Article de recherche

Pharmacologie de réseau, apprentissage automatique et validation in vivo de la capsule Danzhi Jiangtang dans la néphropathie diabétique

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DOI :

10.3791/71328

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28 juillet 2026

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1Anhui University of Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

La capsule Danzhi Jiangtang (DJC) peut atténuer la néphropathie diabétique (DN), comme en témoignent les changements dans la signalisation des chimiokines et les marqueurs de pyroptose, soutenus par la bioinformatique et la validation in vivo .

Résumé

Bien que la capsule Danzhi Jiangtang (DJC) soit une préparation traditionnelle chinoise utilisée cliniquement pour le diabète, la manière dont elle peut protéger le rein lors de la néphropathie diabétique (DN) n’a pas été entièrement clarifiée. Cette étude visait à explorer les mécanismes potentiels par lesquels le DJC affecte la DN, en se concentrant sur la cascade de signalisation pyrinienne de la famille NLR contenant le domaine pyrine 3 (NLRP3)/Caspase-1/Gasdermin D (GSDMD).

Une stratégie intégrée combinant pharmacologie des réseaux et apprentissage automatique a été employée. La Plateforme de Données et d’Analyse des Systèmes de Médecine Traditionnelle Chinoise (TCMSP) et l’Outil d’Analyse Bioinformatique pour le Mécanisme Moléculaire de la Médecine Traditionnelle Chinoise (BATMAN-TCM) ont été utilisés pour dépister les ingrédients bioactifs et leurs cibles protéiques correspondantes de DJC. Les gènes associés à la DN ont été extraits de Gene Expression Omnibus (GEO), GeneCards et Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Les cibles candidates clés ont été filtrées et classées à l’aide de multiples algorithmes d’apprentissage automatique. L’affinité de liaison entre les ingrédients actifs et les cibles principales du DJC a été évaluée par docking moléculaire. Enfin, l’efficacité thérapeutique et les mécanismes prédits ont été évalués chez les souris diabétiques db/db.

L’analyse pharmacologique des réseaux a identifié 599 cibles DJC et 68 gènes qui se chevauchent avec DN. À l’aide d’algorithmes d’apprentissage automatique, le ligand chimiokine C-C motif 2 (CCL2) et CASP1 ont été identifiés comme cibles candidates prioritaires. L’amarrage moléculaire a prédit de possibles affinités de liaison fortes entre les ingrédients actifs du DJC et ces protéines centrales. Les analyses d’enrichissement fonctionnel (GO/KEGG) ont suggéré que la modulation du DJC est associée à des réponses inflammatoires et à la voie MAPK. La validation in vivo a montré que le traitement par la DJC atténuait les marqueurs de lésions rénales et de fibrose. Ces résultats suggèrent que le DJC pourrait atténuer la DN en partie par des modifications de signalisation de la pyroptose liées au récepteur chimiokine CCL2/C-C (CCR2).

Introduction

Le fardeau mondial du diabète sucré (DM) continue de s’aggraver, posant un défi de santé publique de taille. On estime que 5,2 millions de décès chaque année résultent de la DM et de ses complicationsassociées 1. La DN est considérée comme une complication microvasculaire sévère et un facteur majeur du développement de la maladie rénale terminale (ESRD), touchant environ 30 à 40 % de la populationdiabétique 2,3. De multiples facteurs liés contribuent à la progression pathologique de la DN, notamment un dysfonctionnement métabolique, un remodelage hémodynamique et des réponses inflammatoires persistantes. Les insultes pathologiques, notamment l’hyperglycémie élevée et l’hyperlipidémie, activent la voie de la pyroptose médiée par NLRP3/caspase-1/GSDMD, induisant la mort inflammatoire programmée dans les cellules épithéliales mésangiales et tubulaires rénales, suivie de lésions tubulointerstitiellesprogressives 4. La pyroptose se caractérise par la rupture de la membrane plasmique, qui entraîne la libération d’IL-1β et d’IL-185. Ces facteurs pro-inflammatoires augmentent la transcription du ligand chimiokine C-C motif 2 (CCL2), favorisent l’infiltration des macrophages et potentialisent davantage l’activation pyroptotique, aggravant ainsi progressivement la lésionrénale 6. En pratique clinique, cette affection se manifeste par une albuminurie progressive et une réduction progressive du taux de filtration glomérulaire, ce qui peut aboutir à des lésions rénales irréversibles et à une nette détérioration de la qualité de vie des personnesconcernées 7,8. Malgré les avancées dans les soins médicaux, les stratégies thérapeutiques actuelles, qui se concentrent principalement sur un contrôle strict de la glycémie et de la pression artérielle, ne parviennent souvent pas à arrêter complètement la progression de la maladie. Bien que les pharmacothérapies émergentes, incluant les agents bloqueurs SGLT2, les agonistes GLP-1 et les bloqueurs des récepteurs minéralocorticoïdes, ainsi que les thérapies par cellules souches et les interventions alimentaires, aient suscité une attention significative et deviennent plus fréquentes dans la pratique, le risque résiduel de DN reste élevé. Ainsi, le développement de substances thérapeutiques innovantes reste une priorité de recherche urgente, en particulier celles issues de la médecine traditionnelle qui peuvent cibler simultanément plusieurs voies pathologiques.

