Du tissu à la morphométrie : un flux de travail Golgi–Cox étape par étape pour l’analyse neuronale et dendritique de la colonne vertébrale chez la souris adulte

Résumé

Cet article décrit une méthode étape par étape pour la coloration de Golgi–Cox chez la souris adulte, couvrant la préparation de la solution, l’imprégnation tissulaire, la cryoprotection, la sectionnement, le développement et le montage. Il met l’accent sur la préservation des tissus et la coloration homogène à faible fond, permettant une visualisation claire de la morphologie neuronale. La méthode étiquette les arbres dendritiques et soutient l’analyse morphométrique quantitative des épines dendritiques.

Résumé

L’analyse de la morphologie neuronale en santé et en maladie est fondamentale pour comprendre le fonctionnement cérébral et évaluer les effets des interventions expérimentales. La coloration de Golgi–Cox reste une technique classique, mais très pertinente, pour visualiser des arbres neuronaux complets et des épines dendritiques. Cependant, les protocoles publiés diffèrent fréquemment dans les étapes procédurales critiques et manquent souvent de détails méthodologiques essentiels, ce qui entraîne une grande variabilité de la qualité de la coloration et rend la standardisation en laboratoire longue et difficile. Ici, un protocole Golgi–Cox complet, étape par étape, pour les souris adultes est présenté, englobant l’ensemble du flux de travail, de la manipulation in vivo et du traitement des tissus à l’imagerie et à l’extraction morphométrique des données. Il détaille les considérations pratiques et les pièges courants qui influencent l’efficacité de l’imprégnation, l’intégrité de la section et le rapport signal/bruit, et fournit des conseils méthodologiques pour améliorer la reproductibilité. Dans l’ensemble, ce protocole permet une visualisation fiable et une analyse quantitative de neurones entiers, segments dendritiques et épines dendritiques. On prévoit que cette ressource facilitera la mise en œuvre de la coloration de Golgi–Cox avec une plus grande cohérence, transparence et rigueur technique, tout en offrant un cadre clair pour adapter la méthode à divers contextes de laboratoire.

Introduction

L’objectif global de la méthode de coloration de Golgi–Cox est de permettre une visualisation en haute résolution de la morphologie neuronale complète, y compris les arbres dendritiques et les épines dendritiques, dans le tissu cérébral^fixe 1,2,3,4. Cette technique permet une analyse structurelle détaillée de neurones individuels au sein de circuits neuronaux complexes, ce qui la rend particulièrement précieuse pour les études de plasticité synaptique, de neurodéveloppement, de neurodégénérescence et de remodelage structurel dépendant de^{l’expérience 5,6}.

La raison d’être du développement et de l’utilisation continue des méthodes basées sur le Golgi réside dans leur capacité unique à produire une imprégnation neuronale clairsemée^{et complète 1,2}. Initialement décrite par Camillo Golgi en 1873 et affinée en 1891 par^{Cox 7,8}, la méthode repose sur la précipitation du chromate d’argent au sein d’un sous-ensemble limité de neurones, permettant une reconstruction morphologique complète sans chevauchement^{de marquage 3}. La modification de Golgi–Cox remplace le nitrate d’argent utilisé dans la méthode originale de Golgi par du chlorure mercurique, améliorant la pénétration des tissus et la consistance de la^{coloration 2}. Comparé à d’autres techniques de marquage neuronal telles que l’expression protéique fluorescente, le traçage viral ou les approches de remplissage de colorants, la coloration de Golgi–Cox présente plusieurs avantages. Il ne nécessite ni manipulation génétique, ni injections stéréotxiques, ni équipement de microscopie spécialisé, et permet la visualisation d’épines dendritiques à fort contraste sous microscopie^{de champ clair 1,2}. Bien que les méthodes modernes basées sur la fluorescence offrent une spécificité de type cellulaire, la coloration de Golgi–Cox reste particulièrement avantageuse pour un échantillonnage morphologique impartial ^9,10 et pour une utilisation dans des espèces ou des conditions expérimentales où les outils transgéniques ne sont pas disponibles.

