L’acupuncture du cuir chevelu combinée à l’exercice induit l’activation de PI3K/Akt et améliore la plasticité synaptique chez les rats spastiques post-AVC

Résumé

Cette étude vise à étudier les effets de l’acupuncture du cuir chevelu combinée à l’exercice sur la plasticité synaptique du cortex moteur dans un modèle rat de spasticité post-AVC et à explorer l’association entre l’activité de la voie PI3K/Akt et les effets thérapeutiques.

Résumé

Les traitements efficaces pour la spasticité post-AVC (PSS) restent limités, et le mécanisme par lequel l’acupuncture du cuir chevelu combinée à l’exercice (SAE) soulage le PSS n’est pas entièrement compris. Cette étude a étudié les effets de la SAE chez les rats atteints de PSS et a exploré si la SAE régule la plasticité synaptique via la voie PI3K/Akt. Un modèle de rat par obstruction de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) a été établi, et les rats ont été répartis aléatoirement en cinq groupes : Blank, Sham, MCAO, SAE et Baclofène. Toutes les interventions ont été administrées pendant 7 jours consécutifs. La fonction neurologique, le volume d’infarctus cérébral, l’histopathologie, l’ultrastructure synaptique et l’expression protéique associée ont ensuite été évaluées. Comparé au groupe MCAO, l’EAS a amélioré les déficits neurologiques, réduit l’hypertonie musculaire, diminué le volume d’infarctus, soulagé les lésions neuronales, augmenté le nombre de synapses et amélioré la morphologie synaptique. La SAE a également augmenté le facteur neurotrophe dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF), le PI3K phosphorylé (p-PI3K), l’Akt phosphorylé (p-AKT) et les protéines synaptiques, dont la synaptophysine (SYN), la protéine de densité postsynaptique 95 (PSD-95) et la protéine associée à la croissance 43 (GAP-43). La coloration par immunofluorescence a également suggéré une expression accrue de SYN et de p-Akt dans le cortex moteur après le traitement SAE. Ces résultats suggèrent que l’EAS pourrait être corrélée à l’activation de la signalisation PI3K/Akt via une régulation à la hausse du GDNF, améliorant ainsi la plasticité synaptique et soulageant les symptômes du PSS. Cette étude a étudié les effets de la SAE chez les rats atteints de PSS et a exploré l’association potentielle entre l’intervention en SAE, l’activité des voies PI3K/Akt et la plasticité synaptique.

Introduction

L’infarctus cérébral reste une cause majeure de décès et d’invalidité dans le monde. L’ischémie et l’hypoxie endommagent les neurones, perturbent l’équilibre excitation-inhibition dans les circuits moteurs et entraînent un dysfonctionnement moteur¹. La spasticité post-AVC se manifeste par une augmentation du tonus musculaire et une mobilité articulaire réduite, ce qui nuit aux activités quotidiennes et augmente la charge des^{aidants 2}. Bien que des agents antispastiques tels que le baclofène puissent apporter un soulagement temporaire des symptômes, une utilisation prolongée peut entraîner une tolérance aux médicaments et des effets indésirables, et ne rétablit pas une fonction neuronale^{altérée 3}. La rééducation motrice conventionnelle est également limitée par un début lent des bénéfices et une durée prolongée du traitement. Par conséquent, des stratégies thérapeutiques plus sûres et plus efficaces sont urgemment nécessaires, et les mécanismes sous-jacents méritent une investigation approfondie. La neuroplasticité est un mécanisme central de la récupération fonctionnelle post-AVC et implique le remodelage synaptique, la régénération axonale et la survie^{neuronale 4}. Après un AVC ischémique, les neurones du noyau de l’infarctus subissent une mort rapide, tandis que les réponses inflammatoires locales aggravent les lésions tissulaires dans la pénombra ischémique ; Ensemble, ces processus entraînent les lésions^{cérébrales 5,6}. La plasticité synaptique, un élément clé de la neuroplasticité, peut être évaluée par des protéines liées aux synapses, y compris des marqueurs présynaptiques tels que la synaptophysine (SYN) et la protéine associée à la croissance 43 (GAP-43), ainsi que la protéine de densité postsynaptique 95 (PSD-95)^7,8,9.

