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Article de recherche

Piezo1 favorise le remodelage ECM sclérale via la différenciation mécanique induite par la contrainte

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DOI :

10.3791/71340

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11 août 2026

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1Department of Ophthalmology and Visual Science, Eye and ENT Hospital, Shanghai Medical College, Fudan University, 2NHC Key Laboratory of Myopia, Chinese Academy of Medical Sciences, and Shanghai Key Laboratory of Visual Impairment and Restoration, Fudan University, 3Department of Ophthalmology, Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4Department of Ophthalmology, Shanghai Eye Diseases Prevention and Treatment Center, Shanghai Eye Hospital, Tongji University School of Medicine, 5Jinfeng Laboratory, 6Department of Cell Biology, Zunyi Medical University, 7Shanghai Nineth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 8State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude combine un modèle d’hypertension oculaire chez le rat avec des expériences in vitro de souche mécanique, d’agoniste/inhibiteur et d’ARNi dans des fibroblastes scléraux humains afin de montrer que l’expression de Piézo1 est élevée lors du remodelage de la matrice extracellulaire sclérale et qu’elle est fonctionnellement impliquée dans la différenciation des myofibroblastes.

Résumé

La différenciation des myofibroblastes induite par une tension mécanique est un mécanisme central sous-jacent au remodelage de la matrice extracellulaire sclérale (ECM) dans le glaucome. Cependant, la conversion de la déformation mécanique en signaux biochimiques au sein des fibroblastes scléraires reste insuffisamment élucidée. Cette étude visait à étudier le rôle de Piezo1 dans la prolifération et la différenciation cellulaires, dans le contexte de la différenciation des myofibroblastes induite par une contrainte mécanique lors du remodelage ECM sclérale. Le plan de l’étude combine des observations d’expression in vivo d’un modèle d’hypertension oculaire sur un rat sur une semaine avec des essais mécanistiques in vitro utilisant l’étirement mécanique cyclique (10 % à 0,5 Hz pendant jusqu’à 24 heures) et la modulation pharmacologique de Piezo1 (agoniste Yoda1, inhibiteur GsMTx4 et knockdown du siRNA) dans les fibroblastes scléraux humains primaires (cellules HSF). Nos résultats démontrent que Piezo1 s’exprime dans les tissus scléraires et les cellules HSF. Dans le groupe in vivo, une augmentation significative des niveaux de protéines Piezo1 a été observée dans la sclère des rats hypertendus oculaires après une semaine, coïncidant avec une expression élevée de collagène de type I (COL1) et de α actine musculaire lisse (α-SMA). Dans les expériences in vitro, l’étirement mécanique (8–24 h) a augmenté l’expression de Piezo1 dans les cellules HSF. De plus, l’activation de Piezo1 avec Yoda1 (24 h) a facilité la prolifération des cellules HSF et amélioré l’expression de α-SMA et COL1. Inversement, la réduction ou l’inhibition de Piézo1 a supprimé l’expression de COL1 et a entravé la différenciation des myofibroblastes sous contrainte mécanique. De plus, l’activation de Piezo1 a conduit à une augmentation de l’expression de la protéine Yes-associated (YAP), tandis que l’expression de YAP induite par la contrainte mécanique était diminuée lors de la mise en échec ou de l’inhibition de Piezo1. En résumé, nos résultats suggèrent que Piezo1 joue un rôle dans l’expression induite par la contrainte mécanique des composants clés de la MCE dans la sclère, dans le contexte du glaucome, et pourrait représenter une cible thérapeutique potentielle nécessitant une validation in vivo supplémentaire.