Dans la littérature plus large, les méthodes basées sur Golgi ont été largement employées pour quantifier la densité et la morphologie de la colonne vertébrale dendritique dans des études sur l’apprentissage et^{la mémoire 5}, les troubles du stress et psychiatriques^11, l’âge^{de 12} ans, et les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer 12,13,14. Son utilisation continue sur plusieurs décennies met en lumière sa fiabilité pour la neuroanatomie^{structurelle 2}. Cette méthode est particulièrement adaptée aux chercheurs analysant l’architecture dendritique et la morphologie de la colonne vertébrale dans le tissu cérébral lorsque la visualisation de la cellule entière est^{requise 1}. Il est bien adapté aux études morphologiques comparatives entre groupes expérimentaux. Cependant, les chercheurs nécessitant spécificité de type cellulaire, d’imagerie vivante ou de colocalisation moléculaire pourraient bénéficier davantage d’approches de marquage fluorescent ou codées^{génétiquement 9,10}.

Protocole

Des femelles adultes de type sauvage B6129SF2/souris J (n = 3) ont été utilisées dans cette étude. Cependant, une coloration similaire peut être réalisée chez les deux sexes à l’âge adulte. Toutes les procédures expérimentales ont reçu l’approbation préalable du Comité de bioéthique. (#117.A, Institut de Neurobiologie (INb), Université Nationale Autonome du Mexique)

1. Préparation des solutions

ATTENTION : Le chlorure de mercure est hautement toxique et corrosif. Manipulez à l’intérieur d’une hotte chimique tout en portant des gants, une blouse de laboratoire et une protection oculaire. Jetez les déchets dans un contenant de déchets dangereux marqué. Le dichromate de potassium et le chromate de potassium sont des oxydants toxiques et cancérigènes. Manipulez à l’intérieur d’une hotte chimique et évitez le contact avec la peau ou l’inhalation.

1. Préparez des solutions d’imprégnation de stock
   1. Pèse 15 g de dichromate de potassium. Dissous-le dans 300 mL d’eau double distillée pour obtenir une solution à 5 % (p/v).
   2. Pèse 15 g de chlorure de mercure. Dissous-le dans 300 mL d’eau double distillée pour obtenir une solution à 5 % (p/v).
   3. Pèse 15 g de chromate de potassium. Dissous-le dans 300 mL d’eau double distillée pour obtenir une solution à 5 % (p/v).
   4. Enveloppez tous les contenants dans du papier aluminium et conservez-les à température ambiante, à l’abri de la lumière.
2. Préparer la solution de travail de Golgi–Cox
   1. Mélangez 50 mL de solution de dichromate de potassium, 50 mL de chlorure de mercure et 40 mL de chromate de potassium.
   2. Ajoutez 100 mL d’eau distillée et mélangez soigneusement.
   3. Incubez le mélange pendant 48 heures à température ambiante, protégé de la lumière.
   4. Laissez les précipités se déposer. N’utilisez que le surnageant pour l’imprégnation tissulaire.
      REMARQUE : La solution de Golgi–Cox peut être conservée jusqu’à 1 mois lorsqu’elle est protégée de la lumière. Pour réduire les déchets de réactifs et garantir la fraîcheur de la solution, préparez uniquement le volume requis des solutions d’origine et de la solution finale de Golgi–Cox nécessaire à l’expérience. Préparez au moins 23 mL par cerveau pour obtenir 20 mL de surnageant utilisable après la perte de précipités.
3. Préparez une solution cryoprotectrice
   1. Dissoudre 300 g de saccharose dans une solution séline tamponnée phosphate (PBS) à 0,1 M, pH 7,4, préparée avec du phosphate de sodium dibasique anhydre, du monobasique phosphate de sodium monohydraté et du chlorure de sodium.
   2. Ajuste le volume final à 1 L.
   3. Conserver à 4 °C pendant une semaine.