Les facteurs neurotrophes fournissent une base moléculaire pour la plasticité synaptique. Le facteur neurotrophe dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF) est particulièrement important car il favorise la survie et la réparation neuronales, supprime l’inflammation et améliore le microenvironnement^{synaptique 10}. En se liant au récepteur Ret, le GDNF peut activer la signalisation PI3K/^{Akt 11}. La cascade PI3K/Akt est une voie majeure pro-survie dans le système nerveux, et son activation inhibe l’apoptose tout en soutenant la synthèse protéique nécessaire au remodelage^{synaptique 12,13}. L’acupuncture du cuir chevelu combinée à l’exercice (SAE) est une stratégie de rééducation intégrative qui combine la stimulation par acupuncture du cuir chevelu avec un entraînement moteur actif. L’objectif global de cette méthode est de moduler simultanément l’activité neuronale centrale et de favoriser la récupération motrice liée à la tâche, réduisant ainsi l’hypertonie musculaire et améliorant les résultats fonctionnels après un AVC. La SAE est largement utilisée en Chine pour le traitement de la spasticité post-AVC (PSS). La logique de cette approche combinée est que l’acupuncture du cuir chevelu peut moduler l’excitabilité corticale et la perfusion cérébrale, tandis que la thérapie par l’exercice offre un entraînement moteur dépendant de l’activité qui favorise la récupération fonctionnelle et le remodelage synaptique. Comparée à la seule thérapie par l’exercice, des preuves cliniques antérieures ont montré que l’acupuncture du cuir chevelu aux points du cuir chevelu combinée à la thérapie par l’exercice réduit encore la spasticité des membres et améliore la fonction motrice ainsi que les activités quotidiennes chez les patients présentant un spasme post-AVC^{du membre 14}.

Une récente revue systématique et méta-analyse a également suggéré que l’acupuncture du cuir chevelu de type mouvement ou les interventions concomitantes d’acupuncture et d’exercice associées apportent des améliorations plus importantes de la spasticité, de la fonction motrice, de l’équilibre et des activités quotidiennes que les interventions monocomposantes ou séquentielles, soutenant ainsi l’avantage potentiel de la neuromodulation et de l’entraînement moteur^{simultanés 15}. Des études précliniques ont montré que les protocoles d’acupuncture du cuir chevelu de type SAE ou de type de mouvement associé peuvent améliorer le flux sanguin cérébral et atténuer la spasticité grâce à la réactivation spinale KCC2 médiée par le récepteur^{5-HT₂A 16,17}. Une étude récente suggère en outre que l’acupuncture favorise la neuroplasticité via la signalisation PI3K/^{Akt 18}. Par conséquent, la SAE peut être particulièrement adaptée aux contextes expérimentaux et cliniques où la modulation de la plasticité neuronale post-AVC, la récupération motrice et la réduction de la spasticité sont des objectifs thérapeutiques clés. Cependant, l’association potentielle entre SAE, la signalisation GDNF/PI3K/Akt et la plasticité synaptique dans le soulagement du PSS reste peu comprise. La présente étude a établi un modèle de PSS chez le rat afin d’évaluer les effets de la SAE sur les déficits neurologiques et la spasticité musculaire, et de caractériser les changements dans l’expression du GDNF, l’activité des voies PI3K/Akt et les protéines liées à la plasticité synaptique après intervention. Cette étude pourrait fournir des preuves expérimentales pour déterminer si la SAE est une stratégie de rééducation appropriée pour le PSS et pour clarifier son mécanisme d’action potentiel.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine chinoise de Changchun (Approbation n° 20251038) et ont été menées conformément aux directives ARRIVE 2.0 sur la recherche animale : Déclaration des expériences in vivo ainsi qu’au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Tous les matériaux utilisés dans cette étude sont présentés dans le tableau des matériaux.

