Imagerie quantitative des cellules vivantes de la forme nucléaire et de la dynamique de la chromatine pendant le développement et le stress environnemental dans la racine d’Arabidopsis thaliana

Résumé

Ce procédé utilise la microscopie confocale en conjonction avec un noyau et une lignée de marqueurs de chromatine marqués fluorescentement dans Arabidopsis thaliana pour enregistrer simultanément la dynamique du noyau et de la chromatine dans les racines d’Arabidopsis et étudier les changements de ces dynamiques en réponse aux signaux développementaux et environnementaux.

Résumé

Le noyau est l’organite caractéristique des organismes eucaryotes. Contrairement à la vision classique des noyaux statiques, la forme nucléaire est dynamique dans les cellules vivantes. La forme nucléaire altérée ou déformée est une caractéristique du cancer chez les cellules animales et du stress environnemental chez les plantes. Les protéines de l’enveloppe nucléaire interagissent avec la chromatine pour réguler l’expression génique. Malheureusement, on sait peu de choses sur l’impact du stress abiotique sur la forme nucléaire, le mouvement et la dynamique de la chromatine. Pour faire face à ce problème, nous avons développé un pipeline utilisant la microscopie confocale et un logiciel de suivi des particules pour quantifier la dynamique nucléaire et de la chromatine dans les racines d’Arabidopsis sous contrôle et en conditions de stress abiotique. Cette méthode d’imagerie confocale utilise une double lignée de marqueurs marquée fluorescentement – protéine de l’enveloppe nucléaire et chromatine – pour réaliser l’imagerie cellulaire vivante de la racine dans la plante modèle Arabidopsis thaliana sous contrôle et sous stress salin. Ces films capturés sont analysés pour quantifier la dynamique nucléaire et chromatine à l’aide du logiciel de traitement d’image open source Fiji/ImageJ grâce au plugin TrackMate. Pour valider cette méthode, nous avons imagé et quantifié le mouvement de la chromatine dans les racines témoins et soumises à la contrainte, révélant une diminution de la vitesse de la chromatine en conditions de stress sal. Cette méthode permet une imagerie quantitative des cellules vivantes de la forme nucléaire racinaire et de la dynamique de la chromatine lors du développement des plantes et du stress environnemental, permettant ainsi l’analyse des changements dans la dynamique nucléaire et de la chromatine causés par les facteurs de stress abiotiques.

Introduction

La forme nucléaire varie selon les différents types cellulaires et au cours du développement^{dans les racines 1,2} d’Arabidopsis thaliana. Par exemple, la forme nucléaire est sphérique dans les régions méristématiques en division active. Contrairement à la région méristématique, les noyaux dans la zone de transition racinaire et d’allongement sont moins sphériques. De plus, les noyaux dans les cellules différenciées, tels que les poils racinaires, traversent la base radiculaire serrée et sont activement transformés en noyaux^{allongés 3,4,5}. Les changements dynamiques de forme et de mouvement nucléaires sont cruciaux pour le fonctionnement de la^{cellule 6,7}. Les défauts de forme nucléaire entraînent une altération fonctionnelle telle que la réduction du mouvement nucléaire ^1,3. Chez les cellules de mammifères, les changements dans la forme cellulaire et du noyau sont directement corrélés aux changements dans l’expression génique et la synthèse des^{protéines 8}.

Pendant l’interphase, l’ADN d’une cellule est organisé sous forme de chromatine. L’ADN dans la chromatine est regroupé autour des histones, ce qui peut serrer et desserrer l’ADN pour modifier l’expression. De même, le positionnement de la chromatine par rapport à l’enveloppe nucléaire et la proximité de la périphérie nucléaire sont également importants pour l’expression^{génique 9}. Le stress environnemental, tel que le stress osmotique, modifie la forme nucléaire et modifie par conséquent l’expression d’un ensemble de gènes sensibles au toucher dans les racines 10 d’A. thaliana. Dans ce contexte, étudier la forme nucléaire et la dynamique de la chromatine via l’imagerie en timelapse de cellules vivantes est important. Un aspect majeur de la dynamique nucléaire est la vitesse à laquelle les noyaux se déplacent, car le positionnement nucléaire à l’intérieur de la cellule favorise l’expression génique, et le repositionnement nucléaire nécessite un mouvement^{nucléaire 11}. La vitesse de mouvement de la chromatine à l’intérieur du noyau est tout aussi importante, car le positionnement des gènes à l’intérieur du noyau est crucial pour déterminer l’expression^{génique 12}.