La capsule Danzhi Jiangtang (DJC), une formulation exclusive à l’hôpital développée au Premier Hôpital affilié de l’Université de médecine chinoise de l’Anhui (Approbation de préparation de l’établissement médical provincial de l’Anhui n° Z20090006 ; Brevet n° ZL200310112845.1 ; Lot n° 20220427), est un candidat thérapeutique prometteur. Il doit être scellé, stocké dans un environnement sec et ventilé, et protégé de la lumière. La formule est composée de six herbes traditionnelles chinoises : Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Whitmania pigra (Hirudo), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Paeonia suffruticosa (Cortex de Moutan) et Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) (5:4:4:3:2:5)10. En pratique clinique, le DJC a démontré une efficacité hypoglycémique significative et la capacité de réduire les marqueurs de l’insuffisance rénale chez les patientsdiabétiques 11. Des recherches antérieures suggèrent que le DJC pourrait exercer des effets rénoprotecteurs en régulant les niveaux de glucose sanguin et le métabolismelipidique 12,13,14. Les études précédentes sur le DJC se sont principalement concentrées sur la validation à voie unique avec une sélection non systématique des cibles. Nous avons donc intégré la pharmacologie en réseau et l’apprentissage automatique pour dépister les composants actifs et identifier les gènes centraux, suivis d’une validation préliminaire in vivo, afin de renforcer l’analyse.

La pharmacologie en réseau offre une stratégie efficace pour disséquer les prescriptions complexes de plantes à base de plantes. Ce cadre intègre des approches bioinformatiques et biologiques systématiques, la chimie computationnelle et la pharmacologie pour déchiffrer les mécanismes « multi-composants, multi-cibles et multi-voies » des actions desmédicaments 15,16,17. Cette approche holistique facilite un examen structuré des interactions complexes entre les composés à base de plantes et les réseaux spécifiques à la maladie, révélant les effets synergiques inhérents à laMTC 18. Cependant, la pharmacologie traditionnelle des réseaux peut parfois générer un bruit excessif dans les données. Pour surmonter cela, l’intégration d’algorithmes d’apprentissage automatique permet un criblage précis des gènes caractéristiques du cœur à partir de jeux de données à grande échelle. De plus, le docking moléculaire offre une perspective intuitive et dynamique pour prédire les affinités potentielles de liaisonmédicament-biomolécule 19.

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Protocole

Dépistage des composés bioactifs et des cibles potentielles du DJC

Les composés bioactifs des six herbes présentes dans le DJC, Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Paeonia suffruticosa (Moutan Cortex), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) et Whitmania pigra (Hirudo) ont été récupérés dans la base de données TCMSP. Le dépistage a été réalisé sur la base de paramètres pharmacocinétiques : biodisponibilité orale (OB) ≥ 30 % et ressemblance avec le médicament (DL) ≥ 0,18. Pour Whitmania pigra, qui ne dispose pas de données dans TCMSP, ses composés actifs et cibles ont été obtenus à partir du BATMAN-TCM, en utilisant un score ≥ 20 et une valeur P < 0,05 comme critères de sélection. UniProt a été appliqué pour unifier toutes les cibles collectées dans une nomenclature génique standard.