Procédures expérimentales
Animaux expérimentaux et regroupement
Quatre-vingts rats mâles adultes de Sprague–Dawley sans agents pathogènes spécifiques (SPF) (220–250 g) ont été achetés à la ferme d’élevage animalier de Hongda (district de Kuancheng, Changchun, Chine). Les animaux étaient hébergés au Centre Vétérinaire Expérimental de l’Université de Médecine Chinoise de Changchun dans des conditions contrôlées de 22–25 °C, 50–60 % d’humidité relative et un cycle clair/obscurité de 12 heures, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Après une semaine d’acclimatation, les rats ont été assignés au hasard à un groupe blanc (n = 12), un groupe de Sham (n = 12) et un groupe modèle-réserve (n = 56). Le groupe blanc a été inclus comme groupe témoin normal, non traité, afin de fournir des valeurs de base pour la performance comportementale, les caractéristiques histopathologiques et l’expression des marqueurs moléculaires chez les rats en bonne santé. Le groupe Sham a subi la même anesthésie et exposition chirurgicale que le groupe MCAO, sauf que l’occlusion artérielle n’a pas été réalisée ; Par conséquent, ce groupe servait de contrôle aux effets potentiels de l’anesthésie et de la manipulation chirurgicale. L’inclusion des groupes Blank et Sham permettait de distinguer les effets de la lésion ischémique de ceux liés à la procédure chirurgicale elle-même.

Le groupe de modèles-réserves a subi une modélisation MCAO. Les 3 premiers jours après l’opération ont été définis comme la période d’induction du modèle. Durant cette période, 8 rats sur 56 sont décédés, ce qui correspond à un taux de mortalité de 14,29 %, et 12 rats ont été exclus car la modélisation n’a pas été fructueuse. Les 36 rats restants ayant réussi à établir le modèle ont été répartis aléatoirement, à l’aide d’un tableau de nombres aléatoires, aux groupes MCAO, SAE et Baclofène, avec 12 rats dans chaque groupe. Les interventions de groupe étaient les suivantes : (I) Groupe blanc : alimentation de routine uniquement, sans intervention. (II) Groupe simulé : exposition chirurgicale de l’artère carotide commune, des artères carotides internes et externes, ainsi que du nerf vague, sans ligature ni insertion de filament. (III) Groupe MCAO : Le MCAO a été établi sous anesthésie intrapéritonéale avec 3 % de pentobarbital sodique, sans traitement ultérieur. (IV) Groupe SAE : après une modélisation et validation réussies du MCAO, les rats ont reçu une acupuncture du cuir chevelu combinée à de l’exercice. L’anesthésie par inhalation d’isoflurane à 1,5 % à 2,0 % n’a été utilisée que pendant la brève phase d’insertion de l’aiguille. L’entraînement au tapis roulant n’a été initié qu’après une récupération complète de la conscience et la restauration de la capacité de marche spontanée. L’acupuncture a été réalisée à GV20 et à EX-HN1 bilatéralement. Des aiguilles étaient insérées à une profondeur de 1 mm et conservées pendant la période d’entraînement sur tapis roulant. La période standardisée de 30 minutes pour la rétention/entraînement des aiguilles était définie comme la période d’entraînement sur tapis roulant et consistait en 6 m/min pendant 10 minutes, suivie de 12 m/min pendant 20 minutes à 0° incliné. L’intervention a été administrée une fois par jour pendant 7 jours consécutifs. (V) Groupe Baclofène : après modélisation et validation réussies du MCAO, les rats ont reçu le baclofène par gavage intragastrique à 0,4 mg/kg une fois par jour pendant 7 jours consécutifs.

Établissement du modèle MCAO
Le modèle MCAO du rat a été établi en utilisant une méthode de filament intraluminal^{modifiée 19}. Après 12 heures de jeûne et de privation d’eau, les rats ont été anesthésés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 3 % et placés en position couchée. Après désinfection cutanée, une incision cervicale de la ligne médiane a été réalisée pour exposer l’artère carotide commune droite (ACC) ainsi que les nerfs et muscles adjacents. L’artère carotide externe (ECA) a été identifiée et ligatuée, et l’artère carotide interne (ICA) a été isolée. Des ligatures ont été placées à l’ACI et au CCA proximaux, et la ACC distale a été temporairement pincée. Une petite artériotomie a ensuite été pratiquée dans le CCA à proximité de la pinze. Un filament de nylon de 0,26 mm a été inséré et avancé de 18 à 20 mm à travers l’ACI pour occulter l’origine de l’artère cérébrale moyenne. L’ACI et le CCA ont ensuite été ligagés, et l’incision a été suturée. Après l’opération, les rats étaient maintenus au chaud pendant la convalescence et recevaient une injection intrapéritonéale de pénicilline (40 000 U) pour prévenir l’infection. Dans le groupe Sham, seule une exposition vasculaire a été effectuée, sans insertion de filament ; la fermeture des plaies et les soins postopératoires étaient identiques à ceux du groupe MCAO. L’établissement réussi du modèle a été défini comme un score Zea Longa ≥ 2 à 3 jours après^{l’opération 19} et un score de tonus musculaire modifié sur l’échelle d’Ashworth (MAS) ≥ grade^{1 20}.

