Bioinformatique et analyse quantitative en temps réel de la réaction en chaîne par polymérase de SUCNR1 et GPR37L1 dans la schizophrénie

Résumé

Cette étude évalue SUCNR1 et GPR37L1 comme marqueurs moléculaires candidats associés à la schizophrénie grâce à une analyse bioinformatique intégrée de l’ensemble de données GSE54913, une validation quantitative en temps réel de la réaction en chaîne par polymérase (qRT-PCR), et une analyse de corrélation avec la mémoire verbale dans une cohorte indépendante.

Résumé

La schizophrénie est un trouble mental sévère, complexe et multifactoriel impliquant de nombreux éléments de susceptibilité génétique, entraînant un handicap, une morbidité et une mortalité importants. Malgré des progrès significatifs dans la compréhension de sa physiopathologie et de son étiologie, les biomarqueurs diagnostiques spécifiques de la schizophrénie restent insaisissables. Cette étude visait à identifier des marqueurs moléculaires candidats associés à la schizophrénie. Une analyse bioinformatique intégrée a été réalisée sur le jeu de données public de microarrays GSE54913. L’ontologie génétique (GO) et les analyses des voies de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ont révélé que les termes GO les plus significativement enrichis étaient liés à l’activité des canaux, incluant l’activité passive du transporteur transmembranaire, l’activité des canaux ioniques, l’activité des canaux à la porte et l’activité des canaux spécifiques au substrat. Les cinq principales voies enrichies du KEGG étaient la sécrétion d’insuline, la voie de signalisation du cAMP, la réparation par excision des nucléotides, la voie de signalisation du TNF et le métabolisme du glutathion. La validation a été réalisée à l’aide de réaction en chaîne quantitative en temps réel par polymérase (qRT-PCR) sur un ensemble d’échantillons indépendants de l’hôpital Wuhan Rongjun Youfu. Les résultats qRT-PCR étaient en grande partie compatibles avec l’analyse par microarray (Pearson r = 0,89, IC à 95 % : 0,66–0,97). L’analyse du réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) a identifié deux gènes hubs, SUCNR1 et GPR37L1, qui étaient significativement associés au terme GO « activité des canaux ioniques » et enrichis dans la voie KEGG « sécrétion d’insuline ». De plus, l’expression de SUCNR1 montrait une corrélation négative avec les scores de mémoire verbale (r = -0,54, P = 0,015), tandis que GPR37L1'expression montrait une corrélation positive (r = 0,59, P = 0,0034). Ces résultats suggèrent que l’expression modifiée de SUCNR1 et GPR37L1 pourrait être associée à la schizophrénie et pourrait représenter des marqueurs moléculaires candidats pour des investigations ultérieures.

Introduction

La schizophrénie est un trouble mental chronique et complexe d’étiologie non identifiée, caractérisé par un dysfonctionnement cérébral sévère, des troubles cognitifs et des déficits^{psychosociaux 1}. Elle représente un fardeau sanitaire mondial majeur, affectant plus de 21 millions de personnes dans le^{monde 2}. Bien que les approches diagnostiques et thérapeutiques aient considérablement évolué au cours des cinquante dernières années, la pathogenèse centrale reste incertaine, et les résultats à long terme associés à un handicap, une morbidité et une mortalité importants ne se sont pas nettement^{améliorés 3}. Il est donc impératif d’identifier des gènes pivots potentiels et des cibles régulatrices.

La physiopathologie de la schizophrénie, bien qu’elle ne soit pas entièrement élucidée, est largement attribuée aux polymorphismes génétiques et aux variations d’expression⁴. Par exemple, la variation génétique du gène alpha œstrogène peut influencer la susceptibilité à la schizophrénie par une régulation alternative des gènes et un traitement des^{transcrits 5}. De même, une variante promoteur fonctionnelle de NRG1 a été liée à la schizophrénie et corrélée à une expression réduite de l’isoforme⁶ de type III NRG1. Des études post-mortem ont montré une expression significativement réduite des isoformes de PDE4B dans les cerveaux schizophrènes, suggérant son potentiel^{prédictif 7}. Parmi les autres candidats figurent le transporteur de dopamine (DAT), le transporteur de monoamine vésiculaire (VMAT2) et la monoamine oxydase (MAO), qui régulent les niveaux synaptiques de dopamine et peuvent servir de^{biomarqueurs 8}. De plus, TCP1 peut contribuer à des déficits du cytosquelette par un mauvais repliement de l’actine dans la^{schizophrénie 9}. Ainsi, élucider les profils d’expression génique dans la pathogenèse de la schizophrénie pourrait fournir des éclairages sur la prédiction des risques, la compréhension mécanistique et l’évaluation thérapeutique.