2. Collecte et féconisation des tissus

1. Effectuer une perfusion intracardiaque
   1. Anesthésiez l’animal avec du pentobarbital sodique (252 mg/kg, i.p.). Confirmez une profondeur d’anesthésie suffisante en ne faisant pas de retrait de la pédale avant de continuer.
   2. Effectuer une perfusion intracardiaque avec environ 30 mL de 0,1 M PBS (pH 7,4) jusqu’à ce que l’effluent soit clair, assurant ainsi une élimination complète du sang du tissu cérébral. Aucun fixateur n’a été utilisé ; la solution Golgi–Cox elle-même sert de fixateur dans ce flux de travail.
   3. Extraire le cerveau avec précaution et rincer dans de l’eau distillée. Assurez-vous que le cerveau est correctement perfusé et exempt de sang résiduel (Figure 1A).
2. Tissu fécondé
   1. Divisez le cerveau en hémisphères ou blocs coronales (~3 mm d’épaisseur) à l’aide d’une matrice cérébrale pour améliorer l’imprégnation. Les blocs tissulaires plus petits facilitent une imprégnation plus uniforme et réduisent la variabilité, tandis que les échantillons plus grands peuvent nécessiter des temps d’incubation plus longs et présenter une coloration moins homogène.
   2. Placez le cerveau dans une solution de Golgi–Cox de 10 mL. Protège de la lumière.
      REMARQUE : Un volume de 10 mL de solution de Golgi–Cox suffit pour un cerveau adulte de souris entier. Lors de l’utilisation d’un hémisphère unique ou de blocs coronales plus petits (~3 mm d’épaisseur), le volume de solution peut être réduit proportionnellement, à condition que le tissu reste complètement immergé. Si l’ensemble du cerveau est utilisé, il est recommandé de le sectionner tout en préservant la région d’intérêt afin d’assurer une pénétration optimale du réactif et une imprégnation homogène.
   3. Incubez pendant 24 heures à température ambiante.
   4. Remplacer par 10 mL de solution fraîche de Golgi–Cox. Couver pendant 10 à 14 jours à 22–25 °C dans le noir.
      POINT DE PAUSE : Stockez les tissus dans une solution de Golgi–Cox jusqu’à 15 jours sans perte majeure de viabilité.
      REMARQUE : Après l’insémination de Golgi–Cox, le cerveau prend une apparence dorée foncée et devient très fragile ; par conséquent, manipulez-la avec précaution (Figure 1B). Il est recommandé d’utiliser une pince à pince en plastique pour la manipulation afin d’éviter les réactions chimiques avec les matériaux en acier.

3. Cryoprotection

1. Transférez le tissu dans une solution cryoprotectrice de 10 mL (30 % de saccharose (p/v) dans 0,1 M PBS, pH 7,4, préparé à l’étape 1.3).
2. Incuber pendant 24 h (4 °C).
3. À la même température (4 °C), remplacez par une solution cryoprotectrice fraîche et étouffez pendant au moins 4 à 7 jours.
   POINT DE PAUSE : Avant la sectionnement, stockez les tissus dans une solution cryoprotectrice jusqu’à 3 semaines à 4 °C.

4. Encastrement et coupe

1. Tissu d’encastrement
   1. Préparez 8 % (p/v) d’agarose dans de l’eau distillée chaude. Laissez refroidir jusqu’à environ 40 °C.
   2. Placez le papier dans des moules d’encastrement et orientez-les correctement.
   3. Verser de l’agarose sur le tissu et laisser solidifier pendant 1 h à température ambiante ou 30 minutes à 4 °C (Figure 1C).
   4. Coupez l’excès d’agarose du bloc (Figure 1D).
2. Tissu sectionnel
   1. Fixez le bloc d’agarose sur l’étage vibratome à l’aide d’adhésif. (Figure 1E)
   2. Remplissez la chambre de découpe avec une solution cryoprotectrice.
   3. Tissu de coupe à une épaisseur de 100–200 μm. Des sections plus fines (par exemple, 100–120 μm) sont recommandées pour l’analyse de la colonne vertébrale dendritique afin d’améliorer la résolution d’imagerie, tandis que des sections plus épaisses (par exemple, 150–200 μm) peuvent être utilisées pour la reconstruction globale des neurones. Dans cette étude, des coupes ont été découpées à 120 μm (Figure 1F).
   4. Collectez les sections avec un pinceau doux.
      REMARQUE : Enregistrez les réglages du vibratome dans le tableau des matériaux. Ne rincez pas les glissières sous aucun prétexte une fois les sections montées. Le saccharose protégera le tissu jusqu’à l’étape de développement.

