Réaction en chaîne par hybridation assistée par expansion - smFISH et immunohistochimie dans le cerveau de Drosophila

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail HCR-smFISH assisté par expansion et immunohistochimie pour une analyse quantitative, spécifique au type cellulaire, de l’expression d’ARN et de protéines dans le cerveau de Drosophila , incluant l’imagerie par microscopie à feuilles lumineuses ou confocale et la quantification automatisée des transcrits nucléaires et cytoplasmiques.

Résumé

L’analyse quantitative et spatialement résolue de l’expression génique est essentielle pour évaluer les profils moléculaires spécifiques au type cellulaire. Dans le système visuel de Drosophila , de nombreux outils génétiques ouvrent un cadre pour l’évaluation directe des niveaux d’ARN et de protéines dans des populations neuronales définies. Ici, nous présentons un protocole étape par étape qui combine HCR-smFISH (hybridation in situ par réaction en chaîne de réaction en chaîne sur une seule molécule) avec l’immunohistochimie afin de permettre une analyse quantitative des profils moléculaires spécifiques à un type cellulaire dans des types neuronaux du système visuel génétiquement définis. Le flux de travail est optimisé pour les cellules marquées avec des marqueurs localisés nucléairement ou liés à la membrane, permettant de mesurer les niveaux de transcrits et de protéines dans les mêmes neurones. Après l’expansion tissulaire, les échantillons sont imagés à l’aide de la microscopie à feuilles luminiques pour une acquisition volumétrique rapide, avec un flux de montage et d’imagerie alternatif démontré pour les microscopes confocaux à balayage laser inversé standard et à disque tournant. Nous proposons également un algorithme automatisé de segmentation qui distingue les transcrits nucléaires et cytoplasmiques, permettant d’analyser l’état transcriptionnel et la localisation de l’ARN subcellulaire. Des conseils pratiques sont fournis sur les paramètres expérimentaux et les pièges courants affectant la qualité du signal, l’intégrité tissulaire et la performance quantitative. Les applications représentatives incluent la validation des interférences ARN spécifiques à un type cellulaire en quantifiant les variations correspondantes des niveaux d’ARN et de protéines. En permettant des mesures intégrées au niveau ARN et protéique avec une spécificité de type cellulaire, cette approche offre une stratégie évolutive pour l’analyse moléculaire basée sur des hypothèses et, dans des contextes ciblés, une alternative pratique aux tests transcriptomiques monocellulaires. Ce protocole offre une approche pratique pour valider les perturbations moléculaires spécifiques au type cellulaire tout en préservant le contexte anatomique du cerveau intact de Drosophila .

Introduction

Le système visuel de Drosophila melanogaster a servi de modèle puissant pour répondre à un large éventail de questions en neurosciences du développement, notamment la différenciation^{neuronale 1,2}, la spécification cellulaire ^3,4 et la logique moléculaire du câblage ^{cérébral 5,6,7}. Ces progrès ont été portés par un ensemble d’outils expérimentaux exceptionnellement riche, comprenant de grandes collections de lignées de moteurs génétiques spécifiques à chaque type^{cellulaire 8, 9,10}, des reconstructions connectomiques récentes et^complètes 10,11,12, ainsi que des transcriptomiques unicellulaires de plus en plus ^{détaillées 13,14} et^{multiomique 15} jeux de données. Ensemble, ces ressources définissent les types neuronaux de manière multimodale et permettent des manipulations génétiques précises. En conséquence, le domaine peut désormais générer des hypothèses de plus en plus prédictives sur la manière dont des gènes spécifiques régulent l’identité neuronale, la connectivité et^{le fonctionnement 16}... Bien que le séquençage de l’ARN unicellulaire offre des informations puissantes sur les états transcriptionnels, l’abondance d’ARN ne prédit pas toujours l’expression des^{protéines 17}, et de nombreuses expériences de perturbation nécessitent finalement une mesure directe et quantitative de l’ARN et des protéines dans les mêmes neurones.

L’hybridation in situ par fluorescence à molécule unique (smFISH^)18,19 permet une mesure quantitative de l’abondance des transcrits avec une résolution cellulaire et subcellulaire tout en préservant le contexte anatomique. La combinaison de smFISH avec la microscopie à expansion 20,21,22 a encore étendu son utilité aux cerveaux intacts en agrandissant physiquement les tissus à l’intérieur d’un hydrogel gonflable, réduisant ainsi le surpeuplement moléculaire, améliorant l’accès optique et augmentant la résolution spatiale effective. Associé à l’amplification du signal²³ basée sur la réaction en chaîne d’hybridation (HCR), le smFISH assisté par expansion permet une détection robuste de transcrits discrets dans un tissu neural épais et permet l’imagerie du cerveau entier à l’aide de la microscopie à feuille lumineuse ou confocale.

Une gamme d’approches d’imagerie ARN in situ a été appliquée au cerveau de Drosophila , reflétant différentes priorités expérimentales. L’HCR-FISH itératif assisté par expansion a permis la détection d’ARN spatialement résolue dans tout^{le cerveau 24}. Parallèlement, des approches FISH à montage entier sans expansion ont été utilisées pour les mesures d’ARN dans des neurones génétiquement marqués, y compris des stratégies de cartographie d’activité basées sur le HCR centrées sur les gènes précoces^{immédiats 25} et des flux de travail de comptage de transcrits basés sur segmentation utilisant des marqueurs génétiquement codés^{liés par la membrane 26}. Des méthodes commerciales basées sur la sonde telles que l’ARN-scope ont également permis la détection d’ARN multiplex dans le cerveau entier, souvent combinée à l’immunohistochimie pour identifier les populations cellulaires^{ciblées 27}. Ensemble, ces approches établissent que l’analyse spatiale de l’ARN résolu dans le cerveau de la mouche est techniquement réalisable. Cependant, les expériences de perturbation basées sur des hypothèses imposent un ensemble plus spécifique d’exigences qui ne sont pas entièrement prises en compte par un seul flux de travail existant. De nombreuses méthodes privilégient soit la cartographie de transcrits de type découverte multiplex, le profilage de l’état d’activité, ou la quantification de l’ARN seule, l’immunocoloration servant généralement d’identifiant cellulaire plutôt que de lecture correspondante de la protéine perturbée, ou étant appliquée en l’absence d’assignation génétique du type cellulaire²⁸. De plus, les applications de routine bénéficieraient de la compatibilité avec plusieurs plateformes d’imagerie et de pipelines d’analyse automatisés et évolutifs.

Ici, nous présentons un flux de travail intégré, étape par étape, pour le système visuel de Drosophila , qui combine HCR-smFISH assisté par expansion avec une immunohistochimie réalisée avant l’expansion, permettant une mesure par paires des niveaux d’ARN et de protéines dans les mêmes neurones au sein du même échantillon biologique. S’appuyant sur le cadre^{FlySeg 29} que nous avons précédemment développé, nous fournissons un pipeline automatisé de quantification pour la segmentation nucléaire et le comptage des transcrits qui distingue les points nucléaires et cytoplasmiques, supportant à la fois les mesures d’expression totale et les analyses sensibles à l’état transcriptionnel. Le protocole est démontré à la fois sur un microscope à feuille lumineuse et sur deux systèmes confocaux, avec des flux de montage et d’imagerie alternatifs. Enfin, nous illustrons l’utilité de la lecture intégrée ARN–protéine avec une expérience représentative de validation de perturbation (c’est-à-dire un knockdown médié par ARNi d’une cible définie), fournissant des conseils pratiques sur les paramètres et les pièges qui affectent la qualité du signal, l’intégrité tissulaire et la performance quantitative.