Introduction

Le glaucome est une cause majeure de cécité irréversible caractérisée par une dégénérescence progressive des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) et des axones du nerf optique (ONH), touchant 76 millions de personnes dans le monde en 2020 1,2. Une pression intraoculaire (PIO) élevée est le facteur de risque le plus important pour leglaucome 3 et la réduction de la PIO est actuellement la seule option disponible pour retarder le développement et la progression duglaucome 4. L’ONH, la structure par laquelle les axones RGC sortent de l’œil, est le principal site de dommage du glaucome. L’élévation de la PIO induit une tension mécanique et un déplacement dans l’ONH, entraînant la dégénérescence des axones RGC au sein de la cribrose laminaire (LC), conduisant finalement à une neuropathie optiqueglaucomate 5,6.

La sclère péripapillarie (PPS) est le principal tissu porteur de charge de l’ONH, les propriétés mécaniques de la PPS déterminant la réponse de l’ONH à la déformation mécanique induite parla PIO 7,8. La modélisation par éléments finis et des études ex vivo ont confirmé que la déformation biomécanique du LC repose sur la raideur sclérale, et qu’une raideur accrue du PPS contribue à réduire la contrainte dans le LC 9,10. Ensuite, la variation de raideur11,12 et d’épaisseur13 de PPS peut modifier les propriétés biomécaniques liées à la PIO de l’ONH, modifiant ainsi la susceptibilité aux lésions du nerf optiqueglaucomate 14,15. Dans des études biomécaniques, la rigidité oculaire de la sclère glaucomate était supérieure à celle normale des yeux humains post-mortem 16,17, et un raidissement péripapillaire de la sclérome a été observé de manière constante aussi bien chez le glaucome humain que chez les modèles animauxexpérimentaux 18,19,20. Ces données suggèrent que le raidissement de la sclère pourrait être une réponse protectrice due à une diminution de la déformation ONH induite par la PIO lors du glaucome.

Les caractéristiques biomécaniques du tissu sclérographique résultent de la composition de la matrice extracellulaire synthétisée par lesfibroblastes 21. Des preuves récentes suggèrent que la tension mécanique résultant d’une augmentation de la PIO est capable d’activer les fibroblastes scléraires résidant dans lasclère 22, de favoriser la différenciation des myofibroblastes23 et de provoquer une remodelation de laMCE 24,25. La transformation mécanique induite par la déformation des myofibroblastes est un processus clé lors du remodelage de la MCE sclérale dans le glaucome, mais il n’est pas clair comment cette déformation mécanique est convertie en signaux biochimiques et en réponses cellulaires dans les fibroblastes scléraux.

Piézo1 est un membre d’une nouvelle famille distincte de canaux mécanosensibles cationiques non sélectifs impliquée dans la fibrose de plusieurs organes, y compris la peau cardiaque etpulmonaire 26,27. La déformation mécanique peut activer les canaux cellulaires Piézo1, entraînant une augmentation de l’afflux de Ca2+ 28, ce qui permet de générer une signalisation dépendante du calcium pour réguler diverses activités cellulaires, notamment la prolifation, la motilité et la différenciation des fibroblastes29,30. Des études récentes ont révélé que, sous contrainte mécanique, Piezo1 favorise les processus fibrotiques cutanés en stimulant la prolifération des fibroblastes, la motilité etla différenciation 31. Cette étude comprend deux composantes complémentaires : une étude descriptive in vivo de l’expression de Piezo1 dans un modèle d’hypertension oculaire chez un rat, et une étude mécaniste in vitro utilisant des fibroblastes scléraires humains primaires sous contrainte mécanique cyclique. Nous avons émis l’hypothèse que la souche mécanique active le Piézo1, qui favorise la différenciation des myofibroblastes et l’expression des composants ECM dans les fibroblastes scléraux, potentiellement via la signalisation YAP.

