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Article de méthode

Analyse métabolomique par résonance magnétique nucléaire des milieux de culture d’embryons humains usés : validation des méthodes et considérations techniques

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DOI :

10.3791/71285

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31 juillet 2026

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1Department of Reproductive Medicine and Gynaecological Endocrinology, University Medical Centre Maribor, 2Faculty of Medicine, University of Ljubljana, 3National Institute of Chemistry, 4EN-FIST Centre of Excellence, 5Faculty of Chemistry and Chemical Technology, University of Ljubljana, 6Department of Reproductive Science, Manipal Academy of Higher Education

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour collecter, préparer et analyser un milieu de culture embryonnaire humain usé à l’aide de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), permettant la détection reproductible de métabolites de faible poids moléculaire à partir d’échantillons à l’échelle du microlitre dans des conditions de culture clinique de routine.

Résumé

Les milieux de culture embryonnaire humaine usagés contiennent des métabolites de faible poids moléculaire qui peuvent fournir une lecture non invasive de la physiologie embryonnaire préimplantation. Cependant, l’analyse métabolomique basée sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) de ces échantillons est techniquement complexe car les conditions de culture embryonnaire de routine impliquent des volumes de microlitres, une supplémentation en protéines et des couches d’huile de paraffine qui génèrent des signaux de fond et compromettent la qualité spectrale. Ici, nous présentons un flux de travail métabolomique RMN optimisé pour les milieux de culture embryonnaire usées, intégrant la collecte contrôlée de gouttelettes pour minimiser la contamination pétrolière, des tubes de tubage fluoré à propylène d’éthylène (FEP) pour isoler chimiquement l’échantillon de la référence externe (TMSP) tout en tenant compte des volumes de microlitres, ainsi qu’une acquisition à l’aide d’une séquence d’impulsions Carr-Purcell-Meiboom-Gill pour supprimer les signaux de fond macromoléculaire. Le protocole permet une détection et une quantification cohérentes des métabolites de faible poids moléculaire provenant d’embryons humains cultivés individuellement et soutient une analyse reproductible en conditions de laboratoire routinières. En raison de nombreux défis techniques, la méthode doit être correctement validée avant de pouvoir être utilisée à des fins de recherche ou cliniques.

Introduction

Lors du développement préimplantatoire in vitro., les embryons consomment et libèrent continuellement des métabolites de faible poids moléculaire dans le milieu environnant. La composition du milieu de culture embryonnaire usé (MCE) reflète donc l’activité métabolique de l’embryon et fournit un affichage fonctionnel non invasif de la physiologie embryonnaire et de la compétencedéveloppementale 1,2. L’analyse de cette empreinte métabolique pourrait compléter les méthodes d’évaluation conventionnelles et améliorer les stratégies de sélection des embryons dans la technologie de procréationassistée 3,4. En particulier, des altérations du renouvellement des acides aminés et des glucides ont été associées au potentiel et à la viabilité du développement embryonnaire 5,6,7.

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est largement utilisée pour le profilage non ciblé des métabolites de divers échantillons biologiques, y compris les milieux de culture embryonnaireusée 8,9,10. Cependant, l’analyse de ces échantillons reste analytiquementdifficile 11. Dans la pratique clinique courante, les embryons sont cultivés dans des microenvironnements définis conçus pour imiter des conditions physiologiques. Les milieux de culture sont complétés par des protéines, généralement de l’albumine, pour stabiliser la pression osmotique, lier les composés toxiques et fournir des molécules porteuses pour les lipides et les facteurs de croissance qui soutiennent un développement normal12. Pour éviter l’évaporation et maintenir des concentrations constantes de solutés, les gouttelettes de culture sont recouvertes d’huile de paraffinestérile 13.

Les lipides provenant de composants d’huile et de protéines superposés génèrent de larges signaux de fond qui masquent les résonances étroites des métabolites de faible poids moléculaire tels que le glucose, le pyruvate et les acides aminés. De plus, l’analyse des volumes d’échantillons en microlitres dans des tubes RMN standards de 5 mm nécessite une dilution importante pour atteindre le volume actif de la bobine RF. Cette réduction de la concentration d’analytes diminue fortement le rapport signal/bruit (S/N), masquant les métabolites à faible abondance et entravent la quantification reproductible. Bien que de nombreuses études aient appliqué la métabolomique basée sur la RMN à des milieux de culture embryonnaire humaine usée, l’absence de protocoles standardisés et reproductibles de collecte et de préparation a limité la reproductibilité et la comparabilitéinter-études 8,9,11.