Ce protocole s’appuie généralement sur le cadre²⁴ EASI-FISH décrit précédemment pour la détection d’ARN dans le cerveau entier chez Drosophila, et conserve ses principes fondamentaux d’ancrage à ARN, d’expansion hydrogel et d’amplification du signal basée sur HCR. Le protocole actuel étend et affine cette approche en intégrant l’immunohistochimie avant expansion afin de permettre des mesures appariées d’ARN et de protéines dans les mêmes neurones, en révisant de multiples étapes de traitement et de manipulation tout au long du flux de travail pour améliorer la robustesse et la reproductibilité, en fournissant des stratégies pratiques de montage et d’imagerie pour les microscopes à feuilles lumineuses et confocaux inversés conventionnels, et en intégrant la segmentation automatisée du soma et la quantification des transcrits avec une séparation explicite des réservoirs d’ARN nucléaire et cytoplasmique.

Ce flux de travail convient surtout aux expériences ciblées dont l’objectif est de quantifier les lectures définies d’ARN et de protéines dans des neurones génétiquement identifiés tout en préservant le contexte anatomique. Il est particulièrement utile pour valider les perturbations moléculaires lorsque l’objectif est de mesurer la régulation à la hausse ou à la baisse d’un gène défini ou d’un petit ensemble de gènes candidats, de comparer l’expression entre génotypes ou stades de développement, ou d’évaluer l’état transcriptionnel par localisation nucléaire versus cytoplasmique. Il est moins adapté à la découverte de transcrits non biaisée ou à la cartographie d’expression cérébrale à haute plex, où le séquençage unicellulaire, la transcriptomique spatiale ou les approches FISH multiplexées itératives peuvent être plus appropriées.

Protocole

Déclaration d’éthique

Ce protocole utilise Drosophila melanogaster. Aucun vertébré ni sujet humain n’a été utilisé. Ainsi, l’approbation du comité institutionnel de soins et d’utilisation animale n’était pas requise.

REMARQUE : Utilisez la technique RNase-clean tout au long du processus. Portez des gants, essuyez les surfaces et les outils avec une solution de décontamination à RNase, et préparez toutes les solutions avec de l’eau sans RNase.

Figure 1. Flux de travail étape par étape du protocole de préparation de l’échantillon (A) Chronologie schématique du protocole, indiquant la progression approximative jour par jour et les étapes d’incubation nocturnes. (B–J) Aperçu schématique des principales étapes de préparation de l’échantillon, de la dissection et fixation du cerveau à l’immunohistochimie, en passant par le crosscrossing ARN/protéine, l’incorporation d’hydrogel, la digestion, l’hybridation par sonde et l’amplification du signal HCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

1. Dissection du cerveau, fixation et immunohistochimie (jours 1–3)

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes d’une plaque multi-puits de style Terasaki, sauf indication contraire. Utilisez 10 μL par puits pour les incubations et les lavages. Maintenez l’humidité en plaçant une lingette humidifiée dans un coin de la plaque.

ATTENTION : Le paraformoldéhyde et les fixateurs glyoxaux sont toxiques/irritants. Manipulez une hotte à fumée et portez des équipements de protection adaptés.

1. Disséquer des cerveaux dans un milieu d’insecte S2 glacé. Transférer les cerveaux dans des puits, jusqu’à 10 cerveaux par puits (Figure 1B–C).
   REMARQUE : Pour les expériences représentatives présentées ici, 72 cerveaux de nymphes âgés de 7 h ont été utilisés.
2. Remplacer le milieu S2 par un fixateur de 10 μL par puits, changer une fois.
3. Fixez avec Addax glyoxal sans acide avec 5 % (p/v) de saccharose pendant la nuit à 4 °C (Figure 1C).
4. Lavez les cerveaux 3× dans 10 μL PBST (0,5 % Triton X-100 en PBS) pendant 10 minutes chacun à température ambiante.
   ATTENTION : Le Triton X-100 est un irritant ; Évitez le contact visuel avec la peau.
5. Incuber les cerveaux dans une solution primaire d’anticorps de 10 μL (dans PBST, aux dilutions indiquées dans le tableau des matériaux) pendant 24 heures à 4 °C. (Figure 1D).
6. Lavez le cerveau à 3× pendant 10 minutes à 10 μL PBST à 4 °C. Pour chaque lavage, replacez la solution une fois à mi-incubation (deux échanges par lavage).
7. Incuber les cerveaux dans une solution secondaire d’anticorps de 10 μL (en PBST, aux dilutions listées dans le tableau des matériaux) pendant 24 heures à 4 °C (Figure 1D).
   REMARQUE : Protégez les échantillons de la lumière.
8. Lavez le cerveau à 3× pendant 10 minutes à 10 μL PBST à 4 °C. Pour chaque lavage, replacez la solution une fois à mi-incubation (deux échanges par lavage).
   REMARQUE : Utilisez des concentrations d’anticorps primaires et secondaires 2 à 3 fois supérieures aux concentrations standard d’immunohistochimie montée sur montage complet
   POINT DE PAUSE : Stockez les cerveaux dans 10 μL 1× PBS à 4 °C pendant jusqu’à 96 heures.

2. Ancrage covalent de l’ARN et des protéines (jour 4) (Figure 1E)

ATTENTION : Les alkylateurs ancrages de l’ARN et les AcX sont dangereux (toxiques/irritants ; certains sont suspectés d’être cancérigènes). Préparez et manipulez les solutions dans une hotte chimique avec des EPI appropriés. Collectez tous les déchets comme déchets chimiques dangereux.

1. Incubez les cerveaux dans 10 μL de tampon MOPS de 20 mM (pH 7,7) pendant 20 minutes à 37 °C.
2. Préparez la solution d’ancrage en mélangeant 49,5 % (v/v) de MOPS de 20 mM, 49,5 % (v/v) de bouillon Melphalan (2,5 mg·^mL-1 en DMSO) et 1 % (v/v) de stock AcX (10 mg·^mL-1 en DMSO). Cela donne des concentrations finales de 1,24 mg·^mL-1 melphalan et 0,10 mg·^mL-1 AcX.
3. Remplacer les MOPS par une solution d’ancrage de 7 à 8 μL par puits, échanger la solution une fois, puis incuber toute la nuit à 37 °C dans le noir.
   REMARQUE : Utilisez 7 à 8 μL pour minimiser le débordement et le mélange entre puits tout en maintenant une couverture complète de l’échantillon.

3. Gélification (intégration du cerveau dans un hydrogel) et digestion de la protéinase K (jour 5)

ATTENTION : Les monomères acryliques, APS et TEMED sont des irritants/toxiques. Manipuler avec des équipements de protection individuelle ; Préparez des composants volatils/exothermiques dans une hotte à fumée.