Acquisition de gènes liés à la DN

Des gènes liés à la DN ont été collectés à partir de trois sources. Tout d’abord, GeneCards et OMIM ont été recherchés avec « néphropathie diabétique » comme terme de recherche. Les gènes issus de GeneCards avec un score de pertinence > 1 ont été conservés. Deuxièmement, trois profils de micro-arrays (GSE30529, GSE104948, GSE96804) ont été obtenus à partir du dépôt GEO. Les échantillons dans GSE30529 provenaient de tubules rénaux, tandis que ceux de GSE104948 et GSE96804 provenaient de glomérules rénaux. Toutes les recherches dans la base de données ont été effectuées le 15 décembre 2024. Les gènes différenciellement exprimés (DEG) entre les patients DN et les témoins sains dans le jeu de données GSE30529 ont été identifiés à l’aide du package limma dans le logiciel R. Les critères de sélection ont été fixés à une valeur p ajustée < 0,05 et |log2(Fold Change)| > 0,5. Les graphiques volcaniques et les cartes thermiques affichaient des gènes exprimés différenciément.

Identification des cibles thérapeutiques présumées de la DJC pour la DN

L’analyse par diagramme de Venn a identifié des loci partagés entre le pool cible DJC et les gènes associés au DN provenant des GeneCards, OMIM et GSE30529 DEG. Ces loci partagés servaient de gènes thérapeutiques candidats pour toutes les procédures de recherche en aval.

Établissement et profilage des réseaux d’interactions protéiques (IPP)

Des loci thérapeutiques supposés ont été téléchargés sur STRING pour construire un réseau d’interactions protéine-protéine, avec un seuil d’interaction fixé au-dessus d’une valeur de confiance de 0,4. Cytoscape a traité les ensembles de données réseau pour une présentation visuelle. Des indices topologiques tels que le degré étaient calculés via le plugin CytoNCA pour identifier les nœuds centraux dans tout le réseau.

Analyse d’enrichissement

Pour délimiter les rôles biologiques et les cascades de signalisation liés aux cibles candidates, l’enrichissement fonctionnel a été analysé en R avec le package clusterProfiler, en utilisant org. Hs.eg.db pour l’annotation et ggplot2 pour la visualisation. Les termes de l’ontologie génique (GO) ont été évalués à travers les catégories de processus biologique (BP), de composante cellulaire (CC) et de fonction moléculaire (MF). Les voies de l’Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG) ont été conservées lorsque la valeur p d’enrichissement était < 0,05.

Application de l’algorithme CytoHubba

Le plugin CytoHubba dans Cytoscape a été utilisé pour calculer quatre indices de centralité topologique pour chaque nœud réseau. Le degré, le nombre de voisins directement connectés, reflète l’étendue des interactions de chaque protéine. La composante de voisinage maximale (MNC), une métrique qui quantifie la taille de la plus grande composante connexe du sous-graphe de voisinage du nœud, mesure l’influence réglementaire locale. Le composant percolé par arêtes (EPC) évalue l’importance structurelle globale via une suppression aléatoire simulée des arêtes et la quantification de la taille moyenne des composantes connectées. Les gènes classés dans le top 20 pour chaque indice ont été intercoupés pour obtenir les gènes centraux finaux.

Dépistage des gènes de base basé sur l’apprentissage automatique

Trois approches d’apprentissage automatique ont été appliquées aux profils d’expression issus du jeu de données GSE30529 afin d’identifier des gènes hub fiables parmi les cibles candidates.

(1) LASSO (Opérateur de réduction et de sélection absolue minimale) : Le paramètre de régularisation λ a été réglé par validation croisée en cinq ans, la valeur optimale étant déterminée par la performance moyenne entre les plis. Les caractéristiques d’expression génique d’entrée ont subi une standardisation automatique du Z-score afin d’éliminer les effets de l’amplitude de l’expression. Avec le paramètre de pénalité α fixé à 1 pour la régularisation LASSO pure, un panneau prédéfini de valeurs de 100 λ a été utilisé pour le cribring. La pénalité L1 réduisait à zéro les coefficients des caractéristiques à faible pertinence, permettant la sélection simultanée des caractéristiques et le contrôle de la complexité, tandis que la force de régularisation accordée en validation croisée atténuait le risque de sur-ajustement.