5. Montage

1. Préparation des lames recouvertes de gélatine
   1. Préparez une solution de revêtement en dissolvant 0,5 g de gélatine dans 100 mL (0,5 % en p/v) d’eau distillée chauffée à ébullition.
   2. Remuez jusqu’à ce que la gélatine soit complètement dissoute et laissez la solution refroidir à température ambiante.
   3. Ajoutez 0,05 g de sulfate de potassium de chrome (0,05 % en mousse/v) et mélangez jusqu’à ce que ce soit complètement dissous. Enlève la mousse résiduelle si nécessaire.
   4. Filtrez la solution de gélatine à travers du papier filtre pour éliminer les particules non dissoutes et la mousse résiduelle, assurant ainsi un revêtement uniforme des lames.
   5. Lavez les lames en verre avec un détergent neutre et de l’eau, rincez soigneusement, puis rinçez-les à l’eau distillée.
   6. Immergez les lames dans de l’éthanol à 96 % jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gouttelettes visibles.
   7. Sécher au four à 50–60 °C pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que ce soit complètement sec.
   8. On glisse dans la solution de gélatine et on laisse l’excès de solution s’écouler.
   9. Placez les lames au four à 50–60 °C pendant 30 minutes ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches.
   10. Répétez le processus de revêtement et de séchage au moins cinq fois pour garantir une bonne adhérence.
   11. Après la dernière étape de séchage, laissez les lames refroidir à température ambiante dans un environnement sans poussière (par exemple, à l’intérieur d’une hotte chimique) et conservez-les dans un récipient propre et fermé jusqu’à utilisation.
       REMARQUE : Préparez uniquement le volume de solution de gélatine nécessaire pour le nombre de lames à enduire. Les quantités de réactifs peuvent être proportionnellement estimées tout en maintenant les concentrations spécifiées (v/v).
2. Placez les sections sur des lames de microscope recouvertes de gélatine à l’aide d’un pinceau doux
   REMARQUE : Utilisez des lames de microscope recouvertes d’au moins cinq couches de gélatine à 0,5 %. Préparez les lames fraîchement pour garantir l’intégrité des tissus pendant le développement. Les lames électrochargées n’ont pas été testées dans ce protocole.
3. Faites tremper du papier absorbant dans une solution cryoprotectrice et placez-le sur les sections.
4. Appuyez doucement avec la paume pour éliminer les bulles d’air et assurer un contact uniforme entre la section tissulaire et la lame recouverte de gélatine, favorisant ainsi une adhésion stable lors du traitement ultérieur.
   REMARQUE : Une pression douce améliore l’adhérence en maximisant le contact entre la section et la couche de gélatine, réduisant ainsi le risque de décollement lors du développement aqueux.
5. Retirez soigneusement le papier et laissez les lames sécher dans l’obscurité pendant 2 à 3 jours à température ambiante.
   REMARQUE : Le séchage dans un environnement à faible humidité est essentiel pour une adhérence stable. La protection contre la lumière minimise les altérations photochimiques des tissus imprégnés de Golgi–Cox, qui sont sensibles à la lumière en raison de la présence de sels de chromate. De plus, l’agarose résiduelle n’interfère pas significativement avec le processus de développement et peut être observée autour du tissu dans la section développée (Figure 2A). La présence d’agarose facilite une manipulation plus sûre du tissu lors du montage, car le tissu imprégné de Golgi–Cox est très fragile. Si désiré, l’excès d’agarose peut être retiré soigneusement manuellement une fois les sections montées sur les glisses.
   POINT DE PAUSE : Protégez les glissières de la lumière.

6. Développement

ATTENTION : Le xylène est inflammable et toxique par inhalation. Manipulez une hotte chimique et évitez les flammes nues. L’ammoniac est corrosif et produit des vapeurs irritantes. Poignée dans une hotte à fumée.

1. Sections de réhydratation
   1. Immergez les lames dans de l’eau distillée pendant 5 minutes.
   2. Transférez dans de l’eau distillée fraîche pendant 5 minutes.
   3. Immergez dans 50 % d’éthanol pendant 5 minutes.
      REMARQUE : L’étape à 50 % d’éthanol permet une transition progressive des conditions aqueuses à la déshydratation, facilitant la pénétration du réactif et aidant à préserver l’intégrité tissulaire avant l’étape de développement.
2. Développement de la coloration
   1. Incubez les lames dans une solution aqueuse d’ammoniac préparée en mélangeant 2 volumes d’ammoniac à 25 % avec 1 volume d’eau distillée (2:1, v/v) pendant 8 minutes
   2. Laver dans de l’eau distillée pendant 5 minutes.
   3. Lavez à nouveau dans de l’eau distillée pendant 5 minutes.
   4. Incubez dans du thiosulfate de sodium à 5 % (p/v) dans de l’eau distillée pendant 10 minutes dans le noir.
   5. Laver dans de l’eau distillée pendant 1 minute.
   6. Laver à nouveau dans de l’eau distillée pendant 1 minute.
      REMARQUE : Terminez le processus de développement sans interruption une fois lancé.
3. Déshydrater et être clair
   1. Immergez les lames dans 70 % d’éthanol pendant 5 minutes.
   2. Immergez les lames dans de l’éthanol à 96 % pendant 5 minutes.
   3. Immergez les lames dans 100 % d’éthanol pendant 5 minutes.
   4. Transférez les lames dans le xylène pendant au moins 6 minutes.