1. Fixez un joint adhésif en silicone de 0,5 mm d’épaisseur sur une lame de microscope en verre non chargée (Figure 1F, en bas à gauche), appuyez fermement pour assurer un contact complet et un scellement.
2. Ajoutez 200 μL de solution de poly-L-lysine dans la chambre et étalez uniformément pour recouvrir la surface, incubez à température ambiante pendant 5 minutes, puis retirez la solution à l’aide d’une pipette.
3. Laissez la poly-L-lysine s’évaporer complètement jusqu’à ce que la surface soit visiblement sèche.
   REMARQUE : L’évaporation de la poly-L-lysine est lente. Pour des résultats fiables, préparez les chambres à l’avance et laissez-les sécher toute la nuit dans un environnement sans poussière. Sinon, séchez les chambres dans un incubateur à 37 °C pendant ≥ 1 heure le jour de l’utilisation.
4. Lavez les cerveaux 2× dans 10 μL 1× PBS pendant 10 minutes chacun à température ambiante.
5. Préparez la solution monomère en gel et ajoutez immédiatement avant utilisation des réactifs de polymérisation en mélangeant la solution monomère avec 4HT, TEMED et APS (rendre frais) dans un ratio de 47:1:1:1. La solution finale de gélification contient 1 M d’acrylate de sodium, 14 % d’acrylamide, 0,1 % de bis-acrylamide, 1× de PBS, 0,01 % de 4HT, 0,2 % de TEMED et 0,2 % d’APS.
6. Vortex brièvement et gardez la solution finale de gelification sur glace. Utilisez la solution immédiatement.
7. Incubez les cerveaux dans une solution de gélification froide de 10 μL pendant 15 minutes sur de la glace.
8. Lors de la pré-équilibration, à l’aide d’une nouvelle lame de rasoir, découpez un canal étroit de chaque côté du joint en silicone pour permettre à l’air de s’échapper lors du remplissage (Figure 1F, en haut à gauche)
9. À l’aide d’une pointe de pipette, transférez les cerveaux dans la chambre de gélification préparée, en veillant à ce que chaque cerveau reste immergé dans la solution de gelification en permanence.
   ATTENTION : Après ancrage et équilibrage, le cerveau devient très adhésif et adhère facilement aux surfaces plastiques. Pour éviter la perte d’échantillon, utilisez des embouts de pipette à large calibre ou coupez l’extrémité d’une pointe standard pour élargir l’ouverture.
10. Retirez la doublure protectrice de l’adhésif en silicone de surface et placez délicatement une gaine de verre propre de 1,5 H sur la chambre, évitant ainsi les bulles d’air emprisonnées.
11. Faites doucement piper 200 μL de solution de gélification fraîchement préparée dans la chambre par l’un des canaux latéraux, jusqu’à ce que la chambre soit complètement remplie.
12. Placez la chambre scellée dans un récipient sombre et incubez à 37 °C pendant 2 heures.
    REMARQUE : Placez des lingettes de laboratoire humidifiées à l’eau) à l’intérieur du récipient. Assurez-vous que la lame ne soit pas en contact direct avec de l’eau liquide.
13. Préparez un tampon de digestion composé de 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA et 0,5 % (v/v) de Triton X-100 dans une eau sans RNase.
14. Juste avant utilisation, ajoutez la Protéinase K à 1:100 à partir d’un stock de 20 mg·^mL-1 à une concentration finale de 0,2 mg·^mL-1.
    ATTENTION : La protéinase K est un irritant et doit être manipulée avec des gants ; Évitez l’inhalation et le contact cutané.
15. Laissez la lame refroidir à température ambiante pendant 5 minutes avant de retirer la gaine de revêtement. Coupez le gel avec un scalpel en forme rectangulaire en coupes simples et droites. Minimisez l’excès de volume de gel autour de chaque cerveau (Figure 1F, en haut à droite).
16. Placez chaque gel coupé dans un puits individuel d’une plaque à 24 puits contenant une solution de digestion de 1000 μL. Assurez-vous que les gels sont complètement immergés.
17. Scellez la plaque avec du Parafilm et incubez toute la nuit à température ambiante sur un shaker orbital à 0,11 g (Figure 1G).

4. Digestion DNase et hybridation par sonde HCR-smFISH (jour 6)

1. Aspirez soigneusement la solution digestive à l’aide d’une pipette placée au bord du puits pour éviter le contact ou la déformation du gel.
2. Lavez les gels à 3× avec 500 μL 1× PBS pendant 15 minutes chacun à température ambiante sur un shaker orbital à 0,11 g.
   POINT DE PAUSE : Conserver les gels immergés dans 500 μL 1× PBS à 4 °C pendant jusqu’à 7 jours avant de continuer.
3. Préparez une solution de travail de DNase de 500 μL par gel en diluant le stock de DNase I du QIAGEN RNase-Free DNase Set 1:10 dans un tampon RDD. La solution de travail finale contient environ 0,27 unité de Kunitz·^μL-1.
4. Incuber les gels dans une solution de travail de DNase de 500 μL pendant 2 h à 37 °C avec un léger balancement (Figure 1H).
5. Gel lavage 4× avec 500 μL de PBS sans RNASE à 1× pendant 15 minutes chacun à température ambiante.
6. Équilibrer les gels dans un tampon d’hybridation de sonde préchauffé de 500 μL pendant 30 minutes à 37 °C
7. Stock de sonde HCR smFISH dilué (1 μM ; Instruments moléculaires) 1:300 dans le tampon d’hybridation de la sonde pour atteindre une concentration finale de ~3,3 nM. Mélange par vortex
8. Remplacer le tampon d’équilibrage par un mélange de sonde de 500 μL par gel et incuber toute la nuit à 37 °C sur un shaker orbital à 0,11g (Figure I).
   ATTENTION : Les tampons d’hybridation de la sonde contiennent de la formamide, qui est toxique. Utilisez des gants et évitez l’inhalation.

5. Réaction en chaîne d’hybridation (jour 7) (Figure 1J)

1. Gels de lavage 3× avec un tampon de lavage de sonde préchauffé de 500 μL pendant 30 minutes chacun à 37 °C sur un shaker orbital à 0,11 g.
   ATTENTION : Les tampons de lavage de sonde contiennent de la formamide, qui est toxique. Utilisez des gants et évitez l’inhalation.
2. Lavez les gels 3× avec 500 μL 1× PBS pendant 30 minutes chacun à température ambiante sur un shaker orbital à 0,11 g.
3. Laissez les gels dans 1 mL 1× PBS toute la nuit à température ambiante sur un shaker orbital à 0,11 g.
   REMARQUE : Un lavage prolongé pendant la nuit améliore le rapport signal/bruit en réduisant la liaison hors cible de la sonde et les points de fond. Pour le traitement le jour même, procéder directement à l’amplification HCR.
   POINT DE PAUSE : Après les lavages post-hybridation, conservez les gels dans 1 mL 1× PBS à température ambiante ou 4 °C pendant jusqu’à 96 h avant l’amplification par HCR.
4. Remplacer le PBS par un tampon d’amplification de 500 μL (précédemment équilibré à température ambiante) par puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante sur un vibrateur orbital à 0,11 g.
5. Pour chaque ensemble de sondes, diluez les épingles à cheveux h1 et h2 (crosse 3 μM ; Instruments moléculaires) dans tampon d’amplification 1:100 (concentration finale de 30 nM). Préparez 350 μL de mélange en épingle à cheveux dilué par puits.
6. Des solutions en épingle à cheveux diluées à la chaleur dans des tubes PCR à 95 °C pendant 90 s dans un thermocycleur ou un bloc thermique. Utilisez un volume total de 100 μL par tube pour assurer un chauffage uniforme et un équilibre de température.
   REMARQUE : Les directives HCR recommandent généralement de faire un chauffage instantané en épingle H1 et H2 séparément et de les combiner uniquement après refroidissement. Sinon, de combiner H1 et H2 avant chauffage instantané lorsque la manipulation simplifiée est nécessaire.
7. Laissez les épingles refroidir à température ambiante pendant 10 minutes dans le noir sans être perturbées.
8. Retirez le tampon d’amplification et ajoutez un mélange en épingle à cheveux de 350 μL par puits.
9. Incubez les gels pendant 2 heures à température ambiante dans le noir sur un shaker orbital à 0,11 g.
10. Lavez les gels 3× avec 500 μL 5× SSCT pendant 10 minutes chacun à température ambiante sur un vibrateur orbital à 0,11 g.
11. Récupérez les solutions en épingle après amplification, protégez-les de la lumière, puis conservez-les à -20 °C pour la réutilisation.
12. Transférez les gels à 500 μL 1× de PBS et lavez 3× pendant 30 minutes à température ambiante.
13. Conserver les gels dans 500 μL 1× PBS à 4 °C, protégés de la lumière.
    POINT DE PAUSE : Les gels amplifiés peuvent être conservés jusqu’à 2 semaines avant l’imagerie avec une perte minimale de signal.