Nous présentons ici un flux de travail métabolomique basé sur la RMN (Figure 1) conçu pour surmonter les défis techniques liés à l’échantillonnage et à l’analyse des milieux de culture embryonnaire humaine. Cette approche combine la collecte contrôlée de gouttelettes pour réduire le transfert de pétrole, l’acquisition en volume de microlitres à l’aide de liners d’éthylène propylène fluoré (FEP) pour éviter les artefacts de dilution, et l’atténuation du signal macromoléculaire à l’aide d’une séquence d’impulsions Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG).

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Protocole

Cette étude a été menée entre janvier et avril 2023 au Département de médecine reproductive et d’endocrinologie gynécologique, Centre médical universitaire de Maribor, Slovénie. L’analyse RMN a été réalisée à l’Institut national de chimie de Ljubljana, en Slovénie. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants. Il a reçu l’approbation à la fois du Comité d’éthique institutionnelle (n° UKC-MB-KME-21/01) et du Comité national d’éthique médicale (n° : 0120-37/2021/15).

1. Conception de l’étude

REMARQUE : L’étude a analysé des milieux de culture embryonnaire humaine usagée à l’aide de métabolomique basée sur la RMN.

  1. Prélever des échantillons après une culture embryonnaire prolongée suite à l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI). Prélever un nombre égal d’échantillons témoins incubés non utilisés.

2. Collecte d’échantillons

  1. Collectez des échantillons de milieux de culture embryonnaires usés (SECM) après l’incubation de l’embryon, comme illustré à la Figure 2.
  2. Après le retrait de l’embryon de la gouttelette de culture, aspirez soigneusement l’excès d’huile de superposition à la surface de la cuve de culture sans déranger le milieu (Figure 2, étape 1).
  3. À l’aide d’une pipette stérile, aspirez environ 35 μL de milieu de culture à partir de la gouttelette d’origine, en laissant environ 5 μL pour éviter d’aspirer de l’huile de surface résiduelle. Transférez ce volume dans une boîte de Petri stérile pour former une nouvelle gouttelette (Figure 2, étape 2).
  4. Au stéréomicroscope, inspectez visuellement la gouttelette nouvellement formée. Aspirez soigneusement environ 30 μL de cette gouttelette, en laissant à nouveau environ 5 μL pour minimiser le transfert d’huile. Transférez ce volume vers un second endroit stérile pour former une gouttelette plus nettoyante (Figure 2, étape 3).
  5. Inspectez visuellement la deuxième gouttelette sous grossissement. Identifier les régions où les gouttelettes de pétrole sont les moins prononcées. Insérez la pointe de la pipette dans cette région et aspirez environ 25 μL de milieu, en laissant à nouveau environ 5 μL pour minimiser le transfert d’huile (Figure 2, étape 4).
  6. Transférez immédiatement les 25 μL collectés dans un tube de microcentrifuge stérile sans RNase. Évitez de toucher les parois internes du tube lors de la distribution de l’échantillon afin d’éviter toute contamination et perte d’échantillon. Congelez immédiatement instantanément tous les échantillons collectés dans de l’azote liquide et conservez à -80 °C jusqu’à l’analyse RMN (Figure 2, étape 5).
  7. Collecter des gouttelettes témoins non étaies et incubées (milieu incubé sans embryons) préparées, incubées et traitées sous des conditions de culture identiques en utilisant les mêmes plats de culture, l’huile superposée, la durée d’incubation, l’environnement de l’incubateur et la procédure de manipulation décrites ci-dessus afin de minimiser la variabilité environnementale et les biais systématiques potentiels.
    REMARQUE : Le respect strict du transfert séquentiel de gouttelettes et de l’inspection visuelle réduit considérablement la contamination par le pétrole. À ce stade, l’expérience peut être mise en pause et reprise avant un traitement supplémentaire de l’échantillon pour l’acquisition de RMN.

