séances de WBP une fois que tous les critères d’habituation sont remplis.
      REMARQUE : Les souris de cette étude avaient déjà été exposées à la manipulation de tunnels dans le cadre de l’entretien routinier avant le début des séances de BPA.
3. Exécution de la manipulation non aversive
   1. Portez des gants en nitrile sans poudre pour toutes les procédures de manipulation.
   2. Utilisez la manipulation par tunnel comme méthode principale. Si la souris est à l’intérieur du tunnel, soulevez le tunnel horizontalement en soutenant la base d’une main.
   3. Si la souris est à l’extérieur du tunnel, placez l’ouverture du tunnel à moins de 5 à 10 cm de la souris et laissez 10 à 30 secondes pour une entrée volontaire sans la poursuivre ni la forcer.
   4. Si la souris n’entre pas dans les 30 secondes, encouragez le mouvement vers le tunnel en utilisant une main en coupe positionnée derrière la souris sans entrer en contact.
   5. Si la souris n’entre pas après deux tentatives (maximum total 60 s), utilisez la méthode du coupe. Placez une main aplatie près de la souris, laissez l’approche volontaire pendant 10 à 20 secondes, puis soulevez doucement la souris avec les deux mains tout en évitant de manipuler la queue.
   6. Utilisez la méthode de manipulation qui aboutit à un comportement calme, défini comme l’absence de vocalisation, de tentatives d’évasion ou de défécation liée au stress.
4. Transférer les souris dans la chambre de pléthysmographie
   1. Transférez la souris du tunnel vers les mains en coupe avant de la placer dans la chambre.
   2. Maintenez le tunnel horizontalement et inclinez l’arrière (côté arrière) vers le haut d’environ 10 à 20°.
   3. Laissez la souris reculer hors du tunnel, jambes arrière en premier, sur les mains en coupe.
   4. Baissez les deux mains dans la chambre et laissez la souris poser volontairement le pied sur le sol de la chambre dans un délai de 5 à 10 secondes.
      REMARQUE : Cette méthode de transfert tunnel vers mains et chambre offre un meilleur contrôle lors du placement de la chambre.
   5. Sinon, transférez la souris directement du tunnel dans la chambre en inclinant le tunnel au-dessus de l’ouverture de la chambre.
      REMARQUE : Le transfert direct tunnel-chambre-chambre offre moins de contrôle lors du placement et a été utilisé moins fréquemment dans cette étude.
   6. Ne jamais inverser le tunnel verticalement ni le secouer.
   7. Scellez le couvercle de la chambre immédiatement après le placement de la souris et ramenez le tunnel dans la cage de la maison.
      ÉTAPE CRITIQUE : Ne saisissez jamais les souris par la queue à aucun moment de l’étude. Si une souris n’entre pas dans le tunnel dans les 30 secondes ou ne s’approche pas d’une main en coupe, encouragez le mouvement doucement avec une couche souple sans courir après ni forcer l’interaction. Laissez la souris choisir l’approche tunnel ou manuelle selon ses préférences individuelles. La patience lors des premières séances aide à établir des associations positives avec la manipulation non^{aversive 3,7}.