6. Préparation, montage et imagerie des échantillons étendus (Jour 8) (Figure 2)

1. Incuber les gels dans 1× PBS contenant DAPI (1:1000) pendant la nuit à 4 °C sur un shaker orbital à 0,11 g.
2. Utilisez une brève lumière UV pour visualiser le cerveau à l’intérieur du gel. Orientez l’échantillon et coupez l’excès de gel selon les besoins.
   ATTENTION : L’éclairage UV est utilisé lors du positionnement et du montage de l’échantillon. Portez une protection oculaire appropriée.
3. Montez les échantillons en 1× PBS complétés par DAPI (1:1000) en utilisant la configuration appropriée pour la plateforme d’imagerie sélectionnée ( voir Tableau 1).
4. Laissez les échantillons s’équilibrer pendant au moins 1 heure avant l’acquisition.
5. Utilisez des objectifs d’immersion dans l’eau avec une distance de travail suffisante pour imager à travers le gel expansé.
6. Échantillons d’images à l’aide de la microscopie à feuilles lumineuses, de la microscopie confocale à balayage laser ou de la microscopie confocale à disque tournant. Les paramètres de montage et d’acquisition représentatifs spécifiques à chaque plateforme utilisés dans cette étude sont résumés dans le Tableau 1.
   REMARQUE : Après imagerie, les sondes et les épingles à cheveux HCR peuvent être retirées par digestion de DNase comme décrit ci-dessus. Les gels peuvent ensuite être soumis à des cycles supplémentaires d’hybridation par sonde et d’amplification HCR.

Quai	Visualisation, montage et localisation de l’exemple	Objectif / détecteur	Configurations d’acquisition représentatives
Zeiss Lightsheet 7	Utilisez un éclairage UV rapide pour visualiser la position du cerveau dans le gel. Coupez l’excès de gel et orientez chaque cerveau vers l’objectif de détection. Placez 5 à 6 gels sur une housse de 1 × cm recouverte de poly-L-lysine, avec des gels orientés vers l’extérieur (Figure 2A). Fixez la gaine de couverture au porte-échantillons LS7 à l’aide d’une petite goutte d’adhésif polyvalent aux UV ; éteignez la lampe UV avant d’appliquer de la colle. Montez dans la chambre LS7 et localisez les régions cérébrales en direct en ZEN Black.	Objectif de détection par immersion dans l’eau à 20×/1,0 NA ; 2,5× zoom optique (50× grossissement total).	Z-step, 0,4 μm à 2,5× zoom et 2× expansion. Pivot Scanning activé. Exposition, 50 ms pour tous les canaux. Lasers : 405 nm à 5 %, 488 nm à 2 %, 561 nm à 8 %. Émissions : 420–470 nm, 505–545 nm, 570–620 nm.
			(Figure 2C, à gauche)
Confocal à balayage laser Nikon Ti2-E AXR NSPARC	Utilisez une brève lumière UV pour visualiser le cerveau à l’intérieur du gel. Orientez un seul gel de façon à ce que le cerveau soit orienté vers le bas, en direction de l’objectif inversé. Transférer dans une antenne d’imagerie à fond de verre remplie de 1× PBS + DAPI (Figure 2B). Localiser le cerveau avec un objectif de 4×, identifier les ROI avec un objectif de 20× et enregistrer des positions X-Y dans les éléments NIS. Ajoutez un support d’immersion, revisitez les ROI enregistrés et mettez en lumière ces données.	objectif d’immersion aquatique à longue distance de 40 × (Nikon CFI APO LWD 40× WI, 1,15 NA Lambda S, distance de travail de 0,61 mm) ; Détecteur NSPARC en mode super-résolution.	Balayage galvanométrique, 2048 × 2048 pixels, 1,6 μs/pixel, zoom 8,0×. Lasers : 488 nm à 2 %, 640 nm à 20 %. Émissions : 502–546 nm et 666–732 nm.
			(Figure 2C, centre)
Confocal à disque tournant Evident Scientific IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1	Montez les échantillons comme pour l’imagerie confocale inversée : orientez le gel avec le cerveau tourné vers l’objectif et placez-le dans une plaque d’imagerie à fond de verre avec 1× PBS + DAPI (Figure 2B). Identifier les régions d’intérêt telles que décrites pour la microscopie confocale à balayage laser à l’aide du logiciel cellSens.	objectif d’immersion aquatique à longue distance de travail de 60× (Olympus LUMFLN60XW LWD, 1,10 NA, distance de travail de 1,5 mm) ; Appareil photo Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII (2304 × 2304 pixels ; 6,5 × 6,5 μm taille de pixel).	excitation de 488 nm à 75 % de puissance, exposition de 200 ms ; Excitation de 640 nm à 100 % de puissance, exposition de 800 ms. Émissions : 500–550 nm et 665–705 nm.
			(Figure 2C, à droite)

Tableau 1 : Montage représentatif, localisation de l’échantillon et paramètres d’imagerie à travers les plateformes de microscopie. Résumé des stratégies de montage d’échantillons, approches de localisation, objectifs et paramètres d’acquisition utilisés sur les plateformes de microscopie à feuilles lumineuses et confocales.

7. Analyse quantitative de l’expression de l’ARN et des protéines

REMARQUE : Choisissez le flux de travail d’analyse en fonction de l’objectif expérimental. Une comparaison de ces approches est proposée dans le Tableau Supplémentaire 1.