Méthodes d’intervntion
L’acupuncture du cuir chevelu se combine avec une intervention physique
Des études antérieures montrent que chez les rats MCAO, les déficits neurologiques atteignent leur pic au jour 3 et restent élevés dans les 10 jours suivant l’opération, tandis que la résistance musculaire périphérique augmente progressivement du jour 6 au jour^{9 21}. Par conséquent, le traitement a été initié au troisième jour postopératoire et poursuivi une fois par jour pendant 7 jours consécutifs afin de minimiser l’impact d’une récupération spontanée. Avant de modéliser, les rats assignés au groupe SAE suivaient 3 jours d’entraînement adaptatif sur tapis roulant à 5 m/min pendant 10 min/^{jour 22}. Cette formation adaptative a servi à familiariser les rats avec la course sur tapis roulant et à réduire la probabilité de luttes, de chutes, de refus de courir ou d’arrêt pendant la période formelle d’intervention. Lors de l’entraînement adaptatif et de l’intervention formelle, les événements anormaux liés au tapis de course étaient définis comme des difficultés persistantes, des chutes de la piste de course, un refus de courir plus d’une minute ou un arrêt plus d’une minute pendant l’entraînement sur tapis roulant. Ces événements ont été enregistrés dans des journaux expérimentaux lors de leur observation. Une brève hésitation ou un arrêt temporaire ne conduisait pas à l’exclusion si la course sur tapis roulant pouvait être reprise après une douce invitation. Les données n’étaient exclues que si un animal ne pouvait pas terminer la séance quotidienne assignée sur tapis roulant en raison de chutes répétées, d’un refus persistant de courir ou d’une détresse sévère. Après validation réussie du modèle au troisième jour, l’intervention SAE a été administrée une fois par jour pendant 7 jours consécutifs.

Pour chaque séance de traitement, les rats ont été anesthésés avec 1,5 % à 2,0 % d’isoflurane. L’anesthésie a été interrompue immédiatement après l’insertion de l’aiguille. En pratique expérimentale, les rats retrouvaient généralement une pleine conscience en environ 1 à 2 minutes après le retrait de l’isoflurane. L’entraînement sur tapis de course n’a pas commencé pendant que les rats étaient anesthésés. Les points d’acupuncture ont été localisés par des acupuncteurs animaux expérimentés selon la nomenclature et la localisation des points d’acupuncture communs dans les animaux expérimentaux publiée par l’Association chinoise d’acupuncture-moxibustion en 2020. GV20 a été défini comme le point médian de la ligne reliant les fontanelles antérieures et postérieures sur la ligne médiane crânienne. Les points bilatéraux EX-HN1 étaient situés latéralement de 2 mm par rapport à GV20. Des aiguilles jetables mesurant 0,25 mm × 13 mm étaient insérées verticalement à une profondeur de 1 mm et conservées tout au long de la période standardisée de 30 minutes d’entraînement sur tapis roulant. Les aiguilles étaient fixées avec du ruban médical respirant pour éviter le déplacement, et la pénétration du crâne était exclue par palpation afin d’assurer la cohérence de la procédure. La position de l’aiguille et la fixation du ruban étaient vérifiées avant l’entraînement sur tapis roulant, lors de courtes pauses si un comportement de course anormal survenait, et immédiatement après la fin de l’entraînement. De plus, la position de l’aiguille était vérifiée visuellement toutes les 5 minutes pendant l’entraînement sur tapis roulant, quel que soit le comportement animal. Le déplacement de l’aiguille était défini comme un desserrement visible, un changement d’angle de l’aiguille, un retrait partiel ou un déplacement complet lors de la course sur tapis roulant. Si un léger desserrement survenait sans perte de position de l’aiguille, le ruban était doucement renforcé pendant que le tapis roulant était brièvement en pause. Si une aiguille était partiellement retirée ou complètement déplacée, elle n’était pas réinsérée pendant cette séance ; Le rat a terminé l’entraînement restant sur tapis roulant sans manipulation supplémentaire de l’aiguille, et l’événement a été documenté dans le journal expérimental. Les animaux n’étaient pas exclus uniquement à cause d’un seul déplacement d’aiguille, sauf si cet événement s’accompagnait d’une incapacité à terminer l’entraînement sur tapis roulant ou de signes de détresse sévère.

