Caractérisation fonctionnelle des partenaires pré- et postsynaptiques individuels dans le système nerveux central larvaire de Drosophila à l’aide de CaMPARI

Summary

Ce protocole évalue l’activité synaptique fonctionnelle entre partenaires neuronaux définis in vivo dans le système nerveux central des larves de Drosophila melanogaster à l’aide d’outils génétiquement codés. La stimulation optogénétique médiée par CsChrimson des neurones sensoriels présynaptiques cIVda induit la photoconversion dépendante du calcium de CaMPARI dans les interneurones postsynaptiques du Bassin-4.

Abstract

Les études sur le connectome ont considérablement élargi la compréhension de la connectivité synaptique dans les systèmes nerveux de diverses espèces. Alors que la caractérisation des partenaires synaptiques à l’aide de la microscopie électronique (EM) fournit des informations anatomiques détaillées, les aspects fonctionnels des réseaux neuronaux nécessitent des approches complémentaires. Des études récentes sur Drosophila ont révélé non seulement le connectome complet de la larve, ainsi que le système nerveux central adulte mâle et femelle, mais aussi les composants cellulaires des réseaux neuronaux qui régulent des comportements spécifiques, tels que le réseau nociceptif larvaire. Au stade larvaire du troisième stade, les neurones sensoriels multidendritiques de classe IV (cIVda) établissent la plupart des contacts synaptiques avec les interneurones du bassin-4. Pour évaluer la pertinence fonctionnelle de ces connexions anatomiques, l’indicateur calcique génétiquement codé CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivable Ratiometric Integrator) a été utilisé chez des larves vivantes de troisième stade non disséquées comme rapporteur dépendant de l’activité pour évaluer la connectivité synaptique entre les neurones cIVda et les interneurones du Basin-4. CaMPARI est un indicateur fluorescent ratiométrique dont le spectre d’émission varie en réponse à des niveaux élevés de calcium intracellulaire. En conditions de base, CaMPARI fluoresce en vert ; En présence de fortes concentrations de calcium et lors d’une exposition à la lumière de photoconversion (~400 nm), elle passe irréversiblement à la fluorescence rouge. Parce que l’afflux de calcium dans les neurones postsynaptiques est une caractéristique de l’activation synaptique, la photoconversion CaMPARI fournit une lecture de la signalisation synaptique fonctionnelle. Une méthode étape par étape est présentée pour immobiliser les larves du troisième stade sur une lame de microscope pour l’activation optogénétique des nocicepteurs cIVda à l’aide de la channelrhodopsine décalée vers le rouge CsChrimson, combinée à une photoconversion simultanée CaMPARI dans les neurones du Bassin-4. La photoconversion dépendante du calcium dans les neurones du bassin-4, malgré les mouvements internes et les changements du plan focal, fournit des preuves fonctionnelles de la connectivité synaptique entre ces cellules. Cela sert de preuve de principe pour l’utilisation de CaMPARI en combinaison avec la stimulation optogénétique présynaptique chez des larves de Drosophila intactes et non disséquées.

Introduction

L’identification de partenaires synaptiques précis dans le système nerveux central (SNC) permet de suivre la formation et l’affinement des connexions synaptiques lors du développement du système nerveux. En conséquence, les efforts se sont concentrés sur l’utilisation de la microscopie électronique volumétrique (EM) pour reconstruire non seulement des connectomes complets chez des organismes modèles génétiques puissants tels que Caenorhabditis elegans ^1,2 et Drosophila melanogaster ^3,4,5, mais aussi des volumes électromagnétiques à l’échelle millimétrique de cerveaux complexes de mammifères, y compris le cortex visuel^{primaire de la souris 6} et le cortex temporal^{humain 7}. Ces études offrent un éclairage unique sur les principes organisationnels sous-jacents à la connectivité synaptique au niveau anatomique. Cependant, la caractérisation fonctionnelle des partenaires synaptiques offre une compréhension complémentaire de la connectivité neuronale et est nécessaire pour valider les résultats anatomiques.

