Cette étude a examiné si l'acupotomie favorise la réparation du cartilage dans un modèle de lapin d'arthrose du genou. Cinquante lapins ont été répartis en cinq groupes. Une acupotomie a été administrée une fois par semaine pendant 4 semaines. Des évaluations de l'œdème articulaire, de l'histopathologie, des cytokines inflammatoires et des marqueurs liés à l'axe circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK ont été réalisées afin d'explorer le mécanisme sous-jacent.
Article de recherche
L'acupotomie régule l'axe RIC8A/P38 MAPK via l'échafaudage d'un circRNA pour favoriser la réparation du cartilage dans l'arthrose du genou
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'arthrose du genou (AG) se caractérise par une dégénérescence progressive du cartilage et une inflammation. Cette étude a examiné les effets thérapeutiques de l'acupotomie dans un modèle de lapin d'arthrose du genou et son association avec l'axe de signalisation ARN circulaire de la phosphodiestérase 4B (circPDE4B)/résistance aux inhibiteurs de la cholinestérase 8A (RIC8A)/kinase des protéines activée par le mitogène p38 (MAPK). Cinquante lapins blancs de Nouvelle-Zélande ont été répartis aléatoirement en cinq groupes (n = 10 par groupe) : contrôle, modèle d'arthrose du genou, célécoxib, acupotomie et acupotomie factice. L'arthrose du genou a été induite selon la méthode modifiée de Videman. À partir de la sixième semaine après l'induction du modèle, l'acupotomie a été administrée une fois par semaine pendant 4 semaines, tandis que le célécoxib a été administré quotidiennement par gavage à une dose de 24 mg/kg pendant 4 semaines. Le gonflement du genou et l'histopathologie du cartilage ont été évalués. Les concentrations d'interleukine-1β (IL-1β), de facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) et d'interleukine-6 (IL-6) dans les homogénats de tissu cartilagineux ont été mesurées par dosage immunoenzymatique. L'expression génique et protéique associée au métabolisme du cartilage et à l'axe circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK a été évaluée par transcription inverse quantitative suivie de la réaction en chaîne par polymérase et par immunobuvardage. Par rapport au groupe modèle d'arthrose du genou, l'acupotomie a réduit le gonflement du genou, amélioré les scores histopathologiques, diminué les niveaux de cytokines inflammatoires, réduit l'expression de la métalloprotéinase-3 (MMP-3), de la métalloprotéinase-13 (MMP-13), de RIC8A et de la p38 MAPK phosphorylée, et augmenté l'expression du facteur de transcription SRY-box 9 (SOX9), de l'aggrecane et du circPDE4B relatif. Ses effets étaient comparables à ceux du célécoxib, tandis que l'acupotomie factice n'a produit aucune amélioration significative. Ces résultats indiquent que l'acupotomie atténue l'inflammation et la dégénérescence du cartilage dans l'arthrose du genou chez le lapin et qu'elle est associée à une modulation de l'axe circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK.
Introduction
L'arthrose du genou (AG) est une maladie articulaire dégénérative fréquente caractérisée par une dégradation progressive du cartilage, une inflammation synoviale, une sclérose osseuse sous-chondrale et la formation d'ostéophytes1,2,3. Avec le vieillissement de la population mondiale, l'incidence de l'AG continue d'augmenter, en faisant une cause majeure de dysfonction articulaire et de douleur chronique chez les adultes d'âge moyen et les personnes âgées à travers le monde4,5,6. Les traitements cliniques actuels se concentrent principalement sur le soulagement symptomatique à l'aide d'agents pharmacologiques, tels que les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et les injections intra-articulaires de corticostéroïdes. Toutefois, les thérapies modifiant l'évolution de la maladie, capables d'arrêter sa progression ou de favoriser la réparation du cartilage, restent limitées7,8.
Des preuves émergentes ont mis en évidence les rôles régulateurs importants des ARN non codants (ncRNA) dans la pathogenèse et la progression de l'arthrose du genou (KOA)9,10,11. Parmi ces ncRNA, les ARN circulaires (circRNA) ont suscité un intérêt croissant en raison de leur structure en boucle fermée covalente unique, qui leur confère une stabilité supérieure à celle des ARN linéaires, ainsi que de leurs fonctions biologiques diverses12,13. Shen et al. ont rapporté que circPDE4B agit comme un échafaudage moléculaire régulant la résistance aux inhibiteurs de la voie de signalisation de la protéine kinase activée par un mitogène p38 (MAPK) de la résistance à la cholinestérase 8A (RIC8A), influençant ainsi le métabolisme de la matrice extracellulaire et les réponses inflammatoires des chondrocytes14. La voie RIC8A/p38 MAPK joue un rôle important dans la régulation de l'inflammation, du catabolisme, de l'apoptose et de la sénescence dans les chondrocytes, tous des processus contribuant à la pathogenèse de l'arthrose15.
L'acupotomie est une approche thérapeutique peu invasive qui associe la théorie de la médecine traditionnelle chinoise à des principes anatomiques modernes et qui a montré une efficacité prometteuse dans la prise en charge clinique de l'arthrose du genou16,17. Cette technique utilise un dispositif spécialisé en forme d'aiguille-lame pour libérer les adhérences des tissus mous, améliorer la circulation locale et rétablir l'équilibre biomécanique autour des articulations atteintes, atténuant ainsi la douleur et améliorant la fonction chez les patients souffrant d'arthrose du genou18. Malgré ces bénéfices cliniques rapportés, les mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets thérapeutiques de l'acupotomie, en particulier sa régulation potentielle des voies de signalisation médiées par les circARN impliquées dans la réparation du cartilage, restent largement inexplorés.
D'un point de vue mécanistique, l'acupotomie génère des stimuli mécaniques locaux par la libération des tissus mous périarticulaires. Les chondrocytes sont des cellules mécanosensibles qui répondent à des signaux biomécaniques, et l'on a montré que les circARN participent aux réponses de mécanotransduction des chondrocytes19,20. Bien qu'il manque des preuves directes reliant l'acupotomie à la régulation de circARN spécifiques du cartilage articulaire, il est biologiquement plausible que les signaux mécaniques générés par l'acupotomie puissent moduler des circARN mécanosensibles tels que circPDE4B. Cette hypothèse a constitué la base de la présente étude.