(2) SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) : Un cadre de validation croisée à deux couches à 5 couches a été utilisé pour garantir un criblage robuste des fonctionnalités. Cinq sous-ensembles non chevauchants ont été générés en divisant stochastiquement l’ensemble de l’ensemble des données, quatre utilisés pour l’entraînement et un pour les tests sur cinq itérations ; La moyenne par pli atténuait le biais lié à la division à échantillon unique. L’élimination récursive des caractéristiques a été appliquée pour réduire la dimensionnalité des caractéristiques et contraindre la complexité du modèle, atténuant ainsi le surapprentissage. Le taux d’erreur de classification et la précision servaient de métriques de performance pour déterminer le nombre optimal de caractéristiques.

(3) Forêt aléatoire (RF) : Une forêt aléatoire initiale de 500 arbres a été construite, le nombre optimal d’arbres étant déterminé par le taux d’erreur minimal de classification hors du sac pour réentraîner le modèle final. Tous les hyperparamètres restants, y compris la taille aléatoire du sous-ensemble de caractéristiques à chaque division de nœud, étaient maintenus dans les paramètres par défaut du package. Les scores d’importance génique du modèle final ont été classés par ordre décroissant pour générer l’ensemble de gènes signatures de la maladie. L’ensemble final des gènes de base a été déterminé en intersectant les résultats de ces trois algorithmes.

Vérification indépendante basée sur un ensemble de données de l’expression des gènes hub

Deux ensembles de données externes indépendants, GSE104948 et GSE96804, ont été utilisés pour valider les niveaux de transcription des gènes hub. Les ensembles de données d’expression génique ont subi une normalisation ; Les différences d’expression entre les cas DN et les sujets sains ont été tracées à l’aide des trousses d’outils ggplot2 et ggsignif de R.

Amarrage moléculaire

Les conformations 3D des protéines cibles centrales (CASP1, ID PDB : 3E4C ; CCL2, ID PDB : 7S00) ont été obtenues à partir de la Protein Data Bank. Les conformations 3D des composés bioactifs ont été obtenues via PubChem. L’acide ursolique, l’acide 3β-hydroxyurs-12-en-28-oïc et la quercétine ont été sélectionnés pour le docking car la pharmacologie en réseau prédisait les interactions entre ces composés actifs et les cibles principales CCL2 ou CASP1. Les structures protéiques ont été prétraitées en dépouillant des ligands et molécules d’eau indigènes, en introduisant des hydrogènes polaires, puis soumises à un amarrage moléculaire à l’aide d’AutoDock Vina. L’affinité de liaison, représentée par le score d’amarrage (en kcal/mol), servait à évaluer la force des interactions. Un seuil d’énergie de liaison de −5,0 kcal/mol a été fixé pour définir des interactions intermoléculaires stables. Les conformations amarrées ont été visualisées à l’aide de PyMOL.

Animaux et conception expérimentale

La présente étude a utilisé 30 souris mâles de 8 semaines de db/db de grade spécifique sans pathogène (SPF), ainsi que 10 souris mâles SPF db/ m db/m d’âge compatibles. Toutes les souris expérimentales ont été élevées dans une installation de qualité SPF sous une photopériode claire-sombre de 12 heures et maintenues dans des conditions stables : 22 ± 2 °C, 50 à 70 % d’humidité relative, et un accès illimité à la nourriture et à l’eau potable régulières. L’approbation éthique pour tous les protocoles expérimentaux in vivo a été accordée par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine chinoise de l’Anhui (Approbation n° AHUCM-mouse-2023059).

Les rongeurs ont suivi une phase d’adaptation de 7 jours avant un regroupement aléatoire (6 animaux chacun) et 8 semaines d’intervention quotidienne. La glycémie à jeun a été mesurée chez tous les animaux expérimentaux ; les animaux ont été attribués à l’aide d’un tableau de nombres aléatoires, et l’histologie, l’IHC et la quantification Western blot ont été réalisées sous évaluation à l’aveugle.

