Quantification cytométrique du flux sanguin total des plaquettes positifs aux facteurs tissulaires : un flux de travail multicentrique harmonisé

Résumé

Ici, nous présentons un flux de travail harmonisé pour la quantification par cytométrie de flux des plaquettes à facteur tissulaire positif dans les études multicentriques. Le protocole décrit des procédures standardisées pour la prise de sang, la fixation du sang total, la coloration et l’harmonisation des instruments, permettant d’effectuer une analyse locale ou centrale, selon les capacités du laboratoire.

Résumé

Les plaquettes du facteur tissulaire (TF^)pos représentent un sous-ensemble de la population plaquettaire. Récemment, ce sous-ensemble a montré qu’il prédit la mortalité cardiovasculaire chez les patients atteints de maladie coronarienne, l’établissant comme un biomarqueur utile pour la stratification du risque thrombotique. La quantification précise des plaquettes^pos de TF par cytométrie en flux nécessite une standardisation stricte de la manipulation pré-analytique, des procédures de coloration et des réglages des instruments, en particulier dans les études multicentriques où la variabilité technique peut affecter leur mesure. Ce protocole décrit un flux de travail harmonisé pour l’évaluation de la cytométrie du flux sanguin global des plaquettes^pos de TF circulantes, conçu pour garantir la reproductibilité entre les laboratoires disposant d’infrastructures techniques différentes. La procédure comprend une prélèvement sanguin standardisé et une fixation du sang entier afin de préserver le phénotype plaquetique in vivo. Deux méthodes différentes de préparation des échantillons sont proposées selon les capacités du laboratoire local : l’expédition des échantillons fixes au Core Laboratory pour une coloration, une acquisition et une analyse centralisées dans les centres sans installations de cytométrie en flux, ou la coloration et l’acquisition locales pour les centres équipés d’instruments de cytométrie en flux et de personnel formé. L’évaluation du pourcentage de plaquettes^pos TF est réalisée par marquage direct avec des anticorps anti-TF Star Fluor 488 et anti-CD41 PerCP-Cy5.5 afin d’identifier respectivement la protéine cible et le marqueur de population plaquettaire. L’harmonisation du cytomètre à débit est réalisée soit par un modèle d’acquisition partagé pour des modèles de cytomètres identiques, soit par un alignement à billes pour différentes plateformes. Le flux de travail intègre en outre une approche standardisée de gating et une analyse centralisée des données afin de permettre une comparaison fiable des mesures^TF pos-plaquettes entre les sites. Des résultats représentatifs ont démontré que ce flux de travail permet la quantification reproductible des plaquettes^pos TF à travers les paramètres validés d’acquisition multicentre. Ce protocole pourrait faciliter une application plus large de l’évaluation^{des plaquettes pos-TF} dans la stratification du risque thrombotique et soutenir une standardisation plus large de la cytométrie de flux plaquettaire dans la recherche translationnelle et clinique.

Introduction

Le facteur tissulaire (TF) est le principal initiateur de la cascade de coagulation sanguine et un déterminant clé de la génération de thrombine. Au-delà de son expression classique par les cellules subendothéliales et les leucocytes, TF est également associée aux plaquettes^circulantes 1,2,3,4,5. Lors de la thrombopoïèse, les mégacaryocytes transfèrent la TF à un sous-ensemble de^{plaquettes 6}. Dans des conditions physiologiques, environ 20 à 30 % des plaquettes circulantes contiennent de la TF stockée dans le système canaliculaire ouvert, spatialement séparée du facteur^{plasmatique VII 7}. Dans cet état compartimenté, la TF est fonctionnellement protégée des facteurs de coagulation circulants et reste inactive. En conséquence, seule une petite fraction des plaquettes présente une TF de surface détectable lorsque le sang total provenant d’individus sains est analysé par cytométrie de flux, reflétant l’homéostasie physiologique ^2,8. Des pathologies caractérisées par l’activation des plaquettes et un déséquilibre thrombo-inflammatoire peuvent perturber cet équilibre, entraînant une exposition accrue à la surface de la TF. Des proportions élevées de plaquettes TF-positives (TF^pos) ont été rapportées dans plusieurs troubles thrombotiques 9,10,11,12,13,14,15. Notamment, dans la maladie coronarienne, les niveaux de plaquettes^pos de TF supérieurs à 4 % prédisent de manière indépendante la mortalité cardiovasculaire à 5 ans, établissant le pourcentage de plaquettes^pos TF comme biomarqueur cliniquement pertinent du risque^{thrombotique 16}.

La quantification précise et reproductible des plaquettes^pos de TF est donc essentielle tant pour les applications de recherche translationnelle que clinique. Un flux de travail de cytométrie en flux plaquettaire précédemment publié pour l’évaluation des^{plaquettes pos-TF} a amélioré l’étude de cette protéine dans des contextes centraux^{uniques 17} , fournissant des conseils pour optimiser certaines étapes pré-analytiques ou analytiques. Cependant, cette approche n’a pas été spécifiquement conçue pour répondre aux défis logistiques et analytiques supplémentaires des études multicentriques, notamment les procédures d’expédition, le traitement standardisé des échantillons, et la prise en compte aussi de la nécessité d’harmoniser l’acquisition d’échantillons entre différentes plateformes de cytomètres à débit. De plus, les différentes infrastructures et niveaux d’expertise technique des centres participants doivent également être pris en compte.