La période standardisée de rétention/formation des aiguilles de 30 minutes commençait lorsque le rat commençait à courir sur tapis roulant après une récupération complète de l’anesthésie à l’isoflurane et se terminait immédiatement après la fin de l’entraînement au tapis roulant, lorsque les aiguilles étaient retirées. L’intervalle de récupération brève après l’arrêt de l’isoflurane n’a pas été inclus dans la période d’entraînement standardisée de 30 minutes. Comme les aiguilles étaient insérées avant la récupération, le temps réel de permanence physique était environ 1 à 2 minutes plus long que la période d’entraînement sur tapis roulant de 30 minutes. Cette définition a été appliquée de manière cohérente à tous les rats du groupe SAE. Un rat était considéré suffisamment rétabli pour commencer l’entraînement sur tapis roulant lorsque les critères suivants étaient remplis : reprise complète de la conscience, capacité à se tenir debout de manière autonome, capacité à marcher régulièrement sur une surface plane, et réponse normale à une stimulation extérieure douce. Ces critères ont été vérifiés avant de la placer sur le tapis de course.

Pendant la rétention de l’aiguille, les rats effectuaient un exercice sur tapis roulant à une inclinaison de 0° : 6 m/min pendant 10 minutes, suivis de 12 m/min pendant 20 minutes. Aucun choc électrique n’a été utilisé à aucun moment pendant l’étude. Si un rat arrêtait de courir ou refusait de courir plus d’une minute pendant l’entraînement formel, une stimulation auditive douce et non aversive, comme tapoter légèrement le mur du tapis de course, était utilisée pour encourager le mouvement. L’utilisation de ce type d’incitation, ainsi que tout mouvement, chute, arrêt, refus de courir ou déplacement d’aiguille, a été documentée dans le journal expérimental lorsqu’elle a été observée. Ces événements ont été surveillés de manière descriptive et documentés dans le journal expérimental lors de l’observation. L’intensité de l’exercice a été ajustée de manière complète selon des protocoles précédemment rapportés combinant acupuncture du cuir chevelu et entraînement sur tapis^{roulant 16,23}. L’intervention SAE a été administrée une fois par jour pendant 7 jours consécutifs (Figure 1A).

Intervention du baclofène
Après validation réussie du modèle, les rats du groupe Baclofène ont reçu une solution de baclofène par gavage intragastrique à une dose de 0,4 mg/kg. Le médicament était administré une fois par jour à 9h00 pendant 7 jours consécutifs.

Résultat moyen
Observation générale
L’état général a été surveillé quotidiennement dans tous les groupes, y compris le poids corporel, l’état mental, la consommation de nourriture et d’eau, ainsi que l’activité spontanée.

Évaluation de la fonction neurologique et du tonus musculaire
Les déficits neurologiques et la spasticité des membres ont été évalués les jours 1, 3, 5 et 7 après validation du modèle à l’aide du score Zea Longa, du score de gravité neurologique modifiée (mNSS) et de l’échelle d’Ashworth modifiée. Toutes les évaluations comportementales à tous les moments ont été réalisées indépendamment par deux enquêteurs qui ont été aveugles à l’allocation de groupe tout au long de la période d’observation. Des critères de notation détaillés sont présentés (tableaux 1 à 3).

