Article de recherche

Caractérisation moléculaire et génomique ciblée représentative des gènes de virulence chez Staphylococcus aureus issus d’infections diabétiques du pied

DOI :

10.3791/71373

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29 mai 2026

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1Department of Microbiology, College of Medicine, University of Anbar, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Pharmacy, University of Anbar

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a caractérisé les mécanismes de résistance antimicrobienne, les déterminants de virulence et les caractéristiques génomiques des isolats de Staphylococcus aureus récupérés d’infections diabétiques du pied grâce à des tests de susceptibilité antimicrobienne, un profilage de virulence basé sur PCR et un séquençage du génome entier.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les infections du pied diabétique (DFI) représentent un problème majeur de santé publique, et le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA) est l’un des agents pathogènes les plus cliniquement significatifs. Cette étude a étudié la prévalence des gènes de virulence (can et hlg), les profils de résistance aux antimicrobiens et les caractéristiques génomiques représentatives des isolats multirésistants de S. aureus récupérés chez des patients atteints de DFI. Une étude observationnelle transversale a été menée sur 125 patients atteints d’infections diabétiques du pied entre janvier et décembre 2024. Des tests de susceptibilité aux antimicrobiens ont été réalisés en utilisant la méthode de diffusion du disque Kirby–Bauer et le dépistage de la céfoxitine selon les directives du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), avec S. aureus ATCC 25923 utilisée comme souche de contrôle qualité. La susceptibilité à la vancomycine a été confirmée par un test de concentration inhibitrice minimale (CMI). La réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été utilisée pour détecter les gènes de virulence (can et hlg) et les gènes blaOXA-groupe I. Le séquençage du génome entier (WGS) a été réalisé sur deux isolats représentatifs, dont un isolat multirésistant aux médicaments (MDR) et un isolat largement résistant aux médicaments (XDR), en utilisant une approche de séquençage de novo pour générer des assemblages de génomes brouillons. Parmi 125 échantillons cliniques, une croissance bactérienne a été observée dans 90 échantillons (72 %), dont 45 isolats (50 %) ont été identifiés comme S. aureus. Parmi ces isolats, 35/45 (77,78 %) étaient classés comme MRSA, et 36/45 (80 %) étaient multirésistants. Le gène hlg a été détecté dans tous les isolats, tandis que le gène can a été identifié dans 13/45 (28,89 %) isolats. Aucun gène blaOXA-groupe I n’a été détecté. L’analyse génomique a identifié plusieurs gènes associés à la résistance, dont blaZ, tet(38), norA et vanT, ainsi que des éléments CRISPR-Cas et des déterminants de résistance associés aux plasmides. Ces résultats soulignent la forte prévalence de S. aureus multirésistant aux médicaments dans les IFD et soutiennent l’importance d’une surveillance génomique continue des souches résistantes cliniquement pertinentes.

Introduction

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De nombreuses caractéristiques de colonisation et de virulence font de la bactérie à gram positif Staphylococcus aureus (S. aureus) un agent pathogène opportuniste prévalent capable de provoquer une large gamme d’infections, notamment l’impétigo, les infections des plaies, les fouroncles, les abcès cutanés, la bactériémie et l’endocarditeinfectieuse 1. Certaines de ces infections peuvent évoluer vers une maladie grave et nécessiter une hospitalisation, en particulier chez les patients atteints de diabète sucré, d’immunosuppression, de malignité, de cathétérisme urinaire ou d’infection par le virus de l’immunodéficience humaine1.

Les souches de S. aureus résistantes à la méthicilline (MRSA) sont associées à une morbidité et une mortalité importantes en raison de leur capacité à acquérir rapidement des déterminants de résistance antimicrobienne et persistent dans les environnements de soinsde santé 1. Les patients atteints de diabète sucré développent fréquemment des ulcères du pied diabétique en raison de neuropathie, d’insuffisance vasculaire et de réponses immunitairesaltérées 2. Les infections du pied diabétique (IFD) présentent une physiopathologie complexe, et les résultats cliniques sont influencés à la fois par des facteurs microbiens et associés à l’hôte, y compris la virulencebactérienne 3. Bien que les ulcères du pied diabétique puissent contenir des communautés polymicrobiennes composées de bactéries et de champignons aérobies et anaérobies, S. aureus reste l’un des agents pathogènes prédominants isolés de cesinfections. L’organisme possède plusieurs déterminants de virulence qui facilitent l’évasion immunitaire, l’invasion tissulaire, la colonisation chronique et l’infection persistante. De plus, l’acquisition de résistance à la méthicilline médiée par mecA/SCCmec et d’autres déterminants de la résistance antimicrobienne a considérablement limité les options thérapeutiques pour les infections associées auDFI 4,5. Des études antérieures ont rapporté une forte prévalence d’isolats de S. aureus multirésistants aux médicaments (MDR) dans les infections du pied diabétique, avec une résistance fréquemment associée aux gènes β-lactamase, y compris les variants BLATEM, BLAOXA et BLACTX-M 6.

