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Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Sun Yat-sen (Approbation n° SYSU-IACUC-2026-B1278) et ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles.
1. Isolement et culture des SLC primaires de souris
- Disséquez les testicules de souris C57BL/6 et retirez soigneusement la tunica albuginée.
- Réduisez les testicules en petits morceaux.
- Dissociez les cellules interstitielles des tubules séminifères en incubant dans 1 mg/mL de collagénase de type IV dans DMEM/F12 à 37 ºC pendant 15 minutes.
- Ajoutez du DMEM/F12 contenant 10 % de sérum bovin fœtal pour stopper l’activité collagénase.
- Centrifugez à 1500 × g pendant 3 minutes à température ambiante.
- Resuspendez le pellet dans un PBS et filtrez à travers un filtre de 70 μm.
- Enrichir les cellules CD51⁺ par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à l’aide d’un trieur de cellules d’influx.
- Semez les cellules enrichies dans un milieu de culture SLC composé de DMEM/F12 complétés avec : 1 nM de dexaméthasone, 1 ng/mL de LIF, 5 μg/L d’insuline-transférrine-sélénite sodique, extrait d’embryon de poulet à 5 %, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, 1 % d’acides aminés non essentiels, 1 % de N2, 2 % de B27, 20 ng/mL de facteur de croissance fibroblastique basique, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance dérivé des plaquettes et oncostatine M.
- Cultivez les SLC dans des conditions standard (37 °C, 5 % CO₂) jusqu’à ce qu’ils atteignent la densité souhaitée pour l’ensemencement sur des hydrogels.
2. Assemblage du récipient en verre de coulée de gel
- Inspectez et nettoyez soigneusement les plaques de verre spécialisées et les entretoises utilisées pour couler les gels d’électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE), en veillant à ce qu’ils soient exempts de poussière, de dommages et de résidus.
- Assemblez correctement les plaques de verre, les entretoises et les serre-joints selon les instructions du fabricant, afin de garantir que l’ensemble est bien étanche pour éviter les fuites lors du gel.
- Placez le récipient en verre assemblé solidement sur un support de laboratoire, prêt à être moulé.
REMARQUE : Le montage utilise des plaques de verre Western blot standard (sodium dodecyl sulfate [SDS]-PAGE) avec des entretoises fixes d’une épaisseur de 1,0 mm, garantissant une épaisseur de gel reproductible et une surface plane pour la culture cellulaire.
3. Préparation de la solution de gel PAGE
- Mesurez précisément les réactifs suivants selon le plan expérimental ( voir Tableau 1) dans un tube centrifuge stérile de 15 mL ou 50 mL : solution d’acrylamide à 40 %, 2 % de bis-acrylamide à base de stock, tampon 1M HEPES (pH 8,5), ddH₂O stérile.
ATTENTION : L’acrylamide et la bis-acrylamide sont des neurotoxines. Portez toujours des gants et un masque anti-poussière lorsque vous pesez de la poudre sèche afin d’éviter le contact cutané et l’inhalation de particules en suspension dans l’air. Les procédures doivent être effectuées dans une hotte à fumée.
4. Ajout de l’initiateur et du catalyseur, et moulage du gel
- Ajouter les éléments suivants à la solution mixte séquentiellement : Persulfate d’ammonium à 10 % (APS) : Agit comme initiateur pour lancer la réaction de polymérisation. N,N,N',N'-tétraméthyléndiamine (TEMED) : Agit comme catalyseur pour accélérer la réaction de polymérisation. Pour un volume total de gel de 6 mL, ajoutez 60 μL de 10 % d’APS et 6 μL de TEMED (voir le tableau 1 pour le relais).
REMARQUE : La réaction de polymérisation commence immédiatement après l’ajout de TEM ; par conséquent, les étapes suivantes doivent être effectuées rapidement.
5. Verser la solution mixte
- Faites immédiatement une pipette ou versez la solution mélangée de façon constante le long d’un bord du récipient en verre pour éviter de créer des bulles.
6. Laisser le gel polymériser
- Laissez reposer le récipient de gel coulé à température ambiante.
REMARQUE : La polymérisation prend généralement 15 à 30 minutes à température ambiante (20–25 °C).
- Passez à l’étape suivante une fois qu’une interface claire entre le mélange de gel non polymérisé et le gel polymérisé est visible et que le gel est complètement solide (le gel ne s’écoule pas lorsque le récipient est incliné).
- Immédiatement après la fonte, superposez soigneusement une fine couche d’éthanol absolu (ou d’éthanol saturé en eau) sur le mélange en gel pour exclure l’oxygène atmosphérique, qui inhibe la polymérisation radicale. L’éthanol aide également à former une surface supérieure plate.
- Après polymérisation, retirez l’éthanol avant de démonter les plaques.
7. Démontage du récipient et récolte du gel
- Démontez soigneusement les pinces et utilisez un coin ou une spatule en plastique pour séparer doucement les plaques de verre, permettant au gel polymérisé PAGE de rester intact sur une plaque.
- Préparez un plat de culture contenant une quantité suffisante de PBS stérile.
- Décollez soigneusement le gel de la plaque de verre à l’aide d’une spatule ou d’une main gantée, puis laissez-le glisser doucement dans le PBS.
- Scellez le plat contenant le gel dans le PBS et incubez à 4 °C pendant la nuit.
REMARQUE : Cette étape est cruciale. Le gel nouvellement préparé est déshydraté et doit absorber complètement l’eau et enfler jusqu’à ses dimensions finales dans le PBS. Si cette étape est sautée et que le gel est coupé directement, il continuera à s’étendre dans le milieu de culture cellulaire ultérieur, dépassant probablement la surface du puits de culture et le rendant inutilisable. L’épaisseur du gel après un gonflement est de 1 mm. C’est crucial car lorsque l’épaisseur du gel descend en dessous de 100 μm, les cellules peuvent détecter la rigidité de la plaque de culture rigide sous-jacente, ce qui interfèrerait avec les mesures mécanobiologiques prévues.
