Essai d’imagerie sur plaques pour quantifier les réponses photopériodiques chez Neurospora crassa en utilisant le développement des protopérithèques

Résumé

Le test des protopérithèques quantifie les réponses photopériodiques chez Neurospora crassa en mesurant la formation des protopérithèques sous des cycles clair-obscurité définis. Cette méthode basée sur les plaques offre une approche simple et évolutive pour comparer les réponses développementales dépendantes des photopériodes à travers des conditions expérimentales.

Résumé

Neurospora crassa est un organisme modèle bien établi pour étudier le calendrier biologique et le développement régulé par la lumière. Le test des protopérithèques (PPA) est une méthode d’imagerie basée sur plaques permettant de quantifier les réponses photopériodiques en mesurant la formation des protopérithèques comme résultat développemental. L’objectif de ce protocole est de fournir un flux de travail reproductible et évolutif pour évaluer comment les cycles clair-obscurité définis influencent le développement sexuel fongique. Dans cet essai, des cultures fongiques sont cultivées sur un milieu synthétique de croisement dans des conditions photopériques contrôlées, suivies d’un retrait standardisé des conidies de surface pour améliorer la visualisation. Les protopérithèques sont quantifiés par comptage manuel basé sur l’image, et les comptages moyens par plaque sont utilisés pour des comparaisons statistiques entre les conditions de photopériode. Contrairement aux approches précédentes, le PPA intègre des conditions de culture standardisées, une exposition contrôlée à la photopériode et l’imagerie basée sur les quadrants pour permettre des comparaisons quantitatives reproductibles entre souches. Ce flux de travail dépasse un protocole de base en établissant un cadre cohérent et évolutif pour mesurer la production développementale dépendante des photopériodes dans des conditions expérimentales définies. La méthode nécessite environ une semaine entre l’inoculation et l’analyse et peut être appliquée sur plusieurs souches dans des conditions environnementales définies. Le PPA offre une plateforme simple et accessible pour l’analyse comparative du développement dépendant des photopériodes chez les champignons en conditions de laboratoire contrôlées.

Introduction

Le test des protopérithèques (PPA) quantifie les réponses photopériodiques dans le champignon Neurospora crassa. De nombreux organismes mesurent la durée du jour et de la nuit pour coordonner les processus biologiques dans un phénomène connu sous le nom de photopériodisme ^{1,2,3,4,5,6,7,8}. Dans ce test, le développement de la structure sexuelle féminine, le protopérithèce, sert de proxy mesurable et dépendant de la lumière pour la réponse photopériodique. Bien que le photopériodisme soit bien caractérisé chez les plantes grâce aux expériences de l’aube^{nocturne 3}, il existe moins d’approches standardisées pour quantifier les réponses photopériodiques chez les eucaryotes non photosynthétiques tels que les champignons. N. crassa fournit un système modèle facile à gérer à cette fin grâce à sa génétique bien définie et à ses voies de développement réactives à la lumière. La régulation dépendante du photo-temps de reproduction a été observée chez^{les organismes} 1,2,3,4,5,6,7,8, ce qui soutient la pertinence des réponses physiologiques à base de la lumière ; cependant, les études mécanistiques sur les champignons restent limitées par l’absence de tests reproductibles.

Les protopérithèques sont des structures sexuelles féminines prématurées chez N. crassa. Ils proviennent de l’ascogonie, qui développe des trichogyènes enroulés fusionnant avec des hyphes ou conidies du type^{d’accouplement opposé 9}. Après fusion, les noyaux du partenaire « mâle » pénètrent dans le protopérithèce. Le nombre de protopérithèques produits est régulé saisonnièrement et fortement induit par^{la lumière est de 10}. La régulation photopériodique est centrale dans l’écologie, la chronobiologie et la physiologie fongique, car de nombreux processus contrôlés par l’horloge dépendent de la lumière. La lumière influence de nombreuses voies génétiques, notamment les photorécepteurs, les kinases et les mécanismes de transduction de la lumière liés au développement^{sexuel 11}. Les protopérithèques sont bien adaptés à la mesure des sorties photopériodiques car ils sont facilement visualisés au microscope et réagissent sensiblement à la lumière.