Plusieurs gènes associés à la virulence contribuent à la pathogénicité et à la persistance de S. aureus dans les infections chroniques des plaies. Parmi ceux-ci, le gène hlg code γ-hémolysine, un facteur cytotoxique associé à la destruction tissulaire, à l’inflammation, à l’évasion immunitaire et à la persistance de souches de MRSA acquises dans lacommunauté 7,8. Le gène CAN code pour une adhésine liant le collagène, facilitant l’adhésion bactérienne aux tissus riches en collagène et contribuant à la colonisation chronique et à la persistance del’infection 8. Des études antérieures ont identifié une forte prévalence de la GL chez les isolats de MRSA récupérés d’infections du pied diabétique, mettant l’accent sur la cooccurrence de la virulence et des déterminants de la résistance aux antimicrobiens dans cesinfections 9. L’exposition inappropriée aux antibiotiques, l’hospitalisation prolongée, la pénétration tissulaire altérée des antimicrobiens et la progression chronique de la plaie contribuent encore à l’émergence et à la dissemination des organismes MDR chez les patients atteints deDFI 10. Selon les définitions internationales, les bactéries multirésistantes aux médicaments (MDR) présentent une résistance à au moins un agent antimicrobien sur trois classes d’antimicrobiens ou plus, les bactéries fortement résistantes aux médicaments (XDR) restent sensibles à une ou deux classes antimicrobiennes seulement, et les bactéries résistantes aux pandmédicaments (PDR) sont résistantes à toutes les classesantimicrobiennes 10 testées. Malgré l’importance clinique reconnue de S. aureus dans les infections du pied diabétique, il existe des informations moléculaires et génomiques intégrées reliant les déterminants de virulence aux profils de résistance antimicrobienne dans les isolats cliniques de cette région.

Par conséquent, cette étude visait à caractériser les schémas de résistance aux antimicrobiens, à déterminer la prévalence de certains gènes de virulence (HLG et CAN), à étudier la présence des gènes BLAdu groupe OXA I, et à réaliser une analyse représentative du séquençage du génome entier sur des isolats sélectionnés de S. aureus multirésistants récupérés chez des patients atteints d’infections diabétiques du pied.

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Protocole

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1. Étudier les patients

Cette étude a été approuvée par le Comité d’approbation éthique de l’Université d’Anbar, Ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche scientifique, Irak (Approbation n° 145), ville de Ramadi, gouvernorat d’Anbar, Irak, le 24 décembre 2023. Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été réalisées conformément aux directives éthiques institutionnelles de l’Université d’Anbar. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant l’inscription.

Une étude observationnelle transversale a été menée de janvier à décembre 2024 dans les hôpitaux universitaires Ramadi et dans des cliniques privées affiliées dans le gouvernorat d’Anbar, en Irak. Un total de 125 patients éligibles consécutifs atteints d’infections diabétiques du pied (DFI) ont été inscrits durant la période de l’étude. La taille de l’échantillon a été déterminée en fonction du nombre de patients éligibles disponibles durant la période de l’étude plutôt que par un calcul statistique. Cliniquement, la DFI était définie comme la présence d’un ulcère au pied, quel que soit le grade, chez des patients atteints de diabète sucré de type 1 (DT1DM) ou de diabète sucré de type 2 (DT2DM). Des patients masculins et féminins présentant des sévérités ulcéréeuses variables ont été inclus.

Les patients étaient éligibles s’ils présentaient un ulcère diabétique du pied diagnostiqué cliniquement, s’ils fréquentaient les établissements de santé participants et fournissaient leur consentement éclairé. Les critères d’exclusion comprenaient des ulcères du pied sans lien avec le diabète sucré (par exemple, des ulcères traumatiques), une orientation d’autres établissements de santé, l’incapacité à fournir un consentement éclairé en raison d’une maladie grave, la réception d’un traitement antibiotique dans les 48 heures précédant la prélèvement du spécimen, ainsi que des infections polymicrobiennes. Les patients atteints d’infections polymicrobiennes ont été exclus afin d’assurer une caractérisation phénotypique, moléculaire et génomique précise des isolats de Staphylococcus aureus . Les données démographiques et cliniques, incluant l’âge, le sexe, les complications diabétiques, la durée du diabète, les antécédents antibiotiques et les affections comorbides, ont été collectées à l’aide d’un questionnaire structuré.