3. Préparation de l’échantillon pour l’analyse RMN

  1. Dégelez des échantillons à température ambiante pendant ~10 minutes.
  2. Préparez le mélange RMN :
    1. Transférez 25 μL de SECM dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Ajoutez 200 μL de D₂O. Faites passer un vortex pendant 10 s puis centrifugez à 1000 × g pendant 10 s à température ambiante.
  3. Insertion de charge : transférer 225 μL du mélange dans un tubage FEP.
  4. Préparez le tube de référence externe.
    1. Remplir un tube RMN de 5 mm avec 150 μL de D₂O contenant 1 mM de sel sodique acide 3-(triméthylsilyl)2,2,3,3-d4 acide sodique (TMSP-d4).
  5. Assemblez l’échantillon : insérez l’insert FEP dans le tube RMN et scellez avec du parafilm.

4. Acquisition RMN et traitement spectral

  1. Acquérir 1acquisition H-CPMG en utilisant la séquence d’impulsions Bruker cpmgpr1d avec : 64 scans ; 65 536 points de données ; Délai de relaxation : 8 s ; Largeur spectrale : 11,9 kHz ; Temps d’écho : 400 μs × 80 boucles (filtre T₂ effectif 32 ms) ; Temps total d’acquisition : ~15 min.
    REMARQUE : La durée effective du filtre CPMG T₂ de 64 ms a été sélectionnée sur la base des protocoles de métabolomique établis pour des échantillons biologiques contenant des protéines, où cette valeur permet une suppression efficace des signaux macromoléculaires tout en préservant les résonances métabolitiques de faible poidsmoléculaire 14.
  2. Effectuer le traitement spectral :
    1. Obtenir les spectres de la transformée de Fourier.
    2. Appliquez un élargissement exponentiel de la ligne à 0,3 Hz.
    3. Effectuer une correction de phase et de base.
    4. Spectre de référence pour TMSP-d4 à 0 ppm.
    5. Référence les déplacements chimiques (δ) vers le signal externeTMSP-d 4 à 0 ppm.
      REMARQUE : Parce que le mélange d’échantillons à l’intérieur du liner FEP (225 μL) et la solution de référence externeTMSP-d 4 dans l’espace coaxial extérieur (150 μL) occupent des géométries physiques et des volumes distincts dans la fenêtre de détection active de la bobine RMN, leurs intensités absolues de signal ne sont pas à 1:1. La quantification absolue directe à l’aide de la référence externe nécessite une courbe d’étalonnage géométrique spécifique au système. Ainsi, étant donné les volumes d’échantillons strictement constants et la précision de pipetage très reproductible de ce protocole, les intégrales de seaux brutes ont été utilisées directement pour suivre les variations métaboliques relatives entre échantillons, sans nécessiter de normalisation de référence externe ou d’intensité totale.
  3. Effectuer le binning spectral :
    1. Excluez la région de résonance de l’eau (par exemple, 4,65–5,00 ppm) et la région de référence TMSP-d4 (par exemple -0,05–+0,05 ppm) avant le binning.
    2. Divisez les spectres en seaux de largeur variable pour éviter de diviser les pics.
    3. Utilisez des intégrales à seaux brutes pour l’analyse statistique plutôt que de les normaliser au signal externe TMSP-d4, car la référence est physiquement isolée dans le volume externe du tube. Cette approche évite les erreurs de quantification résultant des différents volumes actifs de l’insert par rapport au tube extérieur.
    4. Exportez les intégrales de bucket sous forme de matrice de données numériques pour l’analyse statistique.
      REMARQUE : Chaque « seau » (ou bin) représente l’intégrale numérique sommée de tous les signaux RMN dans une plage de ppm définie. Bien que ces intégrales reflètent la concentration relative des groupes chimiques présents dans cette plage, un seul seau peut contenir des signaux provenant de plusieurs métabolites qui se chevauchent ou seulement d’une partie du signal total d’un métabolite spécifique.

5. Analyse statistique

  1. Importation traitée 1spectre H-CPMG en Python (v3.12) en utilisant nmrglue15.
  2. Retirez l’eau et les régions spectrales TMSP-d4.
  3. Exportez les intégrales de bucket pour l’analyse.
  4. Effectuer des tests statistiques avec SciPy (v1.14.1) :
    1. Évaluer la normalité de chaque seau spectral à l’aide du test de Shapiro–Wilk.
    2. Appliquer une ANOVA unidirectionnelle (pour les données normalement distribuées) ou Kruskal-Wallis (pour les données non paramétriques) pour identifier les buckets présentant des différences statistiquement significatives entre le contrôle incubé non dépensé et le milieu utilisé.
    3. Pour les seaux présentant des différences significatives, effectuer une affectation structurelle en utilisant une combinaison d’expériences RMN 1D et 2D : 1 H-13C HSQC, 1 H-13C HMBC et 1 H-1H COSY.
    4. Comparez les corrélations 2D observées avec les bases de données standard (par exemple, HMDB) afin de vérifier l’identité des métabolites contribuant aux catégories discriminatoires.

