Phénotypage comportemental multimodal des états dépressifs induits par le stress chez Drosophila melanogaster

Résumé

Ce protocole fournit un cadre pour évaluer les changements comportementaux induits par le stress chez Drosophila melanogaster. La combinaison d’essais complémentaires permet de quantifier l’activité, l’exploration et la prise de décision pour des mouches individuelles. Cette approche est flexible et peut être adaptée à un large éventail d’études portant sur la biologie du stress, le métabolisme et les fonctions neurocomportementales.

Résumé

Les troubles métaboliques, neurodégénératifs et liés au stress s’accompagnent fréquemment d’une locomotion modifiée, d’une prise de décision altérée et d’une flexibilité comportementale réduite. Cependant, les cadres comportementaux multimodaux accessibles pour quantifier ces phénotypes chez Drosophila melanogaster restent limités. Ici, un protocole intégrant l’exposition à la nage forcée, le comportement et la mobilité manuelle du labyrinthe en Y, la phototaxie et l’évaluation de l’activité dans le système FlyVac, l’exploration en champ ouvert et la surveillance locomotrice à long terme à l’aide du Drosophila Activity Monitor est présenté. Ces tests complémentaires capturent plusieurs dimensions du comportement, notamment la sortie motrice, la motivation, la structure décisionnelle et la variabilité comportementale, en tant que lectures fonctionnelles des états neuronaux et métaboliques. Le pipeline est évolutif, reproductible et adaptable aux manipulations pharmacologiques, génétiques et environnementales, offrant un cadre polyvalent pour détecter les phénotypes comportementaux liés au stress, métaboliques et neurodégénérescences chez Drosophila.

Introduction

Les altérations comportementales telles que des modifications de la locomotion, de la prise de décision et de l’activité exploratoire sont largement utilisées comme indicateurs au niveau de l’organisme de l’état neural et physiologique. À travers les taxons, la dysfonction neuronale se manifeste souvent par une modification de la structure du mouvement, une motivation exploratoire réduite, un comportement décisionnel guidé par des fonctions sensorielles altérées et des changements dans la prévisibilité comportementale. Parce que ces sorties au niveau de l’organisme intègrent l’état neuronal, métabolique et physiologique, elles fournissent des données évolutives pour détecter des phénotypes pertinents pour la maladie. Cependant, malgré l’utilisation étendue de Drosophila melanogaster en génétique moléculaire et en neurosciences, les cadres comportementaux multimodaux standardisés qui capturent simultanément la performance locomotrice, la structure décisionnelle et la variabilité comportementale restent limités.

Les organismes modèles sont essentiels pour étudier les mécanismes sous-jacents aux phénotypes liés au stress et neuropsychiatriques, car la manipulation expérimentale contrôlée est souvent impossible chez l’humain. Les syndromes comportementaux liés au stress se manifestent chez de nombreux taxons, y compris les insectes, et impliquent des systèmes neuromodulateurs conservés, tels que la sérotonine et la dopamine, ainsi que des voies de signalisation métabolique. La mouche des fruits s’est donc imposée comme un système puissant pour relier la dysfonction moléculaire aux résultats comportementaux au niveau de l’organisme, en raison de son temps de production réduit, de sa facilité génétique et de la conservation des voies pertinentes pour^{les maladies 1,2}.

Parallèlement, de nombreux tests comportementaux chez Drosophila sont généralement appliqués isolément, ce qui rend difficile la distinction entre les effets généraux de la maladie, les troubles moteurs, les changements de motivation et les altations comportementales au niveau de la décision. De plus, les mesures comportementales moyennes seules peuvent obscurcir des phénotypes biologiquement significatifs, car les perturbations neuromodulatrices et développementales modifient souvent la variabilité comportementale plutôt que la sortie comportementale moyenne. Une approche comportementale multimodale combinant des essais locomoteurs, exploratoires, sensoriels et décisionnels est donc nécessaire pour générer des signatures phénotypiques robustes au^{niveau de l’organisme 3}.

