Article de méthode

Construction des organoïdes du cancer du sein humain et de la quantification basée sur des tests de comète des dommages à l’ADN induits par la doxorubicine

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DOI :

10.3791/71299

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28 juillet 2026

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1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole établit un modèle d’organoïdes du cancer du sein (BCO) humain et évalue quantitativement les dommages à l’ADN induits par la doxorubicine à l’aide du test cométique. La faisabilité d’appliquer le test de comète aux BCO est démontrée, et un flux de travail reproductible, évolutif et opérationnel est mis en place pour détecter les dommages à l’ADN induits par la DOX dans les BCO.

Résumé

Le cancer du sein est la malignité la plus courante chez les femmes dans le monde et présente une hétérogénéité importante. La doxorubicine (DOX) est largement utilisée dans le traitement du cancer du sein, et son principal mécanisme d’action consiste à provoquer des ruptures de double brin de l’ADN et à déclencher la mort cellulaire. Dans ce protocole, un modèle de BCO humain a été établi pour évaluer quantitativement les dommages à l’ADN induits par la DOX. Les cellules primaires du cancer du sein ont été isolées à partir de tissus tumoraux dérivés du patient par dissociation mécanique et enzymatique, puis cultivées dans une matrice tridimensionnelle pour générer des BCO. Les organoïdes ont ensuite été traités avec 8 μM DOX pendant 2 heures. Les dommages à l’ADN ont été évalués après 2 heures de traitement. Après traitement, les organoïdes étaient dissociés en cellules uniques, intégrés dans de l’agarose à faible point de fusion, et électrophorisés dans des conditions alcalines. Après électrophorèse, les schémas de migration de l’ADN ont été visualisés comme des structures de comètes sous microscopie à fluorescence et analysés quantitativement à l’aide du logiciel OpenComet pour déterminer le pourcentage d’ADN caudal ( % d’ADN caudal). Le test de comète a permis de détecter avec succès des dommages à l’ADN dans les BCO. Comparés au groupe témoin, les BCO exposés à 8 μM DOX pendant 2 h ont présenté des queues de comète allongées après dissociation organoïde et électrophorèse. L’analyse quantitative a révélé que le pourcentage d’ADN caudal était significativement plus élevé dans le groupe traité, indiquant l’induction de dommages à l’ADN. Cette méthode hautement sensible soutient les études toxicologiques et pharmacodynamiques du DOX et offre une plateforme technique robuste pour évaluer les dommages causés par l’ADN dans les systèmes BCO dérivés des patients.

Introduction

Le cancer du sein est une tumeur maligne qui provient des tissus épithéliaux mammaires en raison de modifications génétiques, de dysrégulations hormonales et d’autres facteurs pathogènes. C’est la malignité la plus courante chez les femmes dans le monde et présente des schémas épidémiologiques uniques ainsi qu’une hétérogénéité intratumorale importante 1,2. DOX, un agent chimiothérapeutique de première ligne, s’intercale dans l’ADN, inhibe l’activité de la topoïsomérase II et induit la rupture des brins d’ADN, déclenchant finalement l’apoptose dans les cellulestumorales 3. Les systèmes traditionnels de culture cellulaire bidimensionnelle sont limités dans leur capacité à reproduire l’organisation cellulaire complexe et l’hétérogénéité des tumeurs mammaires. En revanche, les BCO sont des structures tridimensionnelles dérivées des tissus tumoraux du patient qui conservent les caractéristiques clés de la tumeur d’origine, notamment la composition cellulaire, l’architecture tissulaire et les phénotypes moléculaires. Notamment, les modèles BCO démontrent une forte concordance avec les réponses cliniques aux médicaments ; pour un agent thérapeutique donné, la concordance de réponse négative atteint 100 %, et la concordance de réponse positive atteint 98 % entre les BCO et le patientcorrespondant 4.