4. Protocole de session WBP

1. Préparez le système de pléthysmographie
   1. Calibrez le pléthysmographe corporel entier une fois par jour avant l’acquisition des données.
   2. Avec les chambres vides et scellées, lancez la séquence d’étalonnage automatisée via le logiciel d’analyse respiratoire FinePointe (cible : 18–22 cm H₂O). Confirmez la réussite de l’étalonnage lorsque la plage d’efficacité du débit dépasse ±40 mL/s par site.
   3. Réglez le débit de polarisation à 1,0 L/min par chambre.
   4. Surveillez en continu la température de la chambre (22°C–24°C) et l’humidité à l’aide de capteurs numériques.
   5. Placez les chambres dans un endroit calme avec un éclairage constant et un minimum de vibrations.
      REMARQUE : Maintenez des conditions de chambre constantes sur toutes les séances. Les fluctuations de température modifient les schémas respiratoires et brouillent les comparaisons^{longitudinales 1}.
2. Mener des séances de PBA pendant une phase circadienne constante
   1. Effectuez toutes les mesures pendant la même fenêtre de temps du cycle lumineux.
   2. Faites des séances entre 08h00 et 10h00 (lumières allumées à 06h00) et évitez les 2 premières heures après l’allumage des lumières lorsque les rythmes circadiens sont en transition.
3. Transportez les souris vers la salle expérimentale
   1. Transportez les cages à la maison dans la salle expérimentale sur un chariot environ 15 minutes avant le début de la séance.
   2. Laissez les souris s’habituer à l’environnement de la salle expérimentale tout en restant dans leur cage familière.
   3. Placez des cages à domicile près des chambres de pléthysmographie.
   4. Utilisez la manipulation par tunnel (voir Étapes 3.3–3.4) pour transférer chaque souris de la cage à la maison vers les mains en coupe, puis dans la chambre.
   5. Manipulez les souris calmement et minimisez les mouvements brusques lors du transfert.
      REMARQUE : Le transfert individuel de la souris ne nécessite que quelques secondes.
4. Placez la souris dans la chambre
   1. Transférez doucement la souris des mains en coupe vers la chambre (voir Étape 3.4).
   2. Scellez le couvercle de la chambre dans les 5 secondes suivant la mise en place de la souris.
5. Début de l’acclimatation et de l’enregistrement
   1. Commencez à enregistrer les signaux respiratoires avec le logiciel d’analyse respiratoire.
   2. Prévoyez 10 minutes pour l’acclimatation sans perturbation ni intervention.
6. Surveillez la stabilité comportementale pendant l’acclimatation
   1. Observez la souris en permanence tout au long de la période d’acclimatation.
   2. Notez des mouvements excessifs, une immobilisation soutenue accompagnée de signes de stress (par exemple, une posture rigide), ou des tentatives d’évasion répétées sans périodes de comportement calme dans le journal de la séance.
   3. Reconnaître que de telles sessions peuvent encore fournir des données initialesvalides ; Cependant, les mesures de base de la Fpeuvent être peu fiables.
   4. Séances de signalement sans périodes de calme observables pendant la fenêtre d’acclimatation pour une éventuelle exclusion des analyses de base selon les critères spécifiques à chaque étude.
   5. Conservez toutes les séances de cette étude, car aucune ne remplissait les critères d’exclusion basés sur le comportement d’acclimatation.
      ÉTAPE CRITIQUE : La période d’acclimatation de 10 minutes est essentielle pour évaluer l’habituation. Bien que certains protocoles utilisent des périodes d’acclimatation de 20 à 30 minutes, les souris bien habituées dans cette étude ont atteint des schémas respiratoires stables en 8 à 10 minutes, rendant l’acclimatation prolongée inutile et potentiellement contre-productive en raison d’une augmentation des mouvements.
7. Observez le comportement de la souris pendant l’acclimatation
   1. Observez les souris en continu pendant la période d’acclimatation de 10 minutes grâce à une surveillance visuelle des chambres.
   2. Notez les signes de stress évidents, notamment la défécation, la miction, les tentatives d’évasion prolongées ou l’immobilité prolongée.
   3. Notez la présence et la quantité approximative de granulés fécaux et d’urine dans la chambre après chaque séance.
      REMARQUE : Ces observations fournissent une évaluation qualitative des niveaux de stress et de l’évolution de l’habituation, mais n’ont pas été formellement notées à l’aide d’un éthogramme standardisé dans cette étude.
8. Analyser les métriques respiratoires de phase d’acclimatation
   1. Utilisez le logiciel d’analyse respiratoire pour calculer automatiquement la fréquence respiratoire à partir des signaux de pression en utilisant l’algorithme de détection respiratoire par défaut et les paramètres de seuil par défaut dans ce logiciel.
   2. Acquérir des signaux respiratoires dans des conditions de flux d’air stables (voir Étape 4.1) en utilisant des paramètres d’acquisition standard.
   3. Calculer la fréquence respiratoire moyenne pour deux périodes : finitiale (0–2 min), représentant la réponse initiale au stress et la physiologie immédiatement post-manipulation, et fde base (8–10 min), représentant la fréquence respiratoire de base stabilisée.
   4. Excluez les périodes présentant des artefacts de mouvement visibles, définies comme des déviations de pression non respiratoires ou des formes d’onde irrégulières associées aux mouvements d’animaux ou aux perturbations de la chambre.
      REMARQUE : Inspectez visuellement un sous-ensemble d’enregistrements (environ 10 %) afin de confirmer la détection précise de l’haleine par l’algorithme automatisé. La validation manuelle a confirmé l’accord entre la détection automatisée et les schémas respiratoires observés.
9. Poursuivre le protocole expérimental si applicable
   1. Poursuivre les interventions expérimentales après la période d’acclimatation de 10 minutes selon le plan de l’étude (par exemple, administration aérosolisée de médicaments, défi hypoxique, tests d’effort).
      REMARQUE : Aucune intervention expérimentale n’a été réalisée lors des séances d’évaluation d’habituation dans cette étude. Les indicateurs respiratoires rapportés (initiale fet référence f) ont été obtenus lors de séances d’acclimatation uniquement sans procédures supplémentaires.
10. Remis la souris dans la cage de la maison
    1. Utilisez la manipulation de tunnel ou les mains en coupe pour transférer la souris de la chambre vers la cage de la maison.
    2. Observez la souris pendant 5 minutes après la séance pour confirmer un comportement normal, y compris les mouvements spontanés, le toilettage, l’interaction avec les compagnons de cage et l’investigation de la nourriture et de l’eau.
    3. Prolongez l’observation et consultez le personnel vétérinaire si un comportement anormal persiste au-delà de 15 minutes, notamment une immobilité prolongée (>5 min), une respiration laborieuse, une posture voûtée ou une incapacité à interagir avec les compagnons de cage.
       REMARQUE : Aucun comportement anormal après la séance n’a été observé dans cette étude.
11. Maintenir une fréquence de session constante
    1. Organisez régulièrement des séances de PBA tout au long de la période d’étude longitudinale (10 semaines selon ce protocole).
    2. Effectuez des séances à intervalles hebdomadaires pour suivre l’évolution de l’habituation.
    3. Programmez les séances à des heures régulières de la journée (voir l’étape 4.2) afin de maintenir la cohérence circadienne et procédurale.