Auparavant, la forme nucléaire et la dynamique de la chromatine étaient imagées et quantifiées séparément ; En conséquence, la relation entre la forme nucléaire et la dynamique de la chromatine est restée inexplorée. En imageant simultanément les noyaux et la chromatine, leurs positions relatives peuvent être observées, ce qui peut révéler des mouvements tels que la rotation nucléaire et le mouvement intra-nucléaire de la chromatine qui seraient autrement difficiles voire impossibles à démontrer. Dans cette méthode, nous présentons une technique d’imagerie cellulaire vivante pour visualiser et quantifier la forme nucléaire via la protéine interagissant du domaine WPP (WIP1)¹³ , marquée fluorescentement et la chromatine via la dynamique de l’histone centromérique H3 (CENH3)¹⁴ , simultanément sous contrôle et sous contrainte saline, dans le but de permettre l’analyse des changements dans la dynamique nucléaire et de la chromatine causés par les stresseurs abiotiques. Pour permettre cette méthode, nous avons généré une ligne WIP1-GFP/CENH3-mRFP d’A. thaliana. De plus, nous avons étudié la dynamique de la chromatine de manière quantitative en utilisant le plugin TrackMate du logiciel open source ImageJ/Fiji. Nous avons testé une double ligne fluorescente et des techniques de dynamique de la chromatine présentées ici sous des conditions de contrainte salaire et avons découvert une altération de la morphologie et de la dynamique des foyers centromériques due aux conditions de contrainte. Cette méthode simple et reproductible est idéale pour le suivi à haut débit de la dynamique nucléaire et de la chromatine dans les racines d’Arabidopsis sous diverses conditions de contrainte abiotique.

Protocole

1. Culture des semis d’A. thaliana

1. Préparation du milieu de croissance
   1. Placez 800 mL d’eau pure dans un bécher de 1 L sur une plaque de brassage. Ajoutez une barre de mélange au bécher.
   2. Allumez la plaque de brassage à 600 tr/min.
   3. Ajoutez 10 g de saccharose au bécher.
   4. Ajoutez 2,16 g de milieu de croissance Murashige et Skoog (MS) au bécher.
   5. Ajoutez 5 mg d’agar à chacune des deux bouteilles de 1 L de substrat.
   6. Étiquetez une bouteille « 1/2 MS » et l’autre « 100 mM NaCl ».
   7. Étiquetez les deux couvercles de bouteilles avec du ruban autoclave.
   8. Ajoutez 5,84 g de NaCl à la bouteille étiquetée « 100 mM NaCl ».
   9. Remplissez le bécher avec 1 L d’eau pure.
   10. Remettez le bécher sur la plaque de remuage et attendez que le saccharose et la MS soient dissous.
   11. Versez le contenu du bécher dans un cylindre gradué de 1 L.
   12. Verser 500 mL du contenu du cylindre gradué dans chaque bouteille.
   13. Milieu de croissance autoclave et 250 mL d’eau pure avec un cycle liquide de 60 minutes à 121 °C.
       REMARQUE : Lors de l’autoclavage des supports et de l’eau, assurez-vous que les couvercles sont lâches pour éviter d’éventuelles explosions.
   14. Revissez les couvercles du milieu de croissance.
   15. Inversez les bouteilles de milieu de croissance 7 fois pour garantir une distribution complète de l’agar partout.
   16. Conservez le substrat de culture dans un réfrigérateur à 4 °C jusqu’à ce que ce soit nécessaire, puis passez au micro-ondes pour liquéfier.
2. Pose des plaques de croissance et des graines
   1. Dans une hotte à flux, utilisez un pistolet à pipettes pour pipeter 50 mL de milieu de croissance dans chacune des dix plaques (Figure 1A).
   2. Pendant que le milieu solidifique, nettoyez les graines WIP1-GFP x CENH3-mRFP en les inondant dans un tube microcentrifuge avec 1 mL d’éthanol à 70 % pendant 10 minutes (Figure 1B).
      REMARQUE : Lors de la manipulation de l’éthanol, assurez-vous qu’il n’y a pas de flammes vives à proximité.
   3. Après 10 minutes, dans la hotte de flux, retirez l’éthanol et rincez les graines deux fois avec 1 mL d’eau autoclavée (Figure 1C).
   4. Une fois le milieu fixé, utilisez une pipette de 1000 μL pour placer les graines nettoyées sur des plaques de croissance en deux rangées de 14 graines par plaque (Figure 1D).
   5. Étiquetez les plaques avec un marqueur permanent et scellez-les avec du ruban micropore avant de quitter la hotte de flux (Figure 1E).
3. Semis en germination
   1. Enveloppez les plaques de croissance dans du papier aluminium et stratifiez-les à froid dans un réfrigérateur à 4 °C pendant au moins 2 jours (Figure 1F).
   2. Après stratification à froid, retirez les assiettes du réfrigérateur et laissez-les verticalement sous des lampes de croissance (~80 μmol/^{m 2}/s) pendant un minimum de 4 jours (Figure 1G).
   3. Transférez la moitié des plaques dans un milieu de croissance NaCl de 100 mM dans la hotte de flux, puis scellez et étiquetez les plaques (Figure 1H).
   4. Placez les plaques de culture sous des lampes de croissance pendant 2 jours avant l’imagerie (Figure 1I).