1. Quantification des transcrits à l’échelle de la population utilisant FlySeg.
   REMARQUE : L’analyse est basée sur la version mise à jour du pipeline^{FlySeg 29} . Un aperçu schématique du flux de travail d’analyse est présenté à la figure 3A–B
   1. Installez FlySeg, un paquet basé sur Python, en créant un environnement Conda en utilisant :
      conda env create -f environment.yml
   2. Activez l’environnement avant l’analyse en utilisant :
      conda active flyseg
   3. Commencez l’analyse en utilisant :
      Python main.py --fichier >
      Utilisez les formats d’entrée pris en charge, y compris les fichiers CZI ou NPY.
   4. Personnalisez l’analyse en utilisant des arguments optionnels selon les besoins, notamment :
      Nombre de canaux (--canaux)
      Canaux du noyau (--nuclei_ch ou --nuclei_wavelength)
      Canal cytoplasmique (--cytoplasm_ch ou --cytoplasm_wavelength)
      Paramètres de détection des noyaux (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      Facteur de dilatation nucléaire (--nuclei_dilation)
      Seuils de détection FISH (--fish_threshold_range)
      Répertoire de sortie (--output_dir)
      Visualisation via Napari (--visualize)
   5. Affichez toutes les options disponibles en utilisant :
      main.py Python – À l’aide
   6. Inspectez les métadonnées d’image en utilisant :
      Python main.py --metadata_only.
      Confirmez la taille du voxel, le nombre de canaux et l’identité des canaux.
   7. Effectuez l’analyse en utilisant des paramètres ajustés de manière appropriée pour le jeu de données. En général, il faut spécifier le nombre total de canaux, le canal des noyaux, le canal cytoplasmique (si disponible) et le facteur de dilatation nucléaire.
      REMARQUE : Définir la --nuclei_dilation valeur appropriée pour la frontière nucléaire/cytoplasmique souhaitée. Voir la figure 3C–D pour un exemple.
   8. Surveillez le journal de traitement. Toutes les sorties sont sauvegardées dans un dossier nommé d’après le fichier d’entrée.
   9. Identifier les principaux résultats pour l’analyse en aval, notamment :
      1. < dossier >-Nuclei-df.csv
         qui contient des mesures de caractéristiques par noyau et les comptes de points associés pour chaque canal FISH et fournit des données quantitatives pour l’analyse statistique.
      2. < dossier >-Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         C’est un nuage de points utilisé pour identifier les valeurs aberrantes de segmentation en fonction de la taille et de l’intensité nucléaires ; exclure les noyaux signalés comme des valeurs aberrantes lors d’analyses ultérieures.
   10. Utilisez des sorties intermédiaires supplémentaires (par exemple, masques de segmentation, tables de détection de points et fichiers résumés FISH fusionnés) pour un post-traitement avancé si nécessaire.
2. Comptage des transcrits dans des cellules individuellement identifiables à l’aide d’Imaris
   1. À l’aide de l’outil Surfaces, segmentez le neurone d’intérêt selon un canal marqueur cytoplasmique ou membranaire.
   2. Ajustez les paramètres de lissage de surface et de seuil d’intensité pour garantir que la surface résultante englobe fidèlement le soma tout en excluant les structures voisines.
   3. À l’aide de l’outil de détection Spots, identifiez les points de transcription dans le canal FISH. Fixez le diamètre et le seuil d’intensité estimés du point en fonction de la taille du point et de l’intensité du signal (par exemple, 0,25 μM pour une expansion tissulaire 2x).
   4. Limitez la détection de points à la surface déjà générée afin de s’assurer que seuls les points du neurone sont comptabilisés.
   5. Extraire le nombre total de taches détectées à la surface du neurone à l’aide du panneau Statistiques.
   6. Comptage ponctuel d’exportation et mesures associées pour l’analyse en aval.
3. Quantification de la fluorescence basée sur le ROI utilisant FIJI/ImageJ
   1. Ouvrir les piles d’images dans FIJI et générer des projections d’intensité maximale à l’aide des piles d’images > > Z Project > projection d’intensité maximale . Utilisez des réglages de projection identiques pour tous les échantillons d’une expérience.
   2. Identifier la structure neuronale d’intérêt à l’aide d’un canal marqueur anatomique (par exemple, GFP membranaire ou cytoplasmique). À l’aide de l’outil de sélection à main levée ou polygonale, esquissez manuellement le ROI correspondant à la structure (par exemple, la dendrite en fibre géante).
   3. Passez au canal protéique et mesurez l’intensité de fluorescence dans le ROI défini en utilisant Analyze > Measure. Notez les paramètres suivants : Intensité moyenne de fluorescence ; Densité intégrée ; Zone de retour sur investissement.
   4. Mesurer l’intensité de fluorescence dans un ROI de fond proche de taille similaire qui ne reçoit pas de signal spécifique et se trouve en dehors de la structure neuronale marquée. Utiliser la même stratégie de ROI de fond pour tous les échantillons de l’expérience et soustraire la valeur de fond de la mesure du ROI.
   5. Utilisez des valeurs de densité intégrée ou d’intensité moyenne corrigées en fonction du fond pour une comparaison quantitative entre génotypes ou conditions expérimentales. Assurez-vous que des réglages d’imagerie identiques sont utilisés pour tous les échantillons à comparer.

Résultats

Pour valider le flux de travail HCR-smFISH assisté par expansion et immunohistochimie dans un contexte biologiquement pertinent, nous nous sommes concentrés sur le circuit d’évasion imminent du système visuel de Drosophila. Ce circuit se compose de neurones de projection visuelle LC4^{génétiquement définis 30,31} qui détectent les stimuli menaçants et d’un neurone descendant bien caractérisé à fibre géante (GF) qui génère des décollages^{rapides 32,33}, fournissant un système anatomiquement stéréotypé pour les mesures moléculaires spécifiques au type cellulaire dans des cerveaux intacts.

La protéine de jonction gap de Drosophila Shaking-B (ShakB)³⁴ a été impliquée dans la transmission électrique au sein de plusieurs composants du circuit GF, y compris les synapses de sortie axonale³⁵ et les entrées auditives³⁵. Bien que les preuves directes d’un couplage électrique aux dendrites GF lors de la détection imminente soient limitées, des travaux récents indiquent que les neurones LC4 expriment des niveaux élevés de shakB³⁶. Ces observations ont motivé l’utilisation de stratégies de knockdown et de marquage de ShakB comme cas test pour évaluer si le protocole peut évaluer quantitativement les perturbations moléculaires ciblées à la fois au niveau de l’ARN et des protéines dans des types neuronaux génétiquement définis.

Nous avons d’abord évalué l’efficacité du knockdown shakB dans le GF et LC4 en utilisant HCR-smFISH combiné à la coloration par anticorps ShakB. La GF, un seul neurone par hémicerveau, était marquée avec un marqueur membranaire (Figure 4A). LC4, une population d’environ 60 neurones par hémicerveau, a été marquée avec un marqueur nucléaire permettant la quantification au niveau de la population (Figure 4B). Dans les cerveaux témoins, les transcrits shakB ont été clairement détectés dans les neurones GF et LC4. L’expression de l’ARNi shakB a entraîné une réduction significative des points d’ARNm shakB dans les neurones ciblés des deux types cellulaires (Figure 4C–D). Conformément au site cytoplasmique de l’interférence ARN, la déplétion des transcrits était la plus prononcée dans le compartiment cytoplasmique. La séparation des points nucléaires et cytoplasmiques à l’aide de la quantification basée sur FlySeg a révélé une réduction sélective des transcriptes de shakB cytoplasmiques dans la population de LC4, tandis que les points nucléaires étaient significativement moins affectés (Figure 4D, réduction de 69 % contre 22 %, respectivement).

Nous avons constaté une coloration par anticorps ShakB localisée dans les zones où les dendrites GF chevauchent les axones des interneurones commissuraux géants (GCI), qui relient les deux fibres géantes et permettent des réponses visuelles^{controlatérales 37} (Figure 4E). Ces observations sont cohérentes avec des études^{antérieures 35} démontrant un couplage électrique dépendant de ShakB entre le GF et le GCI. La coloration par anticorps ShakB a également été observée dans les régions où les axones LC4 entrent en contact avec les dendrites GF, bien que la localisation dans cette région ait été moins clairement résolue. Quelle que soit la localisation subcellulaire précise, le signal des anticorps ShakB associé à la région dendritique GF a été nettement réduit après l’expression de l’ARNi (Figure 4F).