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Protocole

Les rats mâles Sprague-Dawley (âgés de 8 semaines) ont été prélevés auprès du Centre Expérimental pour Animaux de l’Hôpital pour enfants de l’Université Fudan. Tous les rats étaient à volonté et hébergés sous SPF à 22±1 °C et un cycle jour/nuit de 12 heures. Toutes les expériences animales ont respecté la Déclaration ARVO concernant l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été approuvées par le comité d’éthique institutionnel et le comité d’éthique de l’Hôpital pour enfants de l’Université Fudan (2022JS-EKYY-019). Les tissus scléraires humains utilisés pour dériver les fibroblastes sclérales humains primaires ont été prélevés à partir de la sclérotique donneuse conformément aux directives institutionnelles, et toutes les procédures associées ont été approuvées par le comité d’éthique institutionnel de l’Université Fudan (2024-YS-187).

Conception expérimentale

La présente étude a utilisé à la fois des approches in vivo et in vitro, conceptuellement liées par une contrainte mécanique, pour examiner la contribution de Piezo1 au remodelage de la MCE scléraire. In vivo, nous avons utilisé un modèle d’hypertension oculaire chez le rat pour examiner l’expression de Piezo1 sous une PIO élevée. In vitro, nous avons soumis des fibroblastes scléraires humains primaires à un étirement mécanique cyclique pour modéliser la contrainte mécanique subie par la sclère dans le glaucome, et nous avons manipulé l’activité de Piezo1 à l’aide d’un agoniste pharmacologique (Yoda1), d’un inhibiteur (GsMTx4) et d’un knockdown par siRNA.

Modèle expérimental d’hypertension oculaire chronique (OHT)

Un total de 18 rats mâles SD ont été utilisés. Chez chaque rat, l’œil droit a reçu une injection de carbomère pour induire l’hypertension oculaire (OHT), l’œil gauche controlatéral servant de groupe témoin (NT). Trois répliques biologiques indépendantes de l’ensemble de l’expérience ont été réalisées, pour un total de 18 yeux par groupe. L’unité expérimentale était l’œil individuel. Les chercheurs effectuant des mesures de la PIO et l’analyse Western blot étaient aveugles quant à l’allocation des groupes.

Un modèle expérimental de THO chronique a été généré chez les rats comme décritprécédemment 25. En résumé, les rats ont été anesthésés avec 10 % d’hydrate de chloral, et après dilatation pupillaire par la tropamide, une solution de carbomère (0,3 %, 20 μL) a été injectée dans la chambre oculaire antérieure. Le chlortétracycline hydrochlorure a été appliqué pour prévenir l’infection. Les mesures de la PIO ont été effectuées avec un tonomètre de rebond après 3 et 7 jours. Des tissus de la sclère ont été prélevés une semaine après que le modèle ait été considéré comme établi.

Les tissus scléraires ont été isolés comme décrit précédemment endétail 25. Après anesthésie, les rats ont été perfusés transcardiquement avec 4 % de formaldéhyde dans le PBS. Le tissu orbitaire extrainte a été disséqué du globe, et les structures du segment antérieur (cornée, iris, cristallin) ainsi que le vitré ont été soigneusement retirés. La rétine et la choroïde ont été doucement grattées sur la paroi sclérale interne. Les tissus de la sclère postérieure ont été collectés et identifiés par coloration pathologique H&E.

Culture cellulaire

Les fibroblastes scléraux humains primaires (cellules HSF) étaient une lignée cellulaire déjà établie à partir de la sclère32 d’un donneur humain. Trois réplications biologiques indépendantes (cellules de trois donneurs différents) ont été utilisées pour chaque expérience. Les cellules HSF ont été maintenues dans le DMEM complétées avec 15 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humidifiée). Les cultures étaient réparties tous les quatre jours, et les cellules HSF entre les passages 5 et 9 étaient utilisées pour toutes les expériences. Les cellules HSF ont été confirmées par immunofluorescence à l’aide de marqueurs de cellules actine de type collagène I et musculaire lisse-α.