7. Montage permanent

1. Appliquez un support de montage Permount® (indice de réfraction ~1,52) à chaque section.
   REMARQUE : L’indice de réfraction du support de montage doit être compatible avec les objectifs d’immersion à l’huile afin d’assurer une qualité d’image optimale.
2. Placez soigneusement une housse de couverture pour éviter les bulles d’air.
3. Scellez les bords avec du vernis à ongles transparent.
4. Laissez les lames sécher dans le noir pendant 48 heures à température ambiante.

8. Imagerie

REMARQUE : Les modalités d’imagerie et les configurations d’acquisition varient selon la marque du microscope ; Les réglages optimaux doivent être déterminés pour chaque système.

1. Allume le microscope.
2. Ouvre le logiciel du microscope
3. Placez une lame sur l’étage du microscope.
4. Capturez une image 2D en vue large de la section cérébrale à l’aide d’un objectif à faible grossissement tel que 1X/0,04 N.A. ou 4x/0,10 (Figure 2A, B).

9. Imagerie des neurones entiers

1. Capturez des piles d’images haute résolution de la zone contenant le neurone d’intérêt, en utilisant un objectif N.A. 10x/0,25 ou 20x/0,40 N.A. (Figure 2C).
   REMARQUE : Les neurones sélectionnés pour l’analyse doivent présenter une imprégnation complète et homogène de Golgi–Cox, avec des arbres dendritiques clairement définis et une coloration minimale de fond. Les cellules avec des processus tronqués, une imprégnation incomplète, des structures qui se chevauchent ou un signal de fond élevé doivent être exclues afin d’assurer une analyse morphométrique précise.
2. Faites la mise au point de l’image et ajustez les réglages de l’appareil, y compris l’exposition et la balance des blancs.
3. Définissez les limites supérieure et inférieure de la pile d’images.
4. Réglez la distance de pas à 0,5 μm dans la fenêtre d’acquisition de l’image.
5. Capturez la pile d’images à l’aide de la commande logicielle pour l’acquisition de la pile.
6. Répétez les étapes ci-dessus pour capturer chaque zone d’intérêt.
7. Sauvegardez le fichier de données et sauvegardez tous les fichiers images. Format TIFF pour le traitement externe.

10. Imagerie des épines dendritiques

1. Capturez des piles d’images haute résolution de la zone contenant le neurone d’intérêt, à l’aide d’un objectif d’immersion à l’huile N.A. 63x/1,4 dans un microscope en champ clair approprié (Figure 2D).
   REMARQUE : Dans le présent manuscrit, des images haute résolution des épines dendritiques montrées à la Figure 2D ont été obtenues en mode champ clair d’un microscope confocal, modèle Zeiss LSM 780. Cependant, d’autres microscopes en champ clair peuvent permettre d’obtenir des images z-stack de haute qualité 63x, dont les paramètres devraient être standardisés par chaque laboratoire.
2. Appliquez 1 à 2 gouttes d’huile d’immersion sur la glissière et placez l’objectif au-dessus de celle-ci, en veillant à établir un contact entre l’objectif et l’huile.
3. Faites la mise au point de l’image et ajustez les réglages de l’appareil, y compris l’exposition et la balance des blancs.
4. Définissez les limites supérieure et inférieure de la pile d’images.
5. Réglez la distance de pas à 0,3 μm dans la fenêtre d’acquisition de l’image.
6. Capturez la pile d’images à l’aide de la commande logicielle pour l’acquisition de la pile.
7. Répétez les étapes ci-dessus pour capturer chaque domaine d’intérêt
8. Sauvegardez le fichier de données et sauvegardez tous les fichiers image au format TIFF pour un traitement externe.
   REMARQUE : Pour les étapes 9 et 10. Si le microscope n’est pas équipé d’un étage motorisé pour l’acquisition par pile Z, les images peuvent être collectées manuellement en ajustant la mise au point micrométrique. Cependant, l’espacement entre les sections optiques peut être moins précis. Dans ce cas, les Z-stacks peuvent être reconstruites ensuite dans un logiciel de traitement d’image (par exemple, ImageJ) à partir de la séquence d’images acquise.