Cependant, la détection basée sur les anticorps ne permet pas d’attribuer de manière sans ambiguïté la protéine ShakB aux terminaux LC4 présynaptiques par rapport aux dendrites GF postsynaptiques aux sites de contact. De plus, l’expression généralisée de ShakB dans tout le système^{visuel 34,36} limite la quantification spécifique au type cellulaire chez les neurones LC4 grâce à l’immunocoloration anti-ShakB. Pour surmonter ces limitations et évaluer directement la localisation de ShakB spécifique au type cellulaire, nous avons utilisé un allèle shakB marqué endogènement que nous avions précédemment^{généré 36,38}. Cela a permis la visualisation sélective de la protéine ShakB spécifiquement dans les neurones LC4. ShakB marqué SmGdP-10×V5 était enrichi à la fois en dendrites (correspondant aux régions d’entrée des neurones visuels en amont) et en terminaisons axoniques en contact avec les dendrites GF (Figure 4G). L’expression de l’ARN shakB a entraîné une disparition quasi totale du signal V5 dans les compartiments dendritique et axonal (Figure 4H). Ces résultats démontrent que le protocole permet la résolution spécifique et subcellulaire de la localisation des protéines endogènes dans un neuropil densément innervé.

En contrôle qualitatif supplémentaire, nous avons testé la FISH non expansée combinée à l’immunohistochimie dans des populations neuronales identifiées (Figure supplémentaire 1). Le signal FISH provenant de la grd a chevauché celui de LC22 somate, cohérent avec l’expression prédite des données scRNA-seq du lobe optique (Figure supplémentaire 1A–C)¹³. Dans les neurones Tm3 exprimant tdTomato, l’ARNm tdTomato chevauchait la protéine tdTomatoes, tandis que l’ARNm VGlut1 ne chevauchait pas Tm3 somata, ce qui correspond à l’identité cholinergique des neurones Tm3 (Figure supplémentaire 1)¹³. Ces exemples illustrent que le FISH + IHC non expansé suffit pour l’évaluation qualitative de la présence/absence, tandis que l’expansion est nécessaire pour une quantification fiable à un seul point.

La réussite de la mise en œuvre de ce protocole est indiquée par un marquage clair spécifique au type cellulaire, des points smFISH discrets avec un faible fond de fond, une segmentation fiable des noyaux individuels ou des volumes cellulaires définis manuellement, et une réduction constante du signal ARN ou protéique cible après perturbation. Les résultats négatifs ou à faible signal doivent également être interprétables : par exemple, l’ARN shakB a produit un signal réduit de l’ARNm et du protéine ShakB , tandis que le FISH non expansé a montré un manque de signal VGlut1 dans la somata Tm3 malgré une détection claire de l’ARNm de tdTomate. Les résultats sous-optimaux incluent un signal faible des anticorps ou smFISH, un point de fond élevé, une segmentation incomplète, une mauvaise répartition des puncta ou une dérive d’échantillon lors de l’imagerie, qui peuvent tous affecter la quantification en aval.

Figure 2. Montage et imagerie d’échantillons étendus à l’aide de plateformes de microscopie à feuilles lumineuses et de microscopie confocale. (A) Visualisation et découpage des hydrogels étendus (1–2), communs à toutes les plateformes d’imagerie, suivis du montage pour la microscopie à feuilles lumineuses (3–4 ; Zeiss Lightsheet 7). (B) Photographie d’un échantillon étendu monté sur un microscope confocal laser inversé (Nikon Ti2-E AXR). (C) Des sections optiques simples représentatives (plans Z simples) d’un échantillon élargi du système visuel de Drosophila (neurones LC4 marqués avec un marqueur nucléaire fluorescent) sondée pour l’ARNm shakB (voir Figure 4), acquise sur trois plateformes d’imagerie. Barres d’écaille, 10 μm (tissu post-expansion). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3. Analyse quantitative des points de smFISH à l’aide de FlySeg. (A) Aperçu schématique du flux de travail d’analyse FlySeg pour la segmentation automatisée et la quantification des points au sein des cellules identifiées. (B) Pavage de Voronoi tridimensionnel illustrant la logique de segmentation centrale de FlySeg. Le volume d’imagerie est partitionné en domaines spatiaux (chacun affiché dans une couleur distincte), chaque partition étant contrainte à contenir au maximum un noyau, assurant une assignation à une seule cellule. Dans chaque domaine de Voronoi, le noyau est segmenté selon une procédure d’optimisation fonctionnelle qui détermine la surface nucléaire optimale en se basant à la fois sur les valeurs d’intensité nucléaire et cytoplasmique environnante. (C) Démonstration de l’option nuclei_dilation pour distinguer les transcriptes nucléaires et cytoplasmiques Une seule section optique montrant un noyau marqué par GFP entouré de points smFISH, avec un signal diffus DAPI délimitant le compartiment cytoplasmique après le traitement par DNase. Les lignes indiquent 0 et 0,5 facteurs de dilatation, correspondant respectivement aux volumes nucléaire et cytoplasmique. (D) Projection d’intensité maximale de (C), illustrant que les points localisent à la fois les compartiments nucléaire et cytoplasmique. Barres d’écaille, 10 μm (tissu post-expansion). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4. Validation du flux de travail quantitatif à l’aide de projections de perturbation moléculaire (A) médiées par ARNi (10 μm d’épaisseur, ne couvrant pas l’ensemble du volume cellulaire) du soma Giant Fiber (GF) marqué avec un marqueur membranaire et sondé pour détecter l’ARNm shakB en conditions de contrôle (haut) et d’ARN shakB (bas). Des contours verts pointillés indiquent les bordures du soma pour souligner l’épuisement du réservoir cytoplasmique mais pas nucléaire d’ARNm. N, cerveaux (un côté par animal). (B) la même chose que (A) pour les neurones LC4 marqués par un marqueur nucléaire. (C) Quantification des points FISH shakB dans les neurones GF (pools nucléaires et cytoplasmiques combinés) sous contrôle et en conditions d’ARN shakB. Les points représentent des neurones individuels (un neurone par cerveau, un côté par animal). (D) Même chose que (C) pour les neurones LC4. Les points représentent des cerveaux individuels (un côté par animal ; nombre de puncta par cellule en moyenne par cerveau). (E) Projections confocales des dendrites GF marquées avec un marqueur membranaire et colorées pour ShakB en conditions de contrôle (haut) et d’ARN shakB (bas). (F) La quantification des niveaux de protéines ShakB dans les dendrites GF mesurée en intensité moyenne de fluorescence sous contrôle et en conditions d’ARN GF>shakB. N, cerveaux (un côté par animal). (G) Projections confocales de neurones LC4 marqués par un marqueur membranaire et exprimant ShakB marqué smGdP-10xV5 en conditions contrôles (haut) et RNAi shakB (bas). Des contours verts pointillés indiquent des zones de dendrites LC4 et des terminaisons axoniques sur lesquelles la densité ShakB-V5 a été évaluée (H). La quantification des niveaux de protéines ShakB-smGdP-V5 dans les dendrites et terminaisons axoniques LC4 mesurée en intensité moyenne de fluorescence sous contrôle et en conditions d’ARN LC4 > ShakB. N, cerveaux (un côté par animal). Les barres d’erreur indiquent la moyenne ± SEM. Toutes les comparaisons statistiques ont été réalisées à l’aide de tests t de Welch à deux faces. Barres d’écailles, 10 μm sur toutes les images (tissu post-expansion). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Ce protocole combine HCR-smFISH assisté par expansion, l’immunohistochimie pré-expansion et la quantification des transcrits par segmentation pour permettre des mesures d’ARN et de protéines appariées dans les mêmes neurones génétiquement définis. En intégrant ces composants dans un seul flux de travail, cette méthode devrait faciliter une analyse moléculaire quantitative spécifique au type cellulaire dans le cerveau intact de Drosophila .