2. Imagerie cellulaire vivante des noyaux racinaires d’A. thaliana et de la chromatine

1. Préparation des lames
   1. Pipettez 60 μL d’eau pure sur une lame en verre (Figure 2A).
   2. Pose 3 plants de semis d’A. thaliana âgés de 6 jours dans l’eau (Figure 2B).
   3. Placez une couverture coulissante #1,5 de 22 mm × 22 mm sur les racines sans recouvrir les feuilles (Figure 2C).
2. Réglages du microscope confocal
   1. Réglez le temps d’exposition laser à 1000 ms (1 s).
   2. Dans le combineur laser, réglez le laser de 488 nm à 50 % pour la protéine fluorescente verte (GFP) et le laser de 561 nm à 50 % pour la protéine fluorescente rouge (RFP) (Figure 2D). Image avec un objectif à 20× sans zoom optique. Si l’enregistrement dure plus de 10 minutes, diminuez l’intensité pour diminuer le photoblanchiment.
   3. Réglez la taille du pas de la tranche Z à 0,3 μm.
   4. Réglez l’intervalle à 1 minute et la durée totale à 10 minutes.
3. Imagerie
   1. Localisez les racines et sélectionnez jusqu’à 20 z-slices et capturez des images 16 bits.
   2. Commencez le timelapse.
   3. Économisez le timelapse en fichier TIFF grâce à la compression sans perte.
   4. Transférez les données vers un ordinateur pour analyse.

3. Suivi et analyse des données

REMARQUE : Il faudra la version fidjienne du logiciel open source ImageJ (v. 1.54 recommandée), qui est livrée avec TrackMate préinstallé.