Les approches computationnelles récentes ont fait progresser l’identification des gènes associés à la maladie grâce à l’analyse intégrée des réseaux et aux méthodes d’apprentissage^automatique 10,11,12. Malgré de nombreuses études génétiques, aucun biomarqueur diagnostique sanguin fiable n’a été appliqué en pratique clinique pour la schizophrénie. Pour combler cette lacune, la présente étude a utilisé une approche bioinformatique intégrée pour réanalyser le jeu de données GSE54913, qui contient des données transcriptomiques sanguines provenant de patients schizophrènes bien caractérisés et de témoins sains. L’ensemble de données a été sélectionné parce que (1) les échantillons de sang périphérique sont peu invasifs et cliniquement pratiques, (2) il inclut une taille d’échantillon relativement large parmi les microarrays de la schizophrénie disponibles publiquement, et (3) les données brutes étaient disponibles pour une réanalyse. Les objectifs de cette étude étaient : (1) identifier des gènes différenciément exprimés chez les patients schizophrènes comparés aux témoins sains utilisant le jeu de données GSE54913 ; (2) effectuer des analyses d’enrichissement fonctionnel et d’analyses de réseaux PPI pour identifier les gènes hubs ; (3) valider l’expression des gènes candidats par qRT-PCR dans une cohorte indépendante ; et (4) explorer la corrélation entre l’expression des gènes hub et la performance de la mémoire verbale. À la connaissance des auteurs, il s’agit de la première étude à identifier SUCNR1 et GPR37L1 comme des marqueurs moléculaires sanguins candidats pour la schizophrénie.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital Wuhan Rongjun Youfu (code d’identification du projet, YF-IRB202310215) et menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki. Tous les participants étaient des résidents de la communauté chinoise et ont donné leur consentement écrit et informé.

Sujets d’étude et prélèvement sanguin
Dix adultes diagnostiqués schizophrènes et dix volontaires témoins sains sans antécédents familiaux de maladie mentale sur trois générations ont été inscrits. Critères d’inclusion pour les patients atteints de schizophrénie : (1) diagnostic de schizophrénie selon les critères du DSM-5 confirmé par deux psychiatres seniors indépendants ; (2) âgés de 18 à 65 ans ; (3) aucun changement de médicament antipsychotique pendant au moins 4 semaines avant le prélèvement sanguin ; (4) la volonté de fournir un consentement éclairé écrit. Critères d’exclusion : (1) maladies médicales majeures comorbides (par exemple, diabète, maladies cardiovasculaires, cancer) ; (2) abus ou dépendance aux substances au cours des 6 derniers mois ; (3) handicap intellectuel ; (4) grossesse ou allaitement. Critères d’inclusion pour les témoins en bonne santé : (1) absence d’antécédents personnels ou familiaux (sur trois générations) de maladie mentale ; (2) absence d’utilisation actuelle ou passée de médicaments antipsychotiques ; (3) correspondant par âge et sexe au groupe schizophrène ; (4) pas de maladies médicales majeures. La durée moyenne de la maladie chez les patients schizophrènes était de 12,5 ± 6,8 ans ; Tous les patients prenaient des antipsychotiques stables (6 sous rispéridone, 4 sous olanzapine) ; la moyenne du score total PANSS était de 76,4 ± 12,3. Les témoins ont été appariés selon l’âge (±5 ans) et le sexe (5 hommes, 5 femmes par groupe). La mémoire verbale a été évaluée à l’aide du score total de rappel du Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R). Tous les sujets ont été recrutés à l’hôpital Wuhan Rongjun Youfu entre le 1er janvier et le 31 juillet 2025. Les données démographiques de référence sont résumées dans le Tableau 1.

La taille de l’échantillon a été déterminée à l’aide d’un logiciel de calcul de taille d’échantillon pour un test t indépendant à deux facettes avec une taille d’effet de 1,2, α = 0,05, et une puissance (1-β) = 0,80, donnant un minimum de neuf sujets par groupe.