Les BCO servent de modèle in vitro avancé qui reprend les caractéristiques structurelles et fonctionnelles clés des tumeurs primaires et ont été largement appliqués pour étudier la tumorigenèse, la progression de la maladie et la résistancethérapeutique 5. L’initiation tumorale dans le cancer du sein repose généralement sur l’inactivation coopérative de plusieurs gènes suppresseurs tumoraux, tels que TP53, PTEN, RB1 et NF1, car les altérations d’un seul gène sont insuffisantes pour provoquer la transformation maligne de l’épithélium mammaire normal. Ce processus s’accompagne d’une perte de polarité cellulaire, d’une désorganisation architecturale et d’une proliférationincontrôlée 6,7,8.

Le test de comète (également appelé électrophorèse en gel unicellulaire, SCGE) est une méthode classique permettant d’évaluer les dommages causés par l’ADN au niveau de la cellule unique. La technique a été introduite pour la première fois par Rydberg et Johanson en 1978, puis affinée par Ostling et Johanson, qui ont établi le test de comète neutre pour détecter les ruptures de double brin d’ADN. En 1988, Singh et ses collègues ont intégré des conditions d’électrophorèse alcaline, permettant la détection de ruptures d’ADN monobrin, de sites abasiques et de lésions alcalines, élargissant considérablement l’application dutest 9. Le principe fondamental du test de comète est que la mobilité électrophorétique de l’ADN dépend de l’intégrité de l’ADN. Après l’inclusion de l’agarose et la lyse pour retirer les membranes et protéines cellulaires, les fragments d’ADN endommagés migrent vers l’anode lors de l’électrophorèse pour former une « queue de comète », tandis que l’ADN intact reste près du site de chargement, formant la « tête de comète »10. Des paramètres tels que la longueur de la queue, le pourcentage d’ADN caudal ( % d’ADN caudal) et le moment olive de la queue permettent une évaluation semi-quantitative ou quantitative des dommages à l’ADN, et des schémas expérimentaux temporels peuvent être utilisés pour évaluer la capacité de réparation de l’ADN. En raison de sa grande sensibilité, de ses faibles besoins en apport d’échantillons et de sa relative simplicité procédurale, le test de comète a été largement utilisé en toxicologie génétique, biologie du cancer et études de réponse médicamenteuse, notamment pour évaluer les dommages à l’ADN induits par des agents chimiothérapeutiques et la radiothérapie, ainsi que les mécanismes de résistance des cellules tumorales. Le test est très sensible aux conditions expérimentales et à la variabilité procédurale, et la reproductibilité ainsi que la comparabilité inter-laboratoire dépendent de flux de travail standardisés et d’analyse automatiséed’images 11. Ces dernières années, l’intégration de logiciels d’imagerie à haut débit, de modèles organoïdes et de systèmes d’édition génétique a encore renforcé l’utilité du test de comète pour étudier les dommages et mécanismes de réparation de l’ADN et pour évaluer les réponses au traitement tumoral.

Comparé aux tests traditionnels sur les dommages à l’ADN tels que la coloration par immunofluorescence γ-H2AX ou la cytométrie en flux, le test de comète fournit un moyen direct de quantifier les ruptures physiques des brins d’ADN au niveau unicellulaire. Parce que cette méthodologie fonctionne indépendamment de l’expression protéique spécifique ou de la spécificité des anticorps, elle élimine efficacement les résultats faux négatifs résultant de variations dans les états du cycle cellulaire ou d’aberrations dans les voies de réponse aux dommages àl’ADN 12. De plus, contrairement aux cultures monocouches bidimensionnelles conventionnelles, le modèle organoïde tridimensionnel utilisé dans cette étude récapitule plus fidèlement l’architecture spatiale complexe, les interactions matricielles extracellulaires et les gradients de perméation des médicaments des tumeurs in vivo. Alors que les modèles traditionnels de lignées cellulaires surestiment souvent la génotoxicité due à la surexposition artificielle aux médicaments, la plateforme organoïde évalue les dommages à l’ADN induits par la DOX dans un microenvironnement qui reflète de près les conditions physiologiques cliniques, améliorant ainsi considérablement la fiabilité et la valeur translationnelle de ce paradigmede dépistage 13.