En s'appuyant sur des résultats antérieurs concernant le rôle régulateur de la circPDE4B dans l'axe de signalisation RIC8A/p38 MAPK, la présente étude a utilisé un modèle de lapin d'arthrose du genou induite par la méthode modifiée de Videman afin de tester l'hypothèse selon laquelle l'acupotomie favorise la réparation du cartilage en modulant la voie de signalisation circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK. L'acupotomie a été choisie pour cette étude plutôt que d'autres interventions pour l'arthrose du genou pour plusieurs raisons. Premièrement, par rapport aux agents pharmacologiques tels que les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et le célécoxib, qui offrent principalement un soulagement symptomatique et dont les effets modificateurs de la maladie sont limités avec des événements indésirables à long terme possibles7,8, l'acupotomie constitue une approche non pharmacologique qui agit à la fois sur les facteurs mécaniques locaux et sur les voies de signalisation biologiques. Deuxièmement, contrairement aux injections intra-articulaires de corticostéroïdes ou d'acide hyaluronique, qui nécessitent des administrations répétées et présentent des risques d'infection et de lésions articulaires, l'acupotomie cible les tissus mous périarticulaires et peut exercer des effets biomécaniques et biochimiques durables21. Troisièmement, des preuves cliniques ont démontré que l'acupotomie produit des résultats comparables, voire supérieurs, aux thérapies conventionnelles en réduisant la douleur et en améliorant la fonction articulaire chez les patients souffrant d'arthrose du genou, et des études expérimentales ont suggéré que l'acupotomie module les réponses inflammatoires et le métabolisme des chondrocytes21,22. Toutefois, les voies moléculaires spécifiques par lesquelles l'acupotomie exerce ses effets chondroprotecteurs restent mal caractérisées, en particulier en ce qui concerne la signalisation médiée par les circARN. Ainsi, l'étude de l'association entre l'acupotomie et l'axe circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK pourrait fournir de nouvelles perspectives mécanistiques et appuyer l'utilisation de l'acupotomie comme intervention modifiant la maladie dans l'arthrose du genou16,18. Les critères d'évaluation principaux étaient le gonflement de l'articulation du genou, la dégénérescence histopathologique du cartilage (scores de Mankin et de Moran), les niveaux de cytokines inflammatoires (interleukine-1β, facteur de nécrose tumorale-α et interleukine-6), l'expression de marqueurs liés au métabolisme du cartilage (métalloprotéinase de la matrice-3, métalloprotéinase de la matrice-13, facteur de transcription SRY-box 9 et aggrecane), ainsi que l'expression de la circPDE4B et de RIC8A, et la phosphorylation du p38 MAPK. L'acupotomie a été administrée une fois par semaine pendant 4 semaines aux points périarticulaires sélectionnés selon la technique en quatre étapes (libération longitudinale, séparation transversale et incision des nodules). L'évaluation histopathologique, la mesure des cytokines inflammatoires et les analyses d'expression génique et protéique ont été utilisées pour caractériser les effets de l'acupotomie et explorer sa base moléculaire potentielle dans l'arthrose du genou.
Protocole
Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles relatives aux soins et à l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité d'éthique animal d'Anhui University of Chinese Medicine (numéro d'approbation : AHUCM-rabbits-2023195). Les réactifs, produits chimiques, logiciels et outils utilisés dans ce protocole sont listés dans le Tableau des matériaux.
1. Animaux expérimentaux et regroupement
Cinquante lapins mâles adultes en bonne santé de race New Zealand White (âgés de 6 mois, pesant entre 2,0 et 2,5 kg) ont été obtenus auprès de la ferme d'élevage Laifu du district de Pukou à Nanjing (licence de production d'animaux : SCXK (Su) 2024-0007). Tous les animaux ont subi une période d'acclimatation de 1 semaine avant l'expérience. Le genou droit a été désigné pour l'évaluation de l'œdème et le genou gauche pour la collecte de tissu cartilagineux, conformément à une convention procédurale constante, et non en fonction d'une hypothèse expérimentale précise. Après l'acclimatation, les lapins ont été répartis aléatoirement en cinq groupes (n = 10 par groupe) : un groupe témoin, qui n'a reçu ni procédure de modélisation ni traitement ; un groupe modèle de l'arthrose du genou (KOA), dans lequel la KOA a été induite selon la méthode modifiée de Videman ; un groupe célocoxib, dans lequel un traitement médicamenteux a été initié 6 semaines après la modélisation ; un groupe acupotomie, dans lequel un traitement par acupotomie a été initié 6 semaines après la modélisation ; et un groupe faux traitement par acupotomie (sham acupotomie), dans lequel une insertion d'aiguille sans section ni relâchement a été effectuée 6 semaines après la modélisation.
2. Établissement du modèle d'arthrose du genou (KOA)
Tous les lapins, à l'exception de ceux du groupe témoin, ont subi la procédure modifiée de Videman afin d'induire une arthrose du genou (KOA). Les animaux ont été privés de nourriture pendant 12 h avant l'intervention chirurgicale. L'anesthésie a été induite par administration intraveineuse de pentobarbital sodique à 3 % à une dose de 30 mg/kg par la veine marginale de l'oreille. Après la préparation habituelle du site chirurgical, la désinfection et le drapage stérile, une incision longitudinale a été pratiquée le long de la face médiale de l'articulation du genou. Le ligament collatéral médial et le ligament croisé antérieur ont été sectionnés séquentiellement, et le ménisque médial a été entièrement retiré. L'incision a ensuite été fermée par plans successifs.
Afin de réduire le risque d'infection postopératoire, de la pénicilline a été administrée par voie intramusculaire à raison de 40 000 U/kg/jour pendant 3 jours consécutifs. Après la chirurgie, les lapins ont été replacés dans leurs cages et ont pu se déplacer librement, sans immobilisation articulaire.
3. Traitement faux acupotomie
Six semaines après la modélisation de l'arthrose du genou, les lapins du groupe faux acupotomie ont subi les mêmes procédures de palpation et de repérage des points que celles utilisées pour le traitement actif par acupotomie. Une aiguille stérile jetable d'acupotomie de 0,35 mm × 25 mm a été insérée perpendiculairement à travers la peau en chaque point repéré jusqu'à atteindre le tissu sous-cutané. Aucune coupe, aucun relâchement, aucune manipulation transversale ni aucune autre manœuvre mécanique de libération n'a été effectuée. L'aiguille a été retirée immédiatement après son insertion, sans manipulation tissulaire. Le traitement factice a été administré une fois par semaine pendant 4 semaines consécutives.
4. Traitement par acupotomie
Six semaines après la modélisation de l'arthrose du genou, les lapins du groupe acupotomie étaient immobilisés sur une table de traitement. Les tissus périarticulaires autour du genou affecté étaient palpés, en particulier autour de la rotule et des espaces articulaires médial et latéral, afin d'identifier des structures en forme de cordons ou des nodules durs. De quatre à six points de traitement étaient sélectionnés selon les résultats de la palpation et marqués sur la peau.
La zone à traiter a été rasée et désinfectée selon les procédures stériles habituelles. Une aiguille jetable stérile pour acuponcture mesurant 0,35 mm × 25 mm a été insérée lentement et perpendiculairement à chaque point marqué jusqu’à atteinte de la surface osseuse. La procédure a été réalisée selon la technique en quatre étapes de l’acuponcture. Une libération longitudinale a d’abord été effectuée, suivie d’une séparation transversale. Lorsqu’un nodule dur était rencontré, il était incisé jusqu’à ce qu’une sensation nette de relâchement soit perçue à travers le couteau-aiguille. À la fin de la procédure, l’aiguille a été retirée, et chaque site d’insertion a été comprimé brièvement avec un pansement stérile puis recouvert d’un pansement adhésif. Le traitement a été administré une fois par semaine pendant quatre semaines consécutives.