Le sang veineux était prélevé dans des tubes anticoagulés à l’EDTA et traité sans délai. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont ensuite été séparées des échantillons par centrifugation à gradient de densité à l’aide d’un milieu à gradient de densité. En résumé, le sang a été dilué 1:1 avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS, pH 7,4), superposé sur le milieu du gradient de densité, puis centrifugé à 400 × g pendant 30 minutes à 20 °C sans le frein désactivé. Après centrifugation, l’interface contenant PBMC a été soigneusement transférée vers un nouveau tube. Les cellules ont été rincées deux fois avec du PBS, chaque lavage suivi d’une centrifugation à 300 × g pendant 10 minutes à 4 °C, et le dernier pellet a été suspendu dans le PBS. La viabilité a été évaluée à l’aide de la méthode d’exclusion de colorant bleu de trypan, et seules des préparations contenant ≥95 % de cellules viables ont été utilisées. Les PBMC isolés ont été aliquotés et stockés à −80 °C pendant un maximum de 3 mois avant l’extraction d’ARN.

Données de microarrays
Le flux de travail de l’étude est illustré à la Figure 1. Le jeu de données de microarrays GSE54913 a été téléchargé depuis la base de données GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Cet ensemble de données a été sélectionné parce que (1) il contient des données transcriptomiques provenant d’échantillons de sang périphérique, qui sont peu invasifs et cliniquement pratiques pour la découverte de biomarqueurs ; (2) elle inclut un échantillon relativement large parmi les ensembles de données de microarrays sur la schizophrénie accessibles publiquement (18 patients, 12 témoins) ; (3) les données brutes étaient disponibles pour une réanalyse. Selon le registre GEO, les échantillons provenaient de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), et non de plasma. La description originale « échantillons de plasma » dans la version précédente était une erreur et a été corrigée.

Prétraitement des données et criblage génique différentiellement exprimé (DEG)
Données brutes (. CEL) étaient prétraités à l’aide d’un logiciel de prétraitement de micro-tableaux. La correction de fond a été effectuée à l’aide de la méthode Robust Multichip Average (RMA), suivie de la normalisation des quantiles et de la transformation log2. Les sondes sans aucune annotation génétique ont été filtrées. Les sondes présentant >20 % de valeurs manquantes entre les échantillons ont été exclues ; Les valeurs manquantes pour les sondes restantes ont été imputées à l’aide de l’algorithme des k plus proches voisins (k = 10) implémenté dans un logiciel d’imputation à valeurs manquantes. Les effets du lot n’étaient pas présents car tous les échantillons étaient traités dans un seul lot selon le registre GEO. Après prétraitement, les valeurs d’expression de 17 200 gènes ont été obtenues pour une analyse en amont. Les DEG entre les patients schizophréniques et les témoins sains ont été identifiés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’expression différentielle. Les gènes présentant un taux de fausse découverte (FDR) < 0,05, un changement de pliage absolu (FC) > 1,2, et un taux de P < 0,05 étaient considérés comme exprimés différenciément. Un seuil de FC relativement bas (FC absolue > 1,2) a été choisi car la schizophrénie est un trouble psychiatrique complexe dans lequel les différences d’expression génique individuelles sont souvent subtiles plutôt que dramatiques.

Analyses GO et d’enrichissement des voies
Des analyses d’enrichissement fonctionnel pour les termes Ontologie Génique (GO) et les voies de l’Encyclopédie des Gènes et Génomes de Kyoto (KEGG) ont été réalisées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’enrichissement fonctionnel. L’ensemble de gènes de fond comprenait tous les gènes ayant passé le prétraitement (17 200 gènes). Des termes d’enrichissement et des voies avec des valeurs P brutes < 0,05 ont été rapportés. Parce que les valeurs P brutes étaient utilisées pour les sorties d’enrichissement GO et KEGG, ces résultats doivent être interprétés comme exploratoires.

Analyse du réseau PPI et identification des gènes centraux
Une base de données d’interactions protéine-protéine a été utilisée pour construire un réseau IPP, avec un score combiné d’interaction > 0,9 fixé comme seuil. Le réseau a été visualisé à l’aide d’un logiciel de visualisation réseau. Les gènes hub ont été identifiés à l’aide d’un plugin d’identification des gènes hub avec l’algorithme Degree. Les 10 premiers nœuds ayant obtenu les meilleurs scores de diplôme ont été sélectionnés comme gènes hub. Le sous-réseau des gènes clés du hub a été extrait à l’aide d’un plugin d’extraction de sous-réseau avec des paramètres par défaut (coupure de degré = 2, seuil de score de nœud = 0,2, K-core = 2, profondeur maximale = 100).