Malgré les avantages substantiels du test de comète intégrée à organoïdes établi dans cette étude pour évaluer les dommages à l’ADN, sa mise en œuvre pratique nécessite une prise en compte attentive de plusieurs limitations techniques et paramètres d’applicabilité liés à l’apport d’échantillons. Le protocole nécessite une dissociation enzymatique approfondie mais douce des organoïdes pour obtenir une suspension unicellulaire hautement viable. Une densité de semis de 15 000 à 20 000 cellules primaires de cancer du sein par 100 μL de la matrice membranaire basale (~200 cellules/1 μL) soutient la signalisation paracrine intercellulaire nécessaire à la formation robuste de sphères tout en empêchant la nécrose centrale induite par l’hyperdensité et une déplétion rapide des nutriments. Concernant la fenêtre thérapeutique, ce test nécessite une calibration minutieuse de la concentration de DOX et de la durée d’exposition afin d’éviter une mort cellulaire excessive (>20–30 %). L’exposition supralétale à des drogues génère une abondance de comètes « hérissons », qui masquent les véritables signaux de dommages à l’ADN et confèrent l’interprétation des données. Concernant les limites du test, le faible débit intrinsèquement du test standard sur comète alcaline le rend inadéquat pour le dépistage de drogues à haut débit. De plus, cette technique exige une standardisation rigoureuse des procédures expérimentales — y compris la stabilité de l’adhérence du gel, la durée de déroulement alcalin et l’uniformité électrophorétique — car même de minuscules déviations opérationnelles peuvent introduire d’importantes erreurs systémiques.

En conclusion, ce protocole établit les BCO humains et démontre la faisabilité d’appliquer le test de comète pour quantifier les dommages à l’ADN induits par la DOX. Après un traitement DOX à 8 μM sur des BCO pleinement établis, les dommages à l’ADN ont été évalués à l’aide du test de comète. Cette approche permet une évaluation stable et directe des dommages à l’ADN induits par la DOX.

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Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Hôpital Populaire Wuzhong de Suzhou (Approbation n° 20251w03) et a été menée conformément aux normes éthiques médicales. Tous les sujets de cette recherche ont donné leur consentement éclairé écrit.