Malgré l’importance du photopériodisme chez les champignons, peu de tests standardisés et reproductibles sont disponibles pour quantifier la production de protopérithèques sous des cycles lumineux contrôlés. Un test à débit moyen, basé sur plaques, est précieux car les champignons sont des organismes modèles peu coûteux et facilement entretenus, permettant une analyse systématique du développement sexuel induit par la lumière et de la fonction des gènes. La plupart des recherches sur le photopériodisme se sont concentrées sur les plantes, tandis que les cadres quantitatifs équivalents pour les systèmes fongiques restent limités. Chez d’autres organismes, y compris les insectes, des phénomènes dépendants de la lumière tels que la diapause sont bien^{caractérisés,} mais des approches comparables chez les champignons font défaut. Cet écart limite la comparaison reproductible des réponses photopériodiques entre souches et conditions expérimentales.

La PPA s’appuie sur une étude de 2004 qui a mesuré la production de protopérithèques sur des durées de jour croissantes, de l’obscurité constante à la lumière constante, dans le mutant bande (bd) (ras-1^bd), utilisé dans des études circadiennes ^4,12. Des changements dépendants du photopérithèque dans la production de protopérithèques ont été observés dans ce contexte. Le flux de travail actuel adapte et étend cette approche en utilisant la souche de référence FGSC 2489, qui est associée au séquençage du génome entier et aux ressources knockout^13,14. Le test quantifie le nombre moyen de protopérithèques produits sous des photopériodes définies sur une semaine comme indicateur de la réponse photopériodique. Cette approche standardise les conditions de culture, l’imagerie et la quantification, permettant une comparaison reproductible entre conditions expérimentales et souches. Les avancées méthodologiques clés incluent des conditions de culture standardisées sur plaques, des paramètres d’exposition à photopériode définis, l’imagerie basée sur des quadrants et un flux de travail de quantification reproductible.

Ce protocole quantifie les réponses photopériodiques chez N. crassa en mesurant la formation des protopérithèques après exposition à des cycles clair-obscurité définis. Pour chaque condition photopériodique, quatre réplicés biologiques sont utilisés, chacun constitué d’une plaque de croisement synthétique (SC) inoculée indépendamment. Quatre images sont collectées par plaque et moyennées pour générer une seule valeur par réplication biologique pour une analyse statistique. Les plaques sont incubées pendant sept jours sous photopériodes calibrées (par exemple, cycles clair-obscur de 12 h à 12 h ou 8 h à 16 h clair-obscur).

Un enregistreur de données est placé à l’intérieur de la chambre de croissance pour enregistrer en continu l’intensité lumineuse, la température et l’humidité, vérifiant ainsi les conditions environnementales stables. L’intensité lumineuse est maintenue au-dessus de 1 000 lux, car des niveaux plus faibles réduisent la production de protopérithèques. Une illumination excessive est évitée afin d’éviter l’augmentation de la température de la chambre et les effets thermiques confus. Après l’incubation, les macroconides sont délicatement retirés avec un essuie-tout humidifié saturé à 70 % d’éthanol. Quatre quadrants espacés uniformément au périmètre de chaque plaque sont imagés à un grossissement de 40× à l’aide d’un microscope stéréo sous éclairage en champ lumineux. Les protopérithèques sont comptés manuellement à l’aide d’un logiciel de traitement d’image, et les comptages moyens par plaque sont utilisés pour des comparaisons statistiques entre photopériodes.

Protocole

Les réactifs, logiciels et équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des supports et des matériaux

(Temps estimé : 1–1,5 h de temps actif ; refroidissement nocturne en option)

1. Préparez un support de croisement synthétique (SC)
   1. Préparez le milieu SC : 0,2 % de sacchaline, 5 μg/L de biotine, 1,5 % d’agar et de sels de Westergaard (pH 6,5 avec 1 N NaOH)¹⁵.
   2. Autoclave le médium. Laissez-la refroidir à 50–55 °C jusqu’à ce qu’elle atteigne un état versable.
      ATTENTION : Utilisez des gants résistants à la chaleur lorsque vous retirez des flasques de l’autoclave.
2. Versez les assiettes
   1. Pipettez 10 mL de milieu en fusion dans des boîtes de Petri de 60 mm à l’aide d’une pipette jetable.
   2. Laissez les assiettes solidifier à température ambiante pendant 30 à 45 minutes.
   3. Conservez les assiettes à l’envers à 4 °C pendant jusqu’à 4 semaines.
      REMARQUE : Maintenez l’hydratation des assiettes. Ne pas conserver les assiettes plus de 4 semaines à 4 °C.
3. Préparez des souches fongiques
   1. Cultivez chaque souche dans de petits tubes à essai en verre contenant un médium complet ou minimal préparé selon les instructions du manuel^{de laboratoire 15}.
   2. Incubez les tubes dans une obscurité constante (DD) à 30 °C jusqu’à ce qu’une couverture mycéliale visible se forme le long de la surface du tube (généralement 2 à 3 jours).
      ATTENTION : Manipuler les cultures fongiques selon des pratiques microbiologiques standard et travailler dans un cabinet de biosécurité pour minimiser la contamination.