Isolation totale de l’ARN et qRT-PCR
β-Actine était utilisé comme gène de référence interne (ménage). La stabilité de l’expression de β-actine entre les échantillons a été confirmée par l’absence de différence significative dans les valeurs de Ct entre les groupes schizophrène et témoin (P > 0,05). La quantification relative a été réalisée en utilisant la méthode 2^−ΔΔCt . Toutes les réactions étaient effectuées en triple exemplaire, et la valeur moyenne de Ct était utilisée pour le calcul (voir les séquences d’amorces dans le tableau 2). Les dix meilleurs DEG (cinq les plus fortement augmentés et cinq les plus fortement baissés par le changement de plongement) ont été sélectionnés pour une validation initiale qRT-PCR afin de confirmer la fiabilité globale des données des microarrays. Par la suite, SUCNR1 et GPR37L1 ont été sélectionnés pour une validation ciblée sur la base de trois critères : (1) ils ont été identifiés comme gènes hub dans l’analyse du réseau PPI (degré ≥ 7) ; (2) ils étaient significativement associés au terme GO enrichi de haut niveau « activité des canaux ioniques » et à la voie KEGG « sécrétion d’insuline » ; (3) codent tous deux des GPCR, qui sont des cibles médicamenteuses connues dans la schizophrénie.

Analyse statistique
La normalité a été évaluée avec le test de Shapiro–Wilk. Les variables présentant une distribution approximativement normale (P > 0,05) ont été analysées à l’aide de méthodes paramétriques, y compris le test t de Student pour les comparaisons à deux groupes et l’ANOVA unidirectionnelle pour les comparaisons impliquant plus de deux groupes. Lorsque l’hypothèse de normalité n’était pas respectée, des tests de Mann–Whitney U ou Kruskal–Wallis étaient utilisés, selon le cas. Tous les tests statistiques étaient à deux queues. Pour les comparaisons multiples (par exemple, dans les tests post-hoc ANOVA), la méthode du taux de fausse découverte de Benjamini-Hochberg (FDR) a été appliquée, avec un seuil FDR de 0,05. Pour les analyses de corrélation, aucune correction par comparaison multiple n’a été appliquée, car seules deux corrélations ont été effectuées ; les valeurs P brutes sont rapportées avec prudence.

Résultats

Identification des DEG et regroupement hiérarchique
L’analyse du jeu de données GSE54913 a identifié 473 gènes différenciellement exprimés (DEG), dont 357 à la hausse et 116 à la baisse, entre les patients atteints de schizophrénie et les témoins (Figure 2A,B). Le regroupement hiérarchique de ces DEG distinguait les échantillons de schizophrénie des témoins (Figure 2C).

Analyse d’enrichissement fonctionnel des DEG
L’analyse d’enrichissement GO a identifié des termes liés à l’activité des canaux, notamment l’activité passive du transporteur transmembranaire, l’activité des canaux ioniques, l’activité des canaux à la porte et l’activité des canaux spécifiques au substrat (P < brute 0,05 ; Tableau 3). L’analyse des voies KEGG a identifié la sécrétion d’insuline, la voie de signalisation du cAMP, la réparation par excision des nucléotides, la voie de signalisation TNF et le métabolisme du glutathion comme les voies enrichies par le dessus (P brut < 0,05 ; Figure 3C et Tableau 4).

Validation des DEG supérieures par qRT-PCR
Les cinq gènes les plus hauts régulés (HCN3, OLFML2A, NOX1, MRGPRX1 et BRIP1) ainsi que les cinq gènes les plus hauts (CCL22, PNMA2, TBX20, ERAS et C12orf68) ont été validés par qRT-PCR. Les gènes validés et les valeurs correspondantes de logFC dans les microarrays sont listés dans le tableau 5, la validation qRT-PCR est montrée à la Figure 4, et les valeurs brutes de Ct sont fournies dans le tableau supplémentaire S1. Les changements de pli qRT-PCR étaient directionnellement cohérents avec les données de microarray pour les dix gènes (tous P < 0,05 selon le test U de Mann-Whitney). La corrélation de Pearson entre le microarray logFC et le qRT-PCR logFC était r = 0,89 (IC à 95 % : 0,66–0,97, P = 0,0004), indiquant un fort accord. Les différences d’expression de SUCNR1 et GPR37L1 ont également été confirmées (Figure 5A,B).

Analyse du réseau PPI
Un réseau PPI a été construit à partir de tous les DEG (score d’interaction > 0,9 ; Figure 6A). Les dix principales protéines centrales basées sur le degré de connectivité étaient RTP5 (degré = 14), CXCL1 (degré = 8), CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4, SUCNR1 (degré = 7) et ATM (degré = 5) (Figure 6B et Tableau 6). Un sous-réseau de gènes clés du hub a été extrait à l’aide d’un plugin d’extraction de sous-réseau avec des paramètres par défaut. L’algorithme d’extraction de sous-réseau a identifié un cluster densément connecté contenant RTP5, CXCL1, CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4 et SUCNR1, avec un score de cluster de 6,2. ATM n’était pas inclus dans le sous-réseau car il avait une connectivité plus faible avec le cluster central (Figure 6C).