1. Construction de BCO humains

  1. Transport et stockage des tissus atteints de cancer du sein
    1. Placez immédiatement le tissu du cancer du sein humain fraîchement réséqué dans une solution de conservation des tissus pré-refroidie (4 °C).
      REMARQUE : Assurez-vous que le tissu reste complètement immergé pendant le transport.
  2. Dissociation mécanique du tissu du cancer du sein
    1. Effectuez toutes les procédures dans une armoire de biosécurité. Placez le tissu du cancer du sein dans une boîte de culture de 6 cm et retirez le tissu adipeux visible à l’aide de scalpels stériles et de pinces.
    2. Ajoutez 3 mL de PBS à la cuvette de culture de 6 cm et lavez le mouchoir trois fois.
    3. Aspirez et jetez la solution saline tamponnée phosphate (PBS).
    4. Répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 deux fois supplémentaires.
    5. Transférez le tissu du cancer du sein dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles et découpez le tissu en petits fragments d’environ 2 x 5 mm.
  3. Digestion enzymatique des tissus du cancer du sein
    1. Ajoutez 1 mL de solution de dissociation organoïde au tube microcentrifuge de 1,5 mL et transférez la suspension dans un tube centrifugeuse de 15 mL.
    2. Ajoutez 8 mL supplémentaires de solution de dissociation organoïde au tube centrifugeuse de 15 mL.
    3. Incubez le tube centrifuge de 15 mL à 37 °C pendant 40 minutes.
    4. Agitez le tube sur un shaker pendant 1 minute toutes les 10 minutes pendant la digestion.
    5. Après 40 minutes, ajoutez 6 mL de PBS au tube centrifuge de 15 mL pour arrêter la digestion.
      REMARQUE : Ajoutez directement le PBS au mélange digestif pour stopper l’activité enzymatique.
  4. Isolement des cellules tumorales primaires du sein et implantation organoïde
    1. Placez une tamis à cellules de 100 μm sur un tube centrifugeuse de 50 mL.
    2. Ajoutez 1 mL de milieu de culture cellulaire complet sur le tamis cellulaire.
      REMARQUE : Préparez le milieu de culture cellulaire complet à l’aide de 500 mL de milieu basal, 50 mL de sérum bovin fœtal et 5 mL de pénicilline-streptomycine.
    3. Aspirez 1 mL de la suspension tissulaire digérée à partir du tube centrifuge de 15 mL et appliquez-la sur la tamoire cellulaire.
    4. Répétez l’étape 1.4.3 jusqu’à ce que toute la suspension passe à travers la passoire.
    5. Rincez la passoire cellulaire avec 1 mL supplémentaire de milieu de culture cellulaire complète.
    6. Centrifugez le tube centrifugeuse de 50 mL à 350 × g pendant 3 minutes à 4 °C.
    7. Aspirez et jetez le surnageant.
    8. Resuspendez la pellete cellulaire dans 1 mL de milieu de culture cellulaire complète et transférez-la dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    9. Centrifugez la suspension à 370 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
    10. Aspirez et jetez le surnageant.
    11. Ajoutez 100 μL de la matrice de membrane basale au tube de microcentrifuge de 1,5 mL et mélangez soigneusement.
      REMARQUE : Maintenir une densité de semis de 15 000 à 20 000 cellules primaires de cancer du sein par 100 μL de la matrice membranaire basale (200 cellules/1 μL). Cela soutient la signalisation paracrine intercellulaire pour une formation robuste de sphères et prévient la nécrose centrale.
    12. Distribuez 25 μL du mélange matrice-cellule membranaire basale dans chaque puits d’une plaque à 24 puits.
    13. Inversez la plaque à 24 puits et incubez-la à 37 °C pendant 10 minutes pour permettre la polymérisation de la matrice membranaire basale.
    14. Ajoutez 500 μL de milieu de culture BCO à chaque puits de la plaque à 24 puits.
      REMARQUE : Cultivez les BCO en utilisant un support commercial prêt à l’emploi avec une formulation propriétaire.
    15. Incubez la plaque dans un incubateur humidifié à 37°C avec 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Après l’ensemencement dans la matrice extracellulaire, les BCO ont été cultivés pendant 7 à 10 jours afin de permettre un développement structurel 3D approprié. Les organoïdes étaient considérés comme pleinement établis et prêts à être traités par médicament lorsqu’ils présentaient des morphologies 3D sphériques denses et atteignaient un diamètre moyen d’environ 50 à 100 μm, sans signes de nécrose centrale. Une fois ces critères remplis, les BCO ont ensuite été traités par DOX.

2. Détection des dommages à l’ADN induits par le DOX dans les BCO à l’aide du test de comète

Le protocole expérimental a été adapté à partir des directives établies et optimisé pour s’adapter à des conditions spécifiques de laboratoire14.

ATTENTION : Exécutez toutes les procédures de manipulation DOX — y compris la pesée de poudre sèche, la préparation de la solution de stock et la dilution en série des solutions de travail — exclusivement dans un cabinet de sécurité biologique certifié Classe II ou une hotte chimique. Évitez strictement toute manipulation sur des établis ouverts. Portez des gants en nitrile double couche et protégez le médicament de la lumière lors de toutes les interventions. Enfin, séparer tous les consommables contaminés par le DOX (par exemple, embouts de pipette et tubes de microcentrifuge) strictement comme des « déchets cytotoxiques » destinés à un élimination spécialisée ; Ne mélangez jamais ces éléments avec des déchets bio-dangereux courants.

