Pharmacologie en réseau et validation par ponction caudale-discale de rat de la décoction Yi Qi Huo Xue pour la dégénérescence du disque lombaire

Résumé

Cette étude a utilisé la pharmacologie en réseau, le docking moléculaire et un modèle de ponction caudale-disque chez le rat pour étudier les effets précliniques potentiels de la décoction Yi Qi Huo Xue sur la dégénérescence du disque lombaire, en se concentrant sur des cibles candidates telles que AKT1, BCL2 et STAT3, ainsi que sur des voies telles que la signalisation PI3K-AKT.

Résumé

Dans cette étude, la pharmacologie de réseau, le docking moléculaire, la simulation dynamique moléculaire et la validation expérimentale ont été utilisées pour étudier la base pharmacologique et les mécanismes moléculaires potentiels de la décoction Yi Qi Huo Xue (YQHXD) dans la dégénérescence du disque lombaire (LDD). Un total de 678 cibles actives liées aux composés de YQHXD et 296 cibles thérapeutiques potentielles associées à la LDD ont été identifiées. L’analyse des réseaux d’interactions protéine-protéine et l’analyse topologique ont identifié plusieurs cibles candidates, dont AKT1, IL6, TNF, BCL2 et STAT3. Des analyses d’enrichissement utilisant Gene Ontology et Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ont indiqué que les cibles candidates étaient liées à des fonctions telles que la liaison aux protéines et la liaison à l’ATP, avec un enrichissement de voies incluant la signalisation PI3K-AKT. Le docking moléculaire prédisait les interactions entre certains composés actifs, tels que la quercétine, la tétraneurine A et l’isorhamnétine, ainsi que les cibles principales. Les simulations de dynamique moléculaire ont également suggéré que les complexes de plus basse énergie restaient stables. Soixante-dix rats mâles de Sprague-Dawley ont été assignés au hasard aux groupes témoin, à opération simulée, modèle, témoin positif, et YQHXD à faible dose moyenne et élevée. Après l’établissement d’un modèle de ponction discale intervertébrale coccygée dans les groupes modèle, témoin positif et YQHXD, les rats ont reçu YQHXD ou clectoxib par gavage oral pendant 8 semaines, tandis que les groupes témoins et opérés par simulacre ont reçu une solution saline normale. L’évaluation histopathologique a montré que le traitement YQHXD était associé à une réduction de la dégénérescence des disques intervertébraux dans ce modèle. Un test immunosorbant lié à des enzymes, la réaction en chaîne de la polymérase et les analyses western blot ont montré des changements dans les niveaux d’expression de l’ARNm et des protéines de cibles sélectionnées, notamment AKT1, BCL2 et STAT3. Ces résultats suggèrent que YQHXD pourrait exercer des effets protecteurs précliniques dans le LDD par une régulation multi-composantes et multi-cibles impliquant des mécanismes liés à l’inflammation et à l’apoptose. Cette étude fournit des preuves précliniques préliminaires soutenant une investigation ultérieure de YQHXD pour le TDL.

Introduction

La dégénérescence discale lombaire (TDL) est une affection orthopédique courante liée à l’âge caractérisée par un début tardif, une difficulté de traitement, une forte récidive et un handicap. La LDD implique des modifications pathologiques dégénératives associées à un déséquilibre entre le métabolisme catabolique et anabolique de la matrice extracellulaire (MCE) dans le disque intervertébral (DI) et est étroitement associée à la douleur lombaire (LBP⁾¹. Des études épidémiologiques montrent que la largibie est l’une des principales causes d’incapacité en pratique^{clinique 2}.

De 1990 à 2017, le nombre de cas mondiaux est passé de 42,5 millions à 64,9^{millions 3}, affectant la vie quotidienne et imposant un fardeau social et économique important. Par conséquent, un traitement efficace du TDL reste cliniquement important. En pratique clinique, la LDD est souvent prise en charge par des traitements symptomatiques conservateurs ou chirurgicaux, qui peuvent soulager les symptômes mais ne réversent généralement pas la dégénérescence disque intervertébrale (IVDD). Les anti-inflammatoires oraux non stéroïdiens couramment utilisés pour un traitement conservateur peuvent également être associés à des effets indésirables rénaux, gastro-intestinaux et cardiovasculaires.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est depuis longtemps utilisée dans la gestion des^{maladies 4}. Les composés à base de plantes et les constituants individuels ont été rapportés comme retardant la progression de la DDI et favorisant la régénération^{tissulaire 5}. En pratique clinique, les formules de MTC sont également utilisées dans le cadre de stratégies de gestion conservatrices des maladies osseuses et articulaires dégénératives. L’école de médecine familiale Wu dans la région de Suzhou a utilisé la décoction Yi Qi Huo Xue (YQHXD) comme prescription principale pour les troubles de la difusion intraveineuse lombaire ; cependant, des preuves mécanistes supplémentaires sont nécessaires pour clarifier son rôle potentiel dans le LDD.

Des études antérieures ont suggéré que YQHXD pourrait retarder la IVDD en favorisant l’autophagie cellulaire et en exerçant des effets anti-âge ^6,7. Cependant, les mécanismes pharmacologiques par lesquels YQHXD pourrait affecter le LDD restent flous, et une analyse systématique de son mode d’action fait encore défaut. Dans cette étude, la pharmacologie en réseau a été utilisée pour analyser les caractéristiques multi-composants et multi-cibles de YQHXD en relation avec la LDD. Le docking moléculaire a été utilisé pour évaluer les interactions entre composés et protéines cibles, suivi de simulations de dynamique moléculaire. Ces prédictions ont ensuite été évaluées à l’aide d’un modèle de ponction caudale-disque chez le rat afin d’étudier les mécanismes potentiels de YQHXD chez^{LDD 8}. Comme le montre la Figure 1, cette étude fournit des preuves précliniques que YQHXD peut affecter les processus liés au LDD en modulant des gènes et des protéines tels que AKT1, BCL2 et STAT3, avec un enrichissement des voies impliquant la signalisation PI3K-Akt et d’autres catégories de voies liées à la maladie.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le Conseil d’Éthique Institutionnelle de l’Université de Médecine Chinoise de Nankin (Code de protocole : 202501A018) et ont été menées conformément au Guide des National Institutes of Health (NIH) pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures expérimentales ont respecté les directives ARRIVE.