Drosophila offre de nombreux avantages pour l’étude de la connectivité neuronale, notamment la disponibilité de connectomes complets pour la^{larve 3} ainsi que pour la femelle 4 et le système nerveux^{central adulte de la femelle 4 et du mâle 5}, en plus de circuits neuronaux bien caractérisés qui régulent les comportements ^{prévisibles 8,9,10}. Le réseau nociceptif larvaire représente l’un de ces circuits bien adaptés à l’étude de la connectivité synaptique^{précise 11}. La reconstruction EM de ce réseau a révélé des partenariats synaptiques détaillés nécessaires au traitement des stimuli nociceptifs, conduisant au comportement d’évasion caractéristique connu sous le nom de roulement^{nocifensif 12,13}.

Dans ce réseau, les neurones de arborisation dendritique de classe IV (cIVda)¹⁴ fonctionnent comme nocicepteurs sensoriels primaires responsables de la détection de la douleur 11,12,13,15,16. Leurs corps cellulaires et dendrites sont situés périphériquement dans la paroi corporelle, tandis que leurs axones projettent dans la mèche nerveuse ventrale larvaire (VNC)¹⁵. Dans le SNC, les neurones cIVda arborisent leurs terminaisons axonales selon un motif stéréotypé et forment la majorité de leurs contacts synaptiques avec les interneurones du Bassin-4 11,12,13,17. Cette relation synaptique définie établit les neurones cIVda et les interneurones du Bassin-4 comme une paire idéale pour l’évaluation fonctionnelle de la connectivité synaptique in vivo. Le développement de méthodes pour analyser les connexions fonctionnelles entre partenaires synaptiques identifiés individuellement facilitera l’étude des mécanismes sous-jacents au développement et au raffinement synaptique, en particulier dans les systèmes génétiquement manipulables avec des circuits neuronaux stéréotypés.

CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivable Ratiometric Integrator⁾¹⁸ est un indicateur fluorescent ratiométrique codé génétiquement dont le spectre d’émission se déplace en réponse à des niveaux élevés de calcium intracellulaire. En conditions de base, CaMPARI fluoresce en vert ; En présence de fortes concentrations de calcium et lors d’une exposition à la lumière de photoconversion (~400 nanomètres (nm)), il se convertit irréversiblement en fluorescence^{rouge 18}. Parce que l’afflux de calcium dans les neurones postsynaptiques est une caractéristique de l’activation synaptique, la photoconversion CaMPARI fournit une lecture de la signalisation synaptique^{fonctionnelle 19,20}.

En plus de CaMPARI, l’activité neuronale peut être visualisée à l’aide de capteurs réversibles tels que les indicateurs de calcium codés génétiquement (GECI) comme GCaMP ou RCAMP²¹, ainsi que des indicateurs de tension codés génétiquement (GEVI⁾²² tels qu’Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴ ou VARNAM²⁵. Bien que ces capteurs rapides et réversibles soient bien adaptés pour surveiller en temps réel l’activité transitoire, ils sont sensibles aux artefacts de mouvement lors de l’imagerie in vivo . En revanche, les propriétés intégratives et irréversibles de photoconversion de CaMPARI permettent de capturer l’activité sur une fenêtre de temps définie, permettant la détection de l’activation neuronale même lorsque les plans focaux se déplacent lors de^{l’imagerie 20}. De plus, la photoconversion CaMPARI peut être ajustée en ajustant l’intensité de la lumière violette, permettant la détection de réduction de la force synaptique ou d’entrées^{sous-seuils 26}. Ces propriétés ont permis la cartographie de l’activité chez des animaux en mouvement libre sans fixation ni attachement de tête, notamment sur le cortex²⁷ de souris, le cerveau du poisson-zèbre²⁸, C. elegans²⁹ et Drosophila^{adulte 20}.

Un protocole est décrit pour visualiser les partenaires synaptiques fonctionnels via la photoconversion CaMPARI combinée à une stimulation optogénétique présynaptique par microscopie confocale chez des larves de Drosophila intactes et non disséquées. Dans cette approche, CaMPARI est utilisé pour détecter l’afflux calcique postsynaptique dans les interneurones du Bassin-4 après l’activation optogénétique des neurones cIVda chez des larves vivantes de troisième stade. Les neurones cIVda expriment la channelrhodopsine activée par la lumière rouge CsChrimson^30,31, tandis que les interneurones du Bassin-4 expriment CaMPARI. L’exposition à la lumière rouge active sélectivement les nocicepteurs, imitant un stimulus nociceptif de manière temporellement^{contrôlée 16,30}. Cette stratégie permet d’évaluer si l’activation présynaptique induit la photoconversion CaMPARI dépendante du calcium chez les neurones postsynaptiques, fournissant ainsi des preuves fonctionnelles de la connectivité synaptique.