  1. Traitement DOX des BCO
    1. Aspirez et jetez le support de culture usé.
    2. Ajouter 500 μL de substrat de culture de BCO frais à chaque puits
    3. Retirer et éliminer 4 μL du milieu de chaque puits
    4. Ajoutez 4 μL de solution d’origine DOX de 1 mM à chaque puits.
      REMARQUE : Pour établir une concentration de travail finale de 8 μM, déterminer le volume de stock requis à l’aide de l’équation de dilution standard : C1V1 = C2V2. Où C1 représente la concentration initiale de stock DOX (1 mM), C2 est la concentration cible (8 μM), et V2 est le volume final du puits (500 μL). Résoudre pour V1 donne 4 μL. Par conséquent, le protocole nécessite d’ajouter 4 μL du stock DOX de 1 mM aux 496 μL restants de milieu de culture par puits, puis de mélanger soigneusement pour garantir une distribution homogène.
    5. Incubez la plaque dans un incubateur à 37°C avec 5 % de CO₂ pendant 2 heures.
  2. Dissociation des BCO
    1. Aspirez et jetez le milieu de culture BCO de la plaque à 24 puits.
    2. Ajoutez 500 μL de solution de dissociation organoïde à chaque puits.
    3. Pipeter de haut en bas à plusieurs reprises pour perturber complètement la matrice membranaire du basale et les structures organoïdes.
    4. Incubez la plaque à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 10 minutes.
    5. Transférez 500 μL de la suspension résultante de chaque puits dans un tube centrifugeuse de 15 mL.
    6. Centrifugez la suspension à 350 × g pendant 3 minutes à 4 °C.
    7. Aspirez et jetez le surnageant.
    8. Ajouter 1 mL de milieu de culture complet au tube centrifugeuse de 15 mL pour resuspendre la granule cellulaire, puis transférer la suspension résultante dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    9. Centrifugez la suspension à 350 × g pendant 3 minutes à 4 °C.
    10. Aspirez et jetez le surnageant.
      REMARQUE : Après centrifugation, la pastille organoïde reste dans le tube de centrifugeuse.
  3. Resuspension cellulaire et encastrement d’agarose
    1. Préchauffez le bloc chauffant métallique à 95 °C.
    2. Placez 1 mL d’agarose à faible point de fusion (LMP) dans un bloc chauffant métallique et incubez pendant 10 minutes pour assurer une fusion complète.
    3. Pipeter 100 μL d’agarose fondue, à 0,5 % à faible point de fusion, dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant des BCO.
    4. Transférez immédiatement les échantillons dans un bain-marie à 37 °C et laissez-les s’équilibrer pendant 10 minutes.
    5. Mélangez soigneusement et pipettez immédiatement 50 μL de la suspension d’agarose cellulaire sur une lame de microscope.
  4. Lyse cellulaire et déroulement de l’ADN
    1. Immergez les lames dans une solution de lyse froide et incubez à 4 °C dans le noir pendant 12 heures.
    2. Retirez les lames de la solution de lyse et immergez-les immédiatement dans une solution alcaline de déroulement.
      REMARQUE : Pour préparer la solution alcaline de déroulement, dissoudez 0,6 g de NaOH dans 4,975 mL d’eau ultrapure, puis ajoutez 250 μL de 200 mM d’EDTA. Pour préparer le tampon d’électrophorèse alcaline, dissoudez 12 g de NaOH dans 995 mL d’eau ultrapure, puis ajoutez 5 mL de 200 mM d’EDTA.
      ATTENTION : Le NaOH dans le tampon de test de comète est une base forte hautement corrosive capable de provoquer de graves brûlures cutanées et oculaires. Pendant la préparation de la solution, ajoutez les granulés solides de NaOH à l’eau lentement, de manière incrémentale et sous un remuage magnétique continu. Ne versez jamais d’eau directement sur les granulés secs, car la réaction exothermique violente peut faire bouillir et éclabousser le liquide caustique. De plus, il faut appliquer toute la poudre sèche pesant exclusivement dans une hotte chimique pour éviter l’inhalation de poussière corrosive.
    3. Immergez les lames dans une solution de lyse et incubez à 4 °C dans l’obscurité pendant 1 heure.
  5. Électrophorèse
    1. Transférez les lames de la solution alcaline de déroulement vers la chambre d’électrophorèse.
    2. Ajoutez 1 L de tampon d’électrophorèse alcaline dans le réservoir d’électrophorèse pour assurer une immersion complète des lames.
    3. Effectuez l’électrophorèse à 25 V et 300 mA pendant 30 minutes.
  6. Lavage et fixation des glissières
    1. Immergez les lames dans 5 mL d’éthanol à 70 % et faites couver pendant 5 minutes à température ambiante.
      REMARQUE : L’éthanol présente un risque grave d’inflammabilité. Lors de préparations à grand volume ou de déshydratation tissulaire, maintenez une ventilation robuste dans l’environnement expérimental. Isoler strictement la zone opérationnelle de toutes les sources d’allumage, y compris les flammes nues (comme les brûleurs à alcool) et les étincelles électrostatiques. Après utilisation, scellez immédiatement les contenants de réactifs et sécurisez-les dans un meuble de rangement ignibrable dédié à l’épreuve des explosions.
    2. Placez les lames dans un incubateur à 37 °C et laissez-les sécher pendant 15 minutes.
  7. Coloration et imagerie de l’ADN
    1. Ajoutez 1 μL de coloration fluorescente à l’acide nucléique à 10 mL d’eau ultrapure.
      ATTENTION : Traitez ces agents intercalants d’acides nucléiques comme des mutagènes potentiels et manipulez-les avec des précautions strictes. Pour éviter la contamination croisée dans les espaces de travail habituels, établissez une « zone de coloration des acides nucléiques » dédiée équipée de pipettes dédiées. Si vous complétez de l’agarose fondue avec des colorants, laissez refroidir le gel à environ 60 °C avant de l’ajouter afin d’éviter l’inhalation de vapeurs dangereuses chargées de colorants. Enfin, jetez toutes les solutions colorantes usées et les gels de déchets strictement dans des récipients désignés pour les acides nucléiques.
    2. Immergez les lames dans la solution colorante préparée à l’étape 2.7.1 et incubez pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
    3. Effectuez un lavage unique de 5 minutes avec 5 mL d’eau ultrapure.
    4. Faites sécher les lames à l’air pendant 15 minutes dans un incubateur à 37 °C.
    5. Visualisez les structures des comètes à l’aide d’un microscope à fluorescence muni d’un filtre d’excitation vert et détectez la fluorescence rouge.