5. Traitement médicamenteux
À 6 semaines après la modélisation de l'arthrose du genou, les lapins du groupe cécoxib ont reçu une suspension de cécoxib par gavage oral à 24 mg/kg une fois par jour pendant 4 semaines consécutives. La suspension était préparée quotidiennement à neuf dans du sérum physiologique. Les informations concernant le fournisseur et le numéro de catalogue sont indiquées dans le tableau des matériaux.
6. Évaluation du gonflement de l'articulation du genou
À la fin de la période d'intervention, correspondant à 10 semaines après la modélisation de l'arthrose du genou (KOA), le gonflement de l'articulation du genou a été évalué. Un fil de soie souple a été enroulé autour de la région la plus gonflée du genou droit, généralement au niveau du plateau tibial. Le fil a ensuite été retiré et sa longueur mesurée au millimètre près à l’aide d’une règle ; cette longueur mesurée a été définie comme la circonférence du genou.
Le rapport de gonflement relatif a été calculé à l'aide de l'équation suivante :
7. Prélèvement des échantillons
À la fin de la période d'intervention, les lapins ont été anesthésiés par administration intraveineuse de pentobarbital sodique à 3 % à raison de 30 mg/kg par la veine marginale de l'oreille. L'articulation du genou gauche a été ouverte à l'aide d'une lame de scalpel n°23 afin d'exposer les surfaces articulaires du plateau tibial et des condyles fémoraux. Le tissu cartilagineux articulaire a été prélevé à partir de ces régions.
Chaque échantillon de cartilage a été divisé en deux parties. Une partie a été fixée dans du paraformaldéhyde à 4 % pour un examen histopathologique. La seconde partie a été placée dans des tubes cryogéniques, rapidement congelée dans l'azote liquide et conservée à −80 °C jusqu'à ce que les analyses moléculaires soient effectuées. Immédiatement après la fin de toutes les procédures de collecte des tissus, les lapins ont été euthanasiés par embolie aérique via une injection intraveineuse rapide d'air par la veine marginale de l'oreille.
Les colorations histologiques ainsi que les évaluations selon les scores de Mankin et de Moran ont été réalisées à l'aide d'échantillons de cartilage provenant des 10 lapins de chaque groupe (n = 10). Des images représentatives après coloration par hématoxyline-éosine et par Safranin O–vert Fast ont été sélectionnées parmi trois lapins choisis aléatoirement dans chaque groupe. L'immunohistochimie et le Western blot ont été effectués à partir d'échantillons de trois lapins sélectionnés aléatoirement par groupe (n = 3). La réaction de transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase et le dosage immunoenzymatique (ELISA) ont été réalisés à l'aide d'échantillons de six lapins choisis aléatoirement par groupe (n = 6). Toutes les sélections de sous-ensembles ont été effectuées aléatoirement, sans connaissance préalable de l'affectation aux groupes.
8. Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine
Le tissu cartilagineux fixé dans du paraformaldéhyde à 4 % a été décalcifié dans une solution d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 10 % à pH 7,4 pendant 4 à 6 semaines. La solution de décalcification a été renouvelée tous les 3 jours. Après confirmation de la décalcification par pénétration à l'aiguille, le tissu a été déshydraté à l'aide d'une série d'éthanol à concentrations croissantes (70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 %), clarifié dans le xylène, puis inclus dans la paraffine. Le tissu inclus a été coupé en sections de 5 µm d'épaisseur à l'aide d'un microtome, et les sections ont été montées sur des lames de verre.
Pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine, les sections ont été chauffées à 60 °C pendant 60 min, déparaffinisées dans le xylène par trois bains de 5 min chacun, puis réhydratées successivement dans de l'éthanol à 100 %, 95 %, 80 % et 70 %, suivis d'eau distillée. Les sections ont été colorées à l'hématoxyline pendant 5 min, rincées sous eau courante pendant 10 min, différenciées dans de l'acide chlorhydrique à 1 % préparé dans de l'éthanol à 70 % pendant 2 à 3 s, puis rincées à l'eau distillée. Ensuite, les sections ont été colorées à l'éosine pendant 2 min, rincées à l'eau distillée, déshydratées par passage dans de l'éthanol à 70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 %, clarifiées dans le xylène, puis montées avec une résine neutre. La morphologie du cartilage a été examinée et des images représentatives ont été acquises à l'aide d'un microscope optique.
9. Coloration à la safranine O–vert rapide
Les sections de cartilage incluses dans le paraffine ont été déparaffinisées et réhydratées comme décrit à la section 8. Les sections ont été colorées avec de l'hémat oxyline de Weigert au fer pendant 5 min, puis rincées à l'eau distillée. Ensuite, les sections ont été colorées avec une solution de vert rapide à 0,05 % pendant 3 min, rincées brièvement dans de l'acide acétique à 1 % pendant 10 à 15 s, puis colorées avec une solution de safranine O à 0,1 % pendant 5 min.
Après la coloration, les sections ont été rapidement déshydratées dans de l'éthanol à 95 % et à 100 %, clarifiées dans le xylène, puis montées avec une résine neutre. Les sections colorées ont été examinées au microscope optique. L'intensité de la coloration au Safranin O, qui reflète la teneur en protéoglycanes, a été analysée de façon semi-quantitative à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images.
10. Score histologique
Deux pathologistes, ignorant des attributions aux groupes expérimentaux, ont évalué indépendamment les sections colorées à l'aide des systèmes de score de Mankin et de Moran afin d'apprécier le degré de dégénérescence du cartilage. Avant l'évaluation, toutes les sections se sont vu attribuer des codes d'identification aléatoires. Les attributions de traitement n'ont pas été divulguées aux pathologistes avant l'achèvement complet de la notation23.
11. Dosage immunoenzymatique
Le tissu cartilagineux congelé a été pesé, mélangé avec du tampon salin phosphate à pH 7,4 et homogénéisé soigneusement sur de la glace. L'homogénat a été centrifugé à 3 000 × g pendant 20 min à 4 °C, puis le surnageant a été recueilli pour analyse. Les concentrations d'interleukine-1β (IL-1β), de facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) et d'interleukine-6 (IL-6) dans le surnageant tissulaire ont été mesurées à l'aide de kits de dosage immunoenzymatique spécifiques aux lapins, conformément aux instructions du fabricant.
12. Réaction de transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase
L'ARN total a été extrait du tissu cartilagineux à l'aide d'une méthode basée sur le phénol–chloroforme. Brièvement, le tissu a été lysé dans un réactif d'extraction d'ARN, puis du chloroforme a été ajouté afin de séparer les phases aqueuse et organique. La phase aqueuse a été récupérée, et l'ARN a été précipité à l'isopropanol, lavé à l'éthanol 75 %, séché à l'air, puis dissous dans de l'eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle. La concentration et la pureté de l'ARN ont été mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre.