11. Analyse morphométrique

REMARQUE : Diverses approches et logiciels spécialisés peuvent être utilisés à cette fin. Parmi les outils d’accès gratuit pour l’analyse de la colonne vertébrale dendritique figurent ImageJ ou, comme dans cette étude, PyReconstruct¹⁵. Pour une description plus détaillée de PyReconstruct et de ses fonctionnalités pour la reconstruction neuronale et l’analyse morphométrique, voir la source référencée.

1. Procédure pour l’analyse morphométrique des épines dendritiques
   1. Une fois le fichier ouvert dans ImageJ, changez le format en RVB en sélectionnant Image > Type > RGB Color.
   2. Convertir les piles Z en séquence d’images dans ImageJ : cliquez sur Fichier > Enregistrer en tant que séquence d’images >. Sauvegardez chaque séquence d’images dans un dossier séparé pour une analyse ultérieure. Dans PyReconstruct, chargez la séquence d’images en cliquant sur Fichier > Nouvelle > From Images.
   3. Une fenêtre de dialogue apparaît, invitant à attribuer un nom au fichier (par exemple, WTVR1N1 – Souris Véhicule de type sauvage 1 Neuron 1).
   4. Trois fenêtres de dialogue consécutives apparaissent alors. Dans la première fenêtre, entrez la valeur d’étalonnage (μm/px). Ces informations sont disponibles dans les métadonnées Z-stack et peuvent être consultées dans ImageJ.
   5. Dans la deuxième fenêtre, entrez l’épaisseur de chaque section optique consécutive (μm). Enfin, la série d’images commencera à se charger automatiquement (Figure supplémentaire 1A).
   6. Une fois le segment d’intérêt identifié, selon les critères d’inclusion définis par l’enquêteur, procéder à la recherche pour obtenir des données quantitatives.
   7. Attribuez un nom et un domaine distincts à chaque type de trace. Localisez les domaines dans le panneau inférieur, où ils sont représentés par des formes géométriques de différentes couleurs (Figure supplémentaire 1B).
   8. Tracez une ligne correspondant à la longueur d’échantillon souhaitée avec l’outil crayon. Ensuite, générez une seconde trace à travers la pile Z le long du segment dendritique à l’aide de l’outil Z.
   9. Utilisez la trace initiale pour déterminer la longueur de segment appropriée et vérifiez-la dans Listes > Liste de traces Z (Figure supplémentaire 1B).
   10. Naviguez à travers la pile Z et identifiez les têtes de colonne vertébrale dendritiques avec une concentration optimale. À l’aide de l’outil crayon, tracez la région distale la plus large de chaque tête de colonne vertébrale. Ensuite, utilisez l’outil Z pour suivre le col de la colonne vertébrale tout au long de la pile Z (Figure supplémentaire 1C, D). Répétez cette procédure jusqu’à ce que toutes les têtes et cous de la colonne vertébrale dans le segment dendritique sélectionné aient été tracés.
2. Mesures de la tête de la colonne vertébrale à l’exportation
   1. Ouvrez les listes contenant les mesures de largeur et longueur de la tête de la colonne vertébrale. Accédez-y sous Listes > Liste de trace (pour la largeur) et Listes > Liste de trace Z (pour la longueur), respectivement.
   2. Exportez les données à l’emplacement souhaité sur l’ordinateur. Deux fichiers Excel distincts seront générés, chacun contenant les données de mesure correspondantes.
3. Classifier la morphologie des spins et calculer la densité
   1. Extraire les mesures de largeur et de longueur des têtes et cous de la colonne vertébrale à partir des fichiers Excel générés précédemment.
   2. Les données doivent être organisées en colonnes correspondantes intitulées Largeur et Longueur pour une classification morphologique basée sur les critères^{suivants : 16} : filopodia (>2 μm), mince (< 2 μm), trapu (rapport longueur-largeur tête ≤1) et champignon (largeur de tête >0,6 μm). (Figure supplémentaire 1E). Les filopodies ont rarement été observés dans les segments dendritiques analysés et n’ont donc pas été inclus dans l’analyse.
   3. Le nombre total d’épines par segment dendritique analysé est déterminé à ce stade, ainsi que la densité des épines (épines par μm linéaire), ainsi que le type et le nombre de chaque sous-type d’épines. Le modèle^{Excel 16} utilisé pour cette analyse est disponible dans la source référencée. Grâce à cette méthode, la densité épine dendritique basale a été quantifiée dans la région CA1 de l’hippocampe chez des souris femelles âgées de 12 mois.
   4. Exportez des données quantifiées et générez des graphiques avec des logiciels scientifiques spécialisés conçus pour l’analyse de données, la création de graphiques et les statistiques. Ici, le graphique de la Figure 3 a été construit avec le logiciel GraphPad Prism.

