Évaluation en temps réel et non invasive de la fonction mitochondriale à l’aide de la spectroscopie Raman par résonance

Résumé

Nous présentons une méthode non invasive et en temps réel pour surveiller la santé mitochondriale à l’aide de la spectroscopie Raman par résonance (RRS). Nous avons utilisé le RRS pour quantifier les états redox mitochondriaux et développé une métrique de la santé mitochondriale, le rapport mitochondrial réduit par résonance Raman (3RMR), qui montre une réponse plus rapide aux variations d’oxygénation que les analytes hémato-gaz traditionnels.

Résumé

Bien que les mitochondries soient au cœur de la pathogenèse et de la progression de la maladie, la compréhension mécanistique de la dynamique de la santé mitochondriale reste coûteuse et inaccessible. Pour combler cette lacune, cette étude utilise la spectroscopie Raman par résonance (RRS) pour évaluer la fonction mitochondriale, en utilisant un système portable qui fournit des mesures en temps réel, non invasives et quantitatives des états rédox du cytochrome mitochondrial dans le foie de rat. Dans ce protocole, nous démontrons l’utilisation de cette technologie, y compris la configuration, l’acquisition et le traitement des données. Cette étude présente une expérience de preuve de concept qui met en lumière la capacité du RRS à mesurer en temps réel les changements de l’état redox mitochondrial – et, par extension, de la fonction mitochondriale. En un court instant, le dispositif RRS était connecté à une pompe laser ainsi qu’à un ordinateur d’acquisition de données et placé à 1 cm du foie du rat.  Les paramètres d’acquisition ont été sélectionnés conformément au protocole du foie du rat ; Les états redox ont été mesurés dans des conditions oxygénées et ischémiques à l’aide d’un test de stress oxygène. Les changements dans les états redox mitochondriaux ont été suivis tout au long du test de stress oxygéné.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle crucial dans la fonction cellulaire et l’homéostasie. Les mitochondries sont les principaux moteurs du métabolisme cellulaire, régulant la génération d’ATP via la phosphorylation oxydatif. Ils servent également d’organites signaleurs qui dictent le destin cellulaire en régulant les voies apoptotiques, ainsi que ROS et Ca⁺2 pour^{signaler 1}. Ainsi, un dysfonctionnement mitochondrial peut entraîner diverses maladies neurodégénératives, musculaires et^{cardiovasculaires 2,3}. Malgré le rôle crucial que jouent les mitochondries dans la progression de la maladie, évaluer la fonction mitochondriale peut être invasif, coûteux et limité.

Les indicateurs clés de la fonction mitochondriale, tels que le taux de consommation d’oxygène, la phosphorylation oxydative et l’activité de divers complexes au sein de la chaîne de transport électronique (ETC), sont mesurés par respirométrie. L’ETC est composé de quatre complexes (I–IV) intégrés dans la membrane mitochondriale interne (IMM). Ces complexes, à l’aide d’autres co-enzymes, transfèrent les électrons de substrats réduits, tels que le NADH et le FADH2, vers l’accepteur final d’électrons,_O2, qui est ensuite réduit en eau. La plupart des tests respirométriques contemporains, tels que le Seahorse et l’Orobros O2k, nécessitent un traitement tissulaire, limitant ainsi leur application à la recherche^{translationnelle 4,5}. La mesure du potentiel de membrane mitochondriale (MMP) est une autre méthode d’évaluation du dysfonctionnement mitochondrial, qui utilise des fluorophores lipophiles cationiques, tels que JC-1, ainsi que l’imagerie microscopique, où mitochondries couplées (saines) et non découplées (endommagées) fluorescent avec différentes longueurs^{d’onde 6}. Cependant, ces tests peuvent avoir une faible^{sensibilité 5}. Le colorant lui-même peut également présenter une cytotoxicité élevée à de fortes^{concentrations 5}. Enfin, à l’instar des mesures respirométriques, cette technique nécessite également un traitement tissulaire. Les techniques basées sur la spectroscopie ont récemment été utilisées comme méthodes non invasives d’évaluation de la santé mitochondriale. Par exemple, la spectroscopie par résonance magnétique du phosphore (P-MRS), une méthode qui évalue le métabolisme cellulaire en mesurant les concentrations de métabolites contenant du phosphore, a été utilisée pour caractériser des tissus adipogéniques modifiés en^{différenciation 7}. Cependant, cette technique nécessite également un équipement spécialisé et une formation spécialisée.

Notre groupe a récemment démontré une technique en temps réel, non invasive et très spécifique pour mesurer l’état redox mitochondrial comme marqueur de viabilité organique à l’aide de la spectroscopie Raman par résonance (RRS). Le RRS utilise la diffusion inélastique des photons pour quantifier les états redox des cytochromes mitochondriaux. Les anneaux porphyrinos dans des moitiés héminique de molécules telles que les cytochromes mitochondriaux, l’hémoglobine et la myoglobine produisent un spectre Raman caractéristique selon leur état d’oxydation lorsqu’ils sont excités par un laser⁸ à 441 nm de longueur d’onde. Bien que le système RRS utilise une longueur d’onde de 441 nm, des lasers de 420 nm et 405 nm peuvent également être utilisés, chacun améliorant préférentiellement un complexe de cytochrome différent. Le spectre obtenu à partir d’un échantillon d’intérêt inconnu est croisé avec des bibliothèques préenregistrées de mitochondries intactes entièrement oxydées ou réduites, ce qui donne le rapport entre les mitochondries réduites et totales ou l’état redox moyen des cytochromes ETC in situ . Ce rapport est défini comme le rapport mitochondrial réduit par résonance Raman (3RMR).

Il existe 3 calculs/types distincts de 3RMR : 3RMR mitochondriale (mito-3RMR), 3RMR complexe III (cIII-3RMR) et complexe IV 3RMR (cIV-3RMR). Chacun de ces indices est calculé par la fraction de réduite au nombre total d’une composante donnée. Par exemple, la 3RMR de cIII serait le rapport entre la réduction de cIII et le nombre total de cIII dans le tissu (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Le même schéma s’applique au cIV. Ainsi, 3RMR-cIII désignerait le rapport entre la réduction de cIII et la quantité totale de cIII, et 3RMR-cIV désignerait le rapport entre la réduction de cIV et la quantité totale de cIV. Par analyse de régression, soit les états redox mitochondriaux (mito-3RMR) sont calculés à l’aide de bibliothèques spectrales de mitochondries intactes, soit les états redox complexes individuels (cIII-3RMR et cIV-3RMR) sont calculés à l’aide de bibliothèques spectrales cIII et cIV. Une publication^{récente 9} a démontré que le mito-3RMR est représentatif de la moyenne pondérée des états redox cIII et cIV (ou cIII-3RMR et cIV-3RMR). Il est important de noter que cI et cII ne sont pas actifs en Raman ni amplifiés par résonance à travers la longueur d’onde de 441 nm. Par conséquent, ils ne sont pas calculés lors du calcul du mito-3RMR.

En tirant parti de ces types de 3RMR, nous avons défini la plage optimale de la 3RMR. Dans les organes « sains », les mitochondries sont intactes et disposent d’un apport suffisant en oxygène. En revanche, les organes endommagés peuvent avoir une livraison ou une utilisation insuffisante de l’oxygène, ce qui entraîne l’accumulation d’électrons par les complexes ETC. L’accumulation d’électrons provoque un « stress réducteur », déplaçant les mitochondries de l’état oxydé à l’état réduit et augmentant les valeurs de 3RMR. Plusieurs études ^8,9,10,11,12, portant sur les cœurs et le foie chez des modèles de rongeurs et porcins, ont commencé à éclairer la plage optimale « saine » pour la 3RMR, qui est proposée entre 10 et 30. Par exemple, Perry et al. ont soumis des cœurs de mammifères à l’hypoxie, où un 3RMR de 30 % a montré l’équilibre optimal entre sensibilité et spécificité afin de détecter le^{tissu hypoxique 8}. Cette tendance a été confirmée par d’autres études portant sur les tissus^{cardiaques 11,12} et les greffes hépatiques¹⁰. De plus, Nyugen et ^al.9 ont démontré que les valeurs de 3RMR tombent à des valeurs très basses (oxydées) pour les tissus dont le métabolisme s’est arrêté, avec des niveaux de 3RMR (7,667 ±± 4,926) de foies tiède-ischémiques non transplantables après 3 heures de perfusion normothermique machine, contre 3RMR supérieures à 10 (~12–15) pour des foies chauds-ischémiques frais et^{transplantables 9}.