Plusieurs avantages techniques soutiennent l’utilisation de CaMPARI en combinaison avec CsChrimson pour l’analyse de la connectivité cIVda–Basin-4. Premièrement, les dendrites cIVda forment un pavage complet et non chevauchant de la paroi corporelle^{larvaire 32}, permettant l’activation optogénétique de neurones sensoriels intacts sans effets de confusion dus aux dommages induits par la dissection¹⁶. Deuxièmement, bien que les larves soient physiquement immobilisées sur une lame de microscope, les mouvements internes modifient fréquemment la position du SNC et le plan focal lors de l’imagerie ; La photoconversion CaMPARI est moins sensible à de tels artefacts de mouvement et fournit une lecture stable et intégrée dans le temps de l’activité neuronale. Troisièmement, les propriétés intégratives et accordables de CaMPARI permettent la détection de l’activité synaptique même lorsque la force synaptique ou le nombre de contact est réduit, comme lors des premiers stades du développement, soutenant ainsi les études futures de formation et d’affinement des synapses.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales impliquant Drosophila melanogaster ont été menées conformément aux directives institutionnelles. Le génotype w ; Basin4-LexA/CyO-TwGFP ; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (obtenu par recombinaison de RRID :BDSC_54899¹² et RRID :BDSC_32079¹⁶) a été utilisé pour piloter l’expression optogénétique et CaMPARI (en utilisant la ligne w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2 ; Sp/Cyo obtenu par recombinaison RRID :BDSC_81085 avec des marqueurs du second chromosome) chez des partenaires pré- et postsynaptiques, respectivement. Les outils de recherche utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des larves

1. Établir des croisements génétiques entre des femelles vierges UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI ; CyO/sp (RRID :BDSC_81085) et des mâles issus d’une lignée de mouches contenant deux systèmes binaires, par exemple, avec le neurone présynaptique d’intérêt guidant l’expression de GAL4 et le neurone postsynaptique d’intérêt entraînant^{LexA 33,34}.
2. Posez des croisements génétiques dans des fioles en plastique contenant un milieu d’agar de semoule de maïs^standard 35,36,37,38, complété avec 0,5 mM de rétinal all-trans (ATR) pour l’activation de CsChrimson^30,33. Préparez des fioles parallèles sans ATR comme contrôles sans ATR.
   REMARQUE : Faites fondre le médium d’agar de semoule de maïs sans faire bouillir. Laissez-la refroidir sans se solidifier. Préparez une solution ATR de 40 mM (ATR en poudre diluée à 95 % d’éthanol selon les instructions du fabricant), puis diluez à 0,5 mM dans le milieu et mélangez soigneusement.
3. Couvrez complètement les fioles avec du papier aluminium pour éviter l’exposition à la lumière.
   REMARQUE : Maintenir des conditions d’élevage dans une obscurité constante en raison de la sensibilité à la lumière de l’ATR et pour prévenir une activation neuronale involontaire. Bien que CsChrimson soit le plus sensible à la lumière rouge (590–680 nm), il peut également être activé par d’autres longueurs d’onde^{visibles 31,39}.
4. Incuber les fioles à 25 °C et élever les larves jusqu’au troisième stade d’entrée.