Résultats

Imprégnation et coupe tissulaire
Le protocole de Golgi–Cox décrit ici a produit une coloration neuronale fiable et homogène dans le tissu cérébral de la souris adulte. Après l’imprégnation dans une solution de Golgi–Cox, le cerveau a acquis une coloration caractéristique dorée foncée, indiquant une diffusion réussie de la solution de coloration dans tout le tissu. Le coupement vibratome a préservé l’intégrité structurelle des processus somates et dendritiques neuronau...

Discussion

La méthode de coloration de Golgi–Cox reste l’une des techniques les plus largement utilisées pour visualiser la morphologie neuronale et les épines dendritiques dans le tissu cérébral^{fixe 3,4}. En imprégnant un petit sous-ensemble aléatoire de neurones, cette méthode permet de visualiser des arbres dendritiques complets avec un minimum de coloration de fond. Dans le protocole actuel, la technique a permis une visualisation claire...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	Technologies de vie	15510-027	CAS 9012-56-6
Solution d’ammoniac 25 %	Merck	208380	CAS 1336-21-6. Dangereux.
Dibase phosphate de sodium anhydre	Sigma-Aldrich	S3264	CAS 7558-79-4
Microscope à champ clair	Nikon	Eclipse Ci
Sulfate de potassium de chrome	Sigma-Aldrich	243361
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 780
Bilan numérique	Accuris Instruments	W3200-1200
Encastrement de moules	Merck	E6032	Dimensions : 22x22 mm
Éthanol	Meyer	394
Animaux expérimentaux	Le laboratoire Jackson	2124-01	Souche de souris B6129SF2/J
Poudre de gélatine	Sigma-Aldrich	G2500
Logiciel GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.		Version 8.0.2
Logiciel ImageJ Fidji	Institut national de la santé des États-Unis		version 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
Chlorure de mercure	J.T. Baker	2594-01	CAS 7487-94-7. Dangereux.
Caméra de microscope	Nikon	DS-Vi1
Objectif de microscope (10x)	Nikon	93183	Plan 10x/0,25 N.A.
Objectif de microscope (1x)	Nikon	93180	Plan UW 1x/0.04 N.A.  ;
Objectif de microscope (20x)	Nikon	93184	Plan 20x/0,40 N.A.  ;
Objectif microscope (4x)	Nikon	93182	Plan 4x/0,10 N.A.  ;
Objectif de microscope (63x)	Zeiss	420782-9900-799	Plan APO 63x/1.4 N.A. oil DIC
Lames de microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Monobase de phosphate de sodium monohydraté	J.T. Baker	3818-05	CAS 10049-21-5
Vernis à ongles	COULEURS PÉCHERESSES	COULEUR AUDACIEUSE	Transparent
Supports de montage permount	Fisher Scientific	SP15-500
Chromate de potassium	Productos Quí ; micros Monterrey	2784	CAS 7789-00-6. Dangereux.
Dichromate de potassium	Sigma-Aldrich	207802	CAS 7778-50-9. Dangereux.
Logiciel PyReconstruct	Université du Texas, Austin		Version 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
Chlorure de sodium	Fermont	24912	CAS 7647-14-5
Thiosulfate de sodium	Productos Quí ; micros Monterrey	7291	CAS 7772-98-7. Dangereux.
Saccharose	J.T. Baker (Avantor)	4072-05	66,55 °C Rotation spécifique, réactif ACS
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	VITESSE 20 mm/s, AMPL & ndash ; 0,60 mm
Xylène	CTR Scientific	CTR05128	CAS 1330-20-7. Dangereux.