Détermination du volume de l’infarctus cérébral
Le volume de l’infarctus cérébral a été évalué à l’aide de coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC). Après 7 jours d’intervention, trois rats de chaque groupe ont été sélectionnés au hasard et euthanasiés par overdose intrapéritonéale de pentobarbital sodique, suivie d’une décapitation rapide pour une collecte cérébrale globale. Les cerveaux ont d’abord été congelés à −20 °C puis découpés en coupes coronales de 2 mm d’épaisseur. Les sections ont été incubées dans une solution TTC à 2 % à 37 °C pendant 30 minutes dans l’obscurité, puis fixées toute la nuit dans du paraformoldéhyde à 4 % à 4 °C. Le lendemain, toutes les sections ont été photographiées avec un appareil photo numérique. Le tissu cérébral normal était teinté de rouge foncé, tandis que le tissu infarcté paraissait d’un blanc pâle. Les zones d’infarctus ont été quantifiées avec ImageJ, et le volume d’infarctus a été exprimé en pourcentage à l’aide de la formule suivante :

Volume d’infarctus ( %) = aire d’infarctus / surface totale de la section cérébrale X 100 %.   (1)

Examen histopathologique du tissu cérébral
Coloration hématoxyline–éosine (HE)
La coloration de l’hématoxyline et de l’éosine a été utilisée pour évaluer les modifications histopathologiques du cortex péri-infarctique. Après 7 jours d’intervention, les rats ont été euthanasiés par overdose intrapéritonéale de pentobarbital sodique. Une perfusion transcardique rapide a ensuite été réalisée avec du sérum tampon phosphaté (PBS) à 0,01 M pour retirer le sang, suivi de 250 mL de paraformodéhyde froid à 4 % (4 °C) pour fixation. Des cerveaux entiers ont été prélevés, et le tissu cortical péri-infarctus a été isolé et fixé dans 4 % de paraformoldéhyde à 4 °C pendant 24 heures. Les tissus étaient incrustés dans la paraffine et sectionnés coronalement à 5 μm. Les sections étaient montées sur des lames, cuites à 60 °C pendant 30 minutes, puis déparaffinées en xylène I–III (10 min chacune). Une coloration HE a ensuite été pratiquée, suivie de déshydratation et de débouchage. Enfin, les sections ont été couvertes de baume neutre, et les images ont été prises à l’aide d’un microscope optique Nikon.

Coloration de Nissl
La coloration de Nissl a été utilisée pour évaluer la survie neuronale et la densité corporelle de Nissl dans la région du péri-infarctus. Après 7 jours d’intervention, les rats ont été euthanasiés et perfusés transcardiquement avec 0,01 M PBS (37 °C), suivis de 250 mL de paraformodéhyde à 4 % (4 °C). Le cerveau entier a été retiré, et les tissus corticaux péri-infarctus et controlatéraux ont été disséqués et fixés pendant la nuit dans 4 % de paraformoldéhyde à 4 °C. Après l’inclusion en paraffine, des sections de 5 μm ont été préparées. Les coupes ont été déparaffinées dans du xylène pendant 10 minutes, réhydratées à travers une série de solutions d’éthanol graduées (95 %, 90 %, 80 %, 70 % et 50 % ; 5 minutes pour chaque concentration), puis colorées avec une solution de travail Nissl pendant 30 minutes à température ambiante. Après un bref rinçage à l’eau distillée, les sections étaient déshydratées à l’éthanol de calibre, dégagées dans du xylène pendant 2 minutes, puis enfin montées avec des couverdisses. Des images ont été capturées et analysées au microscope optique.

Analyse par western blot de l’analyse protéique
Le Western blotting a été réalisé pour évaluer les protéines impliquées dans la signalisation PI3K/Akt et la plasticité synaptique. Après 7 jours d’intervention, les rats ont été euthanasiés avec une surdose de pentobarbital sodique, et du tissu du cortex moteur péri-infarctus a été prélevé. Les tissus ont été entièrement homogénéisés dans un tampon de lyse par radioimmunoprécipitation (RIPA) sur glace et centrifugés à 1610 × g à 4 °C pendant 30 minutes pour extraire la protéine totale. La concentration en protéines a été quantifiée à l’aide d’un kit commercial de test protéique à base d’acide bicinchoninique (BCA). Des quantités égales de protéines (50 μg par voie) ont été séparées par électrophorèse en gel de sulfate de dodécyle de sodium polyacrylamide (SDS-PAGE) et transférées électriquement dans les membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF). Les membranes ont été bloquées avec une solution d’albumine sérique bovine à 5 % (BSA) pendant 1 heure à température ambiante pour éliminer la liaison non spécifique, puis incubées avec des anticorps primaires toute la nuit à 4 °C. Après trois cycles de lavages avec du sérum physiologique tamponné Tris et Tween-20 (TBST), les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire (ratio de dilution 1:1000) pendant 1 h à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide de chimiluminescence améliorée (ECL), et l’intensité des bandes a été quantifiée avec ImageJ. L’expression relative des protéines a été calculée comme le rapport entre la protéine cible et le témoin interne. Les anticorps primaires étaient les suivants : GAPDH (1:1000), PI3K (1:1000), phospho-PI3K (1:1000), Akt (1:1000), phospho-Akt (1:1000), GAP-43 (1:1000), SYN (1:1000), PSD-95 (1:1000) et GDNF (1:1000).