Ici, un pipeline comportemental multimodal intégrant exposition à la nage^{forcée 4,5}, le comportement et la mobilité en rotation du labyrinthe^{en Y} 6,7,8,9, la phototaxie et l’évaluation de l’activité utilisant le système FlyVac ^10,11, l’exploration en champ^{ouvert 12}, et la surveillance locomotrice à long terme via le Drosophila Activity^{Monitor 5,13} est présenté (Figure 1). Chaque test dans ce cadre capture une dimension comportementale distincte pertinente pour les phénotypes liés au stress. Le test de nage forcée mesure le comportement d’adaptation passif, où une transition plus précoce vers l’immobilité reflète une motivation réduite à maintenir des réponses d’évasion. Les tests en champ ouvert et DAM quantifient l’activité locomotrice générale et la structure circadienne, fournissant des mesures de base de la sortie motrice et de l’excitation. Le test Y-maze capture la structure décisionnelle à travers des séquences de choix gauche-droite, permettant d’estimer à la fois le biais de virage (latéralisation) et la variabilité comportementale comme mesure de la prévisibilité. Enfin, le test FlyVac évalue la prise de décision guidée par les sens et le comportement d’approche-évitement à travers des choix phototactiques répétés. Ensemble, ces tests fournissent des lectures complémentaires qui distinguent les changements d’activité, de motivation et de comportement au niveau de la décision.

Ce protocole capture des aspects complémentaires de la sortie motrice, de la motivation, de la structure décisionnelle et de la variabilité comportementale, fournissant un cadre évolutif pour détecter les phénotypes comportementaux liés au stress, métaboliques et neurodégénérescences chez D. melanogaster¹⁴. L’objectif principal de cette étude est d’établir un cadre multimodal de phénotypage comportemental qui intègre des tests complémentaires pour capturer de multiples dimensions du changement comportemental induit par le stress. Le paradigme de contrainte est utilisé ici comme perturbation standardisée pour démontrer la sensibilité et l’applicabilité du cadre.

Protocole

Le test de nage forcé a été réalisé conformément aux principes des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement). Le remplacement a été obtenu en utilisant Drosophila melanogaster comme modèle d’invertébrés, évitant ainsi les paradigmes de la nage forcée chez les vertébrés qui sont de plus en plus restreints pour des raisons éthiques. La réduction était soutenue par la nature à haut débit de l’analyse, qui permet une inférence comportementale robuste à partir de cohortes relativement petites tout en minimisant l’utilisation animale. Le raffinement a été abordé en limitant l’exposition à la nage à 2 minutes, une durée qui évite l’épuisement ou la noyade et permet de récupérer complètement le comportement locomoteur normal immédiatement après les tests. Ensemble, ces considérations garantissent que le test fournit des données comportementales significatives tout en minimisant les détresses potentielles et en maximisant l’acceptabilité éthique, y compris dans les milieux scolaires.

1. Induction d’un état de type dépression chez Drosophila (protocole de contrainte de vibration)

1. Prélever le mâle D. melanogaster dans les 24 heures suivant l’éclosion sous légère anesthésie CO₂. Tous les détails sont mentionnés dans le tableau des matériaux.
2. Placez les mouches par groupes de 10 dans des fioles en polypropylène ou en acrylique (95 mm de longueur × 25 mm de diamètre intérieur) scellées avec des bouchons de coton.
3. Exposer les mouches aux vibrations mécaniques (300 Hz) à l’aide d’une plateforme de vibration.
4. Appliquez des cycles répétés comprenant 45 minutes de vibration suivies de 15 minutes de récupération dans des fioles contenant un aliment standard.
5. Continuez les cycles de vibration pendant un total de 6 heures par jour.
6. Répétez le protocole de stress pendant 3 jours consécutifs.
7. Maintenir les mouches de contrôle dans des conditions de logement identiques sans exposition aux vibrations.
   REMARQUE : Dans le protocole actuel, seuls les mâles ont été utilisés pour réduire la variabilité associée aux différences physiologiques et comportementales spécifiques au sexe, y compris l’état reproducteur et les influences hormonales. Cette standardisation facilite la détection des effets comportementaux induits par le stress dans un cadre contrôlé. Cependant, le protocole s’applique pleinement aux mouches femelles, et les réponses spécifiques au sexe représentent un domaine important pour de futures recherches. Étant donné que la sensibilité aux phénotypes liés au stress et aux phénotypes de type dépressif peut varier selon le sexe et l’âge selon les taxons, y compris Drosophila, étendre ce cadre à différents groupes démographiques peut fournir des perspectives biologiques supplémentaires. Ce paradigme est adapté à partir de modèles établis de contraintes vibratoires incontrôlables qui induisent des altérations motivationnelles et d’activité chez les mouches.

2. Test de nage forcé chez Drosophila melanogaster

ATTENTION : Le dodécyle sulfate de sodium (SDS) est un irritant. Portez un équipement de protection individuelle approprié (par exemple, gants et protection oculaire) lors de la préparation et de la manipulation des solutions SDS. Évitez le contact visuel et la peau des regards. Éliminer les déchets contenant des FDS conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique.