Groupe témoins normal (CTL) : souris db/m recevant du sérum physiologique par voie orale.

Groupe modèle (M) : souris db/db recevant du sérum physiologique par voie orale.

Groupe DJC-Dose Moyenne (DJC-M) : souris en db/db recevant le DJC à 0,78 g/kg (équivalent à la dose clinique quotidienne pour les adultes).

Groupe DJC-Dose élevée (DJC-H) : souris db/db recevant un DJC à 1,56 g/kg (deux fois la dose clinique quotidienne chez les adultes).

Préparation du dosage

L’échelle de dose humaine-murin a été dérivée à l’aide de l’approche de normalisation de la surface corporelle, comme décrit dans la Méthodologie des expériences pharmacologiques, avec un coefficient de conversion de 9,1. La dose clinique quotidienne de DJC était de 6 g pour un adulte de 70 kg (0,0857 g/kg), ce qui donne des doses équivalentes chez la souris de 0,78 g/kg (dose clinique 1 fois) et 1,56 g/kg (dose clinique multipliée par 2). Toutes les souris ont reçu une administration intragastrique à un volume constant de 10 mL/kg. La poudre DJC était précisément pesée et suspendue dans une solution CMC-Na à 0,5 % pour former des suspensions uniformes à 78 mg/mL (dose moyenne) et 156 mg/mL (dose élevée).

Après 8 semaines d’administration quotidienne, une anesthésie a été induite chez toutes les souris expérimentales en utilisant du pentobarbital sodique à 1 %. Des échantillons sanguins ont été prélevés via l’aorte abdominale et centrifugés pour isoler les surnadants dans le cadre d’essais biochimiques en kit. Des cages métaboliques étaient utilisées pour prélever des échantillons d’urine murine. Les tissus rénaux partiels ont été fixés à 4 % de paraformodéhyde pour l’hématoxyline-éosine (HE) et la coloration de Masson. Congelés brusquement dans de l’azote liquide, les tissus rénaux résiduels ont été conservés à −80 °C pour des analyses en aval.

Analyse histologique

Après fixation dans un paraformoldéhyde à 4 %, les tissus rénaux ont subi une déshydratation graduée à l’éthanol, un déblaiement, un embedding à la paraffine et un coupage en série à 4 μm pour la coloration HE et trichrome de Masson. La coloration HE a été réalisée selon des procédures standard (déparaffinisation, réhydratation, coloration nucléaire de l’hématoxyline, différenciation et bleuissement acidifiés de l’éthanol, contre-coloration à l’éosine, déshydratation, dégagement et montage neutre du balume) afin d’observer les modifications histopathologiques rénales. Les coupes ont été immergées dans une coloration à l’hématoxyline pendant 3 minutes, suivies d’une contre-coloration à éosine pendant 15 secondes. Pour la coloration trichrome de Masson, les coupes ont subi une déparaffinisation, une réhydratation, une coloration séquentielle, une différenciation et une séparation des couleurs de l’acide acétique, suivies de déshydratation, de débouchage et de montage pour évaluer l’accumulation de collagène rénal et les changements fibrotiques. La microscopie en champ clair a été utilisée pour inspecter et photographier toutes les sections de tissu colorées à un grossissement de 200×. Les sections colorées par HE ont été notées à l’aide de l’indice de sclérose glomérulaire (GSI). Pour la coloration trichrome de Masson, le préréglage Trichrome de Masson a été appliqué pour isoler le canal de collagène bleu, et le rapport entre la surface du collagène et la surface tissulaire colorée en rouge a été calculé.