Avant la transcription inverse, l'ADN génomique résiduel a été éliminé à l'aide d'un réactif d'élimination de l'ADN génomique. L'ADN complémentaire a ensuite été synthétisé à l'aide d'un kit de transcription inverse conformément aux instructions du fabricant. Une réaction de polymérisation en chaîne quantitative a été réalisée en utilisant une méthode de détection basée sur le SYBR Green sur un système de réaction de polymérisation en chaîne en temps réel. Les conditions de cyclage étaient les suivantes : une dénaturation initiale à 95 °C pendant 1 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 20 s et d'hybridation et d'élongation à 60 °C pendant 1 min. Une analyse de courbe de dissociation a été effectuée pour évaluer la spécificité de l'amplification.
Les niveaux d'expression de la métalloprotéinase matricielle-3 (MMP-3), de la métalloprotéinase matricielle-13 (MMP-13), du facteur de transcription SRY-box 9 (SOX9), de l'aggrecane, de RIC8A et de circPDE4B ont été mesurés. β-actin a été utilisée comme gène de référence interne. L'expression relative a été calculée à l'aide de la méthode. Les séquences des amorces sont indiquées dans Tableau 1.
13. Analyse par immunoblotting
Le tissu cartilagineux a été lysé dans un tampon d'essai de radioimmunoprécipitation enrichi en phénylméthylsulfonylfluorure. Le lysat a été centrifugé à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C, et le surnageant a été récupéré comme fraction totale de protéines. La concentration en protéines a été déterminée à l'aide d'un dosage à l'acide bichinconinique.
Des quantités égales de protéines (30 µg par piste) ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium à 10 % et transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène préalablement activées dans le méthanol. Le transfert a été effectué à 300 mA et à 4 °C. Les durées de transfert étaient les suivantes : aggrecan (250 kDa) pendant 90 min ; MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa) et MMP-13 (52 kDa) pendant 50 min ; et p38 MAPK (41 kDa) et GAPDH (36 kDa) pendant 40 min. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé en poudre dans une solution tampon Tris contenant du Tween 20, pendant 2 h à température ambiante. Les membranes ont ensuite été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre MMP-3 (1:2 000), MMP-13 (1:1 000), SOX9 (1:1 000), aggrecan (1:1 000), RIC8A (1:1 500), la p38 MAPK phosphorylée (1:1 000) et la p38 MAPK totale (1:2 000). GAPDH (1:2 000) a été utilisé comme témoin de chargement. Après trois lavages avec la solution tampon Tris contenant du Tween 20 (10 min chacun), les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (1:20 000) pendant 1,2 h à température ambiante. Après trois lavages supplémentaires, les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat de chimiluminescence amplifiée et analysées à l’aide d’un système de documentation d’images. L’intensité des bandes a été quantifiée à l’aide du logiciel ImageJ et normalisée par rapport à GAPDH.
14. Immunohistochimie
Les sections de cartilage incluses en paraffine ont été désparaffinées et réhydratées à l’aide d’une série d’éthanol à concentration décroissante (trois bains de xylène, 5 min chacun ; puis 100 %, 95 % et 80 % d’éthanol, 3 min chacun). La récupération des antigènes a été réalisée en chauffant les sections dans un tampon EDTA (pH 9,0) dans une cocotte-minute. Le tampon a été porté à ébullition, puis, après pressurisation, la récupération a été poursuivie pendant 2 min, suivie d’un refroidissement à température ambiante. L’activité peroxydasique endogène a été bloquée à l’aide de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 min à température ambiante. Après lavage, la liaison non spécifique a été bloquée à l’aide de sérum de chèvre pendant 20 min à température ambiante, à l’abri de la lumière.
Les sections ont été incubées avec des anticorps primaires dirigés contre la p38 MAPK phosphorylée (1:800) et le facteur nucléaire kappa B (NF-κB) phosphorylé (1:300) pendant 60 min à 37 °C. Après trois lavages avec du tampon salin phosphate contenant du Tween 20, les sections ont été incubées avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort appropriés pendant 30 min à 37 °C. Après trois autres lavages, la diaminobenzidine a été utilisée pour le développement de la couleur (contrôlé au microscope), suivi d'une contre-coloration à l'hématoxyline (2 min), d'une différenciation dans de l'acide chlorhydrique à 1 % dans de l'éthanol à 70 %, et d'une bleuissure dans une solution de carbonate de lithium (30 s). Les sections ont ensuite été déshydratées, clarifiées, montées et examinées au microscope optique. La coloration a été évaluée à l'aide du logiciel ImageJ, et la densité optique intégrée a été calculée pour une analyse semi-quantitative.
15. Analyse statistique
Les données sont exprimées comme moyenne ± erreur type de la moyenne (ETM). Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été effectuées à l'aide d'une analyse de variance à un facteur suivie du test a posteriori de Tukey. Une valeur de P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
Résultats
L'acupotomie atténue les altérations histologiques du cartilage articulaire
Comme illustré sur la Figure 1A,B, la circonférence du genou et le ratio relatif de gonflement étaient significativement augmentés dans le groupe modèle d'arthrose du genou (KOA) par rapport au groupe témoin. Ces deux paramètres étaient significativement réduits après traitement par acupotomie ou célécoxib, tandis que l'acupotomie factice ne produisait aucune amélioration significative par rapport au groupe modèle de KOA.
Comme illustré aux figures 1C et 1D, le score de Mankin était significativement plus élevé dans le groupe modèle de l'arthrose du genou (KOA) que dans le groupe témoin, et était significativement réduit après traitement par l'acuponcture ou le célécoxib. Aucune réduction significative n'a été observée dans le groupe acuponcture factice. Le score de Moran présentait un profil inverse.
Les colorations à l'hématoxyline-éosine et au safran O–vert rapide ont révélé un amincissement et une discontinuité de la surface du cartilage articulaire, accompagnés d'érosions localisées, dans le groupe modèle d'arthrose du genou (KOA) par rapport au groupe témoin (Figure 1E,F). L'acuponcture chirurgicale et le célécoxib ont atténué ces modifications pathologiques, comme en témoignent des contours du cartilage plus nets et une réduction des lésions structurelles. En revanche, le groupe soumis à une acuponcture chirurgicale factice présentait des caractéristiques pathologiques similaires à celles du groupe modèle de KOA. Ces résultats indiquent que l'acuponcture chirurgicale a produit des effets comparables à ceux du célécoxib pour réduire le gonflement articulaire et la dégénérescence du cartilage, ainsi que pour améliorer les scores histologiques dans le modèle de KOA.
L'acupotomie réduit les niveaux de cytokines inflammatoires
Comme illustré à la Figure 2A–C, les concentrations d'interleukine-1β (IL-1β), de facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) et d'interleukine-6 (IL-6) dans les homogénats de tissu cartilagineux étaient significativement plus élevées dans le groupe modèle de l'arthrose du genou (KOA) que dans le groupe témoin. Le traitement par acupotomie ou célécoxib a réduit de manière significative les niveaux des trois cytokines inflammatoires. En revanche, le groupe soumis à la fausse acupotomie n'a montré aucune réduction significative par rapport au groupe modèle de KOA.