2. Immobilisation larvaire

1. Collectez une larve de troisième stade à l’aide d’un pinceau. Lavez les larves dans une plaque micro-ponctuelle à trois puits contenant 0,1 M PBS pour retirer la nourriture.
   REMARQUE : Ne retirez pas l’excès de PBS ; Cela aide à maintenir l’hydratation.
2. Placez une petite quantité de pâte à modeler à chaque coin d’une gaine propre (18 × 18 mm). Placez la larve dans une goutte de PBS sur la gaine de couverture et laissez-la orienter du côté ventral vers le bas.
   REMARQUE : Pour l’imagerie du cordon nerveux ventral (VNC), montez la larve sur son côté dorsal de sorte que la surface ventrale touche la gaine de couvre-robe. Cette orientation permet aux interneurones du Bassin-4 dans le VNC de faire face à l’objectif à travers le couvre-déguisement.
3. Placez une lame de microscope propre sur la gaine contenant la larve.
4. Fixez la gaine de couverture en appliquant de la pâte à modeler supplémentaire sur les coins. Appliquez suffisamment de pression pour immobiliser la larve tout en évitant la rupture de la larve ou le déguisement.

3. Flux de travail de stimulation, photoconversion et imagerie

1. Acquérir une pile z de base de neurones postsynaptiques exprimant CaMPARI en utilisant simultanément les canaux verts (488 nm, 0,8 % de puissance laser) et rouges (~561 nm, 0,8 % de puissance laser). Utilisez un pas Z de 1 μm, une résolution de 256 × 256 pixels, une moyenne de ligne de 2, un balayage bidirectionnel et une vitesse de balayage de 9 sur un microscope confocal équipé d’un objectif 40×/1,2. Réalisez toutes les images dans un environnement sombre. Maintenir des paramètres de pile z identiques tout au long de l’expérience.
   REMARQUE : Attendez-vous à des corps cellulaires vert vif à des positions stéréotypées dans le VNC larvaire et aucune fluorescence rouge détectable au départ.
2. Stimulez la larve en continu pendant 30 secondes à l’aide d’une lumière de photoconversion simultanée (405 nm, 0,5 % de puissance laser) et d’une lumière de stimulation optogénétique (594 nm, 0,8 % de puissance laser).
3. Acquérir une pile z post-stimulation en utilisant les mêmes paramètres que dans l’étape 3.1 sous les canaux rouge (~561 nm) et vert (488 nm). Attendez-vous à des corps cellulaires VNC à des positions similaires à celles de la ligne de base. Détecter la fluorescence rouge de CaMPARI dans les neurones activés lors de la stimulation chez les larves nourries à ATR, avec une photoconversion minimale dans les témoins sans ATR.
   REMARQUE : Le flux de travail et les paramètres sont résumés à la Figure 1.

Figure 1 : Flux de travail pour la stimulation, la photoconversion (PC) et l’imagerie. Trois phases d’imagerie séquentielles ont été utilisées pour évaluer l’activité calcique dans les neurones du Bassin-4. Pendant la phase de base, des piles z ont été acquises à l’aide de lasers de 488 nm et 561 nm pour capter la fluorescence vert et rouge de CaMPARI avant la stimulation. Pendant la phase de stimulation, les neurones cIVda ont été activés optogénétiquement via CsChrimson (594 nm) tandis qu’une illumination simultanée à 405 nm photoconvertissait CaMPARI actif de fluorescence verte en rouge ; Aucune imagerie n’a été réalisée durant cette période de 30 s. Pendant la phase post-stimulation, les piles z ont été réacquises en utilisant les mêmes réglages laser qu’à la base pour détecter le signal rouge photoconverti dans les cellules du Bassin-4. Toutes les piles z ont été acquises à 256 × 256 pixels avec des pas Z de 1 μm, une moyenne de ligne de 2, et un balayage bidirectionnel dans des conditions sombres à l’aide d’un microscope confocal équipé d’un objectif NA de 40×/1,2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Analyse d’imagerie