Application de la stimulation mécanique

Le système d’étirement mécanique cyclique a été utilisé pour produire un étirement cyclique mécanique. Une densité de semis de 2×105 cellules/mL a été utilisée pour les cellules HSF placées en plaques à six puits avec des fonds flexibles recouverts de collagène. Les cellules du groupe d’étirement ont été exposées à un étirement cyclique à 10 % d’amplitude et 0,5 Hz comme décrit dans notre étudeprécédente 32. Les cellules cultivées dans des plaques d’étirement, mais laissant de la statique, servaient de témoins. Expérience de knockdown du siARN Piezo1 : Les cellules ont reçu une transfection de 48 heures de siRNA Piezo1 ou d’un siRNA témoins négatif avant l’étirement mécanique. Après transfection, les cellules subissaient un étirement mécanique cyclique pendant 24 heures. Quatre groupes étaient inclus : (A) cellules témoins transfectées par siRNA sans étirement ; (B) contrôler les cellules transfectées par ARNōr par étirement ; (C) Des cellules transfectées par Piezo1 par siRNA sans étirement ; (D) Cellules transfectées par Piezo1 siRNA avec étirement. Expérience avec l’inhibiteur Piézo1 (GsMTx4) : Les cellules ont été traitées avec 5 μM GsMTx4 avant et pendant l’étirement mécanique. Quatre groupes étaient inclus : (A) cellules non traitées sans étirement ; (B) cellules non traitées avec étirement ; (C) Cellules traitées par GsMTx4 sans étirement ; (D) Cellules traitées par GsMTx4 avec étirement (avec GsMTx4 présentes partout). Expérience agoniste piezo1 (Yoda1) : Des cellules ont été cultivées en présence de Yoda1 à 5 μM pendant 24 heures. Deux groupes étaient inclus : (A) contrôle non traité (véhicule) ; (B) Cellules traitées à Yoda1.

Plaque western

Les niveaux de protéines ont été évalués par Western blotting selon des procédures de routine. En résumé, nous avons lysé des échantillons de fibroblastes scléraires ou cultivés dans un tampon RIPA. La protéine (20 μg) a été résolue par SDS-PAGE puis tachée sur les membranes de la nitrocellulose. Les membranes ont ensuite été bloquées avec 5 % de BSA pendant 1 h à température ambiante, suivies d’une incubation nocturne à 4 °C avec les anticorps primaires appropriés. Les anticorps utilisés comprenaient Piézo1, collagène de type I, α actine musculaire lisse, YAP et GAPDH. L’anticorps Piezo1 a été validé par le fabricant pour le Western blot et l’immunofluorescence dans les tissus de rats et humains, avec des données de knockout/knockdown disponibles sur la fiche produit. Après trois lavages avec TBST, nous avons incubé les membranes avec des anticorps secondaires conjugués HRP appropriés (anti-lapin ou anti-souris) pendant 1 h à température ambiante. Les intensités de bande étaient ensuite mesurées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, et le signal de chaque bande cible était normalisé au signal GAPDH de la même voie. Les données résultantes sont présentées sous forme de variation de pli par rapport à la condition de témoin.

Prolifération cellulaire

La prolifération cellulaire a été évaluée par un test de viabilité colorimétrique selon le protocole fourni. Nous avons ajouté un composé tétrazolium (10 μL/mL) à chaque puits et incubé les plaques pendant 2 h dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % de CO2). L’absorption était alors mesurée à 450 nm.

Transfection d’ARN interférant de petits

La transfection de siRNA Piezo1 a été réalisée commedécrit précédemment 31. Les séquences étaient les suivantes : Piezo1-siRNA, 5'-AGAAGAUCGUCAAGUATT-3' (sens) et 5'-UACUUGACGAUCUUCUUCUTT-3' (antisens), siRNA témoins négatif (NC), 5'-GUGAGCGUCUAUACCAUTT-3' (sens) et 5'-AUGGUAUAUAGACGCUCACTT-3' (antisens).