Les échantillons cliniques ont été transportés au laboratoire de microbiologie dans les 2 heures suivant la collecte, dans des conditions réfrigérées (4 °C), à l’aide de précipolations stériles contenant un milieu d’Amies, puis traités immédiatement pour une analyse microbiologique. Toutes les procédures impliquant des échantillons cliniques, des cultures bactériennes, des tests de susceptibilité antimicrobienne, la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et la visualisation ultraviolette (UV) ont été réalisées selon des conditions de laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) conformément aux directives institutionnelles de biosécurité. Le personnel de laboratoire utilisait des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, y compris des blouses de laboratoire, des gants jetables, des masques chirurgicaux et des protections oculaires lorsque nécessaire. Des procédures strictes d’aseptisme ont été suivies dans toutes les procédures microbiologiques et moléculaires afin de minimiser les risques de contamination et d’exposition. Des zones de travail dédiées étaient utilisées pour la manipulation des cultures bactériennes et les procédures d’amplification de l’ADN afin d’éviter la contamination croisée. Les matériaux contaminés, y compris les plaques de culture, les écouvillons, les pointes de pipette et les objets jetables, ont été autoclavés à 121 °C et 15 psi pendant 15 à 20 minutes avant leur élimination. Les objets tranchants étaient jetés dans des contenants biohazard désignés pour résister aux perforations. Les déchets biologiques étaient gérés selon les protocoles institutionnels d’élimination des déchets biomédicaux. Ces mesures de biosécurité ont permis la manipulation sûre des organismes multirésistants, y compris le SARM et les isolats résistants à la vancomycine (Figure 1).

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Figure 1 : Aperçu du flux de travail clinique, microbiologique, moléculaire, de séquençage du génome entier et de bioinformatique utilisé dans l’étude. La figure résume la collecte de spécimens, la culture microbiologique, les tests de susceptibilité aux antimicrobiens, la détection moléculaire basée sur PCR, le séquençage du génome complet et les analyses bioinformatiques en aval. Cette figure a été générée avec l’aide de la plateforme de conception basée sur l’IA Gamma Pro (Gamma App) puis revue, révisée et validée par les auteurs pour une précision scientifique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Les données ont été analysées à l’aide de la version 22.0 du logiciel SPSS. Des statistiques descriptives, y compris les moyennes et les pourcentages, ont été calculées. Les associations entre variables catégorielles ont été analysées à l’aide du test du chi carré. Une valeur p <0,05 était considérée comme statistiquement significative.

2. Traitement et collecte des échantillons

Des échantillons ont été prélevés dans la partie plus profonde des ulcères du pied diabétique à l’aide de la technique du prélèvement profond. Deux cotons-tiges stériles préhumidifiés avec un bouillon stérile ont été fermement tournés sur la base de la plaie après débridement avec un scalpel stérile et nettoyage avec une solution saline stérile pour minimiser la contamination par des micro-organismes colonisateurs. Un prélèvement a été utilisé pour la coloration de Gram, tandis que le second a été utilisé pour la culture microbiologique. Des frottis directement colorés en Gram ont été examinés microscopiquement.

Des échantillons de tissu osseux ont été prélevés sur des patients présentant une ostéomyélite cliniquement suspectée dans des conditions stériles après débridement chirurgical. Avant la collecte des échantillons, les surfaces des ulcères ont été nettoyées avec une solution stérile normale afin de réduire la contamination superficielle. Les échantillons de tissu osseux étaient prélevés de manière aseptique à l’aide d’instruments chirurgicaux stériles et immédiatement transférés dans des contenants stériles pour un traitement microbiologique.

Les spontans ont été homogénéisés ou finement hachés dans des conditions stériles et inoculés sur de l’agar sanguin, de l’agar de sel de mannitol (MSA), de l’agar MacConkey et de l’agar nutritif. Les plaques étaient incubées en aérobie à 37 °C pendant 18 à 24 heures. L’agar sanguin et l’agar nutritif soutenaient la croissance des organismes à gram positif et à gram négatif, tandis que l’ASM était utilisé pour l’isolement sélectif et la différenciation des espèces de Staphylococcus , y compris S. aureus. L’agar MacConkey était utilisé pour la récupération des bactéries à Gram négatif. Les plaques de culture ont été examinées après incubation, et les spécimens sans croissance visible après 48 heures ont été déclarés « sans croissance ».

L’identification bactérienne préliminaire était basée sur la morphologie de la colonie, la coloration de Gram et les caractéristiques biochimiques, suivie d’une confirmation moléculaire de S. aureus par amplification PCR du gène nuc . L’identification biochimique comprenait des tests de catalase, des tests de coagulase sur lames et tubes, la fermentation du mannitol et les tests de DNase. Les isolats confirmés ont été identifiés en outre à l’aide du système VITEK 2 Compact avec la carte d’identification GP VITEK 2. Les résultats d’identification n’ont été acceptés que lorsque le niveau de confiance était de ≥95 %. Les résultats discordants ou à faible confiance ont été retestés à l’aide d’analyses biochimiques répétées et de tests VITEK répétés. Des isolats purs ont été conservés dans du glycérol à 20 % préparé dans un bouillon d’infusion cérébrale-cœur (BHI) pour des analyses moléculaires et génomiques ultérieures (Figure 1).