1. Ouvrir les images z-stack à Fidji (RRID :SCR_002285) avec les Bio-Formats activés. Réglez la visualisation de la pile sur Hyperstack, le mode couleur sur Composite, et activez l’Autoscale. Faites défiler les plans Z et sélectionnez le plan avec la mise au point optimale. Dupliquer le plan sélectionné (Image → Duplique ; Canaux : 1–2 ; Z-plan sélectionné).
2. Séparez les canaux rouges et verts (Image → Couleur → Séparation des canaux).
   REMARQUE : Ajustez la luminosité et le contraste avec Image → Ajustez → Luminosité/Contraste → Auto pour les deux canaux.
3. Soustrayez le fond des deux canaux (Processus → Soustrait le fond) en utilisant un rayon de boule roulante de 50 px.
4. Configurez les mesures (analysez → définissez les mesures) pour inclure la surface, la valeur grise moyenne, la densité intégrée (IntDen), l’écart-type et les valeurs grises Min & Max.
5. Dessinez les régions d’intérêt (ROI) autour de chaque cellule du canal vert à l’aide de l’outil à main levée. Ajoutez les ROI au gestionnaire de ROI et mesurez. Appliquez les mêmes ROI au canal rouge et mesurez.
6. Notez toutes les mesures dans un tableur, y compris les identifiants des larves et des cellules.
   REMARQUE : Effectuez des mesures pour les images avant et après stimulation.
7. Calculez les rapports de fluorescence rouge/vert en utilisant les valeurs de densité intégrée pour obtenir (R/G)_post et (R/G)_pre pour chaque cellule. Valeurs moyennes au niveau cellulaire par larve.
   REMARQUE : La densité intégrée (surface × moyenne) permet de comparer entre des cellules de tailles différentes.
8. Calculez Δ(R/G) comme (R/G)_post − (R/G)_pre en utilisant les moyennes larvaires. Interpréter les valeurs positives de Δ(R/G) comme une augmentation de l’activité calcique postsynaptique lors de la photoconversion.
   REMARQUE : Des valeurs négatives de Δ(R/G) peuvent résulter du bruit ou d’une asymétrie de fond. Fixez les valeurs négatives à 0. Dans ce jeu de données, une larve a montré une valeur négative (−0,008), fixée à 0.

Results

En suivant ce protocole, la connectivité fonctionnelle entre les neurones cIVda et les interneurones du Bassin-4 a été évaluée chez des larves vivantes de D. melanogaster du troisième stade non disséquées à l’aide de CaMPARI (Figure 2). Avant toute stimulation par lumière de photoconversion (PC) ou activation optogénétique, les interneurones du Bassin-4 affichaient une fluorescence verte due à l’expression cytosolique de CaMPARI (Figure 2A). Aucune fluorescence rouge n’a été détectée sous conditions de base (Figure 2B), confirmant l’absence de photoconversion avant la stimulation.

L’exposition simultanée à la lumière PC et à la stimulation optogénétique a entraîné la photoconversion de CaMPARI de fluorescence verte à rouge (Figure 2C, D). Pour vérifier que la photoconversion était spécifiquement stimulée par une activité neuronale médiée par CsChrimson, un contrôle négatif a été réalisé en utilisant des larves du même fond génétique (du même croisement parental) élevées sans rétine all-trans (ATR). Parce que l’ATR est un cofacteur essentiel pour la fonction de CsChrimson, son absence rend l’opsine non fonctionnelle malgré l’exposition à une lumière de stimulation de 594 nm. Ce contrôle prend également en compte l’activation potentielle des nocicepteurs par la lumière PC de 405 nm^{elle-même 40}, car les larves sans ATR ont été soumises au même protocole de stimulation, y compris l’exposition à la lumière^{PC 40}.

Bien qu’un faible niveau de fluorescence rouge de CaMPARI ait été observé chez les larves témoins sans ATR, cohérent avec une photoconversion partielle induite uniquement par la lumière PC, la quantification de Δ(R/G) a révélé des valeurs significativement plus élevées chez les animaux expérimentaux comparé aux témoins (Figure 2E). Cette augmentation indique que la photoconversion accrue chez les larves expérimentales dépend de l’activité neuronale entraînée par CsChrimson.

L’analyse d’image a été réalisée aux Fidji (RRID :SCR_002285) comme décrit dans le protocole. La comparaison statistique des valeurs de Δ(R/G) entre les groupes témoins expérimentaux et sans ATR a été réalisée dans GraphPad (RRID :SCR_002798) à l’aide d’un test t non apparié après confirmation de la distribution normale et des écarts-types approximativement égaux entre les groupes.