Résultats

L’application de ce protocole de manipulation en tunnel et d’enrichissement environnemental à six souris sauvages de type 129S1/SvImJ (3 mâles, 3 femelles) lors d’une étude longitudinale WBP de 10 semaines a révélé des preuves d’habituation progressive et d’amélioration de la stabilité physiologique. Des mesures de fréquence respiratoire ont été obtenues lors de séances répétées de WBP menées à intervalles longitudinaux réguliers, avec des données analysées sur quatre phases d’étude : Ba...

Discussion

Ce protocole décrit une approche intégrée combinant la gestion des tunnels, l’enrichissement environnemental et l’exposition répétée dans le contexte de la WBP longitudinale. Dans ces conditions, les mesures de fréquence respiratoire ont montré une stabilisation progressive sur plusieurs séances, cohérentes avec une réduction de l’excitation et une habituation progressive. Plusieurs facteurs d’implémentation semblent importants pour la réussite du protocole. Premièrement, la gestion des ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aspen Chip Bedding	Lab Supply	Aspen 323	Litière de copeaux de bois d'Aspen. Autoclavée avant utilisation; disposée à une profondeur d'environ 1 cm sur le sol de la cage.
Eau autoclavée	Fournie par l'établissement	Non applicable	Eau municipale autoclavée fournie ad libitum via des bouteilles d'eau standard.
Tube en carton	Généré par l'établissement	Non applicable	Rouleau de papier toilette en carton blanc. Utilisé comme élément d'enrichissement et d'abri à rotation.
Crink-I-Nest (Irradié)	The Andersons / Lab Supply	CNKR	Matériau d'enrichissement en papier déchiqueté. Irradié aux gamma. Fourni comme élément d'enrichissement à rotation sur une base bimensuelle.
Logiciel FinePointe	Data Sciences International	Aucun numéro de catalogue	Logiciel d'acquisition et d'analyse de données respiratoires, version 3.0. Utilisé pour la collecte de données WBP et le calcul des paramètres.
Rack de cage individuellement ventilé (IVC)	Allentown	EP5000E	Rack IVC avec paquet d'évacuation, capacité de 140 cages. Système haute densité à double face avec connexions de ventilation automatiques.
Chow pour rongeurs irradié	Envigo	T.2918.15	Régime standard irradié pour rongeurs. Fourni ad libitum via un trémie à barres métalliques.
Tunnel de transfert de souris	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	Tunnel en polycarbonate transparent, 100 mm de longueur × 50 mm de diamètre interne. Autoclavable et réutilisable. Utilisé pour les procédures de transfert d'animaux à faible stress.
Nestlets (Irradiés)	Lab Supply	IRR	Carrés de nidification en coton comprimé (environ 5 cm × 5 cm, environ 2,5 g chacun). Irradiés aux gamma. Fourni comme élément d'enrichissement constant; un par cage.
Gants en nitrile, sans poudre	Kimberly-Clark	KC500	Gants d'examen en nitrile violet sans poudre. Portés pendant toutes les procédures de contact avec les animaux.
Éponge en gaze non tissée	Pivetal	21295040	Éponge en gaze non tissée, non stérile, 4 plis, 4 po × 4 po (10,16 cm × 10,16 cm). Utilisée comme matériau d'enrichissement.
Serviette en papier	Tork (Essity)	MB 540A	Serviette en papier multipliée blanche. Utilisée comme matériau d'enrichissement à rotation.
Caméra de smartphone	Apple	Aucun numéro de catalogue	Caméra de smartphone iPhone. Utilisée pour la documentation hebdomadaire de notation des nids.
Système de pléthysmographie corporelle totale	Data Sciences International	10222C (2 sites); 770621 (4 sites)	Système de pléthysmographie corporelle totale FinePointe FP Series sans contrainte pour souris. Disponible en configurations à 2 et 4 sites.