1. Recueillez les mouches adultes dans les 24 heures suivant l’éclosion et maintenez-les sous une lumière constante et des conditions environnementales contrôlées.
2. Préparez des lames à chambre multi-puits et remplissez chaque puits avec ~2 mL de solution SDS à 0,08 % à température ambiante.
3. Transférez une seule mouche dans chaque puits juste avant l’enregistrement. Aucune anesthésie n’est requise.
4. Enregistrez le comportement avec une caméra aérienne pendant 2 minutes pour quantifier la latence à la première immobilité.
5. Quantifiez la latence à la première immobilité.
6. Retirez les mouches après l’enregistrement et placez-les sur du papier absorbant pour confirmer la reprise de la locomotion normale.
   REMARQUE : L’immobilité est définie comme l’arrêt des mouvements d’évasion actifs tout en maintenant la position en surface. Pour enregistrer des paramètres supplémentaires tels que la durée totale d’immobilité et le nombre de séances d’immobilité sont nécessaires, des durées d’enregistrement plus longues (par exemple, 3 minutes) sont nécessaires. Ce test reflète un comportement d’adaptation passif ; La latence réduite à l’immobilité est interprétée comme une motivation diminuée à soutenir les réponses d’évasion. Variabilité de la latence à l’immobilité / immobilité totale entre les mouches. Ce test peut induire un stress ou une fatigue transitoire. Lorsqu’il est utilisé dans des plans longitudinaux, il faut les réaliser avant d’autres essais et permettre une récupération suffisante (par exemple, ≥24 heures) avant les essais ultérieurs.

3. Surveillance de l’activité locomotrice à long terme à l’aide du Drosophila Activity Monitor (DAM)

1. Anesthésiez brièvement les mouches à fruits (5 s) en utilisant du CO₂ pour le tri.
2. Placez des mouches individuelles dans des tubes en verre contenant de la nourriture et des bouchons de^{coton 17}.
3. Insérez des tubes dans le système Drosophila Activity Monitor.
4. Enregistrer une activité locomotrice continue (48 h) sous des conditions contrôlées de température et de lumière-obscurité.
5. Stocker les comptages de rupture de faisceau à l’aide d’un logiciel d’acquisition.
6. Classez les données d’activité dans des intervalles de temps définis (par exemple, 1 à 10 min).
7. Excluez les mouches qui meurent ou ne montrent aucune activité après l’acclimatation.
   REMARQUE : Une surveillance locomotrice continue sur une période de 48 heures suffit à capturer les schémas d’activité circadienne. DAM : variabilité de la distance totale, de la vitesse et de la structure de la zone d’un groupe à l’autre.

4. Essai locomoteur en champ ouvert

1. Anesthésiez brièvement (5 s) les mouches à fruits avec du CO₂.
2. Transférer les braguettes individuelles dans des arènes rectangulaires de 25 x 75 mm (une mouche par arène).
3. Laissez les mouches s’acclimater (20 min) à l’environnement de l’arène avant de les enregistrer sous une lumière blanche diffuse constante et de faible intensité.
4. Enregistrer le comportement sous un éclairage constant à l’aide d’un système automatisé de suivi vidéo.
5. Analysez les trajectoires à l’aide d’un logiciel de suivi pour extraire :
   Distance totale parcourue
   Vitesse moyenne des locomoteurs
   Paramètres d’accélération et de virage
   REMARQUE : Ce test fournit une base pour interpréter les changements comportementaux liés au stress. La période d’acclimatation minimise le stress induit par la manipulation et permet aux mouches de s’habituer à l’arène, garantissant que l’activité locomotrice enregistrée reflète le comportement de base. L’éclairage constant a été utilisé pour réduire la variabilité associée aux fluctuations circadiennes et pour assurer des conditions comportementales cohérentes entre les essais. Les trajectoires peuvent être extraites à l’aide de logiciels de suivi automatisés tels qu’EthoVision XT (Noldus Information Technology), ou d’alternatives open source comme Ctrax, idTracker et TrackMate (ImageJ/Fiji), selon la disponibilité et les préférences de l’utilisateur. Analyse en champ ouvert : variabilité de la distance totale, de la vitesse et de la structure des points entre individus. Pour réduire les effets d’ordre, standardisez les conditions d’acclimatation et d’éclairage sur les sessions. Lorsque plusieurs tests sont réalisés sur les mêmes individus, il faut maintenir la durée d’exposition de l’arène constante.