3. Test de susceptibilité aux antimicrobiens

Des tests de susceptibilité aux antimicrobiens ont été réalisés en utilisant la méthode de diffusion par disque Kirby–Bauer conformément aux directives du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) de 2022. Des tests ont été réalisés sur l’agar Mueller–Hinton avec une profondeur standardisée d’agar de 4 mm. Les cultures bactériennes fraîches ont été ajustées à un standard McFarland de 0,5 à l’aide d’un densitomètre avant l’inoculation. Des prélevés stériles ont été utilisés pour inoculer uniformément les surfaces de l’agar.

Les disques antimicrobiens suivants ont été utilisés : ampicilline (10 μg), gentamicine (10 μg), amikacine (30 μg), céfoxitine (30 μg), céfuroxime (30 μg), piperacilline/tazobactam (100/10 μg), meropenème (10 μg), amoxicilline–acide clavulanique (30 μg), oxacilline (1 μg), lévofloxacine (5 μg), clindamycine (2 μg), tigecycline (15 μg), ciprofloxacine (5 μg), érythromycine (15 μg), triméthoprime–sulfaméthoxazole (25 μg), linézolide (30 μg), et de vancomycine (30 μg). Les plaques étaient incubées aérobies à 37 °C pendant 16 à 18 heures. Les diamètres des zones ont été interprétés selon les points de rupture CLSI.

Le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA) a été identifié grâce au dépistage de la céfoxitine (30 μg) selon les recommandations du CLSI. Les tests de contrôle qualité ont été réalisés à l’aide de S. aureus ATCC 25923. Toutes les expériences ont été réalisées en double afin d’assurer la reproductibilité. Les isolats multirésistants aux médicaments (MDR), largement résistants aux médicaments (XDR) et pandrug-résistants (PDR) ont été classés selon des définitions internationales de standard basées sur des profils de résistance aux antimicrobiens (Figure 1).

4. Détection de S. aureus résistant à la méthicilline (MRSA)

Un test de diffusion par disque de céfoxitine (30 μg) a été utilisé comme méthode phénotypique pour la détection du SARM. Les isolats avec zones d’inhibition ≥22 mm ont été classés comme S. aureus sensible à la méthicilline (MSSA), tandis que les isolats avec zones d’inhibition ≤21 mm ont été classés comme SARM selon les critères CLSI (Figure 1).

5 Détermination de la résistance à la vancomycine par test de concentration inhibitrice minimale (CMI)

Les concentrations inhibitrices minimales (MIC) de vancomycine ont été déterminées par la méthode de microdilution du bouillon selon les directivesCLSI 11. Des dilutions doubles de vancomycine (4–512 μg/mL) étaient préparées dans le bouillon Mueller–Hinton. Les suspensions bactériennes ont été ajustées à une norme McFarland de 0,5 et diluées à environ 1 × 105 UFC/mL.

Après incubation à 37 °C pendant 24 heures, la CMI a été définie comme la concentration la plus basse à laquelle aucune croissance bactérienne visible n’a été observée. La susceptibilité à la vancomycine a été interprétée selon les critères CLSI comme suit : susceptible (≤2 μg/mL), intermédiaire (4–8 μg/mL) et résistant (≥16 μg/mL)11,12 (Figure 1).

6. Détection moléculaire

6.1 Extraction ADN

Des isolats de Staphylococcus aureus ont été cultivés dans un bouillon d’infusion cérébrale-cérébrale (BHI) pendant 24 heures à 37 °C. L’ADN génomique bactérien a été extrait à l’aide d’un kit commercial et d’un système automatisé d’extraction d’acides nucléiques. L’ADN extrait était stocké à −20 °C jusqu’à utilisation. La concentration d’ADN a été mesurée à l’aide d’un fluoromètre pour évaluer l’adéquation à l’amplification par PCR. La concentration moyenne d’ADN était de 85 ± 8,2 ng/μL.

Des amorces ciblant les gènes can, hlg et β-lactamase de classe D (blaOXA-groupe I) ont été obtenus commercialement et utilisés pour l’amplification par PCR, comme indiqué dans les Tableaux1 13, 14, 15, 16.

Tableau 1 : Séquences d’amorces utilisées pour l’amplification par PCR des gènes cibles étudiées dans cette étude. Le tableau résume les gènes cibles, les séquences d’amorce, les tailles d’amplicons attendues, les températures de recuit et les références utilisées pour l’amplification PCR des gènes NUC, mecA, hlg, can etbla du groupe OXA I dans les isolats de Staphylococcus aureus récupérés d’infections du pied diabétique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

6.2 Détection moléculaire des gènes de virulence et de β-lactamase de classe D (blaOXA-groupe I) par PCR

Les séquences d’amorces utilisées dans cette étude sont listées dans le tableau 1. L’amplification par PCR de mecA, nuc, gènes associés à la virulence et gènes de classe D β-lactase (blaOXA-groupe I) a été réalisée dans des mélanges réactionnels de 25 μL contenant 12,5 μL de GoTaq Green Master Mix (2×), 0,5 μL de MgCl2, 3 μL de gabarit génomique d’ADN, 1 μL de amorces avant et arrière (10 pmol/μL), et 7 μL d’eau sans nucléase.