Immunohistochimie (IHC)

Après fixation sur 24 heures avec du paraformodéhyde à 4 %, les échantillons de tissu ont été déshydratés par des gradients d’éthanol en série, puis intégrés dans la paraffine et découpés en sections séquentielles de 5 μm. Après la déparaffinisation, les sections ont subi une récupération d’antigènes et un blocage de la peroxydase endogène. Après le blocage, les lames tissulaires ont été incubées avec des anticorps primaires dilués à 4 °C pendant la nuit dans une chambre humide. Les lames ont reçu une incubation secondaire par anticorps à température ambiante après les lavages au PBS, suivie d’une réaction chromogénique DAB jusqu’à atteindre une intensité optimale de coloration. Les coupes ont ensuite subi une contre-coloration séquentielle à l’hématoxyline, une différenciation, un bleuissement, une déshydratation, un déblaiement, un montage sur la gaine de couverture et une imagerie microscopique en champ clair. La récupération d’antigènes a été réalisée par autoclavage pendant 10 minutes, suivie d’un refroidissement naturel à température ambiante. Après un blocage avec un sérum de chèvre à 5 % pendant 60 minutes à température ambiante, des sections ont été incubées avec un anticorps primaire (dilution 1:200) puis un anticorps secondaire IgG anti-lapin conjugué HRP (dilution 1:300) pendant 60 minutes chacune à température ambiante. La réaction chromogénique du DAB a été réalisée pendant 3 à 5 minutes à température ambiante, surveillée au microscope, puis terminée par un rinçage à l’eau distillée. Les images ont été obtenues à un grossissement ×200, et le pourcentage de surface de coloration positive a été quantifié à l’aide d’ImageJ.

Détection ELISA

Les étapes d’analyse respectaient les protocoles officiels fournis par les fournisseurs de kits. Des étalons de lavage et des étalons dilués en série étaient préparés à l’avance. Les puits blancs, standards et d’échantillons étaient chargés de réactifs et incubés dans l’obscurité. Les plaques étaient soigneusement lavées après l’incubation, puis incubées avec l’enzyme conjuguée dans l’obscurité. Après lavage, un substrat chromogénique a été ajouté pour une réaction colorée protégée par la lumière, terminée par un tampon d’arrêt une fois que des dégradés bleus distincts apparaissaient dans les puits standards. L’absorbance (OD) de chaque puits était mesurée à la longueur d’onde cible à l’aide d’un lecteur de microplaques. Les concentrations sériques d’IL-1β et IL-18 ont été quantifiées à l’aide de courbes d’étalonnage générées à partir des valeurs OD des concentrations standard (échantillons séromiques non dilués ; absorbance mesurée à 450 nm ; huit puits réplicés techniques par échantillon). La créatinine urinaire et la protéine urinaire à 24 h ont été mesurées dans des échantillons d’urine non diluée prélevés à l’aide de cages métaboliques de 24 h (absorption mesurée à 546 nm ; huit réplications techniques par échantillon).

PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR)

L’ARN total a été isolé dans les tissus rénaux, et sa pureté ainsi que sa concentration ont été déterminées par spectrophotométrie. L’ARN purifié a été transcrit à l’inverse pour générer des modèles d’ADNc. La RT-qPCR a été réalisée sur un instrument de PCR en temps réel avec le programme de cycle thermique suivant : 5 minutes de pré-dénaturation (95 °C), suivies de 40 cycles d’amplification : 15 s à 95 °C, 1 min à 60 °C. La RT-qPCR a été réalisée lors d’une réaction de 10 μL contenant 5 μL de SYBR Green Master Mix, 0,2 μL d’amorce directe, 0,2 μL d’amorce inverse, 1 μL de gabarit d’ADNc, et 3,6 μL d’eau sans RNase. La transcription inverse pour la synthèse de l’ADNc a été réalisée sur un volume total de réaction de 20 μL. Une analyse de la courbe de fusion a été réalisée pour confirmer la spécificité d’amplification, et chaque échantillon a été analysé en trois réplications techniques. Les niveaux de transcription ont été évalués par normalisation 2⁻ΔΔCq en β-actine, toutes les séquences d’amorce étant listées dans le tableau 1.