Association entre la mémoire verbale et SUCNR1/GPR37L1
L’expression de SUCNR1 était significativement élevée, tandis que l’expression de GPR37L1 était réduite, chez les patients atteints de schizophrénie comparés aux témoins sains (Figure 5A,B). L’expression de SUCNR1 a montré une corrélation négative avec les scores de mémoire verbale (r = -0,54, IC à 95 % : -0,79 à -0,13, R² = 0,287, P = 0,015 ; Figure 5C), tandis que GPR37L1'expression montrait une corrélation positive avec les scores de mémoire verbale (r = 0,59, IC à 95 % : 0,20 à 0,82, R² = 0,349, P = 0,0034 ; Figure 5D). Des analyses de corrélation ont été réalisées sur les 20 sujets, dont 10 patients atteints de schizophrénie et 10 témoins sains. Avec un échantillon de 20, l’étude disposait de 80 % de la capacité à détecter un coefficient de corrélation de |r| > 0,6 à α = 0,05. Compte tenu de la taille modeste de l’échantillon, ces résultats corrélationnels sont préliminaires et nécessitent une validation dans des cohortes indépendantes plus larges.

Déclaration de disponibilité des données
Le jeu de données GSE54913 analysé dans cette étude est accessible au public via le Gene Expression Omnibus. Les valeurs brutes de qRT-PCR Ct sont fournies dans le tableau supplémentaire S1. Les scripts d’analyse, les fichiers de sortie DEG, les résultats d’enrichissement, les fichiers réseau PPI et les fichiers sources de figures sont disponibles à https://sandbox.zenodo.org/records/514960 ou 10.5072/zenodo.514960.

Figure 1 : Diagramme de flux : collecte des données, prétraitement, analyse et validation. Analyses de microarrays d’ARNm sur PBMC obtenues à partir de GSE54913. Des analyses d’enrichissement fonctionnel et de voies GO ont été réalisées sur les DEG. Les 10 meilleurs gènes classés par changement de pli ont été sélectionnés pour la validation des données de microarray à l’aide de qRT-PCR. L’analyse du réseau IPP a identifié deux gènes centrals. Enfin, une analyse ex vivo des deux gènes hubs SUCNR1 et GPR37L1 a été réalisée. Abréviations : DEGs = gènes exprimés différemment ; ARNm = ARN messager ; PBMCs = cellules mononucléaires du sang périphérique ; qRT-PCR = réaction en chaîne quantitative en temps réel ; IPP = interaction protéine-protéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Sélection des DEG et analyse hiérarchique du regroupement. (A) Complot volcanique des DEGs. L’axe horizontal représente log₂ (changement de pliage), et l’axe vertical représente –log₁₀ (valeur P). Les points verts et rouges représentent des gènes exprimés différemment, et les points noirs représentent des gènes non exprimés différenciellement. (B) Le nombre de DEG à la baisse et à la hausse. (C) Carte thermique des gènes exprimés différemment. Le rouge indique la régulation à la hausse et le vert indique la régulation à la baisse. Abréviation : DEGs = gènes exprimés différemment. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Analyses d’enrichissement GO et KEGG des DEG. (A,B) l’enrichissement GO et (C) l’enrichissement KEGG sont montrés à partir des valeurs brutes de P. Abréviations : DEGs = gènes exprimés différemment ; GO = Ontologie des gènes ; KEGG = Encyclopédie Kyoto des gènes et génomes ; BP = processus biologique ; CC = composante cellulaire ; MF = fonction moléculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Validation des données de microarrays pour les dix gènes les plus dérégulés à l’aide de la qRT-PCR. (A) Des cinq premiers DEG détenus. (B) Augmentation de la régulation des cinq premiers DEG. Les données sont la moyenne ±erreur standard de la moyenne. Les valeurs p sont indiquées dans les cases correspondantes. Abréviations : DEGs = gènes exprimés différemment ; qRT-PCR = réaction en chaîne quantitative en temps réel par la polymérase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Expression de SUCNR1 et GPR37L1 chez les patients schizophréniques et chez les témoins sains. (A) SUCNR1 et (B) GPR37L1 expression déterminée par qRT-PCR. Corrélation entre la mémoire verbale et (C) SUCNR1 et (D) GPR37L1 expression. Les données sont indiquées sous forme de moyenne ± d’erreur standard de la moyenne, lorsque cela est applicable. Les valeurs p pour les corrélations sont indiquées dans les panneaux correspondants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Analyse du réseau d’interactions protéine-protéine. (A) Réseau PPI analysé à l’aide d’une base de données d’interactions protéine-protéine. (B) Les protéines classées par degré d’association dans le réseau IPP. (C) Sous-réseau visualisé à l’aide d’un logiciel de visualisation réseau après analyse d’extraction de sous-réseau. Abréviation : IPP = interaction protéine-protéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Variable	Sujets témoins (n = 10)	Patients atteints de schizophrénie (n = 10)
Âge (année)	36,5 ± 10,6	44,5 ± 9,5
Sexe féminin, n ( %)	5 (50)	5 (50)
Temps de sommeil quotidien (h)	5.4 ± 3.1	7.5 ± 1.2
Indice de masse corporelle (IMC ; kg/m²)	25.2 ± 4.1	22,9 ± 2,3
Score de mémoire verbale	61 ± 18	30,2 ± 10,8
Les données sont présentées en moyenne ± écart-type ou nombre ( %).