Figure 2. La photoconversion CaMPARI dans les interneurones du Bassin-4 révèle une activité synaptique fonctionnelle après la stimulation optogénétique des neurones sensoriels cIVda in vivo. (A) Les flèches blanches indiquent les corps cellulaires des interneurones du Bassin-4 dans la mèche nerveuse ventrale (VNC) larvaire exprimant une fluorescence verte de CaMPARI. (B) Absence de fluorescence rouge de CaMPARI dans les cellules du Bassin-4 délimitées par des raies pointillées avant la stimulation optogénétique et avant l’exposition à la lumière photoconversion. Les régions d’intérêt (ROI) ont été définies manuellement autour des corps cellulaires fluorescents verts dans le canal vert à l’aide de l’outil de sélection à main levée aux Fidji, puis appliquées au canal rouge. (C) Fluorescence rouge et (D) verte de CaMPARI dans les interneurones du bassin-4 après une stimulation optogénétique simultanée et une exposition à la lumière photoconversion. (E) Chaque point de données représente la moyenne Δ(R/G) par larve, calculée à partir de 1 à 4 cellules par individu (tailles totales d’échantillons : témoins, 8 larves, dont 23 cellules ; groupe expérimental, 9 larves, dont 19 cellules). L’analyse statistique montre une augmentation significative de Δ(R/G) après stimulation optogénétique et photoconversion (groupe expérimental) par rapport à la base dans la condition sans ATR (témoin). Barre d’échelle : 10,2 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Le protocole décrit ici permet une évaluation qualitative et quantitative de la connectivité synaptique entre partenaires synaptiques définis chez des larves intactes de D. melanogaster . Cette approche exploite la combinaison de la stimulation optogénétique des neurones sensoriels cIVda avec la visualisation basée sur CaMPARI des interneurones postsynaptiques activés du Bassin-4 pour surveiller l’activité synaptique du système nerveux central (SNC) des larves non disséquées. Les applications antérieures de CaMPARI chez D. melanogaster se concentraient principalement sur les stades^{adultes 20} ou nécessitaient une stimulation présynaptique physique (par exemple, stimulation thermique nociceptive⁾¹⁷. La méthode actuelle étend l’utilisation de CaMPARI à des stades de développement plus précoces et introduit une stratégie d’évaluation fonctionnelle de l’activité synaptique par l’association de la stimulation présynaptique optogénétique avec la détection postsynaptique basée sur CaMPARI. L’activation optogénétique assure un contrôle temporel précis de l’entrée présynaptique, permettant une stimulation contrôlée et une surveillance ultérieure de la réponse postsynaptique CaMPARI.

Malgré ces avantages, la mise en œuvre de cette approche nécessite une attention particulière à la conception expérimentale, aux contrôles appropriés et aux limites techniques. Des témoins négatifs, y compris les larves élevées sans all-trans retinal (ATR), qui empêche l’activation^{de CsChrimson 30,33}, ou les larves sans expression de CsChrimson, sont nécessaires pour confirmer l’absence de photoconversion de CaMPARI en l’absence de stimulation optogénétique présynaptique. D’autres facteurs doivent également être pris en compte. Une activité postsynaptique spontanée ou endogène peut coïncider avec l’exposition à la lumière photoconversion (PC), entraînant une conversion CaMPARI présynaptique indépendante du vert au rouge. Bien que CsChrimson soit optimisé pour une activation par lumière rouge (590–680 nm), il conserve une sensibilité aux longueurs d’onde plus^{courtes 39}, et les lasers d’imagerie utilisés avant stimulation peuvent involontairement induire une activation présynaptique non intentionnelle. De plus, les neurones postsynaptiques reçoivent des entrées de plusieurs partenaires présynaptiques, de sorte que l’activation des entrées non ciblées peut coïncider avec l’exposition à la lumière PC et conduire à une photoconversion CaMPARI indépendante d’une stimulation optogénétique contrôlée.

Par exemple, les interneurones du bassin-4 reçoivent des entrées synaptiques non seulement des neurones cIVda, mais aussi des neurones sensoriels multidendritiques de classe III (cIIIda) et des neurones chordotonaux (Ch) dans le cadre du circuit^nociceptif 11,12,13,17. Ces interneurones peuvent donc être activés par des entrées excitatrices alternatives, y compris la stimulation mécanosensorielle induite par la pression du coverslip. Ce facteur est spécifique à la configuration expérimentale décrite ici, mais souligne l’importance de prendre en compte la photoconversion indirecte de CaMPARI dirigée par le réseau ou non induite par l’optogénétique, en particulier dans des conditions témoins dépourvues d’ATR.