Dans ce contexte, la valeur ajoutée du protocole actuel réside dans la fourniture d’un flux de travail détaillé combinant la prélèvement sanguin standardisé et la fixation du sang global, des protocoles flexibles de traitement des échantillons, l’harmonisation de l’acquisition multiplateforme, ainsi que la coloration directe et le contrôle centralisé de la qualité via l’analyse des données.

L’objectif de ce travail est donc de fournir un cadre opérationnel pour la mise en œuvre harmonisée multicentrique de l’analyse de plaquettes^pos TF dans le sang total par cytométrie de flux. Cette conception intégrée réduit la variabilité pré-analytique, analytique et inter-instruments, établissant ainsi la condition pour une évaluation cohérente des plaquettes^pos TF dans des contextes multicentraux.

Protocole

Tous les donneurs de sang ont fourni un consentement éclairé écrit approuvé par le Comité d’éthique de l’institution (n° 70/24, CE 18.06.24).

Le flux de travail multicentrique pour la quantification de cytométrie à flux sanguin total des^{plaquettes pos} TF est résumé à la Figure 1. Le protocole détaillé ci-dessous guidera l’utilisateur à travers cinq étapes principales.

Figure 1 : Flux de travail multicentrique pour l’analyse^TF pos-plaquettes. Représentation schématique du pipeline analytique pour l’évaluation multicentrique des plaquettes^pos de TF circulantes par cytométrie à flux sanguin total. Après l’inscription des sujets et le prélèvement sanguin, les échantillons sont fixés et traités selon les ressources techniques disponibles dans chaque unité clinique. Les centres sans installations de cytométrie en flux envoient des échantillons fixes au Core Laboratory pour coloration, acquisition et analyse. Les centres équipés de cytomètres à débit peuvent effectuer la coloration et l’acquisition sur site à l’aide de modèles d’acquisition standardisés. L’harmonisation de l’instrument est réalisée soit par des modèles partagés (même modèle d’instrument), des modèles générés au Core Laboratory (un modèle différent disponible pour l’alignement), soit par calibration avec des billes fluorescentes lorsque l’harmonisation directe des gabarits n’est pas réalisable. L’analyse des données est réalisée de manière centralisée à l’aide d’un flux de travail de contrôle standardisé. Le diagramme a été créé à l’aide de ChatGPT (OpenAI). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

1. Prélèvement sanguin

REMARQUE : L’évaluation des plaquettes^pos TF nécessite un maximum de 50 μL de sang total.

1. Prélever le sang veineux périphérique de la veine antécubitale à l’aide d’une aiguille papillon calibre 19. Appliquez le garrot uniquement pour la ponction venaise et relâchez immédiatement après la pose de l’aiguille pour minimiser l’activation plaquettaire ex vivo.
2. Jetez le premier tube EDTA. Ensuite, prélever le sang dans un vacutaïne de citrate de sodium de 0,129 M, remplir le tube selon le marqueur du fabricant afin de préserver le bon rapport sang/anticoagulant.
3. Inversez doucement 5 fois pour mélanger bien le sang et l’anticoagulant.
4. Gardez le tube droit à température ambiante, évitant l’agitation, la réfrigération ou le transport pneumatique.
5. Traitez l’échantillon dans les 3 heures suivant la collecte.

2. Préparation de l’échantillon

REMARQUE : Tous les anticorps doivent être achetés par le Core Laboratory et provenir du même lot. Si un changement de lot devient nécessaire pendant l’étude en cours, le nouveau lot de réactif doit être directement relié au lot en cours d’utilisation par des tests parallèles sous les mêmes conditions d’essai et adopté uniquement si une performance comparable est confirmée. Les réactifs couramment utilisés (par exemple, PBS – solution physiologique tamponnée au phosphate – et PFA – paraformoldéhyde) peuvent être achetés par chaque centre participant ; cependant, les codes produits doivent correspondre à ceux utilisés par le Core Laboratory, et la cohérence des lots doit être maintenue tout au long de l’étude.