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Résultats

Le flux de travail analytique pour le profilage métabolomique RMN non ciblé du milieu de culture embryonnaire usé est résumé à la Figure 1.

Élimination de la contamination pétrolière lors de l’échantillonnage
La figure 2 illustre la procédure séquentielle de transfert de gouttelettes utilisée pour réduire le transfert d’huile en superposition. Les échantillons prélevés sans pipetage soigneux présentaient de lar...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons abordé les principaux défis analytiques liés à l’identification et à la quantification des métabolites de faible poids moléculaire dans des milieux de culture embryonnaire usés en utilisant la métabolomique RMN non ciblée. Nos résultats montrent que ce flux de travail optimisé permet l’acquisition de spectres de haute qualité et riches en informations, adaptés à la détection fiable de métabolites de faible poids moléculaire.

Un tra...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Agence slovène de recherche et d’innovation (ARIS) [projet numéro P3-0327].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5 mm FEP tube linerSP Wilmad-LabGlass4682701Insert intérieur pour NMR coaxial
5 mm NMR tubeSP Wilmad-LabGlass535-PP-7-SBTube extérieur
6-well culture plateOosafeOOPW-SW02Plat de culture d'embryons
Cryogenic liquid nitrogenMesserContacter le fabricantCongélation rapide des échantillons
Deuterium oxide (D2O)EurisotopD214LSolvant pour RMN
Micropipette (10–100 µL)Eppendorf4924000053Pipette à volume réglable
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL, RNase-freeEppendorfN216966NCollecte et stockage d'échantillons
Mineral oilVitrolifeVTL-10029Surimpression goutte de culture
NMR spectrometer, 600 MHzBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.htmlAcquisition spectrale
Pasteur pipetteFalconFAL-357575Transfert de goutte
Pipette, single-channel mechanicalSartorius728060Manipulation d'échantillons
Pipette tips, sterileEppendorf22491148Compatible avec la micropipette
Pipette tips, sterile filterSartorius790201FBarrière anti-aérosol
Sequential G-series culture mediaVitrolifeVTL-10143Milieu de culture d'embryons
TMSP-d4 (sodium 3-trimethylsilylpropionate-d4)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-48-1Référence de déplacement chimique
Tubes, Safe-LockEppendorf0030121589Tubes de stockage