Immunofluorescence

Pour l’immunofluorescence, les cellules cultivées ont été fixées avec 4 % de paraformodéhyde (20 min, température ambiante), perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 (40 min), puis bloquées avec 10 % de BSA. Les coupes tissulaires ont subi une fixation nocturne à 4 % de paraformodéhyde à température ambiante, suivie d’une perméabilisation et d’un blocage. Les sémimens ont été incubés avec des anticorps primaires contre Piezo1 et α-SMA. Par la suite, nous avons appliqué des anticorps secondaires conjugués par colorant fluorescents : anti-souris marqués en vert (pour α-SMA) et anti-lapin marqués en rouge (pour Piezo1), chacun à une dilution de 1:500. Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI, et des images capturées au microscope à fluorescence.

Traitement par agoniste et inhibiteur

Les cellules HSF ont été traitées avec 5 μM GsMTx4 et 5 μM de l’agoniste Piézo1 Yoda1 sur la base d’étudesantérieures 33.

Analyse statistique

Chaque expérience a été réalisée en triple exemplaire. Les résultats sont présentés en moyenne ± écart-type (DS). Pour les comparaisons entre deux groupes, nous avons appliqué un test t de Student à deux côtés. Des comparaisons multiples de groupes ont été réalisées avec l’ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Tukey. La normalité des données a été vérifiée par le test de Shapiro-Wilk, et l’homogénéité des variances a été évaluée à l’aide du test de Levene. La signification statistique a été définie comme p < 0,05. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec un logiciel statistique dédié.

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Résultats

Piézo1 s’exprime dans les tissus de la sclère de rat et les cellules HSF

Nous avons d’abord examiné l’expression de Piezo1 dans les tissus scléraires de rat (in vivo) et dans les fibroblastes scléraux humains cultivés (in vitro). Pour interroger l’expression tissulaire spécifique de Piezo1, la base de données d’annotation génétique BioGPS a étéutilisée 34. L’analyse BioGPS a révélé que Piezo1 est fortement exprimé dans ...

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Discussion

Une pression intraoculaire élevée (PIO) induit une tension mécanique dans la tête du nerf optique et la cribrose laminaire, contribuant à la dégénérescence des cellules ganglionnairesrétiniennes 38,39. La sclère péripapillarie (PPS) est un tissu porteur majeur qui influence la biomécaniquede l’ONH 40. Des études antérieures ont montré que la tension mécanique induit une différenciation fibroblaste sclérale...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Subvention n° 82401257).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0.3% carbomer solution (Carbomer 940 polymer)Solarbio, Shanghai, China—20 μL
10% chloral hydrateMacklin, Shanghai, China—3 mL/kg
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse secondary antibodyThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA —
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibodyThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA—
BioFlex six-well culture plates (coated with collagen I)Flexcell Int Corp, Hillsborough, NC, USA—
Chlortetracycline hydrochlorideZhenhua Pharmaceutical, Yunnan, China—
COL1 primary antibodyNovus Biologicals, CO, USA—
DMEMGibco, Grand Island, NY, USA—
FBSGibco Life Technologies, Australia—
GAPDH primary antibodyBioworld, MN, USA—
GraphPad Prism version 8.4Inc., San Diego, CA, USA—
Nikon Eclipse E800 microscopeNikon, Melville, NY, USA—
Nitrocellulose membranesPierce, Rockford, IL, USA—
Penicillin-streptomycinHyclone, South Logan, UT, USA—
Piezo1 primary antibodyNovus Biologicals, CO, USA—
Rebound tonometer (TonoLab)Icare, Espoo, Finland—
RIPA bufferThermo Fisher Scientific, Shanghai, China—
The Flexcell FX-5000 Tension SystemFlexcell International Corporation—Used to apply mechanical cyclic stretch to HSF cells.
TropicamideBausch Lomb Freda, Shandong, China—
YAP primary antibodyCell Signaling Technology, Danvers, USA—
α-SMA primary antibodyAbcam, Cambridge, UK—

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