Médicaments expérimentaux
La solution d’échantillon YQHXD contenait 20 g de racine d’Astragalus membranaceus , 20 g de racine d’Angelica sinensis , 15 g de rhizome Ligusticum chuanxiong , 6 g de racine de Stephania tetrandra , 15 g de fruit de Chaenomeles speciosa et 10 g de graines matures de Sinapis alba , avec un poids total brut de 86 g par ordonnance. Tous les matériaux à base de plantes ont été authentifiés selon la Pharmacopée chinoise (édition 2020) par le Département de pharmacie de l’hôpital Ruikang affilié à l’Université de médecine chinoise du Guangxi. La solution d’échantillon YQHXD a été préparée à l’aide d’une méthode de décoction à l’eau. De l’eau distillée stérile à 8 fois le volume total de drogue brute a été ajoutée, et les herbes ont été trempées pendant 30 minutes jusqu’à ce qu’elles soient complètement immergées. Le mélange a ensuite été bouilli et décocté à feu doux pendant 30 minutes avant la filtration. Les résidus ont été extraits à nouveau avec le même volume d’eau distillée stérile en suivant la même procédure. Les filtrats des deux extractions ont été combinés et concentrés à 55,5 mL sous pression réduite grâce à l’évaporation rotative pour obtenir la solution d’origine YQHXD. Sur la base du poids total du médicament brut, la concentration finale de drogue brute était de 1,55 g/mL, avec un rendement d’extraction d’environ 64,5 %. La dose administrée aux rats expérimentaux a été convertie à partir de la dose clinique adulte en utilisant la méthode de normalisation de la surface corporelle. Le coefficient de conversion entre humains et rats était d’environ 6,3 ; Par conséquent, la dose chez le rat (mg/kg) a été calculée comme la dose humaine (mg/kg) × 6,3. Le groupe à haute dose a reçu 15,48 g/kg/jour comme dose de référence, tandis que les groupes à dose moyenne et faible ont reçu respectivement 7,74 g/kg/jour et 3,87 g/kg/jour. Pour un volume de gavage de 10 mL/kg, les concentrations de travail correspondantes étaient respectivement de 1,548, 0,774 et 0,387 g/mL pour les groupes à dose, moyenne et basse. La solution d’origine a été diluée en conséquence pour atteindre la dose cible pour chaque groupe expérimental avant l’administration. Après la préparation, les décoctions étaient refroidies, aliquotées en conditions stériles, puis conservées à −40 °C jusqu’à utilisation.

Analyse de pharmacologie de réseau

Prédiction des protéines cibles des ingrédients actifs
Le 24 novembre 2025, des composés actifs ont été récupérés depuis la base de données TCMSP en utilisant les termes de recherche « Huangqi, Angelica, Chuanxiong, Stephania, Mugua et Jiezi ». Les composés ont été dépistés en fonction de leur biodisponibilité orale (OB ≥ 30 %) et de la ressemblance du médicament (DL ≥ 0,18)⁹. La raison d’être de ces seuils est la suivante : la base de données TCMSP intègre des données de composés provenant de sources faisant autorité telles que PubChem, ChEMBL et ChemSpider et fournit des paramètres liés à l’ADME, y compris la biodisponibilité orale. La biodisponibilité orale fait référence à la proportion d’une dose administrée par voie orale qui atteint la circulation systémique sans changement, et un haut taux d’OB est essentiel pour identifier les molécules bioactives. La ressemblance avec un médicament est un indicateur utilisé pour évaluer la capacité à la drogue des composés et pour prédire leur solubilité et leur stabilité. Dans cette étude, un seuil d’OB plus strict (≥30 %), dépassant la valeur recommandée par la base de données (≥20 %), a été appliqué pour identifier les composés candidats présentant une absorption orale favorable et des profils pharmacocinétiques. Par le temps, DL a été utilisé pour estimer le potentiel de type médicamenteux des composés, et un seuil de DL ≥ 0,18 a été adopté en fonction de la valeur moyenne de DL observée dans les composés de la médecine traditionnelle chinoise. Les composés actifs sélectionnés ont été récupérés au format SMILES depuis la base de données PubChem et importés dans la base de données SwissTargetPrediction pour la prédiction des cibles, avec l’espèce réglée sur Homo sapiens. Les protéines cibles ont été standardisées en utilisant des symboles géniques officiels, et seules les cibles avec des valeurs de probabilité supérieures à 0 ont été conservées afin d’améliorer la fiabilité de la prédiction. Les composés sans cible prédite ont été exclus de l’analyse réseau ultérieure. Après la fusion de toutes les cibles, les entrées en double ont été supprimées à l’aide d’un logiciel de tableur pour garantir que chaque cible n’était représentée qu’une seule fois dans l’ensemble de données final.

Collecte des cibles clés
Les gènes liés à la maladie ont été extraits des bases de données^{GeneCards 10}, OMIM¹¹ et TTD¹² en utilisant le mot-clé « dégénérescence du disque lombaire ». Les cibles génétiques collectées ont été fusionnées, et les entrées en double ont été retirées pour obtenir un ensemble final de cibles associées à la maladie.

Cibles potentielles de YQHXD pour le traitement du TDL
La plateforme Venny 2.1.0 a été utilisée pour déterminer les cibles potentielles de YQHXD dans LDD. Un réseau a ensuite été généré pour montrer les associations entre les composants actifs et leurs cibles prédites. Les composants actifs principaux ont été sélectionnés en fonction de leurs valeurs de degré dans le réseau.

Construction en réseau des composants de médicaments et cibles d’intersection de maladies
Les ingrédients actifs, les protéines cibles et les gènes liés au LDD issus de la formule TCM YQHXD ont été importés dans le logiciel^{Cytoscape 13} pour construire un diagramme en réseau composant-cible de la maladie médicament.

Construction du réseau PPI et identification des cibles clés
Des cibles croisées ont été soumises à la plateforme^{STRING 14} pour analyse, l’organisme étant réglé sur Homo sapiens. Pour construire le réseau d’interaction protéine-protéine (IPP), le seuil de score d’interaction a été fixé à >0,4, les nœuds déconnectés ont été cachés, et tous les autres paramètres sont restés par défaut. Les données obtenues étaient importées dans le logiciel, où l’outil NetworkAnalyzer était utilisé pour évaluer les propriétés topologiques et calculer les degrés des nœuds. Les cinq premiers nœuds classés par degré ont été identifiés comme cibles clés du centre.

Analyse d’enrichissement des cibles principales
Les cibles intersectantes ont été téléchargées dans la base de données^{DAVID 15} pour l’annotation fonctionnelle de Gene Ontology (GO) et l’analyse d’enrichissement des voies par la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Le contexte de l’organisme a été défini comme Homo sapiens, avec le seuil d’enrichissement défini selon les paramètres DAVID par défaut, incluant un seuil d’EASE < 0,1 et un seuil de comptage ≥ 2. L’univers génétique était basé sur le fond par défaut du génome complet fourni par DAVID. Les tests multiples ont été corrigés en utilisant la méthode de Benjamini-Hochberg pour contrôler le taux de fausses découvertes (FDR), et les résultats DAVID ont été ajustés sur cette base. Les voies enrichies étaient ordonnées par valeur de comptage dans l’ordre décroissant. Les graphiques en barres d’enrichissement GO et KEGG ont été produits à l’aide d’une plateforme de bioinformatique en ligne.

Amarrage moléculaire
Pour prédire les interactions entre les principaux composants actifs de YQHXD et les cibles principales de LDD, une analyse de docking moléculaire a été réalisée dans cette étude. Les cinq principaux composés actifs, classés selon les degrés topologiques du réseau et la pertinence de la cible, ont été sélectionnés comme ligands, tandis que les protéines cibles principales correspondantes ont été utilisées comme récepteurs. Les fichiers SDF des ligands ont été récupérés depuis PubChem, et les structures tridimensionnelles des protéines cibles ont été téléchargées depuis la Protein Data Bank (PDB). L’analyse de l’amarrage a été réalisée sur la plateforme CB-Dock2 en utilisant son protocole d’amarrage aveugle entièrement automatisé. Après avoir téléchargé les structures protéiques, la plateforme a automatiquement retiré les hétératomes, y compris les petites molécules, les ions et les molécules d’eau, puis a réparé les atomes manquants et les atomes d’hydrogène. Le mode d’amarrage automatique à l’aveugle a été utilisé. Dans ce mode, CB-Dock2 identifie les poches potentielles de liaison protéine-surface grâce à un algorithme de détection de cavité basé sur la courbure, puis effectue des calculs d’amarrage à l’aide du moteur Vina intégré^{AutoDock 16}. Pendant le processus d’amarrage, les protéines étaient traitées comme des structures rigides, tandis que les ligands étaient considérés comme flexibles, et tous les paramètres d’amarrage étaient réglés aux valeurs par défaut de la plateforme. Les résultats de l’amarrage ont été soumis à une visualisation tridimensionnelle et à une analyse d’interaction à l’aide des outils intégrés de CB-Dock2¹⁷, et des énergies de liaison ont été calculées pour estimer les affinités de liaison prédites entre les composés actifs et les protéines cibles.

Simulation de dynamique moléculaire
Des simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées pour le complexe protéine-ligand cible à l’aide de GROMACS 2022.2. La protéine a été modélisée avec le champ de force Amber14SB, et le système de solvants a été représenté à l’aide du modèle hydrique TIP3P. Les charges atomiques des ligands ont été calculées en utilisant la méthode AM1-BCC implémentée dans Antechamber, suivie de l’attribution des types d’atomes GAFF2. Les fichiers topologiques obtenus ont été convertis dans un format compatible GROMACS à l’aide d’ACPYPE. Des paramètres ioniques compatibles avec le modèle d’eau TIP3P ont été attribués en fonction de l’ensemble de paramètres de Joung-Cheatham. Le complexe de départ a été placé dans une boîte de simulation dodécaédrique tronquée avec au moins 1,2 nm entre la surface de la protéine et le bord de la boîte. Des molécules d’eau TIP3P ont été ajoutées pour solvater le système, et des ions Na⁺ et Cl⁻ ont été introduits pour neutraliser la charge du système et fixer la force ionique à 0,15 M. La minimisation de l’énergie a été réalisée avec l’algorithme de descente la plus abrupte jusqu’à ce que la force maximale soit inférieure à 1 000 kJ·mol⁻¹·nm⁻¹. Le système a ensuite été équilibré à 100 ps sous l’ensemble NVT à 298 K et 1 bar. Après équilibrage, une simulation de production de 100 ns a été exécutée sous l’ensemble NPT avec un pas de temps de 2 fs. Les interactions non liées étaient gérées selon le schéma de coupure Verlet. Les interactions électrostatiques ont été calculées à l’aide de la méthode Ewald du maillage de particules (PME), et une coupure de 1,2 nm a été utilisée pour les interactions de van der Waals et coulomb. Les liaisons contenant de l’hydrogène étaient contraintes avec l’algorithme LINCS. La température était contrôlée avec le thermostat Nosé-Hoover, et la pression avec le barostat Parrinello-Rahman, maintenant le système à 298 K et 1 bar. Les trajectoires étaient enregistrées tous les 10 ps. La dynamique structurelle et les interactions intermoléculaires ont été analysées à l’aide des outils intégrés GROMACS, VMD et PyMOL. L’énergie libre de liaison a été estimée avec gmx_MMPBSA lorsque cela est applicable.

Études animales

Élevage des animaux
Soixante-dix rats mâles de Sprague-Dawley (SD) âgés de 3 à 8 semaines ont été répartis au hasard dans sept groupes expérimentaux (n = 10 par groupe) à l’aide de nombres aléatoires générés par ordinateur, assurant ainsi aucune différence statistiquement significative dans le poids corporel de base entre les groupes. Tous les animaux étaient hébergés dans des conditions contrôlées (22 ± 1 °C, 55 ± 10 % d’humidité relative, 12 heures de cycle lumière/obscurité) avec libre accès à la nourriture et à l’eau. Les positions des cages étaient randomisées à chaque changement de cage afin de minimiser les biais environnementaux. Après une semaine d’acclimatation, les rats des groupes modèles ont subi une ponction caudale par IVD pour induire la dégénérescence. Une anesthésie d’infiltration locale avec bupivacaïne a été administrée préopératoirement pour réduire la douleur. Les animaux étaient étroitement surveillés pendant l’opération et tout au long de la récupération postopératoire. Les observations postopératoires comprenaient le temps de récupération, la restauration de l’activité spontanée, la consommation de nourriture et d’eau, ainsi que des changements de poids corporel. Une semaine après l’établissement du modèle, deux rats de chaque groupe ont été sélectionnés au hasard pour une imagerie numérique postopératoire (DR) et une coloration par hématoxyline et éosine (HE). L’analyse radiographique a montré une réduction de la hauteur de la difusion veineuse caudale, tandis que la coloration HE a révélé une nette diminution des cellules notochordales du noyau pulpeux (NP) et une désorganisation de la structure lamellaire de l’annulus^{fibrosus 18}, confirmant l’établissement réussi du modèle. Huit semaines après l’opération, les rats ont été euthanasiés par inhalation d’une surdose d’isoflurane, et des échantillons de tissu de la queue et de sang ont été prélevés. Après validation préliminaire, trois échantillons indépendants par groupe répondant à des critères de qualité prédéfinis ont été utilisés pour l’histologie finale, l’ELISA, la PCR et les analyses western blot. Les coupes histologiques ont été évaluées dans des conditions à simple aveugle, les lames étant étiquetées uniquement par des numéros d’identification animales. Pour les tests ELISA, PCR et western blot, un codage à l’aveugle a été appliqué lors de l’aliquotation et de l’étiquetage de l’échantillon, et l’ordre de test de tous les échantillons a été randomisé avant les expériences. Les données brutes, y compris les valeurs d’absorbance, les valeurs C_t et les intensités de bande, ont été décodées en identités de groupe par un statisticien non impliqué dans le regroupement expérimental ou le traitement des échantillons, puis analysées par le personnel statistique. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées par des statisticiens qui n’ont pas participé au regroupement expérimental ou au traitement de l’échantillon. Tout événement indésirable, y compris une infection de la plaie, une déhiscence, un saignement ou une léthargie sévère, a été immédiatement enregistré et évalué. Les affections légères étaient étroitement surveillées avec des soins de soutien renforcés. Des critères humains ont été appliqués si les rats présentaient une perte de poids corporelle supérieure à 20 % de la valeur initiale, une douleur intense non soulagée par des analgésiques, une perte de mobilité, une incapacité à accéder à la nourriture ou à l’eau, une infection, une nécrose, d’autres complications postopératoires graves, une détresse respiratoire ou toute condition potentiellement mortelle. Dans de tels cas, les animaux ont été euthanasiés de manière humaine par inhalation d’une surdose d’isoflurane.

Modélisation expérimentale
Les rats ont été anesthésés avec de l’isoflurane inhalé et placés sur le ventre. Les IVD caudales Co6/7, Co7/8 et Co8/9 étaient placés sous guidage fluoroscopique aux rayons X. Une aiguille de 21 G était avancée verticalement dans le DII jusqu’à atteindre le côté opposé de la peau, après quoi la pointe de l’aiguille était retirée vers le centre de la queue. Une seconde aiguille servait de référence positionnelle. Pour provoquer une dégénérescence prolongée de la DI, l’aiguille était tournée de 360°, maintenue en place pendant 30 secondes, puis retirée. Dans le groupe Sham, la profondeur de la perforation à travers la peau et le muscle était d’environ 2 mm, sans endommager la DI. Dans les autres groupes, l’aiguille était insérée à 5 mm vers le centre du DI, évitant les vaisseaux sanguins. Après l’insertion, l’aiguille était tournée de 360° et laissée en place pendant 30 secondes. Le site de la ponction a été désinfecté, marqué et protégé avec une gaze stérile. Une semaine après la modélisation, l’imagerie radiologique de la colonne caudale a montré une diminution de la hauteur de la difusion intraveineuse. La coloration HE a révélé une réduction significative des cellules notochordales NP et une désorganisation de la structure de la lamelle annulaire, confirmant l’établissement réussi du modèle. Après une modélisation réussie, les groupes recevant des traitements de MTC et le groupe témoins positif (PC) ont reçu les doses appropriées, calculées sur la base du rapport de surface corporelle entre humains et rats.

Regroupement et intervention
Un total de 70 rats SD mâles âgés de 3 à 8 semaines ont été utilisés dans cette expérience, répartis en sept groupes :
(1) Groupe témoin (Ctrl) : Les rats de ce groupe ont été assignés aléatoirement en même temps et dans les mêmes conditions que les groupes expérimentaux. Ils étaient hébergés dans des cages individuelles dans une installation animale de niveau SPF, avec un accès gratuit à la nourriture standard et à l’eau potable.
(2) Groupe simulé : Les rats ont été anesthésés par inhalation d’isoflurane. Après l’anesthésie, la peau de la queue a été désinfectée avec de l’iode povidone, et les rats ont été placés sur le ventre. Les IVD Co6/7 et Co7/8 ont été placés sous guidage fluoroscopique aux rayons X. L’aiguille a été avancée d’environ 2 mm à travers la peau et le muscle sans blesser la diem intraveineuse. L’eau distillée (10 mL/kg) était administrée une fois par jour par gavage pendant 8 semaines.

(3) Groupe modèle : Les rats ont été anesthésés avec de l’isoflurane inhalé. Après l’anesthésie, la peau de la queue a été désinfectée avec de l’iode povidone, et les rats ont été placés sur le ventre. Sous guidage fluoroscopique aux rayons X, les IVD Co6/7, Co7/8 et Co8/9 ont été localisés. Une aiguille de 21 G était avancée verticalement dans le DII jusqu’à atteindre le côté opposé de la peau, puis la pointe de l’aiguille était retirée vers le centre de la queue.

Une seconde aiguille servait de référence positionnelle. L’aiguille était tournée de 360° et maintenue en place pendant 30 secondes pour induire une dégénérescence continue de la MIDI avant le retrait. De l’eau distillée (10 mL/kg) était administrée quotidiennement par gavage pendant 8 semaines, et la récupération des rats était étroitement surveillée après l’opération.
(4) Groupe PC : Le groupe témoin positif a été soumis à la même procédure de modélisation que le groupe modèle et a ensuite reçu une injection orale de célectoxib (20 mg/kg/jour), préparée en suspension dans 0,5 % de carboxyméthylcellulose sodique (CMC-Na), pendant 8 semaines consécutives, avec un volume de gavage de 10 mL/kg de poids corporel.
(5) YQHXD groupe à faible dose [YQHXD(L)] : La modélisation a été réalisée comme dans le groupe Modèle. Les rats ont reçu YQHXD à 3,87 g/kg/jour par gavage pendant 8 semaines, avec un volume de gavage de 10 mL/kg et une concentration de travail de 0,387 g/mL.
(6) YQHXD groupe à dose moyenne [YQHXD(M)] : La modélisation a été effectuée comme dans le groupe Modèle. Les rats ont reçu YQHXD à 7,74 g/kg/jour par gaffe pendant 8 semaines, avec un volume de gavage de 10 mL/kg et une concentration de travail de 0,774 g/mL.
(7) YQHXD groupe à haute dose [YQHXD(H)] : La modélisation a été réalisée comme dans le groupe Modèle. Les rats ont reçu YQHXJ à 15,48 g/kg/jour par gavage pendant 8 semaines, avec un volume de gavage de 10 mL/kg et une concentration de travail de 1,548 g/mL.

Changements pathologiques
Le tissu caudal de la MII du rat a été isolé chirurgicalement, et des modifications de la DSI et des tissus musculaires environnants ont été observées. Les tissus collectés étaient ensuite transformés en sections pathologiques, avec des spécimens préparés en sections longitudinales pour observation morphologique. La dite veineuse vertébrale caudale, fixée dans du formaldéhyde pendant 96 heures, a été rapidement décalcifiée à l’aide d’une solution décalcifiante, déshydratée par une série d’alcool graduée, puis nettoyée avec du xylène. Après l’inclusion dans la paraffine, des sections de 5 μm de paraffine ont été préparées. Après la déparaffination avec le xylène et la déshydratation par une série de gradients d’alcool, les sections ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine. Ils ont ensuite été déshydratés, dégagés et montés. Les échantillons ont été observés au microscope optique pour examiner les changements morphologiques de la structure de la difusion caudale à travers les groupes. Par la suite, la coloration trichrome de Masson a été réalisée. Les coupes ont été colorées séquentiellement avec une solution de dichromate de potassium et de l’hématoxyline pendant 3 minutes chacune, suivies d’une différenciation avec de l’éthanol acide, puis colorées au rouge de Picrosirius pendant 10 minutes. Après un traitement à l’acide phosphotongstique pendant 10 minutes, les sections ont été colorées au bleu de toluidine pendant 5 minutes. Après déshydratation, les sections ont été dégagées au xylène, montées et observées au microscope pour examiner les changements dans la difusion caudale intraveineuse.

Détection ELISA des protéines cibles sériques
Huit semaines après l’opération, les rats ont été anesthésés avec de l’isoflurane inhalé, et du sang de l’aorte abdominale a été prélevé. Les échantillons de sang périphérique ont été conservés à température ambiante pendant 1 h et centrifugés à 1 400 × g pendant 10 minutes. Le sérum était séparé et conservé à −80 °C jusqu’à utilisation. Les niveaux sériques d’AKT1, STAT3 et Bcl-2 ont été quantifiés par un test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA). Les analyses étaient réalisées selon les protocoles des fabricants. L’absorption a été mesurée à 450 nm, et les concentrations ont été déterminées à partir de courbes standard. Les plages de détection pour AKT1, STAT3 et BCL-2 étaient respectivement de 0,625–40 ng/mL, 31,25–1000 pg/mL et 0,16–10 ng/mL, avec des sensibilités de 0,1 ng/mL, 10 pg/mL et 0,1 ng/mL. Tous les échantillons séromiques ont été analysés sans dilution, et tous les résultats se sont situés dans les plages de courbe standard correspondantes. Tous les échantillons et standards ont été testés en double, et la normalisation a été réalisée sur la base de volumes sériques égaux.

Détection par PCR des niveaux d’expression génique
Les tissus intervertébraux des disques ont été disséqués à partir des vertèbres caudales de rats, et environ 20 mg ont été prélevés à partir de chaque échantillon. Les tissus ont été pulvérisés dans de l’azote liquide et lysés dans 500 μL de tampon de lyse non enzymatique pendant 15 minutes. L’ARN total a ensuite été extrait, et sa concentration ainsi que sa pureté ont été mesurées à l’aide d’un spectrophotomètre. Des échantillons avec des valeurs de A₂₆₀/_{A 280} de 1,8–2,0 ont été acceptés pour analyse, et les concentrations d’ARN ont été ajustées à 500 ng/μL. La transcription inverse a été réalisée selon le protocole du fabricant. La PCR quantitative (qPCR) a été réalisée sur un système de PCR en temps réel pour mesurer l’expression d’ARNm d’Akt1, Bcl-2 et Stat3 . Les séquences d’amorces sont fournies dans le Tableau 1. Le programme PCR consistait en une dénaturation initiale à 95 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles à 95 °C pendant 5 s et 60 °C pendant 30 s. Une analyse de la courbe de fusion a été réalisée après amplification afin de vérifier la spécificité du produit. Le Gapdh a été utilisé comme gène de référence, et tous les échantillons ont été analysés en triple exemplaire. Les rendements d’amplification des amorces étaient de 90 % à 110 %. L’expression relative des gènes a été calculée à l’aide de la méthode 2^−ΔΔCt .

Buvard Western pour les niveaux d’expression protéique
Une protéine totale a été isolée à partir des tissus disques intervertébraux caudaux de rats de chaque groupe. Les tissus ont été lysés dans un tampon RIPA complété par des inhibiteurs de protéase. La concentration en protéines a été mesurée à l’aide d’un kit de test protéique BCA et ajustée à 2 μg/μL. Des quantités égales de protéines (15 μg par échantillon) ont été séparées par 10 % de SDS-PAGE et transférées dans des membranes de polyvinylidène difluorure (PVDF) à un courant constant de 300 mA pendant 90 minutes grâce à un système de transfert humide. Les membranes ont ensuite été bloquées avec 5 % de lait écrémé pendant 1 h à température ambiante et incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre AKT1 (1:5 000), STAT3 (1:6 000), Bcl-2 (1:1 500) et β-actine (1:4 000). Après le lavage TBST, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) à une dilution de 1:5 000 pendant 1 h à température ambiante. Des bandes protéiques ont été détectées à l’aide d’un réactif à chimiluminescence améliorée (ECL), et des images ont été obtenues avec un système d’imagerie sur gel dans des conditions d’exposition identiques. Les intensités des bandes ont été mesurées à l’aide d’ImageJ et normalisées en β-actine afin de déterminer l’expression relative des protéines. Chaque expérience a été réalisée indépendamment en triple exemplaire, chaque échantillon étant obtenu sur un animal différent.

Statistiques
Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type (DS). Les différences entre les groupes ont été évaluées par analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivie du test post hoc de la différence la plus faible significative (LSD). La signification statistique a été définie comme P < 0,05.

Résultats

Conclusions tirées de l’étude
Cette étude a intégré la pharmacologie en réseau, le docking moléculaire, les simulations de dynamique moléculaire et des expériences in vivo pour étudier les effets protecteurs potentiels de YQHXD contre le LDD. Les résultats suggèrent que YQHXD pourrait agir, au moins en partie, par la régulation de l’axe de signalisation AKT1/STAT3/BCL-2, caractérisé par une expression réduite de STAT3 et une augmentation de l’expression d’AKT...

Discussion

Les médecines traditionnelles chinoises ont été rapportées comme ayant des effets pharmacologiques, notamment des activités anti-inflammatoires, analgésiques et favorisant la circulation^{sanguine 19}. Des études antérieures ont suggéré que la décoction Xiaosui Huahe, la formule précurseur de YQHXD, pourrait favoriser la résorption de la hernie massive de la MIV en affectant la résorption du noyau pulpeux (NP) et l’absorption de la^{MII 20} ; cep...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,5 % de carboxyméthylcellulose de sodium (CMC-Na)	Non spécifié		Véhicule utilisé pour préparer la suspension en clectoxib pour le gavage.
Aiguille 21 G	Non spécifié		Utilisé pour la ponction du disque intervertébral caudal.
2 et fois ; Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan	G3326	Réactif d’amplification qPCR.
Solution de gel 30 % d’acrylamide/bis-acrylamide (29:1)	Solarbio Co., Ltd.		Solution de préparation au gel pour SDS-PAGE ; indiqué dans le tableau des matériaux d’origine comme solution gelée 30 %/29:1.
Meuleuse 3D congelée	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Utilisé pour l’homogénéisation/broyage des tissus.
4 et les fois ; Tampon gel concentrant SDS-PAGE (pH 6,8)	Solarbio Co., Ltd.		Réactif de préparation du gel Western Blot.
Éthanol acide	Non spécifié		Utilisé pour la différenciation histologique par coloration.
ACPYPE	Projet ACPYPE		Utilisé pour convertir des fichiers de topologie de ligands dans un format compatible GROMACS.
Kit AKT1 ELISA	Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd.	SYP-R1928	Utilisé pour mesurer les niveaux sériques d’AKT1 ; Portée de détection 0,625 & ndash ; 40 ng/mL.
Méthode de charge AM1-BCC	Outils antichambre/AMBRE		Utilisé pour le calcul de la charge atomique des ligands.
Champ de force Amber14SB	Champ de force AMBER		Champ de force protéique utilisé dans la simulation de dynamique moléculaire.
Racine d’Angelica sinensis	Pharmacie Jianshou, Nanning, Guangxi, Chine	Lot n° 20250503	composante botanique YQHXD ; 20 g par ordonnance.
Éthanol anhydre	Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.		Utilisé dans le traitement et la déshydratation des tissus.
Antichambre	AMBER Tools		Utilisé pour le calcul de la charge des ligands et le typage des atomes.
Anticorps anti-AKT1	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Anticorps primaire contre le Western blotting ; dilution 1:5 000.
Anticorps anti-Bcl-2	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Anticorps primaire contre le Western blotting ; dilution 1:1 500.
Anticorps anti-STAT3	Wuhan Sanying Co., Ltd.	10253-2-AP	Anticorps primaire contre le Western blotting ; dilution 1:6 000.
Réactif APS	Beyotime/Biyuntian Co.		Réactif de polymérisation en gel Western Blot.
Racine d’Astragalus membranaceus	Pharmacie Jianshou, Nanning, Guangxi, Chine	Lot n° 20250405	composante botanique YQHXD ; 20 g par ordonnance.
Autoclave	SANYO, Japon		Équipement de stérilisation.
Moteur AutoDock Vina	Projet AutoDock/Vina		Moteur d’amarrage utilisé dans CB-Dock2.
Kit de test protéique BCA	Solarbio Co., Ltd.		Utilisé pour déterminer la concentration en protéines avant le Western blotting.
Kit ELISA Bcl-2	Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.	PMK1545	Utilisé pour mesurer les niveaux de Bcl-2 sérique ; Portée de détection 0,16&ndash ; 10 ng/mL.
Bupivacaïne	Non spécifié		Anesthésique d’infiltration local utilisé préopératoirement.
CB-Dock2	Serveur web CB-Dock2		Plateforme d’amarrage moléculaire aveugle automatisée.
Clécécoxib	Sichuan New Ston Pharmaceutical Co., Ltd.	H20233911	Médicament à contrôle positif ; 20 mg/kg/jour par gavage.
Fruit de Chaenomeles speciosa	Pharmacie Jianshou, Nanning, Guangxi, Chine	Lot n° 231001	composante botanique YQHXD ; 15 g par ordonnance.
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Version 3.9.0	Utilisé pour construire et analyser des diagrammes réseaux.
Kit de réactifs chromogéniques DAB (20 et plus fois)	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Listé dans le tableau des matériaux existants.
DAVID	Institut national du cancer	Version 6.8	Base de données pour l’annotation, la visualisation et la découverte intégrée ; utilisé pour l’analyse d’enrichissement GO et KEGG.
Solution de décalcification	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Utilisé pour la décalcification du tissu veiné veiné vertébral caudal.
Vibrateur de décoloration	Liu Yi Biotechnology Co., Ltd., Pékin		Secoueur de laboratoire.
Eau DEPC	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Travail ARN/préparation des réactifs.
Système d’imagerie radiographique numérique	Non spécifié		Utilisé pour la validation postopératoire de modèles radiographiques.
Eau distillée	Non spécifié		Préparation de la décoction véhicule/contrôle et YQHXD.
Substrat chimiluminescent ECL	Biosharp Co.		Réactif de détection de signal Western Blot.
Solution de récupération d’antigènes EDTA (pH 8,0)	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Listé dans le tableau des matériaux existants.
Appareil d’électrophorèse	Non spécifié		Utilisé pour l’électrophorèse SDS-PAGE.
Tampon d’électrophorèse	Servicebio Co.		Solution d’électrophorèse Western Blot.
Machine à glace FM40	Changliu Scientific Instruments Co., Ltd., Pékin		Machine à glace.
Formaldéhyde	Non spécifié		Fixateur utilisé pour le tissu veiné veiné vertébral caudal.
Types d’atomes GAFF2	AMBER Tools		Types d’atomes de ligands utilisés pour les simulations de dynamique moléculaire.
Système d’imagerie sur gel	Tianen Scientific, Shanghai		Utilisé pour capturer des images de Western Blot.
GeneCards	Institut Weizmann des sciences	Version 5.26	Base de données génétique humaine utilisée pour récupérer des cibles associées à la maladie.
gmx_MMPBSA	gmx_MMPBSA projet		Utilisé pour l’estimation de l’énergie libre de liaison MM-PBSA lorsque cela est applicable.
GraphPad Prism	Logiciel GraphPad	Version 8.0	Logiciel statistique/graphique listé dans la version manuscrite antérieure des auteurs.
Meulage des billes	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Utilisé pour le broyage/homogénéisation des tissus.
GROMACS	Équipe de développement GROMACS	Version 2022.2	Utilisé pour les simulations de dynamique moléculaire.
Réactifs de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine	Non spécifié		Utilisé pour la coloration en HE des sections caudales en IVD.
Centrifugeuse à grande vitesse	Eppendorf, Allemagne		Centrifugeuse de laboratoire.
Meuleur de tissus à basse température à haute vitesse	Servicebio, Chine		Utilisé pour le broyage des tissus à basse température.
Vibrateur horizontal	Compagnie Chirinbell		Secoueur de laboratoire.
Anticorps anti-lapin marqué par HRP	Servicebio Co.		Anticorps secondaire contre le Western blot ; dilution 1:5 000.
HyperScript III RT SuperMix pour qPCR avec removedeur d’ADNa	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Réactif à transcription inverse listé dans le tableau des matériaux existants.
Machine à glace	SIMAG, Chine		Machine à glace.
ImageJ	Instituts nationaux de la santé		Utilisé pour la quantification de l’intensité des bandes Western Blot.
Microscope biologique inversé	Olympus, Japon		Utilisé pour la microscopie des coupes colorées.
Isoflurane	Non spécifié		Agent anesthésique inhalatoire/euthanasie.
Réactif d’isopropanol	China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.		Réactif d’extraction d’ARN.
Paramètres ioniques de Joung-Cheatham	Non applicable		Ensemble de paramètres ioniques utilisé pour les simulations de dynamique moléculaire.
Rhizome de Ligusticum chuanxiong	Pharmacie Jianshou, Nanning, Guangxi, Chine	Lot n° 20250301	composante botanique YQHXD ; 15 g par ordonnance.
Azote liquide	Non spécifié		Utilisé pour le broyage des tissus avant l’extraction d’ARN.
Centrifugeuse à basse vitesse	Eppendorf, Allemagne		Utilisé pour la séparation sérique et d’autres étapes de centrifugation à basse vitesse.
Solution de coloration trichrome de Masson	Non spécifié		Utilisé pour la coloration Masson des sections de diem caudal IVD.
Lecteur de microplaques (TECAN)	TECAN, Suisse		Utilisé pour la mesure de l’absorbance à 450 nm ; listé dans le tableau des matériaux existants.
Lecteur de microplaques (Thermo Fisher Scientific)	Thermo Fisher Scientific, États-Unis		Lecteur multifonction de microplaques listé dans le tableau des matériaux existants.
Microsoft Excel/logiciels de tableaux Excel	Microsoft		Utilisé pour supprimer les entrées de cible en double et gérer les données tabulaires.
Spectrophotomètre NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific, États-Unis		Utilisé pour mesurer la concentration et la pureté de l’ARN.
Tampon de lyse non enzymatique	Non spécifié		Utilisé pour la lyse tissulaire avant l’extraction d’ARN.
OMIM	École de médecine de l’Université Johns Hopkins		Héritage mendélien en ligne chez l’homme ; utilisé pour récupérer des cibles associées à la maladie.
Plateforme en ligne de tracé bioinformatique	Non spécifié		Utilisé pour générer des graphiques de barres GO et KEGG.
Agent de polymérisation en gel PAGE	Solarbio Co., Ltd.		Réactif de préparation du gel Western Blot.
Paraffine	Non spécifié		Milieu d’incorporation pour les coupes histologiques.
Amorces PCR pour Akt1, Bcl-2, Stat3 et Gapdh	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.		Les séquences d’amorces sont listées dans le tableau 1.
PDB	RCSB PDB		Banque de données sur les protéines ; utilisé pour obtenir des structures 3D de protéines ciblées.
Inhibiteurs phosphorylés/protéases	Servicebio Co.		Ajouté au tampon de lyse RIPA pour l’extraction des protéines.
Acide phosphotungstique	Non spécifié		Utilisé pour la coloration de Masson.
Picrosirius Red	Non spécifié		Utilisé pour la coloration de Masson.
Membrane de polyvinylidène difluorure (0,45 & mu ; m)	Servicebio Co.		Membrane PVDF utilisée pour le transfert Western blot.
Véhicule de drogue à contrôle positif	Non spécifié		Véhicule à suspension CMC-Na à 0,5 % pour le célectoxib.
Povidone-iode	Non spécifié		Utilisé pour la désinfection du site chirurgical.
Marqueur protéique	Thermo Fisher Scientific, États-Unis		Marqueur de poids moléculaire pour le Western blotting.
Appareil de transfert de protéines	Bio-Rad, USA		Équipement de transfert humide pour Western blotting.
Module de transfert de protéines (transfert humide)	Bio-Rad, USA		Module de transfert humide Western Blot.
PubChem	Centre national d’information biotechnologique (NCBI)		Utilisé pour obtenir des fichiers SMILES/SDF de structures composées.
Système de préparation de l’eau pure	Le Feng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai		Utilisé pour la préparation de l’eau pure.
PyMOL	Schrö ; dinger, LLC		Utilisé pour la visualisation et l’analyse des sorties dynamiques moléculaires/docking.
Système de PCR en temps réel qPCR	Applied Biosystems QuantStudio, États-Unis		Utilisé pour l’amplification quantitative par PCR.
Tampon de lyse tissuaire/cellulaire RIPA	Solarbio Co., Ltd.		Utilisé pour l’extraction totale des protéines.
Solution de dissolution d’ARN	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Réactif de manipulation de l’ARN.
Évaporateur rotatif	Non spécifié		Utilisé pour concentrer les filtrés combinés YQHXD sous pression réduite.
Graines matures de Sinapis alba	Pharmacie Jianshou, Nanning, Guangxi, Chine	Lot n° 20240801	composante botanique YQHXD ; 10 g par ordonnance.
Rats de Sprague-Dawley	Shanghai Slack Experimental Animal Co., Ltd.	SCXK (Shanghai) 2022-0004	Soixante-dix rats mâles, âgés de 3 ans et ndash ; 8 semaines, utilisé pour le modèle de ponction caudale-disque.
SPSS	IBM, USA	Version 21.0	Logiciel statistique listé dans la version manuscrite antérieure des auteurs.
Kit STAT3 ELISA	Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd.	SYP-R1555	Utilisé pour mesurer les niveaux sériques de STAT3 ; Portée de détection 31,25 & n-trait ; 1000 pg/mL.
Racine de Stephania tetrandra	Pharmacie Jianshou, Nanning, Guangxi, Chine	Lot n° 230301	composante botanique YQHXD ; 6 g par ordonnance.
Gaze stérile	Non spécifié		Utilisé pour protéger le site de la ponction après modélisation.
STRING	STRING Consortium	Version 12.0	Plateforme de réseau d’interaction protéine-protéine.
SweScript All-in-One RT SuperMix pour qPCR	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan	G3337	Réactif à transcription inverse listé dans le tableau des matériaux existants.
SwissTargetPrediction	Institut suisse de bioinformatique SIB		Utilisé pour prédire les cibles potentielles de composés.
Tampon TBST	Non spécifié		Utilisé pour le lavage de membranes pendant le Western blotting.
TCMSP	Centre de bioinformatique, Collège des sciences de la vie, Northwest A & Université F	Version 2.3	Base de données des systèmes de pharmacologie de médecine traditionnelle chinoise ; utilisé pour obtenir des ingrédients actifs de composés à base de plantes chinoises.
Modèle d’eau TIP3P	Non applicable		Modèle de l’eau utilisé dans les simulations de dynamique moléculaire.
Bleu toluidine	Non spécifié		Utilisé pour la coloration de Masson.
Tampon de transfert	Servicebio Co.		Tampon de transfert de taches occidentales.
Réactif TriQuick	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Réactif d’extraction d’ARN.
Réactif Trizol	Non spécifié		Réactif d’extraction totale d’ARN mentionné dans le manuscrit.
TTD	L’Université chinoise de Hong Kong (IDRBLab)		Base de données des cibles thérapeutiques ; utilisé pour récupérer des cibles associées à la maladie.
Venny	BioinfoGP, CNB-CSIC	Version 2.1.0	Utilisé pour identifier les cibles qui se chevauchent entre YQHXD et LDD.
Schéma de coupure Verlet	GROMACS		Schéma d’interaction non lié utilisé dans les simulations de dynamique moléculaire.
Appareil d’électrophorèse verticale	Bio-Rad, USA		Utilisé pour SDS-PAGE.
VMD	Université de l’Illinois à Urbana-Champaign		Utilisé pour la visualisation et l’analyse des sorties de dynamique moléculaire.
Système de transfert humide	Bio-Rad, USA		Utilisé pour le transfert de protéines dans le Western blotting.
Système de fluoroscopie aux rayons X	Non spécifié		Utilisé pour identifier les niveaux de DVI caudal lors de la modélisation par ponction.
Xylène	Non spécifié		Utilisé pour la déparaffinisation/le nettoyage pendant l’histologie.
Anticorps primaire &bêta ;-actine	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Anticorps primaire de contrôle de charge contre la blottisation Western ; dilution 1:4 000.