Pour mieux contrôler l’afflux de calcium non spécifique et la photoconversion associée, les larves peuvent être divisées en deux groupes : un groupe subissant seule une exposition à la lumière PC, et un second groupe subissant une stimulation combinée de la lumière PC et optogénétique, avec des Z-stacks rouges et verts acquis après chaque condition afin de permettre une comparaison directe entre groupes. Les intensités de fluorescence obtenues sous des conditions de PC uniquement peuvent alors être soustraites de celles mesurées après stimulation combinée. Les niveaux de photoconversion observés dans les conditions témoins (pas d’ATR et stimulation uniquement par PC) fournissent une estimation de l’activation postsynaptique résultant de l’activité endogène stochastique et des entrées pilotées par le réseau.

Dans les conditions expérimentales décrites, la stimulation optogénétique des neurones cIVda combinée à la photoconversion CaMPARI dans les interneurones du Bassin-4 a abouti à un Δ(R/G) positif, indiquant une activité synaptique entre ces partenaires pré- et postsynaptiques. Ce protocole fournit un cadre pour étudier les relations synaptiques fonctionnelles in vivo et peut être adapté à d’autres circuits neuronaux chez Drosophila. En permettant une activation présynaptique ciblée et une détection dépendante de l’activité chez les neurones postsynaptiques, cette approche soutient la validation des connexions synaptiques prédites par les ensembles de données de connectomes et facilite l’étude de la connectivité fonctionnelle lors du développement. En tant que telle, il représente une méthode polyvalente pour analyser la fonction des circuits neuronaux dans le système nerveux génétiquement manipulable de Drosophila .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SAL tamponné phosphate de 0,1 M (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Produit chimique utilisé en solution pour hydrater et monter les larves
All-trans-rétinienne (ATR) & nbsp ;	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Un produit chimique ajouté à la nourriture pour activer les outils optogénétiques
Confocal Microscope	ZEISS  ;	LSM900 Confocal	Microscope confocal, objectif (40 fois / 1,2 NA), source lumineuse/laser (405, 488, 561 nm)
Gaines de couverture (18x18mm)	VWR	48366-205	Utilisé pour monter des animaux pour l’imagerie
Éthanol (95 %)	Sigma Aldrich	E7023	Utilisé comme solvant pour la poudre ATR
Fidji (ImageJ)	Open source	RRID : SCR_002285 & nbsp ;	Utilisation pour l’analyse d’imagerie
Prism version 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID : SCR_002798	Utilisation pour l’analyse statistique
Lames de microscope	VWR	; 48300-041	Utilisé pour monter des animaux pour l’imagerie
Pâte à modeler	Flinn scientifique	FB0600	Utilisé pour tenir le verre de couverture sur une lame de microscope avec des larves entre les deux
Paintbrush  ;	Genesee scientifique	59-204	Utilisé pour transférer les larves entre différents lieux
Milieu standard en agar de semoule de maïs	Genesee scientifique	66-123	Les aliments peuvent également être préparés avec des recettes et ingrédients standards similaires
Fioles en plastique standard de Drosophila (fioles étroites de Drosophila de 25 mm x 95 mm)	Genesee scientifique	32-109	De grandes fioles ou bouteilles peuvent également être utilisées
Plaque micro-spot à trois puits	Sciences de la microscopie électronique & nbsp ;	71561-01	Plaque utilisée pour séparer et nettoyer chaque larve
Stock de Drosophila (génotype : w ; Basin4-LexA/CyO-TwGFP ; ppk-GAL4/ppk-GAL4)  ;	Centre de Stock Drosophila de Bloomington	RRID : BDSC_54899 & RRID : BDSC_32079	Obtenu en recombinant RRID :BDSC_54899 et RRID :BDSC_32079
Stock de Drosophila (génotype : w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2 ; Sp/CyO)	Centre de Stock Drosophila de Bloomington	RRID : BDSC_81085	Obtenu en recombinant RRID :BDSC_81085 avec des marqueurs du second chromosomique