5. Comportement de virage en Y et dosage de variabilité comportementale

1. Anesthésiez brièvement (5 s) les mouches à fruits avec du CO₂.
2. Placez des mouches individuelles dans les chambres du labyrinthe^{en Y 8,9}. Les labyrinthes étaient découpés dans de l’acrylique noir d’une épaisseur de 1,6 mm à l’aide d’un graveur laser. Nous avons placé les mouches dans un ensemble de 95 labyrinthes individuels, chacun composé de trois bras symétriques (12 mm de long et 3,3 mm de large).
3. Permettre aux mouches d’explorer librement pendant de longues périodes d’enregistrement (20 min).
4. Enregistrer les décisions de virage (à gauche ou à droite) lors de la locomotion exploratoire (1 h).
5. Calculez le biais individuel de virage comme la proportion de virages à droite. Calculer des métriques pertinentes telles que la vitesse, l’accélération, le mouvement sans mouvement, les variations d’activité basées sur le^{temps 12,15}.
6. Quantifiez la variabilité comportementale entre les mouches en utilisant la médiane de la déviation absolue (MAD) du biais de virage.
   REMARQUE : Ce test mesure la mobilité lomotrice et la prévisibilité comportementale indépendamment des niveaux d’activité globaux. Les séquences de virage capturent la structure décisionnelle ; Le biais de retournement reflète la latéralisation, tandis que la variabilité entre individus reflète la prévisibilité comportementale. Biais = proportion de virages à droite (par mouche) ; variabilité = dispersion (MADn) du biais entre les mouches. Pour des tests répétés, il faut envisager de contrebalancer l’ordre des tests entre individus ou cohortes afin de contrôler les effets de séquence.

6. Choix phototactiques : surveillance de l’activité dans l’appareil FlyVac

1. Chargez les mouches individuelles dans les chambres^{FlyVac 6, 11} sans utiliser d’anesthésie CO₂.
2. Autorisez l’acclimatation (10 min) avant de commencer les essais.
3. Présentez des choix binaires clair-obscurité répétés à chaque mouche.
4. Enregistrer les choix sur 40 essais grâce à la détection automatisée.
5. Calculer la probabilité de choix de la lumière par mouche et le temps moyen entre les choix de la lumière comme mesure de l’activité.
6. Quantifier la variabilité comportementale chez les individus utilisant la DMA.
   REMARQUE : Le système FlyVac permet une évaluation simultanée du biais décisionnel moyen et de la variabilité interindividuelle. Les tests comportementaux décrits dans ce protocole sont modulaires et peuvent être réalisés selon différentes séquences selon le plan expérimental. Cependant, pour minimiser les effets potentiels de report, il est recommandé de réaliser le test de nage forcé avant d’autres tests. Pour réduire les effets d’ordre, standardisez les conditions d’acclimatation et d’éclairage sur les sessions.

7. Analyse des données

REMARQUE : Les analyses comportementales ont été réalisées en utilisant des mouches individuelles comme unité d’inférence, sauf indication contraire.