Tableau 1 : Caractéristiques de base des patients schizophrènes et des sujets témoins.

Symbole génétique	Séquence d’amorce avant (5'→3')	Séquence d’amorce inversée (5'→3')
HCN3	GTCCGCCGGGGGGTTGGAT	CCTCCCACTGGTGTATGTAGC
OLFML2A	CAGGCAGAGCGGGCGAAG	AATATTTGCGGACTGGGTCA
NOX1	CACCCCAAGTGTGTGTGG	CCAGACTGGAATATCGGTGACA
MRGPRX1	CTAGGGTACCACGGAGGATT	TGGTTCTGGAGGCTCCTTGC
BRIP1	CAGATGAGGGCG-TAAGTGA	CGTCCTCCGGAGCTCTCTAG
CCL22	TCCATCATCTCTCTCTGACTCTGA	CTGTGGGTCAGAGTCAGAAGAGA
PNMA2	GCGGGTCAATTCTCGGGACA	GTCCTGCCCCCAGGTGGTTT
TBX20	GAGGGAAAGTGTGGAGAGCC	AAGGCTGACCCTCGATTTGG
ERAS	AGTCTATTATTTTTGGGCACC	CCTTGTGGTTCCCTGAGAC
C12orf68	TTCAACCCCTACACCGAGTT	CTTGAACGTGGACTGCAGC
GPR37L1	ATGTTTCTTGCCGAGCAGTG	CCACATGGAATCGGTCTAT
SUCNR1	ACAGAAGCCGACAGCAGAAT	GCACAGGAAAGCAAGTCAG
β-Actine	CTAAGGCCAACCGTGAAAAG	GCATACAGGGACAACACAG
qRT-PCR : réaction en chaîne quantitative en temps réel par la polymérase.

Tableau 2 : Amorces PCR pour qRT-PCR.

GO ID	Mandat	Valeur p brute	Comte
GO : 0015267	Activité de la chaîne	0.000000056	13
GO : 0022803	Activité passive du transporteur transmembranaire	5.78E-08	13
GO :0005216	Activité des canaux ioniques	0.000000127	12
GO : 0022839	Activité des canaux à ions guidés	0.000000131	11
GO : 0022836	Activité en canal fermé	0.000000136	11
GO : 0022838	Activité des canaux spécifiques au substrat	0.00000017	12
GO :0005261	Activité des canaux cationiques	0.00000668	9
GO : 0015276	Activité des canaux ioniques ligand-dépendants	0.000315	5
GO : 0022834	Activité des canaux verrouillés par ligands	0.000315	20
GO :0022890	Activité du transporteur transmembranaire cationique inorganique	0.000487	20
GO : 0008324	Activité du transporteur transmembranaire cationique	0.0009	18
GO :0099094	Activité des canaux cationiques ligand-verrouillés	0.00128	16
ALLEZ : 0005244	Activité des canaux ioniques dépendants de la tension	0.001382	16
GO 0022832	Activité des canaux dépendants de la tension	0.001382	18
GO : 0046873	Activité du transporteur transmembranaire d’ions métalliques	0.001836	21
GO : 0022824	Activité des canaux ioniques à commande d’émetteur	0.002762	19
GO :0022835	Activité des canaux verrouillés par l’émetteur	0.002762	13
Note : Les valeurs P sont brutes et non ajustées ; la signification était définie comme P brut < 0,05.

Tableau 3 : Analyse ontologique des gènes exprimés différemment (P brut < 0,05).