1. Corrige l’échantillon.
   REMARQUE : Avant de commencer le traitement sanguin, préparez 1 % de PFA en diluant 4 % de PFA avec du PBS à température ambiante.
   ATTENTION : La PFA est toxique et doit être manipulée dans une cagoule chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants et protection oculaire). Évitez l’inhalation et le contact avec la peau ou les yeux. ÉLIMINATION DES DÉCHETS : Collectez toutes les solutions contenant des PFA, les échantillons fixes et les consommables contaminés dans des contenants fermés et correctement étiquetés conformément aux réglementations institutionnelles et locales.
   1. Inversez doucement le vacuum 5 fois pour mélanger le sang et l’anticoagulant.
   2. Transférez 50 μL de sang dans un tube de 2 mL contenant 950 μL de PFA à 1 %.
   3. Mélangez délicatement l’échantillon et faites éclore pendant 1 h et 30 minutes à température ambiante.
   4. Ajoutez 500 μL de PBS.
   5. Centrifugez à 1500 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
   6. Retirez le surnageant et resuspendez la pellete dans 1 mL de PBS.
      REMARQUE : Point de contrôle technique : Après centrifugation, vérifiez que la pellete est visible avant de retirer le surnageant. Retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Après la resuspension, vérifiez que l’échantillon est homogène et exempt de taches ou agrégats visibles.
   7. Expédiez l’échantillon fixé au laboratoire de carottage dans un emballage à température contrôlée, maintenu à 2-8 °C dans les 24 heures suivant la fixation. Ne gèle pas. Temps de collecte des documents, temps de fixation et temps d’expédition.
2. Étiquetage d’échantillons pour l’analyse de cytométrie en flux.
   REMARQUE : Anti-TF Star Fluor 488 (clone HTF1 ; anti-CD142) est dirigé contre le facteur tissulaire, tandis que l’anti-CD41 PerCP-Cy5.5 reconnaît l’intégrine plaquettaire alphaIIb. Avant de commencer la coloration, centrifugez les anticorps à 17000 x g pendant 5 minutes à +4 °C pour éliminer tout^{agrégat 18}. Diluer l’anticorps anti-TF Star Fluor 488 (1:100) avec PBS. L’Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 ne nécessite pas de dilution intermédiaire et doit être utilisé au volume recommandé par le fabricant.
   1. Préparez quatre tubes en polypropylène de 2 mL.
   2. Distribuez 80 μL d’échantillon fixe dans chaque tube.
   3. Ajoutez à chaque tube le volume correct de PBS et d’anticorps anti-TF Star Fluor 488 comme indiqué dans le tableau 1  (jour 1).
   4. Mélangez doucement les échantillons.
   5. Incubez O/N à 4 °C dans le noir.
   6. Le lendemain (jour 2), ajoutez l’anti-CD41 PerCP-Cy5.5 aux tubes 3 et 4 comme indiqué dans le tableau 1.
   7. Mélangez doucement les échantillons.
   8. Incubez pendant 15 minutes à température ambiante dans le noir.
   9. Diluez chaque tube avec 300 μL de PBS.
   10. Conserver les échantillons colorés dans l’obscurité jusqu’à l’acquisition de la cytométrie en flux.
       REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pendant jusqu’à trois^{jours 17}. Un stockage plus long entraîne une décroissance progressive du signal et doit être évité.

		Jour 1		Jour 2
Non.	ID de la méprise	1X PBS (μL)	Anti-TF Star Fluor 488 (μL)	Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	Sans tache	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

Tableau 1 : Protocole de coloration pour l’évaluation des plaquettes^{TF pos}.

3. Normalisation de l’acquisition du cytomètre à débit

1. Mise en place d’un modèle d’acquisition (par le Core Laboratory).
   1. Mise en place du modèle pour le cytomètre en flux A.
      1. Ouvre le logiciel A v2.6.
      2. Créez un diagramme de points FSC-A/SSC-A [Tous les événements] à l’échelle logarithmique pour visualiser les populations cellulaires (Figure 2A).
      3. Créer un diagramme de points CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A [Tous les événements] à l’échelle logarithmique pour identifier les plaquettes à l’intérieur d’une porte [Plaquettes] (Figure 2B).
      4. Créer un diagramme pseudocolore PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A [Tous les événements] pour vérifier le débordement/compensation (Figure 2C).
      5. Créer un diagramme de points FSC-A/FSC-H dans la porte [Plaquettes] et définir une région pour identifier les singlets ([Singlets] ; Figure 2D).
      6. Créer un diagramme de points CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF Star Fluor 488-A dans la porte [Singlets] pour identifier les plaquettes^{TF pos} (Figure 2E).
      7. Réglez le seuil à 1000 sur SSC-H.
      8. Réglez le débit sur « Lent ».
      9. Régler le gain B525 à 315 pour garantir une discrimination optimale entre événements positifs et négatifs ; ajuster si nécessaire selon l’instrument utilisé.
      10. Fixez le gain du B690 selon le contrôle qualité quotidien. L’acquisition n’est acceptable que si la population de plaquettes^{CD41 pos}- est entièrement résolue à partir du fond négatif et reste dans la porte de référence prédéfinie établie dans le modèle lors de l’acquisition.
      11. Exportez le modèle en utilisant le « Export Experiment Template ».
      12. Télécharger : Le modèle d’acquisition pour l’analyse pos-plaquettes TF sur le cytomètre de flux A est disponible en téléchargement en tant que fichier supplémentaire 1 et figure supplémentaire 1.
          REMARQUE : Un graphique pour vérifier le débordement/compensation (Figure 2C), bien que non nécessaire pour cette analyse multiparamétrique, est inclus. Il convient néanmoins de considérer si une combinaison de fluorochromes différente de celles proposées dans ce protocole sera utilisée.
   2. Créez un modèle pour le cytomètre en flux B.
      1. Créez un fichier protocole incluant l’ensemble de la configuration d’acquisition comme décrit dans la version 3.1.1.
      2. Exportez le modèle en utilisant la fonction « Export Protocol » dans le logiciel B v1.6, générant un fichier protocole.
      3. Sur l’instrument récepteur, importez le fichier protocole en utilisant la fonction « Import Protocol » dans le logiciel.
   3. Création de gabarit pour le cytomètre à flux C.
      1. Créez un fichier d’espace de travail incluant l’ensemble de la configuration d’acquisition comme décrit dans la version 3.1.1. et l’exporter.
      2. Sur l’instrument récepteur, importez le fichier de travail en utilisant la fonction « Copy » du logiciel C v3.1.
2. Harmonisation des cytomètres à débit utilisant des billes d’étalonnage.
   REMARQUE : Utilisez des billes de calibration Rainbow à 6 pics.
   1. Définition de la valeur cible.
      REMARQUE : Utilisez la formule suivante pour définir l’intensité médiane de fluorescence (MdFI) du premier pic dans le canal de fluorescence B525 :
      MdFI_CU =
      où CU : instruments d’unité clinique et RI : instrument de référence.
   2. Préparation d’échantillons.
      1. Vortex, le flacon de perles.
      2. Ajoutez 5 gouttes de billes dans un tube d’échantillon.
      3. Ajoutez 1 mL de PBS.
      4. Vortex pendant 5 à 10 secondes.
   3. Acquisition de perles.
      1. Créer un diagramme de points FSC-A/SSC-A à l’échelle logarithmique affichant [Tous les événements], et définir une région appelée [Billes] (Figure 3A).
      2. Créez un diagramme de points FSC-A/FSC-H dans la porte [Billes] et définissez une région pour identifier les singlets [Singlet] (Figure 3B).
      3. Créez un graphique histogramme pour le canal de fluorescence Star Fluor 488 (B525).
      4. N’afficher que [Singlet]  sur l’histogramme.
      5. Tracez une porte sur toute la largeur du premier sommet (région B dans la Figure 3C).
      6. Dans le ruban Statistiques, affichez les valeurs médianes X (X-Med).
      7. Supprimez toute compensation existante.
      8. Réglez le débit sur « Lent ».
      9. Commencez l’acquisition en mode « Run ».
      10. Depuis « Acquisition setting », modifiez la tension/gain du B525 pour atteindre la cible X-Med calculée selon la valeur cible.
      11. Enregistrer un fichier de données de 10 000 événements dans la porte [Singlet] seulement après que ce critère d’acceptation ait été atteint. Ne prenez pas d’échantillons d’étude avant d’atteindre la plage cible.