L'acupotomie module la voie de signalisation RIC8A/p38 MAPK au niveau protéique
L'analyse immunohistochimique a montré que l'expression de la protéine kinase activée par un mitogène p38 phosphorylée (p-p38 MAPK) et du facteur nucléaire kappa B phosphorylé (NF-κB) était significativement plus faible dans les groupes traités par acupotomie et célécoxib par rapport au groupe modèle d'arthrose du genou (KOA) (Figure 3A). Aucune différence significative n'a été observée entre les groupes soumis à une acupotomie factice et le groupe modèle KOA.
L'analyse par immunobuvardage a montré que les niveaux protéiques de la métalloprotéinase matricielle-3 (MMP-3), de la métalloprotéinase matricielle-13 (MMP-13), de la résistance aux inhibiteurs de la cholinestérase 8A (RIC8A) et de la p-p38 MAPK étaient significativement plus élevés dans le groupe modèle de l'arthrose du genou (KOA) que dans le groupe témoin, tandis que les niveaux des protéines liées à la synthèse du cartilage, le facteur de transcription SRY-box 9 (SOX9) et l'aggrecan, étaient significativement plus faibles. Par rapport au groupe modèle de KOA, les groupes acupotomie et célécoxib présentaient une expression réduite de MMP-3, MMP-13, RIC8A et p-p38 MAPK, ainsi qu'une expression accrue de SOX9 et d'aggrecan. Le groupe faux acupotomie présentait des profils d'expression protéique similaires à ceux du groupe modèle de KOA, sans changements significatifs dans les protéines mesurées (Figure 3B–I). Ces résultats indiquent que les effets de l'acupotomie et du célécoxib sur la KOA étaient associés à une modulation de la voie de signalisation RIC8A/p38 MAPK.
L'acupotomie module la voie de signalisation RIC8A/p38 MAPK au niveau transcriptionnel
Comme illustré sur la figure 4A–G, les niveaux d'expression de MMP-3, de MMP-13 et de RIC8A étaient significativement plus élevés dans le groupe modèle de l'arthrose du genou (KOA) que dans le groupe témoin, tandis que l'expression de SOX9 et de l'aggrecane était significativement plus faible. Par rapport au groupe modèle de KOA, l'acupotomie et la célécoxib ont réduit l'expression de MMP-3, de MMP-13 et de RIC8A, et augmenté celle de SOX9 et de l'aggrecane. Le groupe soumis à l'acupotomie factice ne présentait aucune différence significative par rapport au groupe modèle de KOA concernant les niveaux transcriptionnels mesurés.
L'acupotomie a également augmenté l'expression relative de circPDE4B, indiquant que ses effets thérapeutiques étaient associés à une modulation de l'axe de signalisation circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK et à une réduction des signaux inflammatoires et cataboliques.
DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Les données brutes appuyant les résultats de cette étude, y compris les données de ELISA, de coloration H&E, d'immunohistochimie, de RT‑qPCR, de coloration Safranin O–vert Fast et de western blot, sont accessibles librement dans le dépôt Figshare à l'adresse suivante : https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935.
Figure 1. L'acupotomie réduit le gonflement du genou et la dégénérescence du cartilage articulaire chez les lapins atteints d'arthrose du genou. (A) Circonférence du genou. (B) Rapport relatif de gonflement du genou. (C) Score histologique de Mankin. (D) Score histologique de Moran. (E) Sections représentatives colorées à l'hématoxyline et à l'éosine du cartilage articulaire provenant des groupes témoin, modèle d'arthrose du genou (KOA), célécoxib, acupotomie et faux traitement par acupotomie. (F) Sections représentatives colorées au Safranin O–vert rapide provenant des cinq groupes expérimentaux. L'évaluation histologique (scores de Mankin et de Moran) a été réalisée à partir des échantillons provenant des 10 lapins par groupe (n = 10), tandis que les images représentatives des colorations H&E et Safranin O–vert rapide ont été obtenues à partir de 3 lapins sélectionnés au hasard par groupe. Les données sont exprimées comme moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). Les comparaisons statistiques ont été effectuées à l'aide d'une analyse de variance à un facteur suivie du test post hoc de Tukey. Les barres horizontales indiquent les groupes comparés. P < 0,05, P < 0,01 et P < 0,001. Échelles : 100 µm. Abréviations : KOA = arthrose du genou ; SEM = erreur type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 2. L'acupotomie réduit les concentrations des cytokines inflammatoires chez les lapins atteints d'arthrose du genou. (A) Concentration en interlukine-1β. (B) Concentration en interlukine-6. (C) Concentration en facteur de nécrose tumorale-α. Les concentrations des cytokines ont été mesurées par dosage immunoenzymatique à partir d'échantillons prélevés sur six lapins par groupe (n = 6). Les données sont exprimées comme moyenne ± erreur type de la moyenne. Les comparaisons statistiques ont été réalisées à l'aide d'une analyse de variance à un facteur suivie du test a posteriori de Tukey. Les barres horizontales indiquent les groupes comparés. P < 0,05, P < 0,01 et P < 0,001. Abréviations : IL-1β = interlukine-1β ; IL-6 = interlukine-6 ; KOA = arthrose du genou ; SEM = erreur type de la moyenne ; TNF-α = facteur de nécrose tumorale-α. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Figure 3. L'acupotomie module les protéines liées à l'inflammation et au métabolisme du cartilage chez les lapins présentant une arthrose du genou. (A) Images immunohistochimiques représentatives montrant l'expression du facteur nucléaire kappa B phosphorylé et de la protéine kinase activée par un mitogène p38 phosphorylée dans le cartilage articulaire des groupes contrôle, modèle d'arthrose du genou (KOA), célécoxib, acupotomie et faux acupotomie. Échelles, 100 µm. (B) Immunoblottings représentatifs montrant l'expression de SOX9, RIC8A, MMP-13, p38 MAPK phosphorylée, p38 MAPK totale, MMP-3, aggrecane et GAPDH. (C) Quantification densitométrique de l'aggrecane normalisée par rapport à GAPDH. (D) Quantification de MMP-13 normalisée par rapport à GAPDH. (E) Quantification de MMP-3 normalisée par rapport à GAPDH. (F) Quantification de la p38 MAPK totale normalisée par rapport à GAPDH. (G) Quantification de la p38 MAPK phosphorylée normalisée par rapport à GAPDH. (H) Quantification de SOX9 normalisée par rapport à GAPDH. (I) Quantification de RIC8A normalisée par rapport à GAPDH. Les analyses par immunoblotting ont été réalisées à l'aide d'échantillons provenant de trois lapins par groupe (n = 3). Les données sont exprimées comme moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). Les comparaisons statistiques ont été effectuées par une analyse de variance à un facteur suivie du test a posteriori de Tukey. Les barres horizontales indiquent les groupes comparés. P < 0,05, P < 0,01 et P < 0,001. Abréviations : GAPDH = déshydrogénase du glyceraldéhyde-3-phosphate ; KOA = arthrose du genou ; MAPK = protéine kinase activée par un mitogène ; MMP-3 = métalloprotéinase de la matrice-3 ; MMP-13 = métalloprotéinase de la matrice-13 ; NF-κB = facteur nucléaire kappa B ; p-NF-κB = facteur nucléaire kappa B phosphorylé ; p-p38 MAPK = p38 MAPK phosphorylée ; RIC8A = résistance aux inhibiteurs de la cholinestérase 8A ; SEM = erreur type de la moyenne ; SOX9 = facteur de transcription SRY-box 9. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4. L'acupotomie module les transcrits liés au métabolisme du cartilage et l'expression de circPDE4B chez des lapins souffrant d'arthrose du genou. (A) Expression relative de l'aggrecane. (B) Expression relative de MMP-3. (C) Expression relative de MMP-13. (D) Expression relative de p38 MAPK. (E) Expression relative de SOX9. (F) Expression relative de circPDE4B. (G) Expression relative de RIC8A. L'expression a été mesurée par une réaction de transcription inverse quantitative suivie d'une amplification par polymérase en chaîne et normalisée par rapport au gène de référence. Les analyses ont été réalisées à partir d'échantillons provenant de six lapins par groupe (n = 6). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). Les comparaisons statistiques ont été effectuées par une analyse de variance unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey. Les barres horizontales indiquent les groupes comparés. P < 0,05, P < 0,01 et P < 0,001. Abréviations : circPDE4B = ARN circulaire phosphodiestérase 4B ; KOA = arthrose du genou ; MAPK = kinase activée par un mitogène ; MMP-3 = métalloprotéinase matricielle-3 ; MMP-13 = métalloprotéinase matricielle-13 ; RIC8A = résistance aux inhibiteurs de la cholinestérase 8A ; SEM = erreur type de la moyenne ; SOX9 = facteur de transcription SRY-boîte 9. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
| Gène | Taille de l'amplicon | Amorce sens | Amorce antisens |
| (pb) | (5'→3') | (5'→3') | |
| β-actin | 113 | CAGCCCTCCTTCATCGGTAT | GACATGACGTTGTTGGCGTA |
| MMP-3 | 108 | TGTGAGTTGAAGTGGCTCAT | CCTGTTTGAACACCCGTAAC |
| MMP-13 | 119 | GGCTCCTAGGCAAGTACAAT | GTGTACGCCCATCAGGATAA |
| SOX9 | 85 | GGAGGAAGTCGGTGAAGAAT | GCCTTGAAGATGGCGTTG |
| Aggrecan | 70 | TTGATGAGTGCCTTTCAAGC | CATGTGAAAGAGTCGATGGC |
| RIC8A | 100 | ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGC | TCGATGACAGAGTACTGGTTG |
| p38 MAPK | 103 | TGTTCAAGGTCTCCCACAAG | TGCAGCTCCCTTATGATCTG |
| CircPDE4B | 174 | GTCATTTTGCCGAACTCCC | CATTATCATCTGCCGTCACTG |
Tableau 1 : Séquences d'amorces utilisées pour la réaction de transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase. Le tableau recense les gènes cibles, les tailles attendues des amplicons, ainsi que les séquences des amorces sens et antisens dans le sens 5′ à 3′. Abréviations : bp = paires de bases ; circPDE4B = ARN circulaire de la phosphodiestérase 4B ; MAPK = kinase activée par un mitogène ; MMP-3 = métalloprotéinase matricielle-3 ; MMP-13 = métalloprotéinase matricielle-13 ; RIC8A = résistance aux inhibiteurs de la cholinestérase 8A ; SOX9 = facteur de transcription SRY-box 9.
Discussion
Cette étude a évalué les effets thérapeutiques de l'acupotomie dans un modèle de lapin d'arthrose du genou (KOA) et a identifié une association entre l'expression de circPDE4B et l'axe de signalisation de la kinase des protéines activée par le mitogène RIC8A/p38 (MAPK). L'acupotomie a amélioré les gonflements articulaires et les modifications histopathologiques, et a modifié les marqueurs liés à l'inflammation et au métabolisme du cartilage aux niveaux transcriptomique et protéique.
La réduction de l'interleukine-1β, du facteur de nécrose tumorale-α et de l'interleukine-6 après un traitement par acupotomie est conforme aux effets immunomodulateurs précédemment rapportés de l'acupotomie21. Ces cytokines contribuent à la dégénérescence du cartilage en favorisant les enzymes dégradant la matrice et en supprimant la synthèse de la matrice extracellulaire22,24,25. La diminution concomitante des métalloprotéinases matricielles-3 (MMP-3) et métalloprotéinases matricielles-13 (MMP-13) au niveau des transcrits et des protéines suggère en outre que l'acupotomie supprime l'activité catabolique associée à l'arthrose du genou.
Une découverte notable est l'association entre les modifications induites par l'acupotomie de l'expression de circPDE4B et la modulation de la voie RIC8A/p38 MAPK. Une activation anormale de cette voie est associée à l'inflammation, au stress oxydatif et à la dégradation de la matrice extracellulaire. La réduction de l'expression de RIC8A et de la phosphorylation de p38 MAPK après l'acupotomie suggère que le traitement pourrait aider à rétablir un équilibre de la signalisation au sein de cette voie. Les changements coordonnés des marqueurs relatifs à circPDE4B et à la voie RIC8A/p38 MAPK sont compatibles avec l'hypothèse selon laquelle circPDE4B pourrait agir comme un échafaudage moléculaire, comme cela a déjà été proposé26,27. Toutefois, les résultats actuels sont corrélatifs et n'établissent pas que circPDE4B médie les effets thérapeutiques de l'acupotomie. Des études de perte et de gain de fonction sont nécessaires pour déterminer une relation de causalité.
L'association potentielle entre l'acupotomie et la régulation des circARN constitue un aspect important de cette étude. Il a été démontré que la stimulation mécanique influence l'expression des circARN dans plusieurs tissus28,29,30,31. Toutefois, les preuves directes reliant la stimulation mécanique induite par l'acupotomie à la régulation de circARN spécifiques du cartilage articulaire restent limitées. La variation observée de l'expression relative de circPDE4B après traitement pourrait refléter soit une réponse directe à la stimulation mécanique, soit une réponse indirecte à la réduction de l'inflammation. Des études futures combinant une stimulation mécanique contrôlée et une manipulation spécifique des chondrocytes ciblant circPDE4B permettraient de distinguer entre ces deux hypothèses.