1. Initialisation
   1. Image ouverte J/Fiji.
   2. Cliquez et glisserez un fichier .vsi dans la fenêtre principale de l’application ImageJ/Fiji (Figure 3A).
   3. Une invite intitulée Options d’importation des bio-formats apparaîtra ; cliquez sur Ok en bas à droite (Figure 3B).
   4. Un prompt intitulé Options de la série Bio-Formats apparaîtra. Assurez-vous que la série 1 est sélectionnée et cliquez sur Ok en bas à gauche (Figure 3C).
      REMARQUE : Le fichier peut prendre une minute à se charger, surtout s’il comporte de nombreuses couches Z ou points temporels.
   5. Une fois l’image ouverte (Figure 3D), séparez les signaux en naviguant sur la fenêtre principale ImageJ vers Image > couleur > séparer les canaux (Figure 3E). Cela créera deux fenêtres distinctes, une pour les noyaux marqués par GFP et une pour la chromatine marquée par RFP (Figure 3F).
2. Prétraitement de la chromatine
   1. Déterminez laquelle des deux fenêtres correspond à la chromatine.
   2. Cliquez sur la fenêtre de chromatine (Figure 3F) et appliquez l’opération du projet Z en naviguant sur la fenêtre principale ImageJ pour imager > piles > projet Z (Figure 4A).
   3. Changez le type de projection en Intensité maximale et assurez-vous que toutes les images temporelles sont actives, puis cliquez sur Ok (Figure 4B).
   4. Ouvrez le menu contraste en appuyant sur Ctrl+Shift+C ou en naviguant dans la fenêtre principale d’ImageJ pour ajuster > Luminosité/Contraste > (Figure 4C).
   5. Faites glisser la deuxième barre (appelée Maximum) vers la gauche jusqu’à ce que la chromatine soit facilement visible (Figure 4D).
3. Suivi de la chromatine
   1. Naviguez vers les plugins (Figure 5A).
   2. Cliquez sur la flèche vers le bas dans le menu des plugins pour faire défiler jusqu’à l’option de suivi (Figure 5A).
   3. Cliquez sur le suivi, puis sur TrackMate.
   4. Les premiers réglages apparaîtront. Vérifiez que les réglages d’étalonnage sont exacts, puis cliquez sur Suivant (Figure 5B).
   5. Sélectionnez détecteur de seuil et cliquez sur Suivant (Figure 5C).
   6. Sur la fenêtre d’image, passez à la dernière image de l’accéléré (Figure 5D).
   7. À côté du seuil d’intensité, cliquez sur Auto, puis sur Prévisualisation.
   8. Ajustez le seuil d’intensité et cliquez sur Prévisualisation. Ajustez et prévisualisez à plusieurs reprises le seuil jusqu’à ce que l’aperçu inclue toute la chromatine et un bruit minimal, puis cliquez sur Suivant (Figure 5D).
   9. La détection initiale du seuil aura lieu ; cliquez sur Suivant (Figure 5E).
   10. Mesurez manuellement le seuil jusqu’à ce que seule la chromatine soit visible, puis cliquez sur Suivant (Figure 5F).
   11. Cette page permet de filtrer les taches. Ignorez cela et cliquez sur Suivant (Figure 6A).
   12. Sélectionnez Simple LAP tracker et cliquez sur Suivant (Figure 6B). Le traceur LAP est applicable lorsque les objets suivis ne se fusionnent pas ou ne se divisent pas.
   13. Réglez la distance maximale de liaison à 5 microns, la distance maximale de réduction d’écart à 15 microns, et la distance maximale de réduction à 1. Cliquez sur Suivant (Figure 6C).
   14. Le suivi aura lieu. Les pistes apparaîtront dans la fenêtre d’image originale. Cliquez sur Suivant (Figure 6D).
   15. Cette page permet le filtrage des pistes. Appuyez sur le bouton vert + en bas à gauche pour créer un filtre, puis choisissez le nombre de cases en mode piste et appuyez sur Auto (Figure 6E).
   16. Assurez-vous que le mode est réglé sur Ci-dessus. Cela éliminera les taches qui apparaissent et disparaissent rapidement.
   17. Cliquez sur Suivant (Figure 6E).
   18. La page des options d’affichage permet d’exporter les données sous forme de fichier csv. En bas de la page, cliquez sur le bouton Pistes , puis exportez en CSV (Figure 7A).
   19. Cette page permet un tracé intégré ; ignore-le et clique sur Suivant.
   20. Sur la dernière page, enregistrez la vidéo en utilisant la superposition Capture et appuyez sur exécuter. Cliquez dessus, puis allez jusqu’au fichier > enregistrer en tant que GIF > (Figure 7B).
4. Analyse de vitesse de base
   1. Ouvrez le CSV des pistes dans un logiciel de tableur.
   2. Supprimez toutes les colonnes sauf TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME et RADIUS.
   3. Les emplacements dans chaque piste seront désorganisés. Pour les ordonner, gelez d’abord les quatre premières lignes, puis créez une nouvelle colonne intitulée TRACK_FRAME et copiez-collez cette formule dans la colonne : =concatenate(A4, « _ », if(E4>9, E4, concatenate(« 0 », E4))).
   4. Sélectionnez la colonne TRACK_FRAME , faites un clic droit dessus, puis cliquez sur Trier la feuille A–Z. Les emplacements dans chaque piste devraient maintenant être en ordre.
   5. Pour confirmer qu’aucun endroit ne manque au milieu d’une piste, créez une nouvelle colonne et utilisez cette formule : =if(E4>E3, E4-E3, « NA »). Assurez-vous que la première place de chaque piste renvoie « NA » et le reste 1.
   6. Créez une colonne pour Vitesse (micron/image) et collez-y la formule suivante : =if(H4="NA », « NA », sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). Cela utilisera le théorème de Pythagore pour calculer la distance entre deux points.
   7. Pour traduire cela en Vitesse (micron/seconde), créez une nouvelle colonne et collez la formule suivante : =IF(I5="NA », « NA », I5/(D5/E5)). Cela permettra de trouver les secondes/image et de traduire les microns/image en conséquence.

Résultats

Imagerie cellulaire vivante de l’enveloppe nucléaire et de la dynamique de la chromatine
Nous avons généré une double lignée de marqueurs fluorescents, qui inclut la protéine de l’enveloppe nucléaire externe WIP1-GFP et la chromatine centromérique CENH3-mRFP (Figure 8). Les plants âgés de 4 jours ont été transférés sur la plaque de contrôle ou sur des plaques contenant du NaCl de 100 mM pendant 2 jours. Après 2 jours d’incubation, une inh...

Discussion

La méthode présentée ici est idéale pour suivre la dynamique de la chromatine. Comparé aux méthodes passées d’imagerie à cellules vivantes avec imagerie séparée, l’imagerie simultanée des noyaux et de la chromatine permet d’explorer la relation entre la dynamique nucléaire et la chromatine. Cela peut révéler des mouvements tels que la rotation nucléaire et le mouvement intra-nucléaire de la chromatine qui seraient autrement difficiles à démontrer.

En tant que ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
½ Murashige and Skoog (MS) media	bioWorld	30630058
3M micropore tapes	Amazon	A-1530-0
Acqusition software	Olympus/Evident	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Cover slip	Genesee	29-116
Glass slide	Genesee	29-101
Image/Fiji	Open-source	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Microscope	Olympus/Evident	IX83
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Spinning disk	Yokogawa	CSU-W1
Square petri dishes	Simport	26-275
Sucrose	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987