Fichier supplémentaire 1 : Modèle d’acquisition pour l’analyse^{de plaquettes TF pos} sur le cytomètre de flux A disponible en téléchargement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : Capture d’écran du modèle d’acquisition pour l’analyse pos-plaquettes TF sur le cytomètre de flux A. (A) Le diagramme de points FSC-A vs SSC-A fournit une représentation visuelle de la distribution globale des événements. (B) Les plaquettes sont identifiées dans un graphique CD41 vs SSC-A et signalées comme [Plaquettes]. (C) Un graphique PerCP-Cy5.5 vs Star Fluor 488 est inclus pour évaluer le débordement potentiel. (D) Les doublets sont exclus dans la porte des [Plaquets] à l’aide d’un graphique FSC-A vs FSC-H, définissant la population des [Singlets]. Les plaquettes pos TF (E) sont identifiées dans la porte [Singlets] sur la base de la fluorescence PerCP-Cy5.5 et Star Fluor 488. (F-H) Les paramètres d’acquisition, incluant le débit d’échantillonnage (Lent), le seuil primaire (SSC) et les gains du détecteur (B525 et B690), tels qu’implémentés dans le modèle, sont affichés. Tous les détails de la configuration et du flux de travail d’acquisition sont fournis dans la section 3.1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 2 : Modèle d’acquisition et stratégie de verrouillage pour l’identification des plaquettes^pos TF. (A) Diagramme de points FSC-A/SSC-A (échelle logarithmique) montrant tous les événements détectés. (B) Diagramme de points CD41-A/SSC-A utilisé pour identifier la population de plaquettes. (C) Diagramme de pseudocouleur PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 utilisé pour évaluer les besoins de débordement spectral et de compensation. (D) Graphique FSC-A/FSC-H dans la porte [Plaquettes] utilisé pour exclure les doublets et définir les pourpoints. (E) Diagramme de points PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 dans les [Singlets] utilisé pour identifier les plaquettes^pos TF. Les champs statistiques affichés entre parenthèses sont automatiquement remplis avec des valeurs spécifiques à l’échantillon lorsque le modèle est appliqué lors de l’acquisition de l’échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Procédure d’étalonnage d’instrument à base de billes. (A) Graphique FSC-A/SSC-A utilisé pour identifier les événements de billes. (B) Graphique FSC-A/FSC-H dans les événements de billes utilisé pour exclure les agrégats et définir les singlets. (C) Histogramme de la fluorescence Star Fluor 488 affichant les pics des billes avec une grille appliquée au premier pic de billes pour déterminer l’intensité médiane de fluorescence. Les statistiques visualisées doivent être considérées comme représentatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Acquisition d’échantillons par cytométrie en flux pour l’analyse de plaquettes^{TF pos}