L'acupotomie et le célécoxib ont produit des tendances similaires dans de nombreux résultats mesurés, malgré leurs modes d'action distincts. Plusieurs explications peuvent rendre compte de cette convergence. Premièrement, les deux traitements pourraient agir sur des voies communes en aval, notamment l'axe RIC8A/p38 MAPK et la signalisation du facteur nucléaire kappa B. Deuxièmement, les similitudes observées pourraient refléter des caractéristiques communes de la protection du cartilage plutôt que des effets spécifiques à une voie. Troisièmement, les marqueurs sélectionnés pourraient représenter des points terminaux partagés de l'inflammation et du métabolisme du cartilage, et pourraient donc être insuffisants pour distinguer des mécanismes en amont différents. Une efficacité similaire n'implique pas des mécanismes identiques, mais suggère que les deux interventions pourraient affecter des composants communs du réseau pathologique de l'arthrose26,32,33. Des approches impartiales, telles que le profilage transcriptomique ou protéomique, pourraient aider à définir des signatures moléculaires spécifiques aux traitements.
Les effets comparables de l'acupotomie et du célécoxib pourraient également présenter une pertinence clinique. L'acupotomie pourrait offrir une option thérapeutique non pharmacologique qui cible les facteurs mécaniques périarticulaires tout en évitant certains effets indésirables liés à une utilisation prolongée de médicaments. Toutefois, cette interprétation doit être abordée avec prudence, car le modèle du lapin ne reflète pas entièrement la complexité de l'arthrose gonarthrosique humaine. Des études translationnelles et cliniques supplémentaires sont nécessaires avant que ces résultats précliniques puissent soutenir une application clinique plus large.
Plusieurs limites doivent être reconnues. Premièrement, l'association entre circPDE4B et l'axe RIC8A/p38 MAPK n'a pas été testée à l'aide d'expériences de perte ou de gain de fonction. Deuxièmement, le modèle de lapin et la période de traitement de 4 semaines limitent les conclusions concernant la maladie humaine et les résultats à long terme. Troisièmement, les dosages moléculaires ont utilisé des sous-ensembles relativement restreints d'animaux, ce qui peut avoir limité la détection de différences subtiles entre les groupes. Quatrièmement, le panel de marqueurs sélectionné pourrait ne pas permettre de distinguer les mécanismes en amont spécifiques au traitement. Enfin, les réponses similaires à l'acupotomie et au célécoxib nécessitent des investigations supplémentaires afin de déterminer si ces deux interventions agissent selon des voies convergentes ou indépendantes.
Conclusion
L'acupotomie a réduit le gonflement articulaire, les niveaux de cytokines inflammatoires, la dégénérescence du cartilage et l'expression des marqueurs cataboliques dans un modèle de lapin d'arthrose du genou. Ces effets étaient associés à des modifications de l'expression relative de circPDE4B et à la modulation de l'axe de signalisation RIC8A/p38 MAPK. Étant donné que les résultats actuels sont corrélatifs, des études mécanistiques supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si circPDE4B médie directement les effets thérapeutiques de l'acupotomie.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent ni aucune relation personnelle susceptible d’avoir influencé le travail rapporté dans cet article.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention no 81774436), le projet de transformation de la recherche médicale clinique de la province d'Anhui (subvention no 202427b10020136), le projet de recherche scientifique du Département de l'éducation de la province d'Anhui (subvention no 2023AH050824), le programme de recherche en santé d'Anhui (subvention no AHWJ2023A30123) et le projet de recherche sur la transmission et l'innovation de l'Association d'Anhui de médecine traditionnelle chinoise (subvention no 2024ZYYXH153).
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Peroxyde d'hydrogène à 3 % | Fuzhou Maixin Biotech | SP kit-A3 | Inhibe l'activité peroxydasique endogène lors de l'immunohistochimie. |
| Paraformaldéhyde à 4 % | Biosharp | BL539A | Fixe le tissu cartilagineux avant la décalcification et le traitement histologique. |
| Acide acétique | Merck | A6283 | Utilisé pour préparer l'acide chlorhydrique à 1 % dans 70 % |
| Bandes adhésives | Zhejiang Renkang | RK-8802 | Utilisées après l'acupotomie. |
| Anticorps anti-aggrecane | Proteintech | 13880-1-AP | Anticorps primaire utilisé pour détecter l'aggrecane dans les extraits protéiques du cartilage. |
| Éthanol anhydre | Sinopharm Chemical Reagent | 10009228 | Utilisé pour la déshydratation des tissus et la réhydratation des coupes lors du traitement histologique. |
| Kit d'analyse des protéines BCA | Thermo Fisher Scientific | A55860 | Utilisé pour déterminer la concentration en protéines. |
| Célécoxib | Biochempartner | BCP02156 | Traitement pharmacologique de référence administré par gavage oral. |
| Centrifugeuse | Anhui Jiawen Instruments | JW-3021HR | Utilisée pour clarifier les lysats et homogénats tissulaires par séparation centrifuge. |
| Chloroforme | Nanjing Reagent | 67-66-3 | Utilisé pour la séparation des phases lors de l'extraction totale d'ARN. |
| tampon citrate, pH 6,0 | ZSGB-BIO | ZLI-9065 | Utilisé pour la récupération des antigènes induite par la chaleur avant l'immunohistochimie. |
| Cryotubes | NEST Biotechnology | 607001 | Utilisés pour le stockage des échantillons congelés |
| Substrat DAB | Fuzhou Maixin Biotech | Kit-5230 | Substrat chromogène utilisé pour la visualisation des signaux immunohistochimiques marqués à la peroxydase. |
| Eau traitée au DEPC | Generay Biotech | D1007 | Eau sans RNase utilisée pour la dissolution de l'ARN et les procédures de biologie moléculaire. |
| Aiguille jetable d'acupotomie, 0,35 mm × 25 mm | Ma'anshan Bond Medical Equipment | GB3525R | Aiguille-stilet stérile utilisée pour les procédures d'acupotomie et d'acupotomie factice. |
| EDTA | biosharp | BL617A | Utilisé pour préparer la solution de décalcification pour les tissus contenant du cartilage. |
| Substrat de chimiluminescence améliorée | Thermo 340958 | 340958 | Utilisé pour visualiser les bandes de Western blot. |
| Solution d'éosine | Zhuhai Beso | BA4022 | Contre-coloration utilisée dans la coloration à l'hématoxyline-éosine. |
| Solution de vert rapide | Solarbio | G1371 | Contre-coloration utilisée dans la coloration Safranin O–vert rapide. |