Les conditions de cycle thermique consistaient en une étape initiale de dénaturation à 95 °C pendant 5 minutes, suivie de 30 à 35 cycles d’amplification, incluant une dénaturation à 95 °C pendant 30 s–1 min, un recuit à 50–62 °C pendant 30 s–1 min selon l’ensemble d’amorce, et une extension à 72 °C pendant 30 s–1 min. L’extension finale a été réalisée à 72 °C pendant 7 à 19 minutes.

Les produits PCR amplifiés ont été séparés sur des gels d’agarose à 1,5 % à 2 % colorés avec Safe Red et visualisés sous éclairage ultraviolet à l’aide d’un système de documentation sur gel. Des contrôles négatifs étaient inclus à chaque exécution PCR pour confirmer la validité de l’amplification.

7. Séquençage du génome entier (WGS)

Le séquençage du génome entier (WGS) a été réalisé sur deux isolats cliniques représentatifs de Staphylococcus aureus récupérés à partir d’échantillons de tissu osseux obtenus chez des patients atteints d’infections diabétiques du pied. Les isolats sélectionnés comprenaient un isolat multirésistant aux médicaments (MDR) et un isolat fortement résistant aux médicaments (XDR), identifiés par des tests phénotypiques de susceptibilité antimicrobienne et des profils de résistance confirmés par CMI. Cette stratégie a permis une caractérisation génomique représentative d’isolats résistants cliniquement pertinents (Figure 1).

La qualité, la concentration et l’intégrité de l’ADN génomique ont été évaluées avant le séquençage afin d’assurer leur adéquation à la préparation de la bibliothèque et à l’analyse bioinformatique en aval. L’ADN a été quantifié à l’aide d’un fluoromètre, et l’intégrité a été vérifiée par électrophorèse en gel d’agarose à 1 % à 150 V pendant 40 minutes. Des fragments d’ADN d’environ 200 à 400 pb de longueur ont été sélectionnés par taille par purification magnétique par billes, suivie d’une réparation terminale, d’une adénylation 3′ et d’une ligature par adaptateur.

Des molécules circulaires d’ADN simple brin ont été générées par amplification, purification et circularisation de fragments ligués par adaptateur à l’aide d’oligonucléotides à attelle. Des nanobilles d’ADN (DNB) ont ensuite été générées par amplification par cercle roulant. Le séquençage a été réalisé sur la plateforme DNBSEQ en utilisant la chimie combinatoire de synthèse sonde-ancre (cPAS).

Les lectures de séquençage brut ont subi des procédures de contrôle qualité pour éliminer les lectures de faible qualité, la contamination par les adaptateurs, les lectures ambiguës et les séquences en double. Des lectures nettes étaient utilisées pour les analyses en aval. L’assemblage du génome a été effectué pour estimer la taille du génome, la teneur en GC et la profondeur de couverture du séquençage. Les assemblages finaux du génome ont été générés dans les formats de soumission FASTA, GenBank et NCBI.

L’annotation génomique a identifié les séquences codantes (CDS), l’ARN de transfert (ARNt), l’ARN ribosomique (ARNr) et les gènes d’ARN petit (ARNs). L’annotation fonctionnelle des gènes prédits a été réalisée à l’aide de plusieurs bases de données, dont Swiss-Prot, COG, KEGG, CAZy, VFDB, ARDB et CARD, pour les gènes associés à la résistance à la virulence et aux antimicrobiens.

8. Analyse bioinformatique

L’assemblage et l’annotation du génome ont été réalisés via le Centre de ressources en bioinformatique bactérienne et virale (BV-BRC). Des analyses phylogénétiques ont été réalisées à l’aide des outils PATRIC. Des cartes de visualisation du génome circulaires ont été générées pour illustrer les séquences codantes, la teneur en GC, l’asialité GC, les déterminants de résistance antimicrobienne, les gènes associés à la virulence et les éléments génétiques mobiles.

Les relations phylogénétiques ont été déterminées à l’aide de familles protéiques globales PATRIC (PGFams) identifiées à partir des génomes de référence les plus proches grâce à l’analyse Mash/MinHash. Les alignements protéiques ont été générés à l’aide de MUSCLE, et les alignements nucléotidiques correspondants ont été mappés dans des familles protéiques. Les arbres phylogénétiques ont été construits à l’aide de RAxML avec une analyse rapide par bootstrapping (Figure 1).