3. Traitement des données

  1. Effectuer une analyse quantitative automatisée des images d’essais de comètes à l’aide du plugin OpenComet aux Fidji (distribution officielle) pour obtenir les paramètres liés aux dommages à l’ADN.
    REMARQUE : Concernant l’analyse statistique, ce travail n’a inclus que des comètes à haute résolution, clairement imagées, présentant une morphologie intacte et sans chevauchement. Inversement, le protocole de dépistage excluait les comètes « hérissons » ou « fantômes » (qui présentent une tête diminuée et une queue étendue, indiquant une apoptose ou une nécrose sévère), ainsi que les images avec des bords flous, un regroupement cellulaire ou des artefacts de fond.
    1. Ouvrez le logiciel Fiji (Figure supplémentaire 1A).
    2. Cliquez sur Plugins dans la barre de menu (Figure supplémentaire 1A).
    3. Sélectionnez OpenComet (Figure supplémentaire 1B).
    4. Cliquez sur Parcourir sous Fichiers d’entrée et sélectionnez les images d’essai de comète pour analyse (Figure supplémentaire 1C).
    5. Cliquez sur Parcourir dans le répertoire de sortie et définissez le dossier de destination pour les fichiers de sortie (Figure supplémentaire 1C).
    6. Cliquez sur Exécuter pour lancer l’analyse automatisée (Figure supplémentaire 1C). Cette étape conclut le flux de traitement et d’analyse des données.
      REMARQUE : Pour chaque groupe expérimental, cette étude a quantifié le pourcentage d’ADN caudal ( % ADN caudal) provenant d’une sélection randomisée d’au moins 50 cellules. L’analyse statistique ultérieure a utilisé une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) pour comparer les moyennes des groupes, avec p < 0,05 considérée comme statistiquement significative.