Analyse du western blot

Environ 40 mg d’échantillons de tissu rénal ont été prélevés sur chaque cohorte de souris, hachés sur glace, puis entièrement homogénéisés dans un tampon de lyse protéique. Après une rotation de 15 minutes à 12 000 tr/min à 4 °C, le surnageant contenant une protéine totale provenant des homogénéats tissulaires a été collecté, aliquoté et cryopréservé à −80 °C. Le surnageant protéique a été mélangé avec un tampon de chargement et dénaturé en bouillant dans un bain-marie. Environ 10 μL d’échantillon de protéine normalisée ont été chargés par voie et séparés sur des gels SDS-polyacrylamide à 10 %. Les protéines cibles ont été transférées vers des filtres à nitrocellulose par électroblottage humide. Le transfert a été effectué à un courant fixe de 400 mA dans un bain de glace pendant 30 à 45 minutes. Après le transfert, les blots étaient incubés dans du lait écrémé froid pendant 2 heures, puis incubés toute la nuit à 4 °C avec 1:1 000 d’anticorps primaires. Les blots lavés ont été recouverts d’anticorps secondaires correspondants (1:10 000) à 4 °C pendant 2 heures, et les signaux luminescents ont été enregistrés et quantifiés à partir de photos de blot à l’aide du logiciel ImageJ. Pour le GSDMD-N, la tubuline a été utilisée comme contrôle de charge car son poids moléculaire attendu (~35 kDa) chevauche celui du GAPDH (~36 kDa). Toutes les expériences western blot ont été réalisées avec trois réplications biologiques indépendantes.

Analyse statistique

Les données quantitatives sont présentées sous forme de la moyenne ± de l’écart-type (DE). Les différences entre deux groupes ont été analysées avec un test t de Student non apparié, tandis que les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivie du test post hoc de Tukey. Une valeur p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

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Résultats

Identification des composants bioactifs et cibles du DJC

Un total de 66 composés bioactifs répondant aux critères de dépistage (OB ≥ 30 % et DL ≥ 0,18) ont été identifiés parmi les six plantes composant le DJC. Cela comprenait 26 composés de Pseudostellaria heterophylla, 6 de Paeonia suffruticosa, 8 de Cuscuta chinensis, 6 d’Alisma orientale, 10 de Rehmannia glutinosa et 10 de Whitmania pigra

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Discussion

La DN reste une cause majeure de l’ESRD, caractérisée par une pathogenèse complexe et multifactorielle qui n’est pas encore entièrementcomprise 20,21. Bien que le DJC ait montré une efficacité clinique prometteuse pour améliorer la DN, les mécanismes moléculaires sous-jacents sont restés largementinsaisissables 22. Dans cette étude, nous avons utilisé un schéma analytique multi-omique intégrant la pharmaco...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les projets de recherche clés des universités provinciales de l’Anhui (Subvention n° 2024AH050968).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Creatinine (CRE) Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC011-2-1
ECLBiosharpBL520B
Eosin Staining KitServicebioG1002
Goat anti-rabbit IgG-HRP ConjugateAbbkineA21020
Hematoxylin Staining KitServicebioG1004
Masson's Trichrome Stain KitServicebioG1006
Mouse IL-1β ELISA KitMeiMianMM-0040M1
Mouse IL-18 ELISA KitMeiMianMM-0169M1
Rabbit anti-mouse Caspase1 AntibodyAffinityAF5418
Rabbit anti-mouse CCL2 AntibodyAbcamab315478
Rabbit anti-mouse cleaved-Caspase-1 AntibodyAffinityAF4005
Rabbit anti-mouse GAPDH AntibodyZenbioR380626
Rabbit anti-mouse GSDMD-N AntibodyAbcamab219800
Rabbit anti-mouse NLRP3 AntibodyAbcamab263899
Rabbit anti-mouse Tubulin AntibodyAffinityAF7011
Reverse Transcription KitBiosharpBL696A
RIPA Lysis BufferBeyotime BiotechnologyP0013
RIPA Lysis BufferLeagenePS0013
RNA isolation reagentServicebioG3013-100ML
SYBR Green Master MixServicebioG3326-05
Urinary Protein Quantification KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC035-2-1
nom du logicielversion
AutoDock Vina1.2.3
Logiciel Cytoscape3.10.0
GraphPad Prism9.0
ImageJjava 1.8.0_345
PyMOL2.5
Logiciel R4.2.0

Références

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BiologieNum ro 233Num ro 233Valeur videNum roPyroptoseaxe CCL2 CCR2

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