ID	Description	Valeur p brute	Comte
HSA04911	Sécrtion d’insuline	0.007066	6
HSA04024	Voie de signalisation cAMP	0.010661	10
HSA03420	Réparation de l’excision des nucléotides	0.013724	4
HSA04668	Voie de signalisation TNF	0.023694	6
HSA00480	Métabolisme du glutathion	0.02466	4
HSA04740	Transduction olfactive	0.032104	15
HSA05222	Cancer du poumon à petites cellules	0.03572	5
HSA00590	Métabolisme de l’acide arachidonique	0.035991	4
HSA04080	Interaction neuroactive ligand-récepteur	0.037546	12
HSA05031	Addiction aux amphétamines	0.045653	4
HSA05203	Cancérogenèse virale	0.046404	8
HSA04933	Voie de signalisation AGE-RAGE dans les complications diabétiques	0.04831	5
Note : Les valeurs P sont brutes et non ajustées ; la signification était définie comme P brut < 0,05.

Tableau 4 : Encyclopédie Kyoto des gènes et des génomes analyse d’enrichissement des gènes (raw P < 0,05).

Symbole génétique	Nom complet officiel	logFC	Valeur p brute
Régulation à la baisse
HCN3	Canal 3 cyclique activé par nucléotide, activé par hyperpolarisation	-1.489	0.0001
OLFML2A	Protéine de type olfactomedine 2A	-1.521	0.0042
NOX1	NADPH oxydase 1	-1.522	0.0022
MRGPRX1	Membre récepteur couplé à la protéine G liée à MAS X1	-1.526	0.0003
BRIP1	Protéine J du groupe anémie de Fanconi	-1.699	0.0018
Régulation à l’augmentation
CCL22	Chimiokine C-C motif 22	2.517	0.0041
PNMA2	Antigènes paranéoplasiques Ma	2.159	0.0062
TBX20	Facteur de transcription T-box TBX20	1.866	0.0001
ERAS	Époques GTPase	1.846	0.0008
C12orf68	Domaine à bobine enroulée contenant 184	1.839	0.0002
Note : logFC et les valeurs P brutes proviennent de l’analyse d’expression différentielle des microarrays.

Tableau 5 : Les dix DEG principaux classés par variation de pli dans les gènes à la hausse et à la baisse.

Symbole génétique	Description	Co-gènes (n)	Valeur p
RTP5	Protéine transporteur récepteur 5	14	0.000276
CXCL1	Protéine alpha régulée par la croissance 1	8	0.011423
CXCL10	Motif C-X-C chimiokine 10	7	0.046144
GPR37L1	Récepteur de la prosaposine GPR37L1	7	0.003792
HCAR1	Récepteur de l’acide hydroxycarboxylique 1	7	0.046572
OPRL1	Récepteur de la nociceptine 1	7	0.039753
P2RY4	P2Y purinocepteur 4	7	0.001279
SSTR4	Récepteur de la somatostatine type 4	7	0.006742
SUCNR1	Récepteur succiné 1	7	0.000105
DAB	Sérine-protéine kinase ATM	5	0.004961
IPP : interaction protéine-protéine ; DEG : gènes exprimés différemment.

Tableau 6 : Les 10 principaux gènes hub identifiés dans le réseau PPI pour les DEG.

Tableau complémentaire 1 : Valeurs brutes de qRT-PCR, flux de travail complet d’analyse bioinformatique et résultats traités (DEG, GO/KEGG et PPI) pour l’étude Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La schizophrénie est un trouble sévère et multifactoriel impliquant de nombreux facteurs de susceptibilité génétique^13,14. Bien que des progrès aient été réalisés dans la compréhension de sa physiopathologie, des biomarqueurs diagnostiques fiables font encore défaut. Dans cette étude, une approche bioinformatique intégrée a identifié 473 DEG dans des échantillons sanguins de patients atteints de schizophrénie. Les analyses GO et KEGG ont mis en lumière l’enrichissement des termes et voies liés à l’activité des canaux, notamment la sécrétion d’insuline, la signalisation du cAMP, la réparation par excision des nucléotides, la signalisation du TNF et le métabolisme du glutathion. L’analyse du réseau IPP a également identifié SUCNR1 et GPR37L1 comme des gènes hub, et leur expression était associée à la performance de la mémoire verbale, suggérant leur pertinence potentielle en tant que marqueurs moléculaires associés à la schizophrénie.