1. Achetez avec un modèle FCM.
   1. Importez le modèle d’acquisition en utilisant la fonction « Import Template » dans le logiciel A.
   2. Obtenez les échantillons préparés à l’étape 2.
   3. Vérifiez que les portes des plaquettes et des singlets correspondent à la géométrie du diagramme de référence avant l’enregistrement des données. Ajustez les portes si besoin.
   4. Commencez à enregistrer après 5 à 10 secondes de flux stable. Enregistrez un fichier de données de 20 000 événements à l’intérieur de la porte  des [Singlets]  (voir la Figure 2D). Sauvegardez les fichiers .fcs non compensés et transmettez-les au laboratoire central.
2. Acquisition sans modèle FCM.
   1. Recréez une feuille d’acquisition comme rapporté dans la section 3.1, incluant les cinq graphiques décrits et la hiérarchie des portes : Tous les événements > plaquettes > les pourceaux > quadrants TF/CD41.
   2. Réglez le seuil à 1000 sur SSC-H.
   3. Réglez le débit sur « Lent ».
   4. Réglez la tension/gain B525 comme défini dans la 3.2.3.
   5. Faites préparer l’échantillon à l’étape 2. Commencez l’enregistrement après 5 à 10 secondes de flux stable ; acquérir 20 000 épreuves dans la porte des [Singlets]. Sauvegardez les fichiers .fcs non compensés, puis envoyez-les au Laboratoire Central.
      REMARQUE : L’acquisition n’est acceptable que si l’instrument QC quotidien est approuvé. Si l’objectif de 20 000 plaquettes pos– CD41 n’est pas atteint, il faut acquérir un minimum de 10 000 événements^{pos-plaquettes} CD41.

5. Analyse des données

REMARQUE : Le flux de travail d’analyse décrit ci-dessous vise à soutenir les activités du Laboratoire Principal responsable du traitement centralisé des données et du contrôle qualité.

1. Ouvrez une nouvelle feuille d’analyse et chargez les fichiers .fcs.
2. Pour chaque échantillon, créez un modèle d’analyse comme montré à la Figure 2. Pour les plateformes non identiques, utilisez un modèle équivalent spécifique à chaque plateforme avec la même structure de portes et les mêmes sorties statistiques.
3. Vérifier que le gating identifie correctement la population de plaquettes selon les caractéristiques de diffusion prédéfinies et la stratégie de discrimination des singlets (Figure 4A,B,D).
4. Vérifier le débordement/compensation au moyen d’un diagramme de pseudo-couleur [Tous les événements] (Figure 4C).
   REMARQUE : L’étoile fluorochrome Fluor 488 a une émission spectrale à 520 nm, contre PerCP-Cy5.5, qui a une émission spectrale à 676 nm, ce qui explique l’absence de chevauchement et la nécessité de ne pas compenser.
5. Appliquez la séquence de gating suivante dans le diagramme de points Star Fluor 488 (Figure 5) :
   1. Non coloré : définissez les quadrants en utilisant le contrôle non coloré de sorte que les événements^pos TF de fond restent à 0,01 % ou en dessous de 0,01 % des événements plaquettaires, en excluant par la présente l’autofluorescence plaquettaire (Figure 5A).
   2. TF : appliquer les coordonnées du quadrant définies dans l’échantillon non coloré pour identifier le^{signal pos} TF dans des échantillons à coloration unique (Figure 5B).
   3. CD41 : définir les quadrants en utilisant l’échantillon unique coloré CD41 pour exclure la fluorescence de fond des plaquettes (Figure 5C).
   4. TF/CD41 : appliquer les mêmes coordonnées de quadrants pour identifier le signal^pos TF dans des échantillons colorés à TF/CD41 (Figure 5D).
      REMARQUE : Le pourcentage final de pos-plaquettes TF est obtenu à partir des statistiques générées par le logiciel d’analyse et est rapporté comme le pourcentage d’événements^pos CD41 qui se situent dans le quadrant^pos TF de la population de plaquettes verrouillées.
6. Effectuer un contrôle de qualité centralisé sur l’identification des noms de fichiers, les lots de réactifs, l’intervalle fixation-acquisition, la température d’expédition, le nombre d’événements et les distributions de fluorescence des valeurs aberrantes. Les fichiers montrant des écarts documentés dans la manipulation, l’expédition, le moment de fixation ou les paramètres d’acquisition doivent être signalés, examinés de manière centralisée, puis soit exclus, soit répétés, conformément au plan de gestion des écarts spécifique à l’étude.

Figure 4 : Stratégie de gating séquentielle pour l’analyse^{de plaquettes pos-TF}. Le flux de travail d’analyse représentative illustre l’identification des populations de plaquettes après le chargement de fichiers .fcs. (A-B) Des graphiques en points confirmant la bonne mise en page des populations de plaquettes. (C) Diagramme de pseudo-couleur PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 utilisé pour évaluer le débordement spectral. (D) Graphique FSC-A/FSC-H dans la porte des plaquettes utilisé pour exclure les doublets et définir les singlets. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Modèle d’analyse de données. Diagrammes représentatifs du contrôle non coloré (A) utilisés pour définir l’autofluorescence de base et le positionnement des quadrants. (B) Échantillon TF coloré en une seule teinture ; (C) Échantillon coloré unique CD41 utilisé pour définir le positionnement des quadrants. (D) Échantillon doublement coloré par TF/CD41 utilisé pour l’analyse de plaquettes^pos TF. Les chiffres indiquent le pourcentage de plaquettes^pos TF dans un échantillon représentatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Résultats