2. Inoculation des plaques

(Temps estimé : 15–30 minutes par ensemble d’assiettes)

1. Transfert de conidies fongiques
   1. Inoculez chaque plaque SC en utilisant une technique stérile et une boucle d’inoculation.
   2. Placez les conidies au centre de la plaque pour assurer une croissance uniforme (Figure 1A). Les conidies apparaissent sous forme de spores poudreuses et claires couvrant la surface de la colonie.
   3. Appliquez environ 1 à 2 μL de suspension conidiale concentrée (ou une boucle équivalente) pour standardiser l’inoculation entre plaques.
2. Préparez les plaques pour l’incubation
   1. Fermez les plaques solidement pour éviter la contamination tout en permettant l’échange de gaz.
   2. Étiquetez chaque plaque avec le nom de la souche, la date et l’état de la photopériode.

3. Installation du traitement photopériode

(Temps estimé : 10 minutes d’installation + incubation de 7 jours)

1. Calibrez la chambre de croissance
   1. Réglez la température de la chambre à 25 °C.
   2. Réglez l’humidité à 50 % (plage acceptable : 40 % à 60 %) pour éviter le séchage des plaques.
   3. Cycles de photopériode programmés : EQ (équinoxe) : 12 h lumière / 12 h sombre et SDP (jour court) : 8 h lumière / 16 h sombre
   4. Réglez l’intensité lumineuse à >1 000 lux au niveau de la plaque à l’aide d’un posemètre calibré. Évitez les intensités qui font monter la température de la chambre au-delà de 25 °C.
      REMARQUE : Assurez-vous que les lumières de la chambre ne surchauffent pas l’intérieur.
      ATTENTION : N’utilisez pas de Parafilm ou de sacs plastiques pour maintenir l’humidité, car ils limitent l’échange gazeux et nuisent à la croissance fongique. Si le contrôle de l’humidité n’est pas disponible, placez un réservoir d’eau à l’intérieur de la chambre.
2. Placez les plaques dans la chambre
   1. Disposez les assiettes uniformément sur les étagères pour garantir une exposition uniforme à la lumière.
   2. Placez un enregistreur de données dans la chambre pour surveiller en permanence la température et l’humidité et vérifier les conditions environnementales stables.
3. Commencez le test
   1. Incuber les plaques sous la photopériode programmée pendant 7 jours sans perturbation.

4. Surveillance et préparation des plaques pour l’imagerie

(Temps estimé : 15–20 minutes par assiette)

1. Retirez les plaques de la chambre
   1. Retirez les plaques après 7 jours d’incubation.
   2. Inspectez les plaques pour détecter la croissance des conidiens et la formation de protopérithèces.
2. Lisez les plaques pour la visibilité
   1. Retirez les conidies de surface du couvercle de la plaque et de la surface de l’agar à l’aide de serviettes en papier déchirées (Figure 1B).
   2. Humidifier un essuie-tout avec 1 à 2 mL d’éthanol à 70 %. Tamponnez doucement la surface de la plaque 3 à 5 fois pour enlever les conides. Laissez les plaques sécher à l’air libre pendant 1 à 3 minutes avant l’imagerie (Figure 1C).
      ATTENTION : L’éthanol est inflammable ; Évitez les sources de chaleur.
      REMARQUE : Évitez d’exercer une pression excessive. Ne traînez pas la serviette sur la surface de l’agar, car cela pourrait endommager le milieu ou perturber les protopérithèces.

5. Imagerie des protopérithèques

(Temps estimé : 5 min par assiette)

1. Préparez-vous à l’imagerie
   1. Installez un microscope avec un éclairage et un grossissement constants (généralement 40×).
   2. Assurez-vous que la surface de la plaque est sèche et exempte de débris.
2. Capturer des images
   1. Image de quatre quadrants espacés uniformément au périmètre de la plaque en utilisant un grossissement constant.
   2. Étiquetez chaque image avec la contrainte, l’état photopériode, le numéro de plaque et la position du quadrant.
   3. Enregistrez les images dans un format cohérent (par exemple, TIFF) pour analyse.