Au-delà de ces démonstrations de la manière dont le 3RMR peut mesurer la viabilité tissulaire, la sensibilité, la spécificité et la facilité d’utilisation du RRS le rendent très pertinent à de nombreux autres types de recherche où le métabolisme cellulaire et la fonction mitochondriale sont affectés. Dans des études antérieures, le RRS a été utilisé pour détecter la dégénérescence maculaire et le glaucome chez la souris en évaluant l’activité métabolique des axones non myélinisés des cellules ganglionnaires rétiniennes au niveau du nerf^{optique 13}. De plus, il a été utilisé pour détecter la coarctation de l’aorte (CoA) dans un modèle rat de cardiopathie congénitale, un diagnostic souvent manqué lors des dépistages cardiaques^néonatals. Cette technologie a été exploitée pour comprendre la fonction et la viabilité des organes dans diverses conditions expérimentales pertinentes dans le domaine de la transplantation d’organes, y compris des études évaluant la viabilité des organes sur la perfusion machine^{ex vivo 10,11}, évaluant la réoxygénation post-stockage statique^{au froid 14}, ou atténuant la lésion de reperfusion du foie tiède-ischémique⁹.

Cet article cherche à établir le SRR comme un outil sensible et en temps réel pour évaluer la santé mitochondriale. Des foies entiers d’un modèle de rat ont été soumis à différents niveaux d’ischémie et de reperfusion d’oxygène comme test d’effort pour évaluer la réponse mitochondriale. Dans ce test d’effort oxygène, les foies frais sont soumis à 5 minutes de perfusion initiale, 5 minutes d’ischémie et 5 minutes de réperfusion. 3RMR, ainsi que des mesures de lactate, K+ et pression partielle d’oxygène (pO2), ont été prises tout au long du test d’effort. Une réponse plus rapide aux changements d’oxygénation a été observée avec la 3RMR comparée aux analytes sanguins traditionnels. Grâce à ces expériences, l’utilisation du SRR est mise en avant non seulement pour les études mécanistiques, mais aussi comme méthode diagnostique ainsi que banc d’essai thérapeutique. Ainsi, le protocole partagé peut être utile à divers chercheurs travaillant avec les mitochondries. Dans l’ensemble, le RRS, avec sa nature non invasive, en temps réel et très spécifique, pourrait avoir un impact substantiel sur le métabolisme cellulaire.

Protocole

Tous les animaux pour les expériences ont été maintenus conformément aux directives du Conseil national de la recherche et ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) à l’hôpital général du Massachusetts (Boston, MA, États-Unis).

1. Mise en place et utilisation des RRS

1. Description de l’appareil :
   REMARQUE : Le système RRS portable (Pendar Technologies ; le produit est uniquement destiné à la recherche) utilise un laser 441 nm grâce à une amélioration résonante du spectre Raman des cytochromes mitochondriaux avec cette longueur d’onde. Le laser fonctionne entre 4 mW et 8 mW.
   1. Connectez une source d’excitation laser à une sonde sur mesure via un câble à fibre optique. La sonde éclaire un point laser de 2 mm de diamètre sur le tissu, tout en collectant le spectre émis. Le spectre passe ensuite à travers un filtre passe-bande et est collecté par un réseau de dispositifs à couplage de charge (CCD). Le spectre est collecté toutes les secondes sur une période de 180 secondes et moyenné pour créer un spectre brut, réduit au bruit, pour analyse.
   2. Le logiciel compare ce spectre obtenu à des bibliothèques spectrales pré-mesurées via une analyse de régression.
2. Procédure pour les bibliothèques de pré-enregistrement
   REMARQUE : Pour les expériences présentées dans cet article, des formes réduites et oxydées de mitochondries, de complexes III et complexes IV, d’hémoglobine et de myoglobine ont été créées et utilisées. Les signaux RRS de toutes les bibliothèques étaient captés dans une boîte noire à température ambiante (21 °C). Ces fichiers de bibliothèque sont fournis séparément avec le logiciel d’analyse. Cependant, selon le tissu d’intérêt et la présence d’autres molécules actives sur Raman, d’autres bibliothèques pourraient également être créées en adaptant adéquatement le protocole suivant. Les spectres RRS bruts des bibliothèques d’hémoglobine, de myoglobine et de complexes III/IV oxydé/réduits sont fournis dans Figure supplémentaire 1.
   1. Bibliothèques d’hémoglobine (Figure supplémentaire 1C) :
      1. Collectez du sang frais de rongeur par exsanguination animale. Oxygénez le sang collecté à 100 % d’oxygène, ou désoxygénez-le à 100 % d’azote, dans une cuvette en verre, en ajoutant du dithionate de sodium.
      2. Mesurez les RRS de chaque état à travers la paroi de la cuvette en verre pendant 10 minutes, avec la sonde RRS positionnée à 9 mm de la cuvette en verre.
      3. Utilisez des pics spectraux à 1356 ^cm-1 pour vérifier l’état désoxygéné, et des pics à 1376 ^cm-1 pour confirmer l’état oxygéné.
   2. Bibliothèques mitochondriales réduites/oxydées (Figure 1)
      1. Isoler les mitochondries des cœurs de rongeurs homogénéisés et purifiés dans une cuvette en verre. Placez la sonde Raman à 9 mm de la cuvette en verre et mesurez les spectres de ces mitochondries à travers la paroi de verre.
      2. Créez des conditions entièrement oxydées en fournissant un flux d’oxygène à 100 % vers les mitochondries. Vérifier l’état oxydé en l’absence du pic RR réduit à 1357 ^cm-1.
      3. Créer des conditions entièrement réduites en exposant les mitochondries à 100 % d’azote avec de petites quantités de sulfure d’hydrogène. Vérifier les conditions réduites en l’absence de pic du marqueur RR oxydé à 1371 ^cm-1.
   3. Complexe oxydé/réduit III/IV (Figure supplémentaire 1A,B) :
      1. Isoler les complexes III et IV comme décrit ailleurs 9,15,16,17. En résumé, utilisez un échantillon stock de mitochondries isolées (correspondant à 200 nanomoles de cytochrome a) comme matériau de départ.
      2. Diluez les mitochondries à 10 nmol de cytochrome A/mL dans un tampon C glacé (50 mM Tris, 1 mM MgSO_4, pH 8,45). Ensuite, ajoutez 10 % de n-β-D-dodécyl maltoside (DM) goutte par goutte jusqu’à une concentration finale de 1 %, tout en mélangeant doucement sur de la glace.
      3. Centrifugez l’extrait à 40 000 × g pendant 40 minutes à 4 °C. Appliquez le surnageant sur une colonne en verre de 2,5 cm × 20 cm qui a été précédemment remplie d’une résine d’échange équilibrée avec 5 volumes de colonnes de tampon C (contenant 0,02 % de mo/v de mo).
      4. Après avoir lavé avec 2 volumes de colonnes de tampon C, éluvez les complexes mitochondriaux en appliquant un gradient linéaire de 0–400 mM NaCl dans le même tampon et collectez l’élute en fractions de 4 mL.
      5. Les fractions vertes contenant le complexe IV éluaient près du milieu du gradient (~180 mL NaCl), avant les fractions rougeâtres contenant le complexe III. Concentrez les fractions groupées contenant chaque complexe à 20 à 30 nmoles de cytochrome a/mL.
      6. Une fois les complexes individuels isolés, exposez-les à des conditions oxydantes et réductrices. Réduire un échantillon de 11 mM de complexe III dans le tampon Tris à l’aide de 2 mL d’ascorbate (1 M) pour réduire le cytochrome c1 et 2 mL de HS (hydrosulfite) afin de réduire complètement les cytochromes b_L et b_H.
      7. Réduire un échantillon de 18,67 mM de tampon Complexe IV dans Tris en plusieurs étapes, puisque le Complexe IV subit un processus d’oxydation catalytique en plusieurs étapes. Pour réduire complètement le Complexe IV, ajoutez deux doses de 2 mL de_H2O₂ (10 mM), suivies de 2 mL de HS.
      8. Collectez les spectres de bibliothèque après chaque addition pour capturer chaque étape du cycle. Ajouter des spectres entièrement oxydés et réduits à la bibliothèque de référence finale pour représenter les états stationnaires du complexe IV.
      9. Préparez tous les échantillons dans un flacon en verre de 1 mL, maintenez-les en position fixe à 9 mm de la lentille de la sonde et enfermez-les dans une boîte noire pour éviter toute contamination lumineuse. Collectez les spectres RRS pendant 600 s pour chaque complexe et état d’oxydation.
      10. Valider la pureté des cIII et cIV isolés comme décrit précédemment¹⁷, et valider l’adéquation des bibliothèques spectrales isolées de cIII et cIV pour expliquer l’ensemble des spectres mitochondriaux tels que décrit dans un article^{récent 9}.
   4. Bibliothèques de myoglobine (Figure supplémentaire 1D) :
      1. En utilisant des flux similaires d’oxygène et d’azote (avec dithionite de sodium dissous), la saturation en oxymyoglobine de l’extrait de myoglobine myocarde varie entre 0 % et 100 %. Vérifiez les spectres Raman à l’aide de pics de marqueurs à 1355 ^cm-1 et 1376 ^cm-1.