Plusieurs modifications pratiques introduites ici représentent des étapes cruciales pour combiner l’immunohistochimie avec le HCR-smFISH assisté par expansion dans le cerveau^{de Drosophila 24}. Tout d’abord, l’immunohistochimie doit être réalisée avant l’expansion tissulaire et le smFISH. Parce que le protocole inclut une étape de digestion de la Protéinase K, effectuer une immunohistochimie après expansion peut réduire l’intégrité de l’épitope. Il est important de noter que l’incubation par anticorps avant expansion (primaire 24 h + 24 h secondaire) ne réduit pas de manière notable l’intensité du signal ARN lorsque la technique RNase-clean et l’ancrage covalent à ARN sont utilisés. Deuxièmement, les concentrations d’anticorps primaires et secondaires doivent être augmentées, généralement de 2 à 3× par rapport à l’IHC standard de montage complet, afin de compenser la perte de signal associée à la digestion et à l’expansion tissulaire de la Protéinase K. Troisièmement, les conditions de fixation sont importantes pour préserver à la fois les signaux protéiques et ARN. La fixation glyoxale sans acide favorise la préservation de la localisation des protéines synaptiques ponctuées, maintient l’intégrité structurelle des processus neuronaux et ne compromet pas la détection quantitative des points d’ARNm. Nous avons également observé que l’ancrage simultané de l’ARN et des protéines est compatible à la fois avec la détection en aval de HCR-smFISH et par immunofluorescence. Ensemble, ces ajustements améliorent la compatibilité entre l’immunohistochimie et la détection de transcripts assistée par expansion.

L’expansion ajoute une étape unique du jour au lendemain et n’est pas techniquement complexe, mais son utilisation dépend de l’objectif expérimental. Comme démontré dans la Figure Supplémentaire 1, la FISH non expansée combinée à l’immunohistochimie suffit à évaluer si un gène est exprimé dans un type cellulaire donné, tandis que l’expansion est nécessaire lorsque des points individuels de smFISH doivent être résolus de manière fiable, attribués à chaque somate et analysés quantitativement, en raison de l’augmentation substantielle de la résolution spatiale effective. De même, les plaques multipuits de type Terasaki ne sont pas strictement obligatoires, mais elles réduisent l’utilisation des réactifs, permettent de traiter plusieurs conditions en parallèle et aident à maintenir l’identité de l’échantillon sur de petits lots ; Les tubes de microcentrifuge standards peuvent également être utilisés lorsque le volume du réactif est moins limitant. Bien que la microscopie à feuilles lumineuses permette l’imagerie volumétrique rapide des tissus étendus, nous démontrons que les systèmes confocaux standards à balayage laser inversé et à disque tournant suffisent pour une imagerie complète des populations neuronales sélectionnées dans le cerveau étendu de Drosophila . Une limitation courante de la microscopie confocale est la courte distance de travail. Cependant, comme le cerveau de la mouche est petit et que les échantillons sont étendus d’environ 2 × dans le PBS, les objectifs d’immersion dans l’eau à longue distance de travail offrent une profondeur de pénétration adéquate. Pour les comparaisons quantitatives, les paramètres d’acquisition doivent rester identiques sur tous les échantillons, éviter les pixels saturés, et la taille du voxel doit suffire à résoudre les points individuels de smFISH. Cela élargit l’accessibilité du protocole aux laboratoires sans instrumentation dédiée à la feuille lumineuse.

L’implémentation mise à jour de FlySeg s’appuie sur le cadre FlySeg précédemment publié et introduit deux ajouts principaux pour ce protocole. Premièrement, un paramètre de dilatation nucléaire configurable permet de classer les puncta smFISH comme nucléaires ou cytoplasmiques en fonction de leur relation spatiale avec les noyaux segmentés. La coloration DAPI cytoplasmique après un traitement par DNase est importante pour cette étape, car elle fournit un signal diffus délimitant le corps cellulaire et soutient une segmentation nucléaire fiable, favorisant la séparation des pools de transcrits nucléaires et cytoplasmiques. Deuxièmement, la détection automatisée des valeurs aberrantes identifie les noyaux mal segmentés, qui peuvent être exclus de la quantification en aval. Au-delà de l’évaluation des effets moléculaires du knockdown génétique spécifique au type cellulaire, séparer les transcrits nucléaires et cytoplasmiques peut être utile lorsque la localisation des transcrits reflète une activité transcriptionnelle en cours. Dans le cerveau des mammifères, les premiers transcriptes géniques précoces induits par l’activité apparaissent d’abord dans le noyau puis s’accumulent dans le cytoplasme à mesure que les ARNm sont traités et^{exportés 39}, un principe utilisé dans l’analyse catFISH⁴⁰ des temps d’activation neuronale. On ne sait pas encore si des dynamiques transcriptionnelles comparables se produisent dans le cerveau de Drosophila , mais cela peut en principe être exploré à l’aide du flux de travail actuel. Dans toute autre expérience de poursuite d’impulsions, distinguer les points nucléaires des points cytoplasmiques peut donc fournir des informations temporelles au-delà du nombre total de transcrits. En même temps, le flux de travail ne se limite pas à la segmentation nucléaire et peut être adapté à la segmentation cellulaire whole-soma (c’est-à-dire définie par membrane). Le flux de travail quantitatif actuel est optimisé pour les somatas neuronaux ; bien que les régions neuropil puissent être imageries, l’attribution quantitative des points d’ARNm à des axones ou dendrites individuels nécessiterait des stratégies de segmentation spécifiques à chaque compartiment. FlySeg est particulièrement utile pour la quantification automatisée et à haut débit dans des populations neuronales denses où des statistiques au niveau de la population sont requises. Pour des neurones identifiables individuellement ou des compartiments définis manuellement, d’autres outils comme Imaris ou FIJI/ImageJ peuvent être plus appropriés. Un résumé de ces stratégies de quantification, incluant leurs principales applications, avantages et limites, est présenté dans le Tableau Supplémentaire 1.

Les points de dépannage courants incluent un signal d’anticorps faible, un fond smFISH élevé, des dommages au gel ou une perte d’échantillon, une dérive de l’échantillon lors de l’imagerie et une segmentation faible. Le signal faible des anticorps peut souvent être amélioré en augmentant encore la concentration d’anticorps ou en prolongeant les incubations primaires et/ou secondaires d’anticorps de 24 h à 48 h. Un fond smFISH élevé peut souvent être réduit en prolongeant les lavages post-hybridation et en évitant les environnements d’acquisition saturés. Les dommages au gel et la perte d’échantillon sont minimisés en utilisant des pointes à large calibre, en découpant les gels par des coupes droites, et en découpant des canaux d’évacuation pour éviter les bulles lors du remplissage de la chambre. La dérive de l’échantillon lors de l’imagerie est réduite en équilibrant les gels montés pendant au moins 1 heure avant l’acquisition ; Si la dérive persiste, l’équilibre peut être prolongé à 2 heures ou plus. Une mauvaise segmentation peut résulter d’une coloration DAPI cytoplasmique faible ou d’un équilibrage incomplet de l’échantillon, ce qui peut réduire le signal de la frontière cellulaire ou provoquer des décalages X-Y-Z lors de l’acquisition ; ceux-ci doivent être vérifiés avant d’ajuster les paramètres FlySeg. Dans ce protocole, les gels sont maintenus dans 1× PBS, ce qui entraîne environ 2× expansion isotrope. Si une résolution spatiale plus élevée est requise, une expansion plus importante peut être obtenue dans le PBS dilué ou l’eau déionisée. Inversement, lorsque l’objectif est uniquement d’évaluer la présence ou l’absence d’expression dans un type cellulaire défini, la FISH non expansée combinée à l’immunohistochimie peut suffire, comme le montre la Figure 1 supplémentaire. Le protocole reste compatible avec les flux de travail itératifs FISH. Les sondes et les épingles à cheveux HCR peuvent être retirées par traitement à la DNase, permettant des cycles supplémentaires d’hybridation et d’amplification dans le même stélem. De futures extensions techniques pourraient inclure HCR-smFISH itératif à plus haut niveau de plex, un enregistrement automatisé entre les cycles d’imagerie, une segmentation améliorée des cellules entières ou des neurites, et des pipelines d’analyse plus standardisés pour comparer les signaux ARN et protéiques entre expériences. Le développement ultérieur de stratégies de segmentation spécifiques aux compartiments pourrait étendre l’analyse quantitative au-delà des somates neuronaux vers les axones et les dendrites. Ensemble, la lecture combinée ARN-protéine, la quantification des transcrits résolus en compartiments et la compatibilité avec les plateformes d’imagerie standard rendent ce flux de travail adapté aux expériences ciblées de validation moléculaire sur des neurones génétiquement définis du cerveau intact de Drosophila .