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Résultats

Création des BCO

Cette étude a réussi à établir des organoïdes du cancer du sein à partir d’échantillons de tissu tumoral primaire. Au stade initial de la culture, un grand nombre de cellules individuelles ou de petits groupes cellulaires étaient clairement observés, avec des cellules réparties de manière relativement dispersée et sans organisation sphérique tridimensionnelle évidente. Certaines cellules présentaient des morphologies rondes ou...

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Discussion

Le test de comète représente une avancée significative dans les méthodes d’évaluation de la génotoxicité. Grâce à sa résolution unicellulaire et à la visualisation directe des schémas de dommages à l’ADN basés sur la migration électrophorétique, cette technique offre des avantages évidents par rapport aux tests de génotoxicitéconventionnels 15.

Plusieurs étapes cruciales durant la procédure expérimentale influencent la reproductibilité ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le projet du Centre de recherche en ingénierie de la province du Jiangsu sur la thérapie moléculaire cible et le diagnostic compagnon en oncologie (SGK2202319), l’équipe de recherche innovante de l’établissement d’enseignement supérieur du Jiangsu en science et technologie (2021), le programme du centre de recherche en technologie de l’ingénierie professionnelle du Jiangsu (2023), la Fondation clé des sciences naturelles des institutions d’enseignement supérieur du Jiangsu en Chine (Subvention n° 24KJA310008). les programmes clés du Collège professionnel de santé de Suzhou (szwzy202406), le projet du laboratoire clé d’État de médecine radiologique et de protection, Université de Soochow (n° GZK1202506), le programme de talents en santé de Dongwu (DWWS2024002, DWWS2025009, DWWS2025013).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL centrifuge tubesBIOFILNone15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-well platesCorning Incorporated3524
50 mL centrifuge tubesBIOFILNone50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit PlusMogenel Biotechnology MA-0807T011LPBCO culture medium
Comet SlideR&D SYSTEMS4250-050-03
Dry-bulb thermostatHangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.DH100-2Heating block
Dulbecco’s Modified Eagle MediumgibcoC11995500BTComplete cell culture medium
EDTATREVIGEN4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water BathShanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.MSY-24Water bath
Electrophoresis apparatusBIO-RAD1645052
Fetal bovine serumEallBio03.U16001DC
Fluorescence microscopeWEIDAIM-300LD4
ForcepsBeyotimeFS019
GelRedBeyotimeD0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareStatistical analysis software
ImageJNational Institutes of Health, NIH1.54pImage processing software / image
LMA garoseR&D SYSTEMS4250-050-02Low-melting-point agarose 
Low-temperature high-speed centrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40Centrifuge
Lysis SolutionTREVIGEN4250-050-01Lysis solution
MatrigelMogenel Biotechnology82755The basement membrane matrix
NaOHDAMAO1588
OpenComet softwareOpen-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singaporev1.3.1
Organoid Dissociation SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L01L
Penicillin – StreptomycinBeyotimeCO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032PBS
PipettesRaininPipet-Lite XLS
ScissorsBeyotimeFS001
Tissue Digestion SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06SOrganoid dissociation solution

Références

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