REMARQUE : La plupart des composants spectraux décrits ci-dessus, comme l’hémoglobine ou les mitochondries oxydées/réduites, sont des molécules contenant de l’hème et sont excitées par la même longueur d’onde. Ce système RRS évite le chevauchement des signaux en créant une bibliothèque de régression pour chaque molécule basée sur son signal spectral unique. Les spectres diffusés obtenus sont utilisés par un algorithme de régression sur les bibliothèques sélectionnées. L’algorithme de régression fournit un facteur pour chaque spectre de bibliothèque qui représente l’estimation la mieux ajustée de sa contribution relative dans le spectre enregistré, et donc de sa concentration relative dans le tissu. Parce que l’algorithme utilise le meilleur ajustement sur une plage de nombres d’ondes, de petites différences dans la position ou l’intensité des pics spectraux des différentes composantes de la bibliothèque permettent à la régression de discerner même des chromophores étroitement apparentés. Grâce à l’algorithme de régression et aux bibliothèques spectrales, le système RRS peut décomposer le signal diffusé total en différentes composantes selon leurs pics spectraux uniques, évitant ainsi le chevauchement du signal provenant des molécules contenant des hémes. Pour montrer la relation entre l’hémoglobine et les mitochondries, la Figure 2 supplémentaire est incluse, qui fournit des images de spectres prélevés à partir d’une perfusion hépatique, décomposés en le signal mesuré, la ligne de meilleur ajustement, et le résidu inexpliqué résultant des différences dans les pics spectraux individuels. Dans le panel A, les bibliothèques de régression des mitochondries réduites et oxydées et réduites et oxydées sont sélectionnées. La ligne de meilleur ajustement sélectionnée à travers les bibliothèques et l’analyse de régression chevauche habilement le signal mesuré, et il y a peu de résidus inexpliqués. Dans le panneau B, seules les bibliothèques de mitochondries oxydées et réduites sont sélectionnées. Comme il existe une grande structure résiduelle inexpliquée, le pic spectral mitochondrial est décalé de plusieurs nombres d’onde par rapport à celui de l’hémoglobine, qui n’avait pas été inclus dans l’analyse de régression. De plus, dans les figures complémentaires de Nguyen et ^al.9, les auteurs expliquent la relation entre les mitochondries et les complexes individuels (cIII et cIV), ainsi que la relation entre les complexes^{individuels 16}, où le complexe III présente des pics plus nets et de fréquence plus basse, tandis que le complexe IV présente des bandes plus larges et déplacées vers le haut. De plus, les auteurs montrent que les bibliothèques réduites des complexes III et IV expliquent pleinement le spectre mesuré des mitochondries entières réduites, ce qui donne un résiduel inexpliqué minimal.

Figure 1 : Bibliothèques spectrales de mitochondries entièrement oxydées et réduites. Les spectres de bibliothèque RRS ont été obtenus après que les mitochondries isolées aient reçu (A) 100 % d’oxygène, ou 100 % d’azote (B) pour atteindre respectivement les états oxydé et réduit. Ces états ont été confirmés par la présence de pics oxygénés RR (C) et de pics de marqueurs (D) réduits. Le décalage de ces pics correspond à des modifications des modes vibrationnels moléculaires en présence d’oxygène. L’intensité de chaque pic est normalisée à 1 unité d’intensité arbitraire (UA), car l’amélioration de l’état réduit est plus importante grâce à cette longueur d’onde d’excitation de 441 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