Les contigs génomes ont également été analysés à l’aide de Pathogenwatch pour la confirmation et la détection d’espèces de gènes de résistance antimicrobienne. Les gènes associés à la virulence ont été analysés à l’aide d’ABRicate. Le service d’annotation génomique PATRIC utilisait une approche basée sur le k-mer pour identifier les gènes de résistance antimicrobienne et attribuer des annotations fonctionnelles, des classes d’antimicrobiens et des mécanismes de résistance. Des visualisations circulaires du génome des isolats représentatifs de S. aureus résistants au MDR et à la méthicilline ont été générées comme décritprécédemment 17. Le tableau supplémentaire 1 résume tous les outils de bioinformatique, les versions logicielles, les bases de données et les paramètres analytiques utilisés dans les analyses génomiques.

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Résultats

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Traitement des échantillons et positivité en culture

Un total de 125 échantillons cliniques ont été collectés et analysés dans cette étude. Une croissance bactérienne a été observée dans 90 échantillons sur 125 (72 %). Ces échantillons positifs en culture ont ensuite été traités pour l’identification bactérienne et les tests de susceptibilité aux antimicrobiens. Des statistiques descriptives, incluant la fréquence et les pourcentages, ont été ...

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Discussion

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Les infections diabétiques du pied (DFI) causées par des micro-organismes multirésistants aux médicaments (MDR) augmentent à l’échelle mondiale, avec un mauvais contrôle glycémique et une hygiène des pieds inadéquate contribuant à une augmentation de la morbidité et de lamortalité 18,19,20,21. Bien que les DFI soient fréquemment polymicrobiens, Staphylococc...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs affirment qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent ou relation personnelle connue qui aurait pu influencer le travail rapporté dans cette étude.

Contribution à l’auteur :

Shaymaa H. Al-Kubaisy a contribué à la conceptualisation, au développement méthodologique, à l’investigation, à l’analyse formelle et à la préparation du manuscrit original. Rawaa A. Hussein a contribué à la validation, à l’enquête et à la préparation du manuscrit original du projet de manuscrit. Mushtak T.S. Al-Ouqaili a contribué à la conceptualisation, la supervision, l’administration de projet, l’enquête, ainsi que la relecture et l’édition de manuscrits.

Remerciements

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Les auteurs reconnaissent l’utilisation de la plateforme de conception basée sur l’IA Gamma Pro (Gamma App) pour la génération de la Figure 1. Tout le contenu généré a été soigneusement examiné, édité et validé par les auteurs afin d’assurer l’exactitude scientifique, la cohérence et l’intégrité. Les auteurs n’ont reçu aucun soutien financier pour la recherche, l’auteur et/ou la publication de cet article.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Logiciel AbricateGitHub (T. Seemann)Open sourceDétection des gènes de virulence
AgaroseInvitrogen, États-Unis16500-500Électrophorèse sur gel
Agencourt AMPure XP KitBeckman CoulterA63881Purification de l’ADN et sélection de la taille
Amikacin (30 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0107BAST
Disques antibiotiques (ampicilline 20 et micro ; g)Oxoid, Royaume-UniCT0003BTest de susceptibilité aux antimicrobiens
Base d’agar sanguinOxoid, Royaume-UniCM0055Isolement des bactéries Gram-positives et Gram-négatives
Bouillon Infusion Cérébrale-Cœur (BHI)Oxoid, Royaume-UniCM1135Culture et stockage des isolats
Cefoxitin (30 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0119BDétection du SARM
Céfuroxime (30 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0026BAST
Ciprofloxacine (5 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0425BAST
Clindamycine (2 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0064BAST
Plateforme DNBSEQBGI, ChineDiversSéquençage du génome complet
Érythromycine (15 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0020BAST
FastQCSimon Andrews à l’Institut Babraham (Babraham Bioinformatics)NASystème de file d’attente
Système de documentation gelBio-Rad, USAGel Doc&trade ; XR+Imagerie des gels d’électrophorèse
Gentamicin (10 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0024BAST
Glycérol (de qualité moléculaire)Sigma-AldrichG5516Utilisé à 20 % pour la conservation à long terme des isolats
GoTaq Green Master Mix (2 fois)Promega, USAM7122Mix d’amplification PCR
Lévofloxacine (5 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT1587BAST
Linézolide (30 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT1716BAST
MacConkey AgarOxoid, Royaume-UniCM0007Milieu sélectif pour les bactéries Gram négatives
Agar au sel de mannitol (MSA)Oxoid, Royaume-UniCM0085Milieu sélectif/différentiel pour les spp. de Staphylococcus.
Mérophènem (10 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0774BAST
MgCl2 SolutionPromega, USADiversComposante de réaction PCR
Mueller-Hinton AgarOxoid, Royaume-UniCM0337Utilisé pour Kirby & ndash ; Essais de diffusion du disque Bauer
Outil d’alignement MUSCLEOpen sourceDiversAlignement des séquences protéiques
Eau sans nucléasePromega, USAP1193Composante de réaction PCR
Agar nutritifOxoid, Royaume-UniCM0003Milieu de croissance polyvalent
Oxacilline (1 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0159BAST
PathogenWatchInstitut Wellcome SangerOutil en ligneIdentification de l’espèce & Détection du gène AMR
PATRIC / BV-BRCCentre de ressources en bioinformatique bactériennePlateforme en ligneAssemblage du génome & Annotation
Piperacilline/Tazobactam (100/10 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT1628BAST
Outil de visualisation du génome ProkseeUniversité de TorontoOutil en ligneVisualisation de la carte génomique
Fluoromètre QuantusPromega, USAE6150Quantification de l’ADN
Fluoromètre à qubitsThermo Fisher ScientificQ33238Quantification de l’ADN pour WGS
Logiciels RAxMLOpen sourceDiversAnalyse phylogénétique
S. aureus ATCC 25923ATCC, États-Unis25923Déformation de contrôle qualité pour AST
Tache rouge sûreiNtRON BiotechnologieDiversColoration en gel d’ADN
Kit d’extraction d’ADN bactérien SaMagSacace Biotechnologies, ItalieDiversExtraction d’ADN génomique
Système d’extraction automatisé SaMag-12Sacace Biotechnologies, ItalieSMG-12Extracteur automatisé d’acides nucléiques
Coton-tige-coton stérilesDivers fabricantsDiversUtilisé pour la collecte d’échantillons par écouvillonnage profond
Solution physiologique normale stérileDivers fabricantsDiversUtilisé pour laver la surface de l’ulcère avant le prélèvement
Lames de scalpel stérilesDivers fabricantsDiversUtilisé pour le débridement d’ulcères avant l’échantillonnage
Tigecycline (15 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT1849BAST
Triméthoprime-sulfaméthoxazole (25 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0052BAST
Transilluminateur UVDivers fabricantsDiversVisualisation des produits PCR
Vancomycine (30 & micro ; g) DisqueOxoid, Royaume-UniCT0588BAST
VITEK 2 CompactBioMé ; rieux, FranceDiversSystème d’identification automatisé
Cartes d’identité VITEK 2 GNBioMé ; rieux, FranceDiversIdentification des bactéries à Gram négatif