8. Coupe et transfert du gel sur une plaque de culture
- Le lendemain, récupérez le gel à 4 °C. À l’aide d’une perforatrice de biopsie stérile ou d’un coupe-lame (d’un diamètre correspondant à la taille de la plaque de culture, par exemple une plaque à 6 puits), coupez le gel dans des conditions stériles.
- Dans un cabinet de biosécurité, utilisez des pinces stériles pour soulever doucement le disque de gel coupé et le placer au centre d’un puits de culture vide et stérile.
9. Lavage initial et irradiation UV
- Ajoutez suffisamment de PBS stérile au puits contenant le gel, en veillant à ce qu’il soit complètement immergé.
- Balancez doucement la plaque de culture pour laver la surface du gel.
- Aspirez le PBS à l’aide d’une pipette.
- Répétez ce processus de lavage une fois de plus, pour un total de deux lavages, chacun durant 3 minutes.
- Après le lavage, ajoutez suffisamment de PBS stérile pour recouvrir à nouveau le gel. Placez toute la plaque de culture avec le couvercle légèrement entrouvert sous une lampe UV (à l’intérieur d’un meuble de biosécurité ou d’un réticulateur UV dédié) et irradiez pendant 1 heure pour une stérilisation basique.
10. Activation du réticulateur Sulfo-SANPAH
- À l’intérieur de l’armoire de biosécurité, aspirez soigneusement le PBS du puits.
- Avant d’aspirer, séparez doucement le gel des parois et du fond du puits à l’aide d’une pointe de pipette pour éviter d’endommager le gel à cause de la tension superficielle du liquide.
- Transférez le gel dans un autre puits propre dans la même plaque de culture à l’aide de pinces stériles.
REMARQUE : Lors du transfert du gel, ajouter d’abord une petite quantité de PBS dans le puits propre peut aider à expulser les bulles d’air piégées entre le fond du puits et le gel lors de la pose, et sert également de lavage supplémentaire.
- Préparer une solution de travail par réticulation : préparer fraîchement une solution de travail Sulfo-SANPAH de 0,2 mg/mL en diluant la solution d’origine (voir Tableau 1) à l’aide d’eau stérile ou du tampon recommandé (par exemple, PBS).
REMARQUE : Protégez la solution de la lumière.
- Ajoutez suffisamment de solution de travail Sulfo-SANPAH pour recouvrir le gel (par exemple, 250 μL pour une plaque à 12 puits, 500 μL pour une plaque à 6 puits), en veillant à ce que le gel soit complètement couvert.
- Placez la plaque sous une longueur d’onde de 365 nm /120 mJ/cm 2 UV et irradiez pendant 1 heure.
REMARQUE : Cette étape active le Sulfo-SANPAH, lui permettant de se lier aux groupes fonctionnels à la surface du gel.
11. Activation du réticulateur et lavages finaux
- Après irradiation, aspirez la solution de Sulfo-SANPAH depuis le puits à l’intérieur de l’armoire de biosécurité.
- Ajoutez suffisamment de PBS stérile au puits, balancez doucement pour laver la surface du gel, puis aspirez le PBS.
- Répétez ce processus de lavage une fois de plus, pour un total de deux lavages, chacun durant 3 minutes, afin d’éliminer complètement tout Sulfo-SANPAH non réagi.
12. Préparation de la solution de travail au collagène de type I pour la queue de rat
- Utilisez une solution d’acide acétique à 0,02 M comme solvant pour diluer la solution de collagène type I de queue de rat.
- Ajustez la concentration finale de la solution de travail à 60–100 μg/mL. Par exemple, si la concentration de collagène est de 4 mg/mL, ajoutez 15 à 25 μL de stock à 985 à 975 μL d’acide acétique 0,02 M pour obtenir 1 mL de solution de travail.
13. Revêtement et incubation du collagène
- Ajoutez le volume approprié de solution de travail au collagène à chaque puits contenant le gel activé selon le type de plaque : ajoutez 2 mL pour une plaque à 6 puits, ou 1 mL pour une plaque à 12 puits.
- Faites doucement tourner la plaque de culture pour que la solution de collagène couvre uniformément le gel et le fond du puits.
- Couvrez la plaque et incubez toute la nuit dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ afin de permettre au collagène de se fixer sur la surface du gel via un crossing Sulfo-SANPAH.
14. Irradiation et fixation UV secondaire
- Le lendemain, retirez la plaque et irradiez à nouveau sous environ 120 mJ/cm 2 de lumière UV pendant 1 heure.
15. Retirer le collagène et les cellules de graines non liés
- À l’intérieur de l’armoire de biosécurité, aspirez soigneusement la solution de travail de collagène de type I de queue de rat provenant des puits.
- Ajoutez du PBS stérile dans les puits, balancez doucement pour laver la surface du gel, puis aspirez le PBS.
- Répétez le lavage une fois de plus, pour un total de deux lavages, chacun durant 3 minutes.
- Après le lavage, la matrice gel est prête. Resuspendez les cellules souches de Leydig préparées dans le milieu de culture SLC complet (composition détaillée à l’étape 1).
- Ensemencer la suspension cellulaire directement sur la surface du gel. La densité de semis recommandée est de 2 × 104 cellules/cm2 (par exemple, environ 2 × 105 cellules par puits pour une plaque standard à 6 puits).
- Incubez les plaques de culture à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂.
- Pour maintenir une viabilité cellulaire optimale et une fonction stéroïdogène, changez le milieu de culture toutes les 48 heures.