2. Collecte de données via RRS

1. Configuration de l’appareil :
   1. Connectez l’unité spectrométrique (logée dans une boîte compacte) à l’alimentation en courant continu (DC) et à l’adaptateur secteur via les câbles fournis. L’unité spectrométrique possède un bouchon rond avec des indentations d’alignement.
   2. Alignez les creux de la fiche ronde avec ceux du câble qui est connecté à l’adaptateur secteur. Aucun nettoyage n’est nécessaire avant la connexion des ports (Figure 2).
   3. Connectez l’ordinateur qui effectue l’analyse au même adaptateur secteur qui relie le spectromètre et l’alimentation via les câbles fournis.
   4. Placez la sonde laser dans le porte-sonde. Ajustez la position de cette sonde au début de l’expérience.
   5. Ouvrez le logiciel de contrôle du spectromètre (Cellular Energetics Software).
2. Configuration logicielle :
   REMARQUE : Des fichiers de réglage et des bibliothèques de régression pour différents types de tissus sont fournis avec le système. Ces fichiers incluent des informations sur les bibliothèques que le système RRS doit inclure dans la régression, le nombre de spectres inclus dans la fenêtre de régression, ainsi que d’autres paramètres tels que la puissance du laser. Les paramètres par défaut peuvent être modifiés et un nouveau fichier de paramètres enregistré pour une utilisation dans de futures expériences. Les captures d’écran du logiciel détaillées ci-dessous sont présentées dans la Figure 3 supplémentaire.
   1. À l’ouverture du logiciel de contrôle du spectromètre, un graphique affichant le pourcentage de 3RMR, la saturation en oxygène (_{StO 2}) et la saturation en myoglobine apparaît. Cet écran est l’endroit où ces indicateurs seront affichés, si sélectionnés, en temps réel tout au long des mesures. Cliquez sur l’onglet Paramètres en bas à gauche de la page.
   2. Dans l’onglet Infos , saisissez les informations de la session sous Nom de la session, ainsi que les détails nécessaires dans l’onglet Description de la session .
   3. Il existe deux modes de collecte de données. Utilisez le mode Spot Check pour accumuler des spectres jusqu’à ce que les métriques de qualité spécifiées soient atteintes (par exemple, sigma cible ou fenêtre/nombre de spectres de régression), puis arrêtez l’enregistrement. Utilisez le mode continu pour enregistrer les spectres jusqu’à ce que le bouton d’arrêt soit pressé. Dans les deux modes, toutes les données, résultats 3RMR et spectres individuels, sont stockées automatiquement. Cette expérience utilise le mode continu.
   4. Une fois toutes les informations de session saisies, cliquez sur l’onglet Système .
   5. Dans Fichier de paramètres, sélectionnez le protocole approprié pour le projet (pour les perfusions acellulaires du foie de rat, choisissez le protocole acellulaire du foie de rat). Cela ajustera automatiquement le type de mesure, la durée moyenne de mesure (fenêtre de régression), ainsi que le sigma cible.
      1. Pour créer un nouveau fichier de paramètres, ajustez l’un des composants listés ci-dessus, puis cliquez sur le bouton Enregistrer . Cela devrait enregistrer ces paramètres sous forme de fichier de paramètres séparé qui pourra ensuite être importé dans le système.
      2. Pour importer un nouveau fichier de paramètres, cliquez sur le menu déroulant à côté de Default (Mod) et sélectionnez Importer un nouveau fichier de paramètres. Cliquez sur le nouveau fichier Paramètres pour être importé.
   6. Dans la section Bibliothèques de régression, sélectionnez et confirmez la combinaison de bibliothèques à utiliser pour l’acquisition et l’analyse des données. Les bibliothèques pour les mitochondries réduites et oxydées [Mito uniquement] ont été sélectionnées pour cette expérience. D’autres utilisateurs peuvent choisir d’utiliser des bibliothèques incluant également l’hémoglobine, la myoglobine ou d’autres complexes trouvés dans la bibliothèque avancée.
   7. Sélectionnez et confirmez le mode de largeur de fenêtre préféré.
      1. Mode largeur adaptative : Utilisez le mode largeur adaptative pour ajouter des spectres individuels au spectre moyen jusqu’à atteindre la cible sigma maximale. Si la cible sigma n’est pas atteinte, l’enregistrement s’arrêtera lorsqu’il atteindra la limite supérieure de la fenêtre de régression définie (c’est-à-dire le nombre maximal de spectres qu’il a été désigné à enregistrer). Les résultats de la mesure seront affichés à l’écran après avoir atteint la cible sigma minimale.
      2. Mode de largeur fixe : Utilisez le mode de largeur fixe pour ajouter des spectres individuels au spectre moyen jusqu’à ce que le nombre cible de spectres soit inclus (placé sous la longueur moyenne).
   8. Une fois les paramètres système terminés, cliquez sur l’onglet Plot .
   9. Dans la section Série principale, sélectionnez les composants à tracer et à afficher à l’écran pendant les mesures.
   10. Confirmez que tous les composants de mesure sélectionnés sont conformes au protocole d’intérêt.
3. Acquisition de données :
   REMARQUE : Les mesures Raman doivent être prises dans un espace sombre. Avant de commencer la collecte des données, assurez-vous que l’espace de travail est aussi protégé que possible de la lumière. Si la pièce ne peut pas être entièrement protégée de la lumière, le système RRS est livré avec un couvercle noir avec une ouverture rectangulaire au centre (illustré dans Figure 2), à travers laquelle la sonde laser peut être placée. La boîte peut couvrir l’échantillon/la section de l’organe d’où sont prises les mesures RRS. Lorsque vous utilisez le laser RRS, évitez une exposition directe ou prolongée des yeux. Ne pointez pas un laser directement dans l’œil ou sur des surfaces réfléchissantes. N’activez le laser que lorsqu’il est positionné directement sur le tissu d’intérêt. Le laser RRS est un laser de classe 3R lorsqu’il est utilisé à 4 mW, et de classe 3B lorsqu’il est utilisé à 10 mW. Le laser est sans danger pour le contact tissulaire.
   1. Sélectionnez les paramètres préenregistrés, paramètres d’enregistrement et fichiers de bibliothèque appropriés.
   2. Placez la sonde laser directement au-dessus du tissu/organe d’intérêt. Placez la sonde aussi perpendiculaire que possible et à 1 cm du tissu. Utilisez une règle pour mesurer précisément 1 cm de la surface de l’orgue. Ajustez la sonde pour qu’elle soit positionnée à moins de 1 cm si le signal n’est pas clair. Cependant, assurez-vous que la sonde ne touche jamais le tissu.
      REMARQUE : La sonde peut être tenue à la main, mais il est recommandé d’utiliser un support ou un support ajustable qui reste stable. Placez la sonde aussi perpendiculaire que possible et à 1 cm du tissu. Une règle pouvait être utilisée pour mesurer avec précision 1 cm de la surface de l’orgue. La sonde pouvait être ajustée pour être positionnée à moins de 1 cm si le signal n’était pas clair. Cependant, la sonde ne doit jamais toucher le tissu.
   3. Confirmez que le point laser est sur le lobe latéral gauche, aussi près que possible de la veine porte.
   4. Confirmez que toutes les bibliothèques sélectionnées, les paramètres de régression, le sigma cible, la fenêtre de régression et les modes d’acquisition sont corrects et souhaités.
      1. Assurez-vous que la pièce soit aussi sombre que possible. Vérifiez que la sonde ne contient aucune contamination, surtout du sang, sur la fenêtre. En cas de contamination, utilisez une lingette sans peluches, non abrasive, contenant de l’alcool isopropylique à 70 % pour nettoyer la fenêtre en quartz, suivie d’un séchage approfondi avec une lingette sèche avant de procéder.
      2. En cas de contamination importante, essuyez la sonde aussi soigneusement que possible, comme décrit ci-dessus. Ensuite, calibrez l’appareil en plaçant le laser dans un boîtier sombre doublé de ruban noir et en appuyant sur le bouton Take Dark . La calibration prend environ 5 à 10 minutes. Quelle que soit la contamination, calibrez l’appareil une fois par mois, et il enverra des messages de rappel automatiques.
         REMARQUE : Les explications de chaque mesure de contrôle qualité, des exemples de telles métriques QC, et le signal spectral brut obtenu à partir d’enregistrements optimaux et sous-optimaux (Fichier supplémentaire 1, Figure 3, Figure 3 supplémentaire). Ces critères de contrôle qualité ont été optimisés pour le foie entier à partir du modèle du rat. Tout protocole nouvellement développé utilisant un autre organe/modèle animal devrait affiner et ajuster ces indicateurs en conséquence.
   5. Sur la page principale, cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer à acquérir des données. Selon les réglages choisis, le logiciel prendra des enregistrements jusqu’à ce que la valeur d’erreur cible (sigma) ou 180 s soit atteinte. L’acquisition des données est désormais terminée.
      1. Déduire la qualité du signal RRS à partir de ces graphiques et de ces valeurs afin de permettre l’ajustement de la position de la sonde ou des conditions de mesure (Figure 3). Si le signal RRS obtenu ne respecte pas ces critères de contrôle qualité, ajustez la sonde pour qu’elle soit aussi perpendiculaire que possible et d’environ 9 mm de la surface à la fenêtre de la sonde.
   6. Une fois le protocole d’acquisition des données / expérimental terminé, jeter tout le foie/tissu dans une boîte à biohazard. Nettoyez tout système ou surface en contact avec l’organe/tissu avec 70 % d’éthanol.
      1. Si vous utilisez un système de perfusion, faites couler de l’eau DI mélangée à un nettoyant enzymatique (7,8 mL dilués dans 1 L d’eau déionisée [DI]), suivie d’eau DI propre.
         REMARQUE : Chaque enregistrement sera enregistré comme un fichier d’analyse séparé sous un nouveau fichier de session. Les résultats pour la 3RMR et la force du signal mitochondrial (r3RMR) sont tracés dans la fenêtre principale. Le spectre brut peut également être affiché. D’autres indicateurs de contrôle qualité, tels que la force résiduelle du signal et la puissance totale du signal, seront affichés sous l’onglet Spectre .
4. Analyse des données :
   1. Une fois l’acquisition des données terminée, cliquez sur le dossier Critiques en bas de l’écran pour ouvrir le fichier expérimental et voir les résultats.
   2. Sinon, ouvrez un fichier texte contenant les résultats. Sélectionnez le fichier de session qui vous intéresse. Un fichier d’analyse contenant toutes les mesures obtenues s’ouvrira. Chaque paramètre et sa valeur sigma auront leur propre colonne. Par exemple, les valeurs de 3RMR obtenues chaque seconde seront listées sous la colonne « 3RMR », et sa valeur sigma sera indiquée sous « sigma_3RMR ».
   3. La dernière ligne de chaque colonne contiendra les valeurs finales pour chaque paramètre de ce fichier de session. Utilisez cette valeur pour tracer.
   4. Répétez les étapes pour chaque fichier de session/chaque enregistrement. Tracez les valeurs obtenues selon le souhait.