Observation de l’ultrastructure synaptique
La microscopie électronique en transmission (MET) a été utilisée pour évaluer le nombre de synapses et l’intégrité structurelle. Après 7 jours d’intervention, les rats ont été anesthésés et perfusés transcardique avec un fixateur mixte contenant 4 % de paraformoldéhyde et 2,5 % de glutaraldéhyde. Des blocs de tissu cortical, péri-infarctus (1 mm × 1 mm × 1 mm) ont été collectés et fixés dans du glutaraldéhyde à 2,5 % pendant 2 heures, suivis d’une post-fixation avec 1 % de tétraoxyde d’osmium pendant 1 heure. Les échantillons ont ensuite été traités par déshydratation à éthanol graduée, incrustation en résine époxy, coupe ultrafine (épaisseur de 50 nm) et double coloration à l’acétate d’uranyle et au citrate de plomb. L’ultrastructure synaptique a été examinée à l’aide d’un microscope électronique à transmission. Les images ont été acquises à 8 000× pour une évaluation structurelle, et les synapses comptabilisées à 5 000×. Trois champs neuropil aléatoires par groupe ont été analysés pour calculer le nombre moyen de synapses, et les données ont été comparées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle.

Essai de double marquage par immunofluorescence
Une coloration par double marquage par immunofluorescence a été réalisée pour évaluer l’expression et la distribution de SYN et p-Akt dans le cortex péri-infarctique. Après 7 jours d’intervention, les rats ont été euthanasiés par overdose intraperitonéale de pentobarbital sodique, et le tissu cortical péri-infarctique a été rapidement disséqué. Les échantillons ont été fixés dans du paraformoldéhyde à 4 % pendant 24 heures, intégrés dans un composé à température de coupe optimale (OCT), puis coupés en sections de 10 μm d’épaisseur. Les coupes ont été séchées à l’air à température ambiante pendant 1 h et lavées trois fois avec un tampon TBST pour éliminer les résidus de composé OCT. Les sections ont été perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,3 % pendant 20 minutes à température ambiante, rincées avec du PBS, puis bloquées avec une solution à 5 % de BSA pendant 1 heure à température ambiante. Dans des conditions sombres, des sections ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires anti-SYN de lapin (dilution 1:200) et anti-p-Akt de lapin (dilution 1:200). Le lendemain, les sections ont été lavées trois fois avec du PBS et incubées dans le noir avec un anticorps secondaire (dilution 1:400) pendant 50 minutes à température ambiante. Après six lavages supplémentaires avec le tampon TBST, les noyaux cellulaires ont été contre-colorés avec une solution de travail 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 minutes à température ambiante. Les images ont été obtenues sous des réglages identiques d’exposition et de fond à l’aide d’un microscope à fluorescence. Des images représentatives ont été utilisées pour évaluer les schémas d’expression de SYN et de p-Akt dans le cortex moteur entre les groupes.

Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism 10.1.2 et IBM SPSS Statistics 25. Les données sont présentées en moyenne ± écart-type (DS). Les données comportementales collectées à plusieurs moments, y compris le score Zea Longa, le score de gravité neurologique modifié et l’échelle d’Ashworth modifiée, ont été analysées à l’aide d’une ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles, le groupe étant le facteur entre sujets et le temps comme facteur dans les sujets. Lorsque des effets ou interactions principaux significatifs étaient détectés, le test de comparaison multiple de Sidak était utilisé pour une analyse post-hoc. D’autres données ont été analysées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Sidack pour les comparaisons post hoc. Un p. < à deux queues de 0,05 était considéré comme statistiquement significatif. Dans les graphiques à barres, la signification statistique est indiquée par des astérisques tels que définis dans les légendes de figures correspondantes.