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution d’hydroxyde de sodium 10N	Fisher Scientific	Cat# SS255-1
Solution d’hydroxyde de sodium 1N	Fisher Scientific	Cat# SS266-1
20X Tampon Séline-Citrate de Sodium   ;   ;	Invitrogen  ;	Cat# AM9763
4-Hydroxy-TEMPO  ;	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# 176141
Solution de chlorure de sodium 5M   ;	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# S5150
Acrylamide	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# A9099
Acide acrylique & nbsp ;	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# 147230
Acryloyl-X, SE & NBSP ;	Invitrogen	Cat# A20770
Adobe Illustrator	Adobe  ;	N/A
Alexa Fluor 488 Anti-Poulet pour Chèvres (1:200)	Laboratoires de recherche immunitaire Jackson	Cat# 103-545-155, RRID : AB_2337390
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-21124, RRID : AB_2535766
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-11011, RRID : AB_143157
Persulfate d’ammonium   ;	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# A3678
DMSO & nbsp anhydre ;	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# 900645-4X2ML
Adhésif adhésif UV-durcissement bondic & nbsp ;	Bondic	Kit de démarrage Bondic
cellSens imaging software v4.4.1	Évident Scientifique	N/A
Poulet Polyclonal Anti-GFP (1:400)	Abcam	Cat# ab13970, RRID :AB_300798
Conda (responsable de l’environnement)	Anaconda, Inc	N/A
Corning et échange ; Lames de microscope givrées   ;	Corning	Cat# 2948-75X25
Porte-échantillons LS7 conçu sur mesure	Janelia Tech  ;	ID 2021-021
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat# D9542
Scalpel stérile en inox inoxydable jetable	MedPride	MPR-47101
Acide éthylénédiaminetétraacétique   ;	Sigma-Aldrich	Cat# EDS-100G
Logiciel d’analyse d’image des Fidji (ImageJ) v2.14.0	ImageJ Consortium	N/A
FlySeg (pipeline personnalisé)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	N/A
Solution fixative GAF   ;	Addax Biosciences  ;	Cat# VI25
GenClone® ; Plaques de culture cellulaire à 24 puits, non traitées	Genesee Scientific	Cat# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	Centre de bétail de Bloomington	#41315
Troupeau de donneurs de sérum de chèvre   ;	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# G6767
HCR & commerce ; Tampon amplificateur RNA-FISH(v3.0)	Instruments moléculaires	N/A
HCR & commerce ; Amplificateurs RNA-FISH(v3.0) : AF546, JF669	Instruments moléculaires	N/A
HCR & commerce ; Tampon d’hybridation de sonde ARN-FISH(v3.0)	Instruments moléculaires	N/A
HCR & commerce ; Tampon de lavage de sonde RNA-FISH(v3.0)	Instruments moléculaires	N/A
HCR & commerce ; Sonde ShakB RNA-FISH(v3.0)	Instruments moléculaires	N/A
Imaris 10.1	Oxford Instruments & nbsp ;	N/A
Microscope confocal à disque tournant IXPlore IX85 SpinSR	Évident Scientifique	N/A
Microscope à feuille lumineuse LS7   ;	Carl Zeiss  ;	N/A
Melphalan  ;   ;	Cayman Chemical	Cat# 16665
MOPS Buffer & nbsp ;	Fisher Scientific	Cat# BP308-100
Anti-V5 monoclonal de souris (SV5-Pk1) (1:100)	Abcam	Cat# ab27671, RRID :AB_471093
N,N,N',N'--Tétraméthyléthylène de mine  ;	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# T7024
N,N'-méthylène bisacrylamide   ;	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# M7279
Napari	Communauté open source	N/A
Logiciel d’imagerie avancée de recherche NIS-Elements	Nikon Corporation	N/A
Eau sans nucléase	Qiagen	Cat# 129114
Nunc&trade ; MiniPlateaux avec Nunclon et commerce ; Delta surface & nbsp ;	Invitrogen	Cat# 163118
PBS (10X), pH 7,4 & nbsp ;	Gibco	Cat# 70011044
Détergent Photo-Flo & nbsp ;	Sciences de la microscopie électronique	Cat# 74257
Solution de poly-L-lysine   ;	Ted Pella & nbsp ;	Cat# 18026
Lunettes Precision Cover, épaisseur #1,5H   ;	Thorlabs	Cat# CG15CH2
Press-to-Seal & commerce ; Isolateur silicone avec adhésif, un puits, 20 mm de diamètre, 0,5 mm de profondeur	Invitrogen	Cat# P24740
Protéinase K  ;	Nouvelle-Angleterre & nbsp ; Biolabs	Cat# P8107S
Rabbit Anti-ShakB (1:400)	Don de Geord Ammer	N/A
RNase AWAY & échange ; Décontaminant de surface	Invitrogen	Cat# 7002
RNase-Free DNase Set  ;	Qiagen  ;	Cat# 79256
Schneider » s Drosophila Medium   ;	Gibco	Cat# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5 ;	Frighetto et al., 2025	PMID : 41278920
Azidée de sodium & nbsp ;	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# S8032
Microscope stéréo Stemi 508	Carl Zeiss	N/A
SYTO & TRADE ; 41 Coloration fluorescente bleue à acides nucléiques	Invitrogen	Cat# S11352
Microscope confocal laser à balayage laser Ti2E AXR NSPARC	Nikon Corporation	N/A
Tris Base  ;	Fisher Scientific & nbsp ;	Cat# BP152-500
Triton et le commerce ; X-100  ;	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat# T8787
UAS-GFP-2A-KDR ;	Sanfilippo et al. 2024	PMID : 38262414
UAS-his2A-GFP ;	Dombrovski et al., 2025	PMID : 40468081
UAS-mCherry RNAi	Centre de bétail de Bloomington	#35785
UAS-myr ::GFP ;	Centre de bétail de Bloomington	#32198
UAS-shakB RNAI	Ammer et al., 2022	PMID : 35385694
UltraPure & Trade ; 1 M Tris-HCI, pH 8,0 & nbsp ;	Invitrogen	Cat# 15568025
VT042336-Gal4 (Fibre géante)	Dombrovski et al., 2025	PMID : 40468081
Zen Black 3.1  ;	Carl Zeiss  ;	N/A