1. Test de nage forcé : Analysez les enregistrements vidéo manuellement ou à l’aide d’un logiciel de notation comportementale.
   REMARQUE : L’immobilité était définie comme l’absence de mouvements d’évasion actifs tant que la mouche restait à flot. Les paramètres suivants ont été extraits par mosche : latence à la première immobilité ( s).Des comparaisons de groupes ont été réalisées à l’aide de tests statistiques non paramétriques en raison de la distribution anormale des mesures comportementales.
2. Activité locomotrice à long terme (DAM) : Nombre record de ruptures de faisceau par le Drosophila Activity Monitor. Exporte et barre en intervalles de 10 minutes.
   REMARQUE : Pour chaque mouche, les comptes d’activité totale et les schémas d’activité circadiennes ont été calculés. Ces motifs peuvent être calculés en R, Python ou Excel — selon les options disponibles. Les mouches présentant une inactivité due à la mortalité ou à des artefacts techniques ont été exclues avant l’analyse. Le test a duré 48 heures.
3. Essai sur locomoteur en champ ouvert : Traiter les données de suivi vidéo à l’aide d’un logiciel de suivi automatisé. Importez les fichiers vidéo dans EthoVision XT. Effectuez le suivi en utilisant une détection automatisée avec un seuil basé sur le contraste.
   REMARQUE : Les trajectoires ont été lissées à l’aide de l’algorithme de filtrage par défaut. Les paramètres locomoteurs par fly-out (distance, vitesse, accélération) étaient exportés sous forme de fichiers CSV pour une analyse en aval. Les paramètres locomotrices par fly comprenaient : distance totale parcourue (mm), accélérations (mm/^{s 2}). Les statistiques sommaires ont été calculées au niveau individuel avant la comparaison de groupes. La durée de ce test était d'1 heure pour chaque groupe.
4. Comportement de virage en Y : Extraire les décisions de virage à partir des trajectoires enregistrées, les classer en gauche ou droite, et exporter en séquences binaires (gauche/droite) pour chaque individu.
   REMARQUE : Pour chaque mouche, le biais de virage était calculé comme la proportion de virages à droite dans toutes les décisions enregistrées. La variabilité comportementale entre les mouches a été quantifiée à l’aide de la déviation absolue médiane à l’échelle (_{MAD n} = 1,4826 × MAD) du biais de virage. La durée de ce test était d'1 heure pour chaque groupe.
5. Choix phototactiques FlyVac : Enregistrer automatiquement les choix binaires lumière–obscurité. Pour chaque mouche, calculez la probabilité de choix de la lumière (LCP) comme la proportion d’essais dans lesquels le bras léger a été sélectionné. Exprimez le biais phototactique comme la moyenne des résultats binaires des essais (lumière = +1, obscure = −1).
   REMARQUE : La variabilité entre les mouches a été quantifiée à l’aide de la_{DMAD n} des indices individuels de phototaxie.
6. Analyse statistique : Évaluer les différences entre groupes dans les mesures comportementales à l’aide de tests basés sur la permutation avec 10 000 randomisations sur étiquette.
   REMARQUE : Pour comparer la variabilité, des tests de permutation ont été réalisés sur les différences absolues de_{MAD n} entre les groupes. Les intervalles de confiance pour les_{estimations de la MAD n} ont été obtenus par rééchantillonnage bootstrap. Un test t non apparié à deux queues a été utilisé pour comparer la distance parcourue par les mouches (mm) et l’accélération maximale (mm/^{s 2}). Pour la visualisation des données, des diagrammes de violon (principalement pour montrer la densité, la concentration et l’asymétrie), des diagrammes à boîtes et des graphiques à colonnes ont été utilisés. La signification statistique a été évaluée à α = 0,05.

Résultats

L’application du protocole de contrainte vibratoire a produit des modifications comportementales mesurables à travers plusieurs tests (Figure 1) destinées à capturer l’activité, le comportement d’adaptation et la prise de décision chez D. melanogaster.

Induction de type dépression

Les mouches exposées à des vibrations mécaniques répétées (Figure 1A) ont montré une activité explorat...

Discussion

Le protocole actuel démontre une approche multimodale pour induire et quantifier les états comportementaux de type dépression chez D. melanogaster. En utilisant un paradigme de stress basé sur les vibrations combiné à des tests comportementaux complémentaires, cette étude montre que l’induction de type dépression peut être détectée à travers des mesures de comportement d’adaptation, d’activité locomotrice, de dynamiques exploratoires, de prise de décision et de variabilité

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anesthesia equipment: e.g., Benchtop Flowbuddy, Complete System w/ Ultimate Flypad	Genesis Scientific, El Cajon, CA, USA	59-122BCU
BioSan MSV-3500 multispeed vortex	Biosan SIA, Riga, Latvia	BS-010210-TAH	Avec toutes les plateformes
Cotton closures for narrow vials	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	Numéro de catalogue: 51-101
Drosophila Activity Monitor (DAM2)	TriKinetics Inc, Waltham, MA, USA	DAM2; RRID: non disponible	32 tubes
Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	BDSC:25211; RRID:BDSC_25211
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, MA, USA;	Nom du catalogue: GraphPad Prism, RRID:SCR_002798	Version 11.0.1
Logitech C920 HD Pro Webcam, HD 1080p lensCatalog name: HD Pro Webcam C920	Logitech Europe S.A., Lausanne, Switzerland	RRID: non disponible	La caméra de surveillance utilisée pour FST
Narrow Fly Vial, Polypropylene	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	Numéro de catalogue: 32-120BF
Noldus EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	RRID: SCR_000441	v. 15.0
Sodium dodecyl sulfate (SDS, ≥99%)	Merck KGaA (Sigma-Aldrich), Darmstadt, Germany	Nom du catalogue: Sodium dodecyl sulfate (réactif ACS, ≥99% de pureté); RRID: non disponible
ZEISS Stemi 508 Stereomicroscope	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Baden-Württemberg, Germany	15634448