Références

  1. Seli E, Botros L, Sakkas D, Burns DH. Non-invasive metabolomic profiling of embryo culture media using proton nuclear magnetic resonance correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril. 2008;90(6):2183-2189.
  2. Vergouw CG et al. Metabolomic profiling by near-infrared spectroscopy as a tool to assess embryo viability: a novel, non-invasive method for embryo selection. Hum Reprod. 2008;23(7):1499-1504.
  3. Eldarov C et al. LC-MS analysis revealed significantly different metabolic profiles in spent culture media of human embryos with distinct morphology, karyotype and implantation outcomes. Int J Mol Sci. 2022;23(5):2706.
  4. Simopoulou M et al. Editorial: The role of metabolomics in ART: from diagnosis to treatment. Front Endocrinol (Lausanne). 2025;16:1558561.
  5. Gardner DK et al. Human and mouse embryonic development, metabolism and gene expression are altered by an ammonium gradient in vitro. Reproduction. 2013;146:49-61.
  6. Sturmey RG, Hawkhead JA, Barker EA, Leese HJ. DNA damage and metabolic activity in the preimplantation embryo. Hum Reprod. 2009;24:81-91.
  7. Sturmey RG, Brison DR, Leese HJ. Assessing embryo viability by measurement of amino acid turnover. Reprod Biomed Online. 2008;17:27-33.
  8. Nadal-Desbarats L et al. Is NMR metabolic profiling of spent embryo culture media useful to assist in vitro human embryo selection? Magn Reson Mater Phy. 2013;26:193-202.
  9. Wallace M et al. 1H NMR-based metabolic profiling of Day 2 spent embryo media correlates with implantation potential. J Assist Reprod Genet. 2014;31:58-63.
  10. Salmerón AM et al. Solution NMR in human embryo culture media as an option for assessment of embryo implantation potential. NMR Biomed. 2021;34:e4536.
  11. Kirkegaard K et al. NMR metabolomic profiling of Day 3 and 5 embryo culture medium does not predict pregnancy outcome in good prognosis patients. Hum Reprod. 2014;29(11):2413-2420.
  12. Otsuki J, Nagai Y, Chiba K. Damage of embryo development caused by peroxidized mineral oil and its association with albumin in culture. Fertil Steril. 2009;91(5):1745-1749.
  13. Martinez CA et al. The overlaying oil type influences in vitro embryo production: differences in composition and compound transfer into incubation medium between oils. Sci Rep. 2017;7:10505.
  14. Beckonert O et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2007;2:2692-2703.
  15. Helmus JJ, Jaroniec CP. Nmrglue: an open-source Python package for the analysis of multidimensional NMR data. J Biomol NMR. 2013;55:355-367.
  16. Siristatidis C et al. Why has metabolomics so far not managed to efficiently contribute to the improvement of assisted reproduction outcomes? Diagnostics (Basel). 2021;11(9):1602.
  17. Miao SB et al. Glutamine as a potential non-invasive biomarker for human embryo selection. Reprod Sci. 2022;29(6):1721-1729.
  18. Ferrick L, Lee YSL, Gardner DK. Metabolic activity of human blastocysts correlates with their morphokinetics, morphological grade, KIDScore and artificial intelligence ranking. Hum Reprod. 2020;35(9):2004-2016.
  19. Boyama BA et al. Homocysteine in embryo culture media as a predictor of pregnancy outcome in assisted reproductive technology. Gynecol Endocrinol. 2016;32(3):193-195.
  20. Yazdani A, Halvaei I, Boniface C, Esfandiari N. Effect of cytoplasmic fragmentation on embryo development, quality, and pregnancy outcome: a systematic review of the literature. Reprod Biol Endocrinol. 2024;22:1-40.
  21. Scott R et al. Non-invasive metabolomic profiling of human embryo culture media using Raman spectroscopy predicts embryonic reproductive potential: a prospective blinded pilot study. Fertil Steril. 2008;90:77-83.
  22. Vergouw CG et al. Day 3 embryo selection by metabolomic profiling of culture medium with near-infrared spectroscopy as an adjunct to morphology: a randomized controlled trial. Hum Reprod. 2012;27(8):2304-2311.
  23. Figoli CB et al. A robust metabolomics approach for the evaluation of human embryos from in vitro fertilization. Sci Rep. 2024;14(1):17447.
  24. Olcay IO et al. Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo aneuploidy. Gynecol Endocrinol. 2022;38(8):461-466.
  25. Tesarik J. Non-invasive biomarkers of human embryo developmental potential. Int J Mol Sci. 2025;26(10):4928.
  26. Alizadeh Moghadam Masouleh A et al. Embryo metabolism as a novel non-invasive preimplantation test: nutrients turn over and metabolomic analysis of human spent embryo culture media (SECM). Hum Reprod Update. 2025;31(5):405-444.
  27. Hajnajafi K, Iqbal MA. Mass-spectrometry based metabolomics: an overview of workflows, strategies, data analysis and applications. Proteome Sci. 2025;23:5.
  28. Emwas AH et al. NMR spectroscopy for metabolomics research. Metabolites. 2019;9(7):123.
  29. Giera M, Yanes O, Siuzdak G. Metabolite discovery: biochemistry's scientific driver. Cell Metab. 2022;34(1):21-34.
  30. Lippi G et al. Influence of hemolysis on routine clinical chemistry testing. Clin Chem Lab Med. 2006;44:311-316.
  31. An Z, Shi C, Li P, Liu L. Stability of amino acids and related amines in human serum under different preprocessing and pre-storage conditions based on iTRAQ®-LC-MS/MS. Biol Open. 2021;10(2):bio055020.
  32. Fomenko MV, Yanshole LV, Tsentalovich YP. Stability of metabolomic content during sample preparation: blood and brain tissues. Metabolites. 2022;12(9):811.
  33. Wishart DS et al. HMDB 5.0: The Human Metabolome Database for 2022. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D622-D631.

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