Figure 2 : Configuration de l’appareil RRS. Un schéma de la configuration du système RRS. La sonde est reliée par un câble à fibre optique au système RRS, qui contient la source d’excitation laser et le spectromètre. Cette configuration se connecte ensuite à tout ordinateur portable contenant l’application de contrôle du spectromètre pour la collecte et l’analyse des données. L’ordinateur et l’unité spectrométrique sont tous deux connectés à une prise électrique. Les mesures du RRS doivent être prises dans le noir. Si la pièce ne peut pas être entièrement protégée de la lumière, le système RRS est doté d’un couvercle noir avec une ouverture rectangulaire au centre, où la sonde laser peut être placée. La boîte couvre l’échantillon/la section de l’orgue à partir de laquelle les mesures RRS sont prélevées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Exemples de traces et métriques de contrôle qualité de qualité sous-optimale et de qualité optimale. Le signal résiduel (bruit) est marqué par un crochet orange, et le signal mitochondrial par un crochet vert. (A) Exemple de traçage à partir d’un signal Raman sous-optimal. Le signal résiduel est trop important pour être différencié du signal mitochondrial. Les pics spectraux sont indiscernables dans tout le signal mesuré. (B) Exemple de trace à partir d’un signal Raman optimal. Le signal mitochondrial est visiblement plus important et distinct du signal résiduel. Les pics spectraux issus de la mesure obtenue sont distinguables. (C) Métriques de contrôle qualité obtenues à partir de chaque signal. Dans l’ensemble, le signal total obtenu dans la lecture sous-optimale est inférieur à la lecture optimale. Un signal mitochondrial plus important est mesuré dans l’enregistrement optimal par rapport à l’enregistrement sous-optimal, le signal mitochondrial représentant respectivement 17 % et 14 % du signal total. Le signal a été mesuré avec une erreur de 4,3 % dans la lecture optimale, contre une erreur de 18,5 % dans la lecture sous-optimale. De même, le signal résiduel inexpliqué représente 11 % du signal total dans l’enregistrement sous-optimal, tandis qu’il représente 3,6 % dans l’optimal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Évaluation de la santé mitochondriale à l’aide du RRS

REMARQUE : La technologie de spectroscopie Raman par résonance (SRR) a été utilisée pour développer une métrique de viabilité mitochondriale (3RMR) qui indique la viabilité des organes transplantés. Cette étude vise à démontrer comment les changements d’oxygénation – et, par extension, de respiration cellulaire – se reflètent dans les tendances du 3RMR par rapport aux biomarqueurs traditionnels de dommages, tels que le lactate et le K⁺. Un test de stress oxygéné est utilisé ici, où, après 5 minutes de perfusion continue, le flux de perfusion oxygéné est interrompu pendant 5 minutes, puis repris pendant 5 minutes. Des mesures RRS, ainsi que des échantillons de perfusate d’entrée et de sortie, sont prises tout au long du test de force.

1. Approvisionnement hépatique :
   1. Sédater les animaux dans une chambre d’induction en utilisant de l’isoflurane à 3 % à 5 %. Filtrez l’excès de vapeur avec du charbon activé.
   2. Réalisez une hépatectomie complète sur des rats Lewis mâles (150 g). Ligadez les branches de la veine porte. Injectez 50 U d’héparine sodique par la VCI. Cannulez la veine porte avec un cathéter de 16 G pendant l’opération, puis rincez le foie avec 50 mL de solution saline.
   3. Placez les foies obtenus sur de la glace dans une boîte de Petri contenant 30 mL de solution de l’Université du Wisconsin (UW).
2. Installation de la perfusion par machine subnormotherme (SNMP) et mesures de Raman par résonance :
   1. Configurez l’appareil RRS comme décrit précédemment. Configurez le protocole Acellular Rat Liver sur le logiciel de contrôle du spectromètre, qui règle automatiquement le mode largeur sur la largeur adaptative, la longueur moyenne à 180, et la cible sigma à 1,5. Il sélectionne également le 3RMR et la fluorescence comme paramètres de mesure, ainsi que Mito uniquement comme bibliothèque de régression. Réglez le mode acquisition en mode continu.
   2. Mettre en place le système SNMP comme décrit ailleurs¹⁸.
      1. En résumé, assurez-vous que le système de perfusion comprend une chambre de perfusion, une pompe péristaltique, un oxygénateur à membrane et un piège à bulles.
      2. Fournir de l’oxygène avec un mélange atmosphérique (95 %_d’O2 et 5 % de_CO-2) ; Gardez le_{pO 2} entre 400 et 500 mmHg. Surveillez la pression intrahépatique avec un capteur de pression et maintenez-la entre 3 et 5 mmHg. Prélève les échantillons via des ports d’échantillonnage.
   3. Une fois le logiciel et le système de perfusion installés, connectez la canule pénétrant le PV au tube d’entrée de la machine de perfusion. Gardez l’organe, la perfusion et la perfusion à température ambiante (21 °C), sans l’aide d’un bain-marie.
   4. Administrez la perfusion à l’organe via la canule dans la PV en utilisant une pompe péristaltique.
      1. Pour préparer le perfusat, mélangez 500 mL de Williams' Medium sans rouge de phénol avec 5 g d’albumine sérique bovine (BSA), 12 mg de dexaméthasone hydrosoluble, 5 mL de pénicilline-streptomycine, 5 mL de L-glutamine, 2,5 μL d’insuline et 1000 U d’héparine.
      2. Remuez tous les composants sur une plaque de remuage pendant environ 20 minutes, ou jusqu’à ce que tous les composants soient dissous. Augmenter les débits de perfusion à des pressions de rendement de 3 à 5 mmHg.
   5. Ensuite, placez la source laser RRS dans le support de sonde et placez-la à 1 cm au-dessus du plus grand lobe du foie, aussi près que possible du PV. Mettez le flux de perfusion en pause à 5 min (T₅) et reprenez à 10 min (T₁₀). Effectuez le test d’effort à 15 minutes (T₁₅).
   6. Prenez des mesures RRS pendant tout le test de résistance ; prendre des mesures d’entrée et de sortie toutes les 5 minutes, en partant de T₀ (Figure 4). Tracez les valeurs de 3RMR, ainsi que les niveaux de K⁺ à flux extérieur et les niveaux de lactate pour T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (n = 3) (Figure 5).
   7. Calculez le taux de consommation d’oxygène (OCR) à T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ en multipliant la pression partielle d’apport/sortie d’oxygène (_{pO 2}) par le coefficient de solubilité de l’oxygène dans le plasma (0,00314). Tracez l’OCR pour T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (Figure 5).
      REMARQUE : Des traces spectrales Raman par résonance exemplaire dans les états perfusés (T₅), ischémiques (T₁₀) et reperfés (T₁₅) d’un foie sont montrés (Figure 6)

Figure 4 : Schéma représentant l’écoulement expérimental. Une hépatectomie complète a été pratiquée sur des rats Lewis femelles. Le foie extrait a été placé sous perfusion machine subnormotherme et administré en perfusate oxygéné pendant les 5 premières minutes. Le perfusat s’écoule dans le foie par la veine porte et recircule par la pompe péristaltique (flux de perfusion représenté par des flèches bleues). La perfusion oxygénée a été mise en pause pendant 5 minutes à T5 puis reprise encore 5 minutes à T10. Des mesures RMR 3 prises tout au long du test de contrainte (représentées par le laser). Des échantillons de perfusate ont été prélevés à T0, T5, T10 et T15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Résultats

Des foies frais ont été soumis à des périodes d’ischémie et de reperfusion à l’aide d’un test de stress à l’oxygène. Ensuite, les variations en temps réel de la 3RMR ont été comparées tout au long du test de stress au taux de consommation d’oxygène, au lactate de sortie et au potassium obtenus par analyse de perfusate à T₀, T₅, T₁₀, T₁₅. Dans des conditions saines, les valeurs de 3RMR devraient se situer entre 10 % et 30 % (Figure 5A). Comme prévu, les valeurs de 3RMR à T₀ et_{T 5} entrent dans cette fourchette, puisque le foie était continuellement alimenté en perfusate oxygénée entre ces moments (Figure 5A). Cependant, la valeur de 3RMR à la fin de la période ischémique (T₁₀) est hors de la plage optimale (Figure 5A). Cette augmentation indique que les mitochondries passent à leur état réduit, à mesure que les électrons s’accumulent tout au long de la chaîne de transport en raison de la désoxygénation. À T_10, le flux oxygéné reprend ; La période de réperfusion commence. À la fin de la période de réperfusion (T₁₅), les valeurs de 3RMR reviennent à des niveaux optimaux (Figure 5A) lorsque l’activité de l’ETC est rétablie avec la réintroduction de l’oxygène comme accepteur final d’électrons. Ces changements dans le flux d’oxygène sont également visibles dans les spectres bruts. Les spectres RRS bruts à T₀ et_{T 15} présentent des caractéristiques spectrales similaires à celles des mitochondries oxydées (Figure 6A,C), telles qu’un pic de marqueur spectral à 1371 ^cm-1 (Figure 6D,F). De même, les spectres Raman bruts à T₁₀ (Figure 6B) montrent des marqueurs RR réduits, comme un pic de marqueur spectral à 1357 ^cm-1 (Figure 6E). En conclusion, le RRS identifie les variations des états redox mitochondriaux en temps réel, ce qui est démontré à la fois dans le signal spectral brut et comme mesure de la santé mitochondriale (3RMR).