Ce flux de travail a été spécifiquement conçu pour permettre aux centres dotés d’infrastructures techniques hétérogènes de participer à des études multicentriques nécessitant la quantification des plaquettes^pos TF. La figure 1 illustre le diagramme de flux de travail organisationnel conçu pour soutenir les études multicentriques visant à mesurer les plaquettes^pos de TF circulantes par cytométrie du flux sanguin entier. Différentes procédures de préparation des échantillons sont mises en œuvre selon les ressources techniques disponibles dans les centres participants. Plus précisément, (i) lorsqu’une unité clinique ne dispose pas d’installation de cytométrie en flux ou de personnel formé, les échantillons de sang entier sont fixés immédiatement après la collecte, puis envoyés au laboratoire central pour une coloration, une acquisition et une analyse centralisées. (ii) Alternativement, les centres équipés d’installations de cytométrie en flux peuvent effectuer localement des colorations et acquisitions. Dans ces cas, l’acquisition de données suit un flux de travail harmonisé défini par le Core Laboratory. Si le modèle d’instrument correspond à celui utilisé dans le Core Laboratory, l’acquisition est effectuée à l’aide d’un modèle standardisé fourni par le Core Laboratory. Lorsque différents modèles d’instruments sont utilisés, l’harmonisation peut être obtenue soit par transfert de gabarit – lorsque des instruments sont disponibles pour l’alignement au Core Laboratory – soit par des procédures d’étalonnage à billes avant l’extraction de l’échantillon. Les échantillons peuvent ensuite être acquis et analysés selon le flux de travail standardisé.

Les résultats représentatifs suivants visent à illustrer la faisabilité du flux de travail et les étapes clés d’harmonisation, plutôt qu’à fournir une validation formelle multicentrique des tests. Pour garantir une détection fiable des TF, la stratégie de coloration a d’abord été évaluée pour la compatibilité spectrale et la stabilité du signal. Les plaquettes ont été identifiées à l’aide d’anti-CD41 PerCP-Cy5.5, tandis que la détection de TF reposait sur un anticorps monoclonal anti-TF conjugué à Star Fluor 488. Des témoins à coloration unique ont été utilisés pour vérifier l’absence de débordement de fluorescence entre les canaux de détection. Comme montré à la Figure 6A, les échantillons de PerCP-Cy5.5 en une seule coloration CD41 n’ont produit aucun signal détectable dans le canal Star Fluor 488. De manière constante, le pourcentage de plaquettes^pos TF mesuré dans des échantillons doublement colorés était comparable à celui obtenu dans des échantillons TF colorés en une seule coloration (Figure 6B).

Figure 6 : Validation de la spécificité de la coloration. (A) Échantillon anti-CD41 PerCP-Cy5.5 à coloration unique analysé dans un diagramme de points PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 afin de vérifier la spécificité du signal. (B) Les pourcentages de plaquettes^pos TF mesurés dans les échantillons TF colorés en simple par rapport aux doubles colorations TF/CD41 sont présentés comme des mesures individuelles par des paires (points) et la moyenne ± SD (n = 18 sujets indépendants). Les données ont été analysées par le test Wilcoxon par paires à rang signé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.La sensibilité analytique du test proposé a été évaluée sur des échantillons de n=200 sujets sains. En utilisant des échantillons biologiquement vierges, la limite calculée de l’espace blanc (LoB) était de 0,39 %, la limite de détection (LoD) de 0,77 %, et la limite de quantification (LoQ) de 1,12 %, définie comme le niveau le plus bas associé à un CV ≤ 20 %. La reproductibilité interopérateur de la stratégie de gating a été évaluée sur 40 échantillons indépendants analysés par 6 opérateurs à l’aide du modèle d’analyse prédéfini, obtenant un ICC de 0,985 (IC à 95 % : 0,978-0,990).

La stabilité de la détection de la TF après fixation du sang entier a ensuite été évaluée en colorant longitudinalement des échantillons fixes. Comparés aux échantillons de base colorés le jour de la fixation (D0), les niveaux de plaquettes^pos de TF sont restés stables jusqu’à quatre jours après fixation (D3-D4), ne montrant qu’une diminution non significative d’environ 22 % au niveau D3-D4 (77,8 ± 7,2 % - pourcentage relatif dans les plaquettes^pos TF) par rapport au niveau de D0. Lorsque la coloration a été réalisée à D5-D6, la détection de plaquettes^pos TF a diminué significativement à 53,8 % ± 20,7 % (pourcentage relatif dans les plaquettes^pos TF ; p< 0,0001 ; Figure 7). Ces résultats indiquent que les échantillons fixés peuvent être analysés de manière fiable dans les quatre jours suivant la fixation avec seulement une perte modérée de signal.

Figure 7 : Analyse du parcours temporel après fixation de l’échantillon. La quantification des plaquettes^pos TF mesurée à différents moments après fixation indiquait sur l’axe des x comme suit : D0 = jour de prélèvement sanguin ; D1 = jour 1 ; D2 = jour 2 ; D3-4 = jour 3 ou 4 ; D5-6 = jour 5 ou 6. Les données sont exprimées en moyenne ± pourcentage relatif de l’DE par rapport à D0 (n = 7-10 sujets en bonne santé, évalués sur les points de temps post-fixation indiqués). Les données ont été analysées à l’aide d’Anova suivies du test de comparaison multiple de Dunnett. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

La performance du flux de travail d’acquisition harmonisé a ensuite été évaluée sur différentes plateformes de cytométrie en flux. L’harmonisation basée sur des modèles a d’abord été évaluée à l’aide d’instruments FACSLyric et MACSQuant comme cytomètres de référence. Des instruments supplémentaires des mêmes modèles, situés dans des installations externes, furent utilisés comme plateformes d’essai. Des échantillons de sang entier contenant des plaquettes au repos ont été prélevés à la fois sur instruments de référence et de test en utilisant le modèle d’acquisition standardisé. Comme montré à la Figure 8A, B, des pourcentages comparables de^{plaquettes TF} pos ont été obtenus sur les cytomètres de référence et test, confirmant la reproductibilité de l’approche à gabarit partagé.