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, X., Yuan, C. X., Xu, B., Yu, Z. Diabetic foot ulcers: Classification, risk factors and management. World J Diabetes. 13 (12), 1049-1065 (2022).
  2. Budzynska, A., Kazmierczak-Siedlecka, K., Białowas-Kot, A., et al. Virulence factor genes and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus. strains isolated from blood and chronic wounds. Toxins (Basel). 13 (7), 491(2021).
  3. Xia, N., Morteza, A., Yang, F., Cao, H., Wang, A. Review of the role of cigarette smoking in diabetic foot disease. J Diabetes Investig. 10 (2), 202-215 (2019).
  4. Arfaoui, A., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. from diabetic foot infections in a Tunisian hospital with the first detection of MSSA CC398-t571. Antibiotics (Basel). 11 (12), 1755(2022).
  5. Hussein, S. Z., Mohammed Saleh, G. Molecular detection of virulence factor genes for Staphylococcus aureus. in diabetic foot ulcers in Iraq. Ibn Al-Haitham J Pure Appl Sci. 37 (3), 98-105 (2024).
  6. Shahi, S. K., Kumar, A. Isolation and genetic analysis of multidrug-resistant bacteria from diabetic foot ulcers. Front Microbiol. 6, 1464(2015).
  7. Víquez-Molina, G., Aragón-Sánchez, J., et al. Virulence factor genes in Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot soft tissue and bone infections. Int J Low Extrem Wounds. 17 (1), 36-41 (2018).
  8. Ventura, C. L., et al. Identification of a novel Staphylococcus aureus. two-component leukotoxin using cell surface proteomics. PLoS One. 5 (7), e11634(2010).
  9. Hussein, R. A., Al-Kubaisy, S. H., Al-Ouqaili, M. T. S. The influence of efflux pump, outer membrane permeability, and β-lactamase production on the resistance profile of multi-, extensively, and pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae. J Infect Public Health. 17 (11), 102544(2024).
  10. Magiorakos, A. P., et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and pandrug-resistant bacteria: An international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect. 18 (3), 268-281 (2012).
  11. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. , 32nd ed, CLSI. Wayne (PA). (2022).
  12. Moses, V. K., Kandi, V., Rao, S. K. D. Minimum inhibitory concentrations of vancomycin and daptomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from various clinical specimens: A study from South India. Cureus. 12 (1), e6749(2020).
  13. Karimzadeh, R., Ghassab, R. K. Identification of nuc nuclease and sea enterotoxin genes in Staphylococcus aureus. isolates from nasal mucosa of burn hospital staff: A cross-sectional study. New Microbes New Infect. 47, 100992(2022).
  14. Alkhafaji, I. A. Proliferation of tst genes in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. (MRSA). Clin Med Insights. 1 (1), 1-5 (2020).
  15. Kumar, J. D., Negi, Y. K., Gaur, A., Khanna, D. Detection of virulence genes in Staphylococcus aureus. isolated from paper currency. Int J Infect Dis. 13 (6), e450-e455 (2009).
  16. Armin, S., Fallah, F., Navidinia, M., Vosoghian, S. Prevalence of blaOXA-1 and blaDHA-1 AmpC β-lactamase-producing and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. in Iran. Iran J Microbiol. 5 (4), 1-8 (2017).
  17. Grant, J. R., et al. Proksee: In-depth characterization and visualization of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 51 (W1), W484-W492 (2023).