Le RRS peut également calculer des valeurs de 3RMR basées sur les états redox de cIII et cIV. Un schéma similaire a été observé dans les valeurs de 3RMR de cIII et cIV (Figure 5B). À T₀, des valeurs de 3RMR entièrement oxydées pour le cIV, et des valeurs de 3RMR dans la plage optimale pour le cIII ont été observées. Cet équilibre redox entre les complexes est physiologique, car les électrons circulent du cIII au cIV pour être rapidement oxydés. Au début de l’ischémie, une augmentation des niveaux de 3RMR pour chaque complexe a été observée. Pendant la période ischémique, une accumulation d’électrons à travers l’ETC augmente la contrainte réductrice sur cIII et cIV, ce qui augmente par conséquent cIII-3RMR et cIV-3RMR. Cependant, lors de la réintroduction de l’oxygène, les valeurs de 3RMR des deux complexes redescendent à des niveaux optimaux : cIV entièrement oxydé et cIII physiologiquement réduit (Figure 5B). Les tendances du 3RMR dans les deux complexes montrent que l’arrêt de l’oxygène impacte l’ensemble du ETC, et aucun complexe individuel n’est particulièrement vulnérable à l’ischémie sans écoulement.

En revanche, les changements dans la dynamique d’oxygénation ne se sont pas reflétés dans les biomarqueurs de dommages et les analytes hémato-gazeux obtenus par analyse de perfusate. Au début de l’ischémie, le lactate et le K⁺ devraient augmenter, car la cellule commence à dépendre de la respiration aérobie, puis se dégrade lentement pour libérer du K⁺ intercellulaire. Nous nous attendons également à ce que la TOC diminue, car les cellules ne produisent pas assez d’énergie pour poursuivre la respiration cellulaire. Même après une période d’ischémie sans débit, les taux de consommation d’oxygène ne montraient aucun signe de dommage. Les niveaux de lactate à l’extérieur et de K⁺ restent relativement constants tout au long du test d’effort, malgré les variations d’oxygénation (Figure 5D–E).

Figure 5 : Modifications du 3RMR et dommages aux biomarqueurs tout au long du test de stress oxygène. Le début de l’ischémie et les périodes de reperfusion sont représentés par des lignes pointillées aux minutes 5 et 10, respectivement. De plus, les périodes d’écoulement oxygéné sont représentées par des lignes bleues, et les périodes d’ischémie par des lignes rouges. (A) Valeurs de 3RMR tout au long du test mitochondrial. Les valeurs de 3RMR augmentent lorsque le débit oxygéné est interrompu et redescendent à des niveaux optimaux lorsque le débit est repris. (B) 3RMR des complexes III et IV. L’arrêt de l’écoulement entraîne une réduction des deux complexes. (C) Débit moyen K⁺ de valeurs tout au long du test de résistance. Les valeurs de K⁺ restent constantes tout au long du test de force, malgré des changements dans la dynamique d’oxygénation. (D) Niveaux moyens de lactate à l’extérieur pendant le test d’effort. La production de lactate reste constante tout au long du test d’effort. (E) Taux de consommation d’oxygène à T₀, T₁₀, T₁₅. Puisque les valeurs de_{pO 2} sont des mesures basées sur l’écoulement, OUR n’a pas pu être calculée pour une période d’ischémie sans écoulement. Aucun changement significatif n’a été observé (valeur p : 0,2500) (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Traces spectrales brutes exemplaires d’un foie de rat frais tout au long du test d’effort. Profils spectraux complets d’un foie dans les états (A) oxydés, (B) ischémiques et (C) réperfusés. Le passage du marqueur RR oxygéné au marqueur RR réduit est visible lorsqu’on zoome sur le pic spectral des mitochondries, marqué par une case rouge dans chaque profil spectral. (D–F) Les pics de marqueurs RR oxydés (1371 ^cm-1) sont présents aux états oxydé (D) et (F) reperfusionné et sont marqués par une ligne pointillée rouge. Le pic réduit du marqueur RR (1357 ^cm-1) est présent dans l’état ischémique (E) et est marqué par une ligne bleue pointillée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Traces spectrales du complexe III, complexe IV, hémoglobine et myoglobine réduits et oxydés. (A) C-omplexIII, (B) complexe IV, (C) hémoglobine et (D) myoglobine. L’analyse de régression analyse les spectres collectés par rapport à ces bibliothèques spectrales (si sélectionnées), ce qui donne un facteur pour chaque spectre de bibliothèque qui représente la meilleure estimation de sa contribution relative dans le spectre enregistré et donc de sa concentration relative dans le tissu. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 2 : Exemple d’utilisation de bibliothèques de régression pour décomposer des molécules contenant des hèmes qui se chevauchent (hémoglobine et mitochondries oxydées/réduites). (A) Des traces spectrales brutes issues du tissu hépatique perfusé avec du perfusat cellulaire, avec toutes les bibliothèques de régression nécessaires, telles que l’hémoglobine, l’hémoglobine oxydée, les mitochondries réduites et les mitochondries oxydées, ont été sélectionnées. Il est clair que la ligne de meilleur ajustement, dérivée des bibliothèques et de l’analyse de régression, chevauche proprement le signal mesuré, avec peu de résidus inexpliqués. (B) Trace spectrale brute provenant du même tissu, mais avec seulement des bibliothèques mitochondriales oxydées et réduites sélectionnées. Puisqu’il existe une grande structure résiduelle inexpliquée, il est clair que le pic spectral mitochondrial est décalé de plusieurs nombres d’onde par rapport à celui de l’hémoglobine, qui n’a pas été incluse dans l’analyse de régression. Cette figure montre que le spectromètre haute résolution et l’analyse de régression sur l’ensemble du spectre sont capables de distinguer des spectres étroitement liés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 3 : Capture d’écran du logiciel. (A) Fenêtre principale qui affiche les valeurs de mesure dans le temps. 3RMR, StO2 et toute autre série sélectionnée seront affichées ici pendant la mesure. De plus, la force du signal de chaque série sera affichée sous forme de ligne pointillée sur le graphique, et une valeur en dessous sur le côté droit de l’écran. Par exemple, la ligne solide capturée ici représente le 3RMR d’un tissu, et la ligne pointillée représente le r3RMR (force du signal de 3RMR). Si l’on voulait voir la qualité des spectres enregistrés, on pouvait cliquer sur l’onglet Afficher le spectre (entouré en violet). (B) Écran qui affiche les spectres bruts du tissu. C’est l’onglet où l’on peut évaluer la qualité du signal en fonction de la force des spectres mesurés par rapport au bruit résiduel. (C) Onglet qui montre les tendances des séries à travers l’expérience. Si l’on effectue, par exemple, plusieurs mesures 3RMR au cours d’une expérience, chaque mesure sera affichée dans le temps dans cet onglet. Les tendances dans d’autres séries, si sélectionnées, seront également affichées ici. Cet onglet peut être accessible en cliquant sur le bouton Tendances à l’écran principal (entouré en vert sur A). (D) onglet Info, où l’on peut saisir des informations expérimentales, telles que le nom et la description de la session. (E) onglet système, où l’on peut télécharger des protocoles préchargés. Par exemple, lors de la sélection du protocole LiverContAcell, ce protocole définira la bibliothèque de régression, la fenêtre de régression cible et sigma selon le protocole de perfusion acellulaire pour le foie de rat. Pour importer un protocole, on peut cliquer sur Importer Paramètres depuis le fichier et importer le protocole qui vous intéresse. Si l’on souhaite créer son propre protocole, on peut sélectionner les bibliothèques nécessaires dans le menu déroulant de la bibliothèque de régression (F), ajuster la sigma cible et la fenêtre de régression, ainsi que les alarmes, et cliquer sur Enregistrer (représentée par un disque) en bas à gauche. (F) Onglet Graphique, où l’on peut choisir la série à afficher dans la fenêtre principale. Si l’on réanalyse un spectre et que l’on souhaite ajouter plus de séries à ses mesures précédentes, on peut sélectionner la série d’intérêt sous la section Recal. Lors du recalibrage (Recal), le logiciel réanalyse les spectres bruts mesurés et affiche les résultats des séries nouvellement sélectionnées. On peut également sélectionner pour afficher la puissance du signal des séries sélectionnées depuis cet onglet. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Explications de chaque métrique de contrôle qualité.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette étude met en lumière une méthode non invasive, en temps réel et très sensible pour quantifier la santé mitochondriale à l’aide d’un système portable de spectroscopie Raman à résonance, composé d’un laser dans une sonde compacte, relié par un câble à fibre optique à une pompe laser. Cette méthode utilisait un laser de 441 nm pour exciter les mitochondries, qui produisent des signaux spectraux uniques selon leur état d’oxydation. Ainsi, les RRS sont capables de quantifier chaque état des mitochondries grâce à leurs signatures spectrales et de comparer les spectres émis avec des bibliothèques spectrales pré-mesurées à l’aide d’analyses de régression. Une mesure de santé mitochondriale a alors été créée basée sur le rapport entre les mitochondries réduites et totales : le Rapport Mitochondrial Raman à Résonance Réduite (3RMR).