| Anticorps anti-GAPDH | Zsbio | TA-08 | Utilisé comme témoin de chargement pour le Western blot mais actuellement non répertorié. |
| Système d'imagerie de gel | Shanghai Peiqing Technology | JS-1070P | Capture les images chimiluminescentes de Western blot. |
| Lames de microscope en verre | CITOTEST | 188105 | Utilisées pour monter les coupes |
| Immunoglobuline G de chèvre anti-souris, conjuguée à la peroxydase | ZSGB-BIO | ZB-2305 | Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase pour les anticorps primaires de souris. |
| Immunoglobuline G de chèvre anti-lapin, conjuguée à la peroxydase | ZSGB-BIO | ZB-2301 | Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase pour les anticorps primaires de lapin. |
| Sérum de chèvre | ZSGB-BIO | ZLI-9056 | Inhibe la liaison non spécifique des anticorps lors de l'immunohistochimie. |
| GraphPad Prism, version 10 | GraphPad Software | Non applicable | Utilisé pour l'analyse statistique et la préparation des graphiques. |
| Solution d'hématoxyline | Zhuhai Beso | BA4041 | Colorant nucléaire utilisé pour la coloration à l'hématoxyline-éosine et la contre-coloration immunohistochimique. |
| Homogénéisateur | Witeg | SGCR-5-553-722 | Homogénéise le tissu cartilagineux pour les dosages ELISA et moléculaires. |
| Acide chlorhydrique | Merck | 7607 | Utilisé pour préparer l'acide chlorhydrique à 1 % dans 70 % |
| Logiciel Image Lab | Bio-Rad | Non applicable | Utilisé pour l'analyse densitométrique des bandes de Western blot. |
| Image-Pro Plus, version 6.0 | Media Cybernetics | Non applicable | Utilisé pour l'analyse semi-quantitative de l'intensité de coloration au Safranin O. |
| Isopropanol | Sinopharm Chemical Reagent | SCR40007960 | Utilisé pour précipiter l'ARN lors de l'extraction totale d'ARN. |
| Microscope optique | Olympus | CX41 | Utilisé pour examiner et imager les coupes de cartilage colorées. |
| Marqueur médical | edding | 497985 | Utilisé pour marquer les points de traitement |
| Méthanol | Shanghai Suyi | 20180427 | Utilisé pour activer la membrane PVDF |
| Microtome | Leica | RM2016 | Découpe les tissus inclus en paraffine en coupes de 5 µm. |
| Anticorps anti-MMP-13 | Bioss | bs-0575R | Anticorps primaire utilisé pour détecter la métalloprotéinase-13 de la matrice. |
| Anticorps anti-MMP-3 | Bioss | bs-43017R | Anticorps primaire utilisé pour détecter la métalloprotéinase-3 de la matrice. |
| Résine neutre | Wuxi Jiangyuan | ZLI-9516 | Milieu de montage utilisé pour la préparation permanente des coupes tissulaires colorées. |
| Lapins blancs de Nouvelle-Zélande (mâles, 6 mois, pesant 2,0–2,5 kg) | Ferme d'élevage de Pukou, district de Nanjing | SCXK (Su) 2024-0007 | Animaux expérimentaux utilisés pour la modélisation de l'arthrose du genou et l'évaluation du traitement. |
| Lame de scalpel n°23 | Caisson | SCX08-100PC | Utilisée lors du prélèvement d'échantillons. |
| Lait écrémé en poudre | Gene | 9999S | Utilisé comme réactif de blocage. |
| Anticorps anti-p38 MAPK | Bioss | bs-0637R | Anticorps primaire utilisé pour détecter la p38 MAPK totale. |
| Paraffine | Thermo | 8330 | Utilisée pour l'inclusion tissulaire |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | Utilisé pour l'homogénéisation tissulaire, le lavage et la préparation des réactifs. |
| Pénicilline | Jilin Huamu Animal Health Products | Non applicable | Utilisée postopératoirement à 40 000 U/kg/jour |
| Pentobarbital sodique | Beijing Chemical Reagents | 61222 | Utilisé pour l'anesthésie à 3 %, 30 mg/kg. |
| Solution saline tamponnée au phosphate | beyotime | ST448 | Utilisée pour l'homogénéisation tissulaire et le lavage lors de l'immunohistochimie. |
| Sérum physiologique | servicevio | G4702 | Utilisé pour préparer la suspension de célécoxib |
| PMSF | Beyotime | ST506 | Inhibiteur de protéase ajouté au tampon de lyse lors de l'extraction des protéines. |
| Anticorps anti-p-NF-κB | Santa | sc-136548 | Anticorps primaire utilisé pour détecter p-NF-κB en analyse immunohistochimique. |
| Anticorps anti-p-p38 MAPK | Bioss | bs-5476R | Anticorps primaire utilisé pour détecter la p38 MAPK phosphorylée. |
| Kit de réactifs PrimeScript RT avec éraseur d'ADN génomique | TaKaRa | RR047A | Utilisé pour l'élimination de l'ADN génomique et la transcription inverse de l'ARN en ADN complémentaire. |
| Membrane PVDF | Millipore | IPVH00010 | Membrane utilisée pour le transfert des protéines lors du Western blot. |
| Kit ELISA de l'IL-1β de lapin | Jiyinmei | JYM0011Rb | Quantifie l'interleukine-1β de lapin dans l'échantillon analysé. |
| Kit ELISA de l'IL-6 de lapin | Jiyinmei | JYM0006Rb | Quantifie l'interleukine-6 de lapin dans l'échantillon analysé. |
| Kit ELISA du TNF-α de lapin | Jiyinmei | JYM0003Rb | Quantifie le facteur de nécrose tumorale-α de lapin dans l'échantillon analysé. |
| Système de PCR en temps réel | Thermo Fisher Scientific | PIKOREAL 96 | Effectue l'amplification par PCR quantitative basée sur la fluorescence. |
| Anticorps anti-RIC8A | Bioss | bs-11355R | Anticorps primaire utilisé pour détecter RIC8A. |
| Tampon de lyse RIPA | Beyotime | P0013B | Extrait les protéines totales du tissu cartilagineux. |
| Solution de Safranin O | Solarbio | G1371 | Colore les protéoglycanes du cartilage en histologie Safranin O–vert rapide. |
| Réactifs SDS-PAGE ou gels préfabriqués | Solarbio | S8010 | Incluent le pourcentage du gel ou le produit. |
| Anticorps anti-SOX9 | Bioss | bs-4177R | Anticorps primaire utilisé pour détecter SOX9. |
| Spectrophotomètre | Nanjing Wuyi Technology | OD1000+ | Mesure la concentration et la pureté de l'ARN. |
| Gaze stérile | Zhende | V505463 | Utilisée pour la compression après le retrait de l'aiguille. |
| SYBR Green Master Mix | Novoprotein | E096-01B | Réactif fluorescent utilisé pour la PCR quantitative. |
| Solution saline tamponnée au Tris | Solarbio | T8060 | Utilisée pour préparer le tampon de lavage et de blocage pour le Western blot. |
| Réactif TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Réactif phénol–guanidinium utilisé pour l'extraction totale d'ARN. |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | Détergent non ionique ajouté aux solutions de lavage de la solution saline tamponnée au Tris et au tampon phosphate-saline. |
| Solution d'hématoxyline de Weigert au fer | Merck | 1.15973 | Utilisée dans la coloration Safranin O–vert rapide. |
| Xylène | Sinopharm Chemical Reagent | 10023428 | Utilisé pour la déparaffinisation et la clarification tissulaire. |
Références
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