  18. Adams, F. G., et al. Staphylococcus aureus. strain 63-2498 isolated from a diabetic patient. Microbiol Resour Announc. 14 (10), 1-4 (2025).
  19. Al-Ouqaili, M. T. S., Hussein, R. A., Kanaan, B. A., Al-Neda, A. T. S. Investigation of carbapenemase-encoding genes in Burkholderia cepacia and Aeromonas sobria. isolates from nosocomial infections in Iraqi patients. PLoS One. 20 (8), e0315490(2025).
  20. Anwar, K., Hussein, D., Salih, J. Antimicrobial susceptibility testing and phenotypic detection of MRSA isolated from diabetic foot infection. Int J Gen Med. 13, 1349-1357 (2020).
  21. Wazqar, A. A., Baatya, M. M., Lodhi, F. S., Khan, A. A. Assessment of knowledge and foot self-care practices among patients with diabetes mellitus in a tertiary care center in Makkah, Saudi Arabia: A cross-sectional analytical study. Pan Afr Med J. 40, 123(2021).
  22. Hinojosa, C. A., et al. Impact of the bacteriology of diabetic foot ulcers on limb loss. Wound Repair Regen. 24 (5), 923-927 (2016).
  23. Inzucchi, S. E., et al. Management of hyperglycemia in type 2 diabetes, 2015: A patient-centered approach. Diabetes Care. 38 (1), 140-149 (2015).
  24. Tentolouris, N., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus.: An increasing problem in a diabetic foot clinic. Diabet Med. 16 (9), 767-771 (1999).
  25. Citron, D. M., Goldstein, E. J., Merriam, C. V., Lipsky, B. A., Abramson, M. A. Bacteriology of moderate-to-severe diabetic foot infections and in vitro. activity of antimicrobial agents. J Clin Microbiol. 45 (9), 2819-2828 (2007).
  26. Anvarinejad, M., et al. Isolation and antibiotic susceptibility of microorganisms isolated from diabetic foot infections in Nemazee Hospital, Southern Iran. J Pathog. 2015, 328796(2015).
  27. Lipsky, B. A., Senneville, É, Abbas, Z. G., et al. Guidelines on the diagnosis and treatment of foot infection in persons with diabetes (IWGDF 2019 update). Diabetes Metab Res Rev. 36 (S1), e3280(2020).
  28. Bai, Z., et al. Identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. and molecular characterization in Quanzhou, China. Front Cell Dev Biol. 9, 629681(2021).
  29. Abebe, T. A., Gebreyes, D. S., Abebe, B. A., Yitayew, B. Antibiotic-resistant bacteria and resistance genes in drinking water sources in North Shoa Zone, Amhara Region, Ethiopia. Front Public Health. 12, 1422137(2024).
  30. Herman-Bausier, P., et al. Mechanical strength and inhibition of Staphylococcus aureus. collagen-binding protein Cna. mBio. 7 (5), e01529-16(2016).
  31. de Almeida, L. M., et al. Comparative analysis of agr groups and virulence genes among subclinical and clinical mastitis Staphylococcus aureus. isolates from sheep herds in Northeast Brazil. Braz J Microbiol. 44 (2), 493-498 (2013).
  32. Elboshra, M. M. E., Hamedelnil, Y. F., Moglad, E. H., Altayb, H. N. Prevalence and characterization of virulence genes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from Sudanese patients in Khartoum State. New Microbes New Infect. 38, 100784(2020).
  33. Mohsin, S. M., Al-Ghanimi, A. A. K., Alwan, D. H. Molecular detection of virulence and antibiotic resistance genes of Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot infection. Med J Babylon. 22 (4), 1369-1377 (2025).
  34. Wang, M., Zhang, Q. Characteristics of virulence genes of clinically isolated Staphylococci .in Jingzhou area. Contrast Media Mol Imaging. 2022, 8804616(2022).

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