Cet article se concentre sur la démonstration des changements en temps réel dans le 3RMR en fonction de l’oxygénation avec le tissu natif sans nécessiter de traitement des échantillons. Cela a été réalisé par un test de stress oxygéné : après 5 minutes de perfusion oxygénée continue, le flux de perfusion est interrompu pendant 5 minutes puis repris pendant 5 minutes supplémentaires. Des mesures RMR de 3 sont prises tout au long du test d’effort. Un modèle d’essai de stress, où l’on passe d’une période ischémique à une période oxygénée, nous permet de suivre les changements continus des états redox mitochondriaux – et, par extension, de la fonction mitochondriale. En d’autres termes, le test de stress à l’oxygène nous permet de suivre les tendances du 3RMR en fonction de l’oxygénation. Notre groupe a attribué l’augmentation des valeurs de 3RMR à des conditions ischémiques, perturbant le flux de perfusion, ce qui provoque l’accumulation d’électrons passant par l’ETC, car_l’O2 n’est pas disponible comme accepteur final d’électrons. Cette accumulation d’électrons provoque un état réduit, ce qui se traduit par une augmentation des valeurs de 3RMR. Cependant, lors de la réintroduction de_l’O2, on s’attend à ce que les mitochondries saines reprennent l’activité de l’ETC et retrouvent des états rédox physiologiques, car leurs éléments structurels et fonctionnels sont intacts.

Comme prévu, dans le présent article, une augmentation continue et en temps réel de la 3RMR a été observée tout au long de la période ischémique (Figure 5A). De même, la 3RMR revient progressivement à des niveaux optimaux tout au long de la période de reperfusion (Figure 5A). Ce changement en temps réel des états redox mitochondriaux est également visible dans le graphique spectral, car le pic mitochondrial passe d’états oxydés (1371 ^cm-1) à des états réduits (1357 ^cm-1) tout au long de la période ischémique, puis revient à l’oxydation à la fin de la reperfusion (Figure 6). D’autres pics de marqueurs RR réduits apparaissent également durant la période ischémique. Contrairement aux tests traditionnels de santé mitochondriale, le Raman par résonance est suffisamment sensible pour quantifier les états redox des complexes III et IV complexes, ce qui a pu, et a fourni, une vision mécanistique de l’impact spécifique des lésions ischémie-reperfusion sur l’ETC. Dans les mitochondries saines, les électrons sont passés à travers divers complexes dans l’ETC, en partant du complexe I, jusqu’à atteindre_O2 comme dernier accepteur d’électrons. Une pause dans le flux d’oxygène peut déplacer chaque complexe vers un état réduit, car les électrons sont refoulés le long de l’ETC. Comme prévu, une augmentation en temps réel a été observée des valeurs de 3RMR de cIII et cIV à l’apparition de l’ischémie. Cela indique que l’absence d’O₂ impacte l’ensemble de l’ETC, plutôt qu’un complexe spécifique (Figure 5B). Comme nous le verrons ci-dessous, la sensibilité du SRR facilite des études mécanistiques détaillées et oriente le développement de thérapies ciblées pour l’IRI.

Traditionnellement, on s’attend également à observer des niveaux élevés de lactate dans les organes ischémiques, car ils dépendent d’un métabolisme anaérobie en l’absence d’oxygène pour produire de l’ATP. De même, une augmentation des niveaux de K⁺ était attendue dans les organes endommagés, car l’intégrité membranaire des cellules est perturbée, permettant un efflux de K⁺ intercellulaire. Enfin, les cellules gravement endommagées peuvent avoir un métabolisme plus faible, car leurs voies métaboliques sont affectées par les déchets métaboliques induits par l’ischémie et les ROS, entraînant une consommation d’oxygène diminuée. Cependant, aucun changement dans la consommation de lactate, K⁺ ou oxygène n’est observé pendant ou après la période ischémique. En fait, les valeurs n’indiquent pas d’arrêt du flux d’oxygène, car elles restent relativement constantes tout au long de l’essai de contrainte (Figure 5B–D). En somme, à l’aide d’un test de stress oxygéné, cette étude montre que les valeurs de 3RMR reflètent les déplacements des états redox mitochondriaux lors de la réperfusion ischémie-réperfusion plus rapidement, en temps réel et de manière plus sensible que les biomarqueurs de dommages traditionnels (Figure 5). Nous reconnaissons que cette étude comparait la dynamique du 3RMR avec des indicateurs indirects de la santé mitochondriale, tels que le lactate et l’OCR, plutôt que des comparateurs plus directs en amont, tels que NAD+/NADH et ATP. Bien que cette étude ne corréle pas explicitement les changements de 3RMR aux concentrations d’ATP/NADH, des travaux antérieurs ^9,14 ont montré que le 3RMR prédisait les changements de ces biomarqueurs en aval. Par exemple, Nguyen et ^al.9 ont démontré que des foies à 3 heures de type ischémique tiède (WI) avec de faibles valeurs de 3RMR (<10 %) présentent des concentrations et des rapports NAD/NADH significativement plus faibles que les foies de 1 h (valeurs de 3RMR de ~15 %). De plus, Jain et ^al.14 n’ont observé aucune différence significative dans le ratio NAD+/NADH ou dans la CE chez les groupes qui n’avaient pas de différences significatives dans leur 3RMR. Ils ont également observé que les rapports NAD+/NADH et la CE étaient significativement différents dans les foies ischémiques froids (IC) de 24 h lors d’une perfusion acellulaire par rapport à la perfusion cellulaire, qui montraient également des valeurs statistiquement significatives de 3RMR. Pris ensemble, ces résultats démontrent des valeurs de 3RMR pour refléter des changements dans des mesures plus directes de la fonction mitochondriale et de l’ETC.