L’enrichissement des termes « activité de canal » dans les GO s’aligne avec les recherches antérieures sur la schizophrénie. Les canaux calciques dépendants de la tension (par exemple, CACNA1C, CACNB2) et les canaux potassiques (par exemple, Kv3, Kv2.1) ont été impliqués dans la susceptibilité à la schizophrénie et l’excitabilité neuronale 15,16. De même, les principales voies KEGG identifiées sont cohérentes avec la littérature existante. L’hyperinsulinémie et les anomalies de la sécrétion d’insuline sont rapportées dans la schizophrénie précoce¹⁷. La voie de signalisation du cAMP est de plus en plus liée à la physiopathologie^{de la maladie 18}. Les mécanismes de réparation par excision des nucléotides, y compris la modification de la variante histone H2AX, peuvent également jouer un rôle 19,20,21,22. De plus, la signalisation du TNF et le métabolisme du glutathion ont été associés à la pathogenèse de la^{schizophrénie 23,24}.

Le trouble de la mémoire verbale est un déficit cognitif fondamental dans la schizophrénie, est présent au début de la maladie et est associé à des résultats fonctionnels. Le Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R) est une mesure bien validée de l’apprentissage verbal et de la mémoire. Évaluer la corrélation entre l’expression des marqueurs candidats et la performance de la mémoire verbale aide à établir la pertinence clinique, car le trouble cognitif est un déterminant majeur du handicap dans la schizophrénie.

Bien que les dix DEG les plus validés par qRT-PCR aient correspondu aux données de micro-tableaux, ils ne correspondaient pas étroitement aux résultats principaux de GO/KEGG. En revanche, SUCNR1 (régulé à la hausse) et GPR37L1 (régulé à la baisse) étaient significativement associés à une « activité des canaux ioniques » et enrichis par une « sécrétion d’insuline ». Les deux gènes codent pour des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), qui sont des cibles critiques des antipsychotiques et modulent l’activité des canaux^{ioniques 25}.

SUCNR1 (GPR91) relie le stress métabolique à la sécrétion et résistance à^{l’insuline 26,27}, et la résistance à l’insuline est un facteur de risque connu^{pour la schizophrénie 28}. GPR37L1, un récepteur orphelin fortement exprimé dans le cerveau, est impliqué dans le développement cérébelleux et la fonction^{motrice 29}, et a été impliqué dans la maladie de Parkinson³⁰ et le transport rénal^{de sodium 31}. Son rôle dans la schizophrénie peut impliquer la modulation de l’activité des canaux ioniques.

Le trouble de la mémoire verbale est une caractéristique centrale de la schizophrénie, reflétant la responsabilité génétique et la gravité de la^{maladie 32,33}. La corrélation inverse entre l’expression de SUCNR1 et la corrélation positive de l’expression GPR37L1 avec les scores de mémoire verbale renforcent en outre leur pertinence potentielle dans la schizophrénie.

Plusieurs limites doivent être reconnues. Premièrement, la taille de l’échantillon pour la cohorte de validation (n = 10 par groupe) était petite, ce qui limite la puissance statistique et la généralisabilité. Deuxièmement, tous les patients atteints de schizophrénie recevaient des médicaments antipsychotiques, donc les changements d’expression observés pourraient refléter les effets du médicament plutôt que la pathologie de la maladie. Les études futures devraient inclure les patients naïfs des médicaments ayant un premier épisode. Troisièmement, la cohorte de validation manquait de confirmation RNA-seq ; Le séquençage à l’échelle du transcriptome dans de grandes cohortes indépendantes est justifié. Quatrièmement, le plan transversal exclut l’évaluation des relations causales entre les niveaux de biomarqueurs et la progression de la maladie. Cinquièmement, les analyses de corrélation avec la mémoire verbale étaient exploratoires et nécessitaient une réplication. Sixièmement, le jeu de données GSE54913 a été généré sur une plateforme de micro-arrays qui présente une sensibilité inférieure à celle de RNA-seq. Les orientations futures incluent des études longitudinales pour suivre les niveaux de SUCNR1 et GPR37L1 au cours de la maladie et du traitement, des études fonctionnelles pour élucider les rôles mécanistiques de ces GPCR dans la physiopathologie de la schizophrénie, ainsi que le développement d’un test cliniquement validé pour ces biomarqueurs.

En résumé, cette analyse intégrée suggère que l’expression altérée de SUCNR1 et GPR37L1 est associée à la schizophrénie et à la performance de la mémoire verbale. Ces gènes peuvent représenter des marqueurs moléculaires associés à la schizophrénie candidats. Cependant, les limites incluent une taille d’échantillon relativement petite et une évaluation partielle de la sévérité de la schizophrénie par la mémoire verbale. Des études supplémentaires sont nécessaires pour valider ces résultats.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction