Production à grande échelle de vésicules extracellulaires à partir de cultures cellulaires 3D à haute densité dans des bioréacteurs à perfusion de fibres creuses

Résumé

Des instructions sont fournies pour installer et utiliser un bioréacteur à fibres creuses en perfusion 3D pour la production de vésicules extracellulaires à partir de MSC et d’autres types cellulaires. Ce protocole décrit une méthode permettant de produire des vésicules extracellulaires à haute concentration de façon continue tout en contrôlant la densité cellulaire dans les bioréacteurs à fibres creuses.

Résumé

Les progrès dans le domaine de la recherche sur les exosomes sont freinés par le faible nombre cellulaire et la faible productivité des exosomes sécrétés dans la culture cellulaire traditionnelle 2D. Les cultures cellulaires à haute densité dans les bioréacteurs à fibres creuses (HFBR) permettent la production continue de biomolécules sécrétées et de vésicules extracellulaires (EV), à partir d’un grand nombre de cellules, sur de longues périodes, à fortes concentrations dans la culture 3D. Ce protocole décrit la collecte d’exosomes concentrés sécrétés tout en maintenant une masse cellulaire optimale et des conditions de culture de perfusion 3D soutenant la croissance cellulaire à haute densité pendant plusieurs semaines ou mois de production continue dans un HFBR commercialement disponible. Le système est compact, fermé, à usage unique, peut être conforme aux cGMP, simple à utiliser et s’adapte à un incubateur standard de CO 2. Certaines cellules, telles que les cellules souches mésenchymates (MSC) et les cellules souches du liquide amniotique humain (HAFSC), peuvent présenter une prolifération réduite dans ces conditions, ce qui peut influencer la différenciation et le phénotype au fil du temps. Les résultats représentatifs démontrent les rendements typiques des EV et la viabilité cellulaire sur plusieurs semaines ou plus de production continue. Cette méthode fournit des récoltes de VE reproductibles et de haute qualité, adaptées à la fois à la recherche et aux applications cliniques.

Introduction

Les vésicules extracellulaires sont de plus en plus reconnues pour leur rôle dans la communication intercellulaire et les applications thérapeutiques, y compris la médecine régénérative. Les méthodes traditionnelles de culture cellulaire 2D sont laborieuses et de rendement limité, nécessitant parfois des centaines de flasques de culture pour obtenir suffisamment de VE pour des expériences ou des études animales ^1,2. L’échelle de la traduction clinique utilise généralement des bioréacteurs traditionnels à bâton utilisant des microporteurs ou d’autres supports. Ces systèmes sont intrinsèquement non physiologiques, inefficaces et peuvent avoir des résultats variables. Les bioréacteurs à fibres creuses offrent un environnement tridimensionnel, basé sur la perfusion, qui soutient les cultures cellulaires à haute densité dans une empreinte compacte et à une échelle potentiellement appropriée pour des applications^{cliniques 3,4}.

Les HFBR offrent un système de culture cellulaire compacte et à haute densité permettant la production continue de VE concentrés avec moins de main-d’œuvre, de temps et d’espace comparés à la culture 2D^{traditionnelle 5}. Ils permettent la réalisation de cultures cellulaires à haute densité dans un espace compact, soutenant la production à grande échelle de VE dans n’importe quel laboratoire. Les HFBR cultivent un grand nombre de cellules (1X10⁹ à 1×10¹⁰) dans un petit volume (20–60 mL), dans un incubateur standard à_CO-2 , et ne nécessitent aucun équipement spécialisé. Ces systèmes permettent des récoltes continues et concentrées de VE sur plusieurs semaines ou mois tout en facilitant l’utilisation de milieux sérumiques ou chimiquement définis à faible intensité. Dans un HFBR, les cellules sont retenues dans le petit volume de l’espace extra-capillaire (ECS) séparé du milieu de recirculation par une membrane fibreuse creuse semi-perméable de seuil moléculaire défini (MWCO) (Figure 1). De petites molécules telles que le glucose et le lactate peuvent facilement traverser les fibres, tandis que des éléments plus gros comme les anticorps ou les vésicules extracellulaires sont retenus et concentrés dans le SEQ, où ils peuvent être prélevés.

Trois caractéristiques fondamentales différencient la culture cellulaire à fibres creuses de toute autre méthode : 1) le rapport surface/volume élevé (200 cm²/mL) permet des densités cellulaires in vivo, 1–2 ×^{10 8}cellules par mL. 2) Les cellules sont liées à un support poreux, et non à une boîte plastique non poreuse. La séparation des cellules n’est pas nécessaire³. La limite de poids moléculaire (MWCO) de la fibre peut être contrôlée. Les produits sécrétés sont conservés et concentrés de 10 à 100 fois comparé à la culture de fioles 2D dans l’ECS de la cartouche. De plus, des matrices protéiques spécifiques, telles que la fibronectine ou le collagène, peuvent être facilement appliquées à la surface de la fibre sans affecter le flux à travers les fibres.

HFBR offre un environnement de culture basé sur la perfusion 3D, plus proche de la culture 2D⁶ et réduit de manière unique la dépendance des cellules au soutien sérique et simplifie leurs besoins en milieu. Cet environnement de culture à haute densité pourrait soutenir des différences dans le traitement des protéines par rapport à la culture 2D, ainsi qu’une bioactivité accrue des EV^{rapportée 7,8,9}. Les bioréacteurs à fibres creuses sont « histocentriques » ; Ils tentent d’imiter les propriétés tissulaires de la physiologie cellulaire^{in vivo 10}. Les deux caractéristiques clés d’un bioréacteur histocentrique sont 1) une forte densité cellulaire, permettant aux cellules de générer leur propre microenvironnement spécifique, et 2) la division ou le passage des cellules n’est pas nécessaire, permettant aux interactions cellulaires et aux structures 3D telles que les sphéroïdes de se développer organiquement au fil du temps. Cette méthode permet d’atteindre des densités cellulaires difficiles à atteindre avec les systèmes de culture 2D conventionnels et peut faciliter l’utilisation de milieux simplifiés, sans protéines et définis chimiquement.

Tout type cellulaire pouvant être cultivé en flasques peut être cultivé dans un bioréacteur à fibres creuses. Les lignées cellulaires transformées seront^{prolifératives 11}. Le paramètre clé à surveiller est le taux d’absorption du glucose. La surveillance du glucose fournit une mesure directe de l’activité métabolique, permettant d’optimiser le moment de la récolte et de contrôler la densité cellulaire¹². Il est important de contrôler la masse cellulaire à l’intérieur de la cartouche afin que le taux d’absorption du glucose ne dépasse pas la capacité du système à délivrer de l’oxygène et à éliminer le^CO2. Cela se fait simplement en retirant la masse cellulaire lors de la prélèvement. Les MSC et HAFSC ne prolifèrent pas dans le bioréacteur à fibres creuses mais restent silencieux. Ces cellules nécessitent une expansion avant d’être ensemencées dans le bioréacteur. Cependant, une fois la culture établie, les VE peuvent être récoltés en continu pendant des semaines ou des mois. Le phénotype MSC ne change pas sur 30 jours de culture, sauf peut-être pour l’expression de CD105, qui diminue pendant cette période. Lorsque les MSC du bioréacteur ont ensuite été plaqués dans un flascon contenant un milieu contenant du sérum, l’expression de CD105 est revenue à des niveaux^{initiaux 13}. L’expression CD105 peut servir de marqueur pour la culture vs. 3D 2D. Les techniques de transfection transitoire peuvent également être utilisées pour fabriquer un¹⁴ transfectant quasi-stable.

Des exemples des conditions de culture cellulaire plus in vivo et des avantages de la culture cellulaire 3D à fibres creuses incluent des modifications post-traductionnelles complètes et uniformes au fil du^{temps 15,16}, la formation de villosités par épithélium gastrique pour la culture de cryptosporidium¹⁷, le^{foie 3D 18}, le modèle 3D de barrière hémato-encéphalique¹⁹, la formation²⁰ du sporozoïte de plasmodium, et la co-culture de la moelle osseuse/cellules^{souches 21}.

Dans le HFBR, les EV sont fortement concentrés, avec une contamination réduite par les protéines intracellulaires et les fragments de membrane, car la lyse cellulaire est limitée. Les bioréacteurs à fibres creuses sont compatibles avec n’importe quel milieu, à condition qu’il n’y ait pas de composants de poids moléculaire élevé qui ne croisent pas les fibres. Si nécessaire, ces grosses molécules peuvent être ajoutées directement au SEC du bioréacteur. Les milieux à haute teneur en glucose, comme le DMEM, sont préférés. Des milieux de culture cellulaire moins complexes et sans protéines peuvent simplifier la purification en réduisant la charge protéique. Des cellules souches mésenchymateuses et des cellules souches du liquide amniotique humain ont été cultivées dans des milieux basaux standards et des FBS, ainsi que dans plusieurs formulations commerciales de milieux MSC. Le HFBR peut produire des quantités de grammes d’exosomes à l’aide de cartouches standard. Un bioréacteur à fibres creuses est une méthode utile pour la production à grande échelle d’exosomes dans des conditions potentielles de cGMP et représente un changement de paradigme dans l’avancement à la fois de la recherche sur les exosomes et de la traduction clinique.

L’utilisation réussie d’un bioréacteur à fibres creuses pour la production de vésicules extracellulaires est très spécifique au protocole. La manipulation du bioréacteur, la densité d’ensemencement cellulaire, la fréquence de récolte et le milieu utilisé peuvent tous contribuer à un fonctionnement réussi du bioréacteur. Ce protocole décrit une méthode standardisée pour utiliser un bioréacteur à fibres creuses afin de produire et collecter des vésicules extracellulaires à partir de cultures cellulaires à haute densité. L’objectif est de fournir une approche reproductible pour la récolte des VE, incluant des conseils sur la mise en place du système, l’inoculation cellulaire, l’entretien de la culture et les procédures de prélèvement. La méthode vise à soutenir une production constante de VE pour des applications de recherche et à fournir un cadre pouvant être adapté à différents types cellulaires et objectifs expérimentaux.

Protocole

Toutes les procédures respectent les recommandations standard de bonnes pratiques de laboratoire (GLP) et de bonnes pratiques en culture cellulaire et tissulaire.

REMARQUE : La cartouche est préassemblée et stérilisée par gamma. Il est doublement emballé, et des capsules Luer sont sur chaque connexion, donc il est complètement scellé et restera stérile à l’extérieur des sacs. Voir la Figure 2 pour l’identification du port de cartouche. Toutes les étapes ont été effectuées à température ambiante dans une hotte à écoulement laminaire.

1. Préparation et stérilisation du Bouchon du Réservoir.

1. Retirez les deux petits tubes de la cartouche double en sac.
2. Fixez le tuyau aux barbes du tuyau sur le tube en acier inoxydable du bouchon du réservoir.
3. Enveloppez les courts tubes et les extrémités exposées des tubes en acier inoxydable avec du papier aluminium pour maintenir la stérilité après l’autoclavage. Placez les composants assemblés dans un sac autoclave.
4. Autoclave en utilisant un cycle sec à 121 °C pendant 15 à 30 minutes. Laissez le bouchon refroidir à température ambiante avant utilisation.

2. Fixez la cartouche de fibre creuse à la bouteille réservoir

1. Transférez 50 mL de PBS d’une bouteille de 1 L dans un tube conique de 50 mL pour une utilisation ultérieure.
2. Retirez le bouchon du réservoir du sac d’autoclave et retirez le papier d’aluminium protecteur des longs tubes en acier.
3. Retirez le bouchon de la bouteille PBS et vissez le bouchon du réservoir à sa place. Retirez la cartouche du sac stérile intérieur.
4. Retirez le papier aluminium d’un des tubes situés en haut du bouchon du réservoir.
5. Retirez le capuchon Luer d’un des longs tubes de la cartouche et fixez-le au tube du réservoir sur le bouchon du réservoir. Utilisez un peu de backspin pour éviter les plis.
6. Répétez pour la deuxième connexion de tube.
7. Pressez doucement le tube marron de la pompe pour faire passer le PBS dans le système jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient éliminées.

3. Remplissage de l’espace capillaire supplémentaire (ECS)

1. Extraire 20 mL de PBS dans une seringue stérile à l’aide d’une aiguille de gros calibre d’au moins 1,5" de long ; Une aiguille émoussée est préférée pour la sécurité.
2. Désinfectez les deux raccords de luer latéraux avec de l’alcool et laissez-les sécher.
3. Fixez la seringue remplie de PBS sur un port latéral et une seringue vide stérile sur l’autre orifice. Fermez les deux ports d’extrémité et ouvrez les deux côtés.
4. Injectez lentement le PBS dans l’ECS tout en tenant la cartouche légèrement inclinée pour minimiser les bulles d’air. La seringue vide sur le port opposé se remplira d’air.
5. Si de l’air est présent dans le SEC, ouvrez le port d’extrémité droit et retirez le liquide dans la seringue vide jusqu’à ce que l’ECS soit rempli de liquide (cela tire le PBS de la bouteille réservoir, à travers les fibres, et dans le SEC).
6. Fermez les deux pinces latérales des coulisses, ouvrez les deux colliers des ports, et vérifiez le débit en comprimant doucement le tube de la pompe avec vos doigts.
7. Laissez les seringues vides fixées aux ports latéraux pour servir de bouchons. Remplacez les seringues par de nouvelles chaque fois qu’elles sont sorties de la hotte à flux laminaire.

4. Revêtement des fibres et inoculation cellulaire

REMARQUE : Les procédures pour recouvrir les fibres avec une protéine matricielle spécifique et pour inoculer les cellules sont essentiellement les mêmes. L’excès de liquide circulera à travers les fibres et pénètre dans le réservoir, tandis que les cellules ou le matériau de revêtement resteront à l’extérieur des fibres dans l’ECS. 1 × 10^{8 cellules pour} l’ensemencement sont recommandées. 100 à 500 μg de protéine matricielle dans 20 mL de PBS sont recommandés pour le HFBR de 4 000^cm2 . Les protéines matricielles liées à la surface des fibres n’affectent pas le MWCO

1. Préparez une solution de revêtement ou une suspension à cellules dans un tube conique stérile de 50 mL. 1 x 108 cellules dans un milieu conditionné par expansion en flasque ou une protéine matricielle de 100–500 ug dans PBS. Volume 20 mL.
2. Retirez 20 mL de cellules ou de solution de revêtement dans une seringue stérile à l’aide d’une aiguille de gros calibre.
3. Fixez la seringue contenant la solution sur un port latéral et une seringue stérile vide sur l’autre port latéral.
4. Fermez les deux ports d’extrémité et ouvrez les deux côtés.
5. Mélangez doucement la solution en transférant le liquide entre les deux seringues. Laissez la moitié de la solution dans chaque seringue. Fermez les deux ports latéraux.
6. Ouvrez la sortie de l’extrémité droite et desserrez le bouchon du réservoir d’un quart de tour.
7. Injectez la solution d’une seringue dans le SEC. Fermez le port latéral attaché.
8. Injectez la solution de l’autre seringue. Fermez le port latéral attaché. Ouvrez les deux ports d’extrémité.
9. Si vous inoculez les cellules, laissez la cartouche en position horizontale pendant 30 minutes à température ambiante, puis tournez de 180° le long de l’axe long et laissez-la reposer 30 minutes supplémentaires.
   1. Si vous enrobez les fibres de protéine matricielle, laissez toute la nuit à température ambiante.
10. Placez la cartouche dans le système de pompe Duet et initiez le débit à 25.

5. Préparation à la récolte (voir Figure 2)

1. Fixez une seringue stérile vide avec un robinet d’arrêt à 3 voies et un filtre stérile sur le port latéral droit.
2. Réglez le robinet d’arrêt à trois voies pour permettre la ventilation à travers le filtre stérile. Fixez une deuxième seringue vide stérile sur le port latéral gauche.

6. Collecte de milieu conditionné (Récolte)

1. Ouvrez la sortie latérale droite et maintenez une ventilation stérile via le filtre.
2. Inclinez l’extrémité droite de la cartouche vers le haut et retirez le milieu conditionné (produit) dans la seringue gauche. Videz complètement le contenu du SEC dans la seringue gauche.
3. Fermez le port droit. Fermez la prise latérale gauche, retirez la seringue et collectez la récolte dans un tube conique de 50 mL.
4. Remplacez la seringue sur le port côté gauche. Ouvre le port gauche. Ouvre le port droit.
   Dévissez le bouchon du réservoir d’un quart de tour.
5. Inclinez l’extrémité gauche de la cartouche vers le haut et remplissez l’ECS en retirant la seringue reliée au port latéral gauche. Remplissez complètement le ECS jusqu’à ce que le ménisque liquide soit au milieu du tube latéral.
6. Fermez le port droit. Ouvrez le port côté droit et réglez le robinet d’arrêt à trois voies pour qu’il ventile par le filtre.
7. Ouvre le port gauche. Inclinez la cartouche vers la droite et videz complètement l’ECS dans la seringue gauche.
8. Ferme le port gauche. Retirez la seringue et collectez le SEC prélevé dans le tube conique de 50 mL.
9. Replacez la seringue dans le port côté gauche. Fermez le port droit. Ouvrez le port de droite
10. Inclinez le côté gauche de la cartouche vers le haut et remplissez l’ECS en retirant la seringue gauche. Remplissez complètement le ECS jusqu’à ce que le ménisque liquide soit au milieu du tube latéral.
11. Ferme le port gauche. Ouvre le port gauche. Serrez le bouchon du réservoir.
12. Confirmez le débit du système en comprimant manuellement le tuyau de la pompe avant de remettre la cartouche dans la pompe Duet.

7. Insérer le bioréacteur dans le système de pompe.

1. Réglez le débit de la pompe à 25 sur la boîte de contrôle. La cartouche est plus facile à installer pendant que la pompe fonctionne.
2. Saisir le bord droit du support du chemin d’écoulement. Faites glisser le tuyau de la pompe dans le tuyau de la pompe.
3. Faites glisser la base du chemin d’écoulement dans la fente de la base de la pompe. Assurez-vous que la bouche rectangulaire s’enclenche dans la découpe du support du chemin d’écoulement.
4. Placez la bouteille du réservoir dans l’endentement sur le côté de la base de la pompe.
5. Le fil fin pour l’alimentation s’insère entre le joint de l’incubateur. La boîte de contrôle possède un aimant pour la fixer sur le côté de l’incubateur.

8. Surveillez le taux de glucose

1. À l’aide d’une pipette de 1 mL, retirez un échantillon de 1 mL de substrat de la bouteille réservoir.
2. Mesurez la concentration de glucose à l’aide d’un glucomètre compatible en déposant une petite goutte de milieu échantillonné sur la bande de test du mesureur.

9. Calcul du taux d’absorption du glucose

REMARQUE : Le taux d’absorption du glucose est calculé en soustrayant la mesure de glucose 24 heures plus tard de la mesure initiale du glucose. Puisque le débit dépend du volume du réservoir, on multiplie la baisse de la concentration de glucose par le volume du réservoir en litres. Par exemple, s’il y a 250 mL dans la bouteille réservoir, multipliez par 0,25 (25 %). (Glucose1-Glucose2) X (bouteille réservoir en litres). 250 mL équivaut à 0,25 L. Si plus d’un jour s’est écoulé, divisez cela par le nombre de jours. Par exemple : Début de la glycémie 4,5 g/L ; mesurer la glycémie 24 h plus tard : 2,7 g/L ; bouteille réservoir : 250 mL. 4,5-2,7=1,8 g. 1,8X,25 (bouteille réservoir de 0,25 L), 0,45 g de glucose consommé. Le taux d’absorption de glucose est de 450 mg/jour.

10. Vérification de viabilité

1. Prélever un petit échantillon de cellules en suivant le protocole de prélèvement.
2. Placez les cellules dans une fiole de culture T 25 avec un milieu sérique frais à 10 %. Évaluez visuellement l’attachement et la viabilité.

11. Entretien quotidien de la cartouche et première semaine de culture.

REMARQUE : Durant la première semaine de culture, les cellules prolifératives vont atteindre leur taux cible de 1 à 2 grammes de glucose consommés par jour.

1. Jour 0 : Inoculer les cellules, déterminer la concentration de glucose à partir de la formulation du milieu. Volume de départ du réservoir : 125 mL.
2. Jours 1-2 : Mesurez le glucose chaque jour. Lorsque le glucose initial est épuisé à 50 %, remplacez le réservoir de 125 mL par un média frais de 250 mL, et réduisez le sérum à 7,5 %.
3. Jours 3-4 : Mesurez le glucose. Lorsque le glucose de départ est épuisé à 50 %, remplacez le réservoir de 250 mL par un milieu frais de 500 mL, et réduisez le sérum à 5 %.
4. Jours 4-5 : Mesurez le glucose. Lorsque la glycémie initiale est épuisée à 50 %, remplacez 500 mL par 1L de substrat frais. Réduisez le sérum à 2,5 % et passez à un milieu chimiquement défini si désiré.
5. Jour 6+ : Mesure du glucose, récolte du SEC. Contrôlez la densité cellulaire en prélevant pour maintenir la prise de glucose entre 1 et 2 grammes par jour.
6. Pour les cellules non prolifératives, commencez par 125 mL dans la bouteille réservoir, puis changez le milieu tous les 3 jours.
7. En cas de consommation significative de glucose, augmentez le réservoir à 250 mL. Retirez le sérum du SEC les jours 3-4 et remplacez-le par un médium basal.

Résultats

En suivant ce protocole, une cartouche² de 4 000 cm ensemencée de lignées cellulaires proliférantes consomme généralement 1 à 2 g de glucose par jour. Cela se traduit par 1 L de milieu tous les 2 à 3 jours lorsqu’on utilise un milieu à haute teneur en glucose comme le DMEM. Les cellules atteignent leur densité maximale dans la semaine suivant la sémination. La récolte doit commencer après 5 à 7 jours ou lorsque le taux d’absorption du glucose atteint 1 g par jour, puis doit être effectuée chaque jour, si possible. Durant cette première semaine de culture, le milieu contenant du sérum dans le SEC peut être remplacé par un milieu basal sans sérum tout en maintenant le sérum dans le milieu circulant, si le sérum est nécessaire. Une fois que le taux d’absorption du glucose atteint 1 g/jour, vous pouvez facilement passer à des milieux séricaux réduits ou à d’autres milieux chimiquement définis. Les MSC et HAFSC consomment le glucose à un rythme bien inférieur à celui des lignées cellulaires transformées, telles que le CHO, le 293 ou les hybridomes. La formation des sphéroïdes est typique du MSC et du HAFSC, ainsi que d’autres types cellulaires (Figure 3). La surveillance quotidienne de la glycémie fournit une mesure fiable de la santé en culture et de l’activité métabolique. Des supports standard et commercialement sans xéno ont été utilisés avec succès avec MSC et HAFSC. Les volumes de récolte sont d’environ 20 mL. Des intervalles de 24 h entre les récoltes sont optimaux lorsque les concentrations de VE atteignent un maximum après 24 h (Figure 4). Les concentrations typiques d’exosomes dans le milieu récolté varient de 1 à 5 × 10¹² particules/mL, selon le type cellulaire, le nombre de semences cellulaires et d’autres facteurs, et peuvent entraîner des granulés visibles après centrifugation (Figure 5). Un grand nombre de cellules peuvent être ensemencés et doivent être basés sur le nombre de cellules, pas sur la surface de culture (Figure 6).

Les résultats démontrent que la production de VE est corrélée à l’activité métabolique mesurée par la consommation de glucose, fournissant un paramètre pratique pour surveiller et optimiser la performance de la culture. La récolte quotidienne à des intervalles de 24 heures maximise la concentration des EV tout en maintenant la stabilité de la culture. Ces résultats soutiennent l’utilisation de la surveillance du glucose et de la fréquence contrôlée de la récolte comme paramètres clés pour la production reproductible de VE dans les bioréacteurs à fibres creuses.

Figure 1 : Coupe transversale du bioréacteur à fibres creuses. Le milieu circule à travers l’intérieur des fibres, et les cellules s’attachent à leur extérieur. Des composants de faible poids moléculaire comme le glucose et le lactate peuvent facilement traverser les fibres. Les produits sécrétés, comme les EV, ne peuvent pas traverser les fibres et deviennent fortement concentrés dans la zone extérieure aux fibres, appelée ECS (espace extracapillaire). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Photo de la cartouche avec des orifices et des pinces identifiés. Les clapets anti-retour unidirectionnels sur le chemin d’écoulement génèrent un flux de recirculation du milieu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Les cellules souches mésenchymateuses, les cellules souches du liquide amniotique humain, les progéniteurs cardiaques et certains autres types cellulaires forment des sphéroïdes lorsqu’ils sont ensemencés dans la cartouche en nombre suffisant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Mesure des concentrations de VE après différentes récoltes à intervalles de temps. Après 24 heures, la concentration de VE atteint un maximum de concentration. La récolte optimale a lieu après 24 heures. (Données fournies par Paolo Neviani, EV core, Children’s Hospital of Los Angeles). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Prélèvement d’une semaine de VE à partir de cellules DIFI cultivées dans le bioréacteur à fibres creuses C2011. Les VE sont isolés par centrifugation différentielle. (données fournies par Jeff Franklin, Université Vanderbilt)^18,19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Un nombre étonnamment important de cellules peut être ensemencé dans le bioréacteur à fibres creuses. Les MSC occupent une grande surface dans la culture 2D ; lorsqu’ils sont cultivés en sphéroïdes dans la culture 3D, ils occupent moins d’espace. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Les bioréacteurs à fibres creuses ne peuvent pas raisonnablement produire des protéines ou des anticorps en quantités commerciales réelles. Cependant, ils ont une capacité unique à cultiver un nombre relativement important de cellules à haute densité et à sécréter un produit VE concentré à une échelle cliniquement pertinente. Ce n’est que ces dernières années que les véritables avantages d’un bioréacteur histocentrique ont été reconnus. Les conditions de culture de perfusion à haute densité aboutissent à des VE concentrés, utilisant un milieu conforme à cGMP, en quantités pouvant convenir à la recherche et à des applications cliniques potentielles. Une seule récolte d’un 4 000^{cm 2} peut contenir 5 × 10¹² à 1 × 10¹⁴ EV dans un volume de 10 à 20 mL. Ces rendements se situent dans la fourchette rapportée dans les études évaluant le dosage de^{VE 22}.

La surveillance quotidienne du taux d’absorption du glucose est un paramètre important pour évaluer la performance des cultures et constitue un indicateur direct du métabolisme cellulaire, du nombre cellulaire et de la santé. En général, les milieux glucosiques plus élevés sont préférés, comme le DMEM, qui a une concentration initiale de glucose de 4,5 g/L. Le milieu doit être remplacé par un milieu frais lorsque le glucose est consommé à 50 %. Certaines cellules, comme les MSC, semblent consommer du glucose et produire du lactate à des concentrations supérieures à 3 g/L, puis passent à la consommation de glutamine et à la production d’ammoniac à des concentrations inférieures à 3 g/L. Un profilage métabolique complet des CMS en culture 3D n’a pas encore été réalisé.

Le paramètre le plus critique pour une culture de bioréacteur réussie est le nombre d’inoculation cellulaire. Un nombre minimum de cellules d’inoculation pour un bioréacteur C2011 de 4 000 cm 2 est de 1 × 10⁸ cellules. Pour les cellules non proliférantes telles que MSC ou HAFSC, un nombre plus élevé est préféré, jusqu’à 1 × 10⁹ cellules au total. Le volume du réservoir doit être proportionnel au nombre de cellules dans la cartouche. 1 × 10^{8 cellules doivent} utiliser un réservoir d’au plus 125 ml. 1 × 10^{9 cellules doivent} avoir un réservoir ne dépassant pas 1 L. Un réservoir trop grand peut entraîner les cellules en phase de décalage. Cela se caractérise par une absence de consommation de glucose par les cellules, même si elles sont viables selon la coloration au bleu de Trypan. Dans ce cas, réduisez le volume du réservoir ou ensemencez davantage de cellules. Des inoculations multiples peuvent être nécessaires pour obtenir un nombre suffisant de cellules nécessaires à une culture bioréactrice efficace. Il suffit de semer plus de cellules au-dessus de celles déjà présentes dans la cartouche. Lors de l’évaluation des performances du bioréacteur, notez la taille de l’inoculum cellulaire. Une augmentation de 10 fois le sement des cellules peut entraîner une production de VE 10 fois supérieure.

Les modifications du protocole peuvent inclure des modifications des formulations du milieu, des revêtements de surface, du nombre de cellules, du volume de récolte, de la fréquence de la récolte ou de la taille de la seringue, selon le type de cellule et le rendement souhaité. La culture continue permet une optimisation facile des conditions en temps réel, car des modifications peuvent être effectuées pendant la culture et les résultats sont obtenus en^{temps réel 21}. Le dépannage doit se concentrer sur le maintien de la stérilité et la surveillance de l’activité métabolique. Assurez-vous qu’il n’y a pas de blocages ni de pli dans le tube, surtout autour des pinces cullissantes. La contamination bactérienne entraîne une consommation rapide de glucose et une opacité dans la bouteille réservoir. La contamination fongique est indiquée par une accumulation blanche et duveteuse à l’extrémité gauche de la cartouche, bloquant le flux. L’utilisation du système de bioréacteur à fibres creuses nécessite une manipulation habile et un respect strict des protocoles. Les étapes cruciales incluent l’ensemencement du nombre exact de cellules, le maintien de la stérilité pendant la récolte et la surveillance attentive de la consommation de glucose pour éviter la surcroissance ou la diminution des nutriments. La plupart des cellules s’attachent aux fibres, parfois en dépendant de la matrice protéique recouverte de fibronectine, qui facilite l’attachement rapide des cellules. Certaines cellules, telles que les MSC, les HAFSC et les progéniteurs cardiaques, restent attachées aux fibres et forment des sphéroïdes 3D.

Le système HFBR supporte des cultures à haute densité, définies chimiquement et sans xéno de la plupart des types cellulaires, facilitant la production à grande échelle de^{VE 23}. La surveillance quotidienne du glucose fournit un indicateur fiable de la performance du bioréacteur. Le système fermé, basé sur la perfusion, est compatible avec les normes cGMP, et une mise en gamme est possible avec des cartouches plus grandes ou même plusieurs cartouches. La production de VE à l’échelle de gramme peut être possible dans des conditions optimisées. Le bioréacteur à fibres creuses offre une plateforme reproductible pour la production et la collecte soutenues de VE dans des conditions contrôlées. Le protocole décrit ici met l’accent sur des considérations pratiques, notamment la mise en place du système, la manipulation aseptique et la surveillance métabolique, afin de soutenir un fonctionnement cohérent et des résultats fiables. Des études supplémentaires pourraient être nécessaires pour évaluer les caractéristiques et les propriétés fonctionnelles des VE sous différentes conditions de culture et pour comparer les performances avec des systèmes de production alternatifs.

Cette méthode est largement applicable à la recherche et à la production clinique de VE, y compris la médecine régénérative et les applications thérapeutiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
16 gauge 1.5" needle	Stellar Scientific	SOLM-111615
3-way stopcock, sterile	Cole-Parmer	UX-48523-28
20mL luer lock syringe	Becton Dickenson	302830
25mL serological pipette, sterile	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25mm syringe filter, sterile	Thomas Scientific	1162B74
38 mm reservoir cap	FiberCell Systems	A1006
50 mL conical centrifuge tubes	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 mL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS Sterile Alcohol Prep Pads, 480 CT	CVS Pharmacy	Item # 376560
Hollow fiber bioreactor	FiberCell Systems	C2011
Human Fibronectin, 1 mg	Corning	354008