Bien que cet article utilise le RRS sur une perfusion de 15 minutes pour démontrer la performance du système, d’autres études publiées ont démontré l’utilité du RRS dans les études longitudinales. Plus précisément, dans un travail précédent, nous avons démontré que le RRS complète les biomarqueurs traditionnels lors de perfusions d’organes plus longues, car il offre un aperçu de la santé et du fonctionnement mitochondriaux qui diffèrent significativement des méthodes traditionnelles. Par exemple, l’étude a utilisé le RRS pour évaluer la viabilité des foies transplantables (SCS 24 h) et non transplantables (SCS 72 h) de rats ischémiques froids dans la perfusion^{subnormotherme 10}. Bien que la réponse initiale à l’oxygénation dans les deux groupes ait été similaire, la 3RMR des foies non transplantables augmentait avec la perfusion, tandis que la 3RMR des foies transplantables restait constante grâce à la SNMP. De même, les niveaux de potassium et la prise de poids globale pour le foie à IC à 72 h étaient plus élevés dans l’ensemble des SNMP comparativement aux foies à IC à 24 h. L’étude a démontré l’utilité du RRS pour compléter les biomarqueurs traditionnels sur de longues perfusions. Dans une autre étude, nous avons utilisé le RRS pour comprendre la dynamique de la réoxygénation et la récupération métabolique des foies de rats ischémiques (IC)^{froids 14}. Nous avons perfusé des foies ischémique minimalement ischémique (15 minutes d’ischémie froide) et des hépaties ischémiques froids sur 24 heures avec un perfusat acellulaire ou un foie rempli de globules rouges (pRBC). Lorsque le foie de l’IC à 24 heures a été perfusé avec du perfusat acellulaire, nous avons observé une diminution latente du 3RMR par rapport à la perfusion avec des pRBC. L’étude a attribué cette augmentation retardée du 3RMR à l’accumulation d’électrons dans les cytochromes mitochondriaux lors d’une ischémie froide, qui peuvent être rapidement transférés aux molécules d’oxygène abondantes dans le cas du perfusat à base de pRBC. Cependant, en combinaison avec d’autres marqueurs de lésion, nous observons une lésion hépatique plus importante dans des foies à IC sur 24 heures perfusés avec des pRBC. L’étude a conclu que mesurer l’oxygénation mitochondriale en temps réel via le RRS peut fournir un éclairage sur la récupération mitochondriale, ce qui pourrait être bénéfique pour optimiser les stratégies de perfusion longue. En somme, les résultats indiquent que l’intégration des biomarqueurs traditionnels (par exemple, lactate, OCR, ATP) avec des connaissances basées sur le RRS sur les états redox mitochondriaux et la dynamique de l’oxygénation permet une évaluation plus complète de la récupération mitochondriale.

D’autres études ont utilisé le RRS comme banc d’essai pour des traitements pouvant atténuer les lésions ischémie-réperfusion de l’ETC⁹. Lors de longues périodes d’ischémie, les électrons s’accumulent à l’intérieur de l’ETC, ce qui permet aux électrons de s’échapper à travers les différents complexes, notamment lors de la réperfusion. Comprendre l’état redox des complexes individuels en fonction de l’ischémie-réperfusion peut offrir une compréhension plus approfondie de la localisation des blessures, avec un potentiel d’interventions plus ciblées. Par exemple, notre groupe a utilisé le SRR pour développer des interventions thérapeutiques pour le dysfonctionnement complexe-III des foies porcins à ischémie chaude. Dans une étude menée par Nguyen et al. (2026)⁹, des foies WI de 1 h et 3 h ont été placés sur SNMP pendant 3 heures. Comme mentionné précédemment, les foies WI de trois heures sont connus pour souffrir de dommages au ETC, entraînant une suroxydation et une réduction du métabolisme. Bien que les valeurs de 3RMR pour les foies frais et les foies à 1 h aient été dans la plage optimale tout au long de la perfusion, nous avons observé que les valeurs de 3RMR pour des foies à 3 heures de WI diminuent continuellement, atteignant en dessous de la plage optimale (10 %) à 3 heures. De plus, nous n’avons observé aucune différence dans les valeurs de 3RMR du cIV entre les deux groupes, le cIV étant entièrement oxydé dans chaque groupe. L’hyperoxydation du cIII, combinée à un état redox sain observé dans le cIV, indique une suroxydation induite par la reperfusion au complexe III. Forts de ces connaissances, Nyugen et al. (2026)⁹ont pu sélectionner un traitement capable de surmonter le dysfonctionnement du cIII : le bleu de méthylène (MB), qui agit comme une navette électronique entre le cI et le cytochrome c, contournant le cIII et transférant directement les électrons vers le cIV. Les résultats de la 3RMR reflètent l’effet thérapeutique de la MB sur les mitochondries, les valeurs de 3RMR pendant le SNMP du foie WI à 3 heures augmentant pour refléter les électrons transportés directement vers le cIV, et le métabolisme hépatique redémarrant. L’effet atténuateur de la MB a également été validé par la diminution du lactate à l’extérieur et l’amélioration de la consommation d’oxygène. En somme, la spécificité du SRR a permis le développement d’une voie thérapeutique adaptée aux besoins mitochondriaux après une ischémie chaude.

Tout au long de cet article, nous présentons la spectroscopie Raman par résonance comme une méthode non invasive, en temps réel et très spécifique pour mesurer la santé mitochondriale. L’étude démontre comment le RRS peut mesurer des changements subtils dans les états redox sans perturber le tissu avant que ces changements physiologiques n’aient des effets en aval. Cependant, il est important de noter les nombreuses limites du système Raman de résonance. Premièrement, le RRS exige que toutes les molécules qui sont améliorées par résonance dans un tissu soient identifiées et prises en compte lors de la régression, chaque molécule ayant des facteurs d’amélioration différents pour tenir compte de la puissance relative du signal. Bien que nous ayons créé des bibliothèques spectrales pour tous ces composants à une longueur d’onde et un tissu donnés, l’utilisateur peut avoir besoin de créer et de valider de nouvelles bibliothèques pour chaque tissu et longueur d’onde d’intérêt. De plus, certains tissus peuvent contenir des éléments spectraux complexes, ce qui peut rendre difficile la mesure des cytochromes mitochondriaux présents à des concentrations plus faibles. Par exemple, le foie de porc ou d’humain contient du bêta-carotène, et le sang contient de l’hémoglobine, qui ont tous deux de puissants signaux spectraux qui augmentent le nombre de signatures spectrales que RRS doit prendre en compte lors de la régression. Enfin, le laser de 441 nm utilisé pour ces mesures a un diamètre de faisceau de 2 mm et une profondeur de pénétration inférieure à 1 mm. De telles mesures localisées en surface peuvent favoriser une erreur d’échantillonnage, car les différences d’état redox dans d’autres parties de l’organe peuvent être négligées. Pour surmonter de tels défis, des mesures pourraient être prises à partir de biopsies prises sur le noyau de l’organe, ou un système multi-laser pourrait permettre des mesures sur une surface plus large afin d’offrir une compréhension plus complète de la santé globale de l’organe.

En conclusion, nous montrons que la spectroscopie Raman par résonance est sensible aux changements subtils de la dynamique mitochondriale par rapport aux analytes hémato-gazeux. Une explication détaillée de la configuration et de l’exploitation du système est fournie ici. Nous mettons en avant la nature non invasive, très spécifique et d’évaluation en temps réel de la SRR, et expliquons comment elle pourrait être utilisée comme approche diagnostique et mécanistique. Nous soulignons également son utilisation dans le développement de voies thérapeutiques spécifiques pour les dysfonctionnements mitochondriaux. De futures études pourraient se concentrer sur l’adaptation du système RRS pour évaluer la santé mitochondriale à partir de biopsies, de tranches de tissu découpées de précision ou d’autres produits dérivés des tissus, y compris les tissus humains, pour la recherche translationnelle. L’adoption du SRR offre une approche puissante dans la recherche métabolique, améliorant notre compréhension des processus bioénergétiques cellulaires avec plus de facilité que les méthodes traditionnelles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	Utilisé pour canuler la veine porte
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	Utilisé pour filtrer l'excès de vapeur pendant l'anesthésie
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	Composition du perfusat
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Composition du perfusat
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	Composition du perfusat
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	Utilisé pour faire circuler le perfusat à travers le foie
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	Utilisé pour faire circuler le perfusat à travers le foie
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	Utilisé pour oxygéner le perfusat.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Composition du perfusat
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	Pour l'analyse des gaz du sang
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	Contactez Pendar Technologies pour toute demande concernant ce produit