6. Quantification et analyse des données

(Temps estimé : 10–20 minutes par plaque pour le comptage ; 15–25 minutes pour l’analyse)

1. Comte protopérithèques
   1. Ouvrez chaque image dans un logiciel de traitement d’image.
   2. Utilisez le plugin Cell Counter pour compter manuellement les protopérithèces. Excluez les bulles, les artefacts de bord et les structures ambiguës. Comptez les protopérithèques regroupés comme des unités individuelles et distinguables.
   3. Enregistrez les comptes pour chaque quadrant et calculez la moyenne par plaque.
2. Analyser les données
   1. Importez des données quantifiées dans un logiciel d’analyse statistique.
   2. Effectuer une analyse statistique en utilisant le test t de Welch pour les comparaisons montrées à la Figure 2.
   3. Générez des graphiques comparant les traitements, souches ou répliques à photopériode.

Résultats

Après inoculation avec la souche sauvage, les conidies ont couvert la surface du SC en 36 à 48 heures. Après 7 jours d’exposition à la photopériode, une épaisse couche conidiale s’est formée et a été retirée avec un essuie-tout humidifié saturé à 70 % d’éthanol (Figure 1). Cette étape a exposé les protopérithèques sous-jacents sans perturber leur structure. À la microscopie, les protopérithèques apparaissaient sous forme de structures circulaires sombres réparties sur la surface de la plaque...

Discussion

L’objectif de l’APP est d’utiliser le développement sexuel chez les champignons comme indicateur pour déterminer si un organisme perçoit une photopériode spécifique. En quantifiant le nombre moyen de protopérithèques produits sous différents cycles lumineux, les réponses photopériodiques peuvent être évaluées et comparées entre les conditions. Conformément aux observations^{précédentes 4,16}, N. crassa présente une producti...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar	BD	90000-786	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal
Alcohol burner flame	Wards	470346-104	Pour stériliser la boucle d'inoculation
Ammonium iron sulfate hexahydrate	Supelco	FX0245-1	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal
Ammonium nitrate (NH4NO3)	BeanTown Chemical	BT134170-250G	Pour les milieux minimaux
Autoclave	VWR International	76683-456	Pour stériliser la verrerie et les milieux
Biological Safety Cabinet	ThermoFischer Scientific	1323TS	Pour réduire la contamination des plaques et du laboratoire.
Biotin	VWR	97061-444	Pour les milieux de croisement synthétique
Boric acid (H3BO3)	Electron Microscopy Sciences	100503-696	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal
Calcium chloride (CaCl2)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT1311-1	Pour les milieux de croisement synthétique
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	223506-25G	Pour les milieux minimaux
Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O)	Sigma-Aldrich	1002440500	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal
Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O)	BeanTown Chemical	BT121245-1KG	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal
Ethanol	Decon Labs	71001-754	Utilisé pour retirer les conidies de la surface de la plaque et stériliser la boucle d'inoculation
FIJI/ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	N/A	Pour analyser les images/comptage
Gloves	SW Safety Solutions	76382-944	Pour la sécurité
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	N/A	Pour effectuer des tests statistiques et créer des figures
Growth Chamber	Caron Products & Services	6320 & 6340 Series	Programmable pour les cycles de photopériode
HOBO Data Logger	Onset Computer Corporation	MX2202	Pour la journalisation de l'intensité lumineuse et de la température
Inoculation loop	VWR International	10806-354	Pour transférer le matériel fongique dans les boîtes de Petri
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT145380-1KG	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal
Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O)	Sigma-Aldrich	1059410250	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal
Microscope (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope)	Leica Microsystems	10446297	Pour l'imagerie
Neurospora crassa FGSC 2489	Fungal Genetics Stock Center	74-OR23-1VA, JCM19069	Souche fongique
Paper Towels	Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex	6666114	Pour verser les milieux
Permanent Marker	Sharpie	30072	Pour étiqueter les plaques
Petri Dishes	VWR International	25384-164	Pour le placage des milieux de croisement synthétique
Pipettes	VWR International	75816-090	Pour verser les milieux
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	BeanTown Chemical	BT225070-500G	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal
Potassium nitrate (KNO3)	Sigma-Aldrich	221295-100G	Pour les milieux de croisement synthétique
Small Disposable Glass Test Tubes	VWR International	470211-698	Pour la croissance initiale de la souche fongique
Sodium chloride (NaCl)	VWR International	BDH9286-500G	Pour les milieux de croisement synthétique
Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O)	VWR	97061-008	Pour les milieux minimaux
Sodium hydroxide (NaOH)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT5635-2	Pour les milieux de croisement synthétique
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Supelco	1.06524.1000	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal
Sucrose	VWR International	BDH9308-500G	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT122545-500G	Pour les milieux de croisement synthétique/milieu minimal