Figure 8 : Reproductibilité inter-instruments à l’aide de modèles d’acquisition partagés. Pourcentages de plaquettes^pos de TF mesurés dans le sang entier de n=6 sujets sains acquis sur des instruments de référence et testés FACSLyric (A) ou MACSQuant (B) au moyen d’un modèle d’acquisition partagé appliqué entre les instruments. Les données sont exprimées sous forme de déterminations individuelles (points) et de moyenne ± de la DC. Les données ont été analysées par un test t par paires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Enfin, l’harmonisation à base de billes a été évaluée pour aligner des instruments de différentes configurations. Le cytomètre A était utilisé comme instrument de référence, et un FACSymphony comme instrument de test. L’alignement a été réalisé à l’aide de billes de calibration Rainbow à 6 pics en ajustant la tension du détecteur FACSymphony à 488 nm jusqu’à ce que l’intensité de fluorescence des billes tombe dans la plage cible prédéfinie. Les profils histogrammes illustrant les distributions des pics des billes avant et après l’alignement sont présentés à la Figure 9A. Des échantillons de sang entier ont ensuite été prélevés sur l’instrument de test avant et après l’étalonnage. Avant l’harmonisation, les pourcentages de plaquettes^pos de TF différaient entre les deux plateformes. Après un alignement basé sur des billes, les valeurs correspondaient étroitement à celles obtenues sur le cytomètre de référence (Figure 9B), démontrant une harmonisation multiplateforme réussie et une quantification reproductible des TF.

Figure 9 : Harmonisation des instruments à base de perles. (A) Histogramme représentatif de fluorescence des billes de calibration Rainbow à 6 pics acquises avant (pics rouges) et après l’alignement de l’instrument (pics verts). (B) Pourcentages de plaquettes^pos TF mesurés dans des échantillons au repos préparés sur n=6 sujets sains acquis sur l’instrument test avant (pré) et après (post) harmonisation. Les mesures obtenues sur l’instrument de référence sont montrées pour comparaison. Les données ont été analysées par un test t jumelé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Ce protocole fournit un flux de travail étape par étape pour la quantification par cytométrie du flux sanguin global des plaquettes^pos TF, spécifiquement conçu pour une implémentation multicentre. Son principal avantage méthodologique par rapport aux flux de travail conventionnels basés sur l’analyse par cytométrie par flux plaquettaire est qu’elle standardise l’ensemble du processus analytique, de la collecte de sang et la fixation du sang entier à l’étiquetage de l’échantillon, à l’harmonisation des instruments avant l’obtention de l’échantillon, ainsi qu’à l’analyse centralisée et au contrôle de la qualité des données. Cela permet aux centres sans capacité de traitement d’échantillons de participer à des études multicentriques, s’ils peuvent fournir des échantillons de sang. Le flux de travail actuel traite des sources pratiques de variabilité entre centres qui sont les plus pertinentes, étant donné qu’une faible proportion de plaquettes présente une TF associée à la surface détectable dans des conditions^{physiologiques 7,8}. Ces sources incluent des différences dans la gestion locale des échantillons, l’accès aux installations de cytométrie en flux, la configuration des instruments et l’analyse des données dépendante de l’opérateur.

Pour surmonter ces problèmes, le sang total est fixé peu après la collecte, stabilisant ainsi le phénotype plaquettaire in vivo et évitant la nécessité d’un marquage immédiat et d’une collecte d’échantillons. Les résultats représentatifs indiquent que cette approche à échantillon fixe permet un traitement centralisé différé dans l’intervalle post-fixation validé. Cela élargit le potentiel de participation à l’étude vers les centres disposant d’installations de cytométrie en flux sur site, tout en maintenant un flux de travail pré-analytique cohérent. Un second avantage du protocole est l’utilisation d’une stratégie de coloration directe simplifiée avec un panneau simple bicolore, ce qui réduit la complexité de la procédure.

Dans le panel, nous avons utilisé le clone monoclonal anticlonal anti-TF HTF1, bien caractérisé, qui reconnaît le site catalytique de la TF et concurrence la liaison au facteur VII, ce qui en fait l’un des réactifs les plus fiables disponibles pour la détection de TF, également dans les^{plaquettes 14, 16, 17}. L’anticorps a été conjugué à Star Fluor 488, un fluorochrome lumineux et photostable spectralement similaire au FITC mais avec une meilleure stabilité du signal. Il est important de noter que l’excitation à 488 nm permet la détection d’échantillons avec la configuration laser bleue disponible sur pratiquement tous les cytomètres à flux conventionnels, y compris les instruments d’entrée de gamme. Cette combinaison de spécificité épitope et de détection simple du fluorochrome améliore la sensibilité analytique et la scalabilité sur plusieurs sites. Dans cet essai, les seuils de positivité ont été définis en utilisant des contrôles non colorés et FMO comme une meilleure option comparé au contrôle isotype pour la position des seuils dans les populations à basse fréquence¹⁸.

L’utilisation de différents cytomètres en flux peut représenter une source de variabilité dans les études de cytométrie en flux^{multicentrique} 19,20,21. Nous avons déjà conseillé la gestion pré-analytique, la mise en place des teintures et l’optimisation locale des^{instruments 17}. Mais ces mesures ne garantissent pas de signaux de fluorescence cohérents sur différentes plateformes. Le flux de travail actuel répond à cette problématique en combinant une analyse centralisée avec l’harmonisation des acquisitions prospectives. Les modèles d’acquisition partagée peuvent être utilisés lorsque des cytomètres identiques sont disponibles, tandis que l’alignement basé sur des billes peut être appliqué lorsque différentes plateformes doivent être incluses. Cette double stratégie offre un avantage pratique par rapport aux modèles analytiques multicentriques qui reposent uniquement sur une analyse centralisée après une acquisition locale hétérogène, en réduisant la variabilité de l’analyse des données ab initio et en soutenant une application plus reproductible des portes à travers les sites.

La généralisation du flux de travail ne doit pas être surestimée. Le protocole a été validé à l’aide de conditions de fixation du sang entier spécifiées, de la combinaison anti-TF-Star Fluor 488 et anti-CD41 PerCP-Cy5.5, de procédures d’harmonisation et d’un ensemble limité de configurations de cytomètres à débit. Si d’autres clones anti-TF, combinaisons de fluorochrome, timings de fixation, concentrations fixatives ou cytomètres à flux avec des optiques sensiblement différentes sont utilisés, la performance analytique du flux de travail doit être vérifiée. Dans l’ensemble, toute défaillance de protocole doit être gérée selon les règles de déviation prédéfinies suggérées. Selon la gravité de la déviation, les données peuvent être signalées, répétées ou exclues selon le plan de déviation spécifique à l’étude. Dans ces limites, le protocole actuel doit être considéré comme un cadre opérationnel pour la mise en œuvre multicentrique de l’analyse^{plaquettaire TF pos}. La validation analytique formelle, incluant une évaluation plus large de la performance inter-laboratoires, la validation des expéditions et la répétabilité des essais, est actuellement abordée dans le cadre d’une étude internationale dédiée à la normalisation de la Société internationale de thrombose et d’hémostase. La pertinence clinique d’une quantification précise des^{plaquettes pos} TF est soulignée par des preuves démontrant sa valeur pronostique dans la maladie coronarienne, où des niveaux de plaquettes^pos TF supérieurs à 4 % prédisent indépendamment la mortalité cardiovasculaire à long terme au suivi^{de cinq ans 16}. Une mesure multicentrique fiable est donc essentielle pour valider les^{plaquettes pos} de TF en tant que biomarqueur et pour étendre son application aux essais cliniques prospectifs et aux registres réels. La mise en œuvre future d’algorithmes automatisés de normalisation et de stratégies d’autogating pourrait encore réduire le biais des opérateurs et soutenir l’analyse décentralisée tout en maintenant la comparabilité^{inter-sites 22,23}.

En conclusion, ce flux de travail harmonisé offre une approche pratique et reproductible pour la quantification des plaquettes^pos TF par cytométrie à flux sanguin total dans des contextes multicentriques. En combinant des procédures pré-analytiques standardisées, un traitement simplifié des échantillons et des stratégies d’harmonisation des instruments, le protocole permet une comparaison fiable entre sites des mesures^{de plaquettes TF pos}. Au-delà du soutien à l’évaluation des plaquettes^pos TF comme biomarqueur du risque thrombotique, les principes décrits ici peuvent contribuer à des efforts plus larges visant à standardiser la cytométrie de flux plaquettaire pour des applications de recherche translationnelle et clinique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1X PBS w/o Calcium and Magnesium	Gibco	10010-015	Pour les anticorps et la dilution des échantillons
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	Anticorps monoclonal anti-humain CD41a utilisé comme marqueur de la population plaquettaire ; devrait être fourni par le laboratoire central
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	Anticorps monoclonal anti-facteur tissulaire humain (CD142) ; devrait être fourni par le laboratoire central
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	non catalog item	Dans le texte, Flow Cytometer B
BD FACSuite software v1.6	BD	non catalog item	Dans le texte, logiciel B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	Pour le prélèvement sanguin
CytExpert Software	Beckman Coulter	non catalog item	Dans le texte, logiciel A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	non catalog item	Dans le texte, Flow Cytometer A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	non catalog item	Dans le texte, Flow Cytometer C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	non catalog item	Dans le texte, logiciel C
Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	120094	Pour la fixation du sang total
Paraformaldehyde	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Pour fixer les échantillons
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	Pour transférer des échantillons sanguins
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	Pour transférer des échantillons sanguins
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	Pour transférer des échantillons sanguins
Polystyrene Round-Bottom Tube 5 mL	Corning	352052	Nécessaire pour l'acquisition du cytomètre
Rainbow calibration beads (6 peaks)	Spherotech (BD)	556286	Pour l'harmonisation du cytomètre
Vacutainer EDTA	BD	368857	Pour recueillir les 3 premiers ml de sang
Vacutainer multiple sample luer adapter	BD	367300	Pour le prélèvement sanguin
Vacutainer one use holder	BD	364815	Pour le prélèvement sanguin
Vacutainer with 0,129 M sodium citrate	BD	363079	Pour collecter le sang