Résultats

L’EAS améliore la fonction neurologique et réduit la spasticité musculaire chez les rats PSS
Les effets thérapeutiques de l’EAS sur les troubles comportementaux chez les rats présentant une spasticité post-AVC ont été évalués à l’aide du score Zea Longa, du score de gravité neurologique modifié et de l’échelle d’Ashworth modifiée aux jours 1, 3, 5 et 7 après validation du modèle (n = 12 par groupe). Le score Zea Longa et le mNSS ont été utilisés pour évaluer les défic...

Discussion

Des études cliniques antérieures ont montré que l’acupuncture du cuir chevelu combinée à l’exercice peut soulager les symptômes spastiques chez les patients souffrant de spasticité post-AVC, tout en améliorant la fonction motrice et les activités de la vie quotidienne (AVQ^)14,24. Ces résultats confirment sa valeur clinique. La présente étude a également confirmé le bénéfice thérapeutique de la SAE dans un modèle de rat en utilisa...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining solution	Beyotime	C0651	TTC staining
3MM Filter Paper	Whatman, UK	3030861	Western blot transfer
AKT Antibody	Affinity	AF0836	Primary antibody
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10000418	Infiltration of electron microscopy specimens
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	Version 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html	64-bit version, used for graphic editing and scientific figure preparation
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092683	Deparaffinization of paraffin sections
Anti-fade mounting medium	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1020	coverslipping
BCA Protein Assay Kit	MDL	MD913053	Protein concentration determination
Bluishing solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	Hematoxylin staining
Chemiluminescence Imaging System	CLINX, China	ChemiScope6100	System Detect target protein
Concentrated normal goat serum	Boster Biological Technology	AR1009	serum blocking
DAPI	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1030	nuclear staining
Diamond Knife	Daitome	Ultra 45°	Slice ultrathin specimens
Differentiation solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	HE staining
Drying Oven	Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd.	GFL-230	Bake fixed tissue slices
EDTA (pH 9.0) antigen retrieval solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1052	Antigen retrieval
Electron microscopy fixative	ASPEN	AS1063	Fixation of electron microscopy specimens
Electrophoresis Power Supply	Longfang	LF-2000	Provide electrophoresis voltage
Embed 812 embedding medium	SPI	90529-77-4	Infiltration of electron microscopy specimens
EndNote X9	Clarivate Analytics (US) LLC	Version X9, https://endnote.com/	Used for reference management and academic citation formatting
Freezing Stage	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-L5	Freeze frozen tissue blocks
GAP-43 Antibody	Affinity	Df7766	Primary antibody
GAPDH Antibody	Affinity	AF7021	Primary antibody
GDNF Antibody	Biosynthesis	Bs-1024r	Primary antibody
Glacial acetic acid	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2138	Nissl staining
Glass Slides and Coverslips	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10212432C	Mount tissue sections
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 10.1.2 (324) for Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/	64-bit version, used for statistical analysis and scientific plotting
Grinding machine	Beijing Herde	N.9548	Grind tissue samples
HE staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2103	HE staining
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse Secondary Antibody	Servicebio	C030205	Secondary Antibody
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	SeraCare	5220-0336	Secondary antibody
Hydrogen peroxide (H2O2)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C5101	preparation of TSA reagents
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	Version 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics	64-bit version, used for statistical data analysis and processing
Imaging System	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Capture microscopic images
Metal Bath	COYOTE	H203-H	Constant temperature incubation
Microwave Oven	Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd.	P70D20TL-P4	Antigen retrieval
NC Membrane (0.22 μm)	GVS, USA	ISEQ00010	Protein blot transfer
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10004160	dehydration and coverslipping
PBS buffer	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C0003	decolorization and washing
PI3K Antibody	Affinity	AF6241	Primary antibody
PSD-95 Antibody	Affinity	Af5283	Primary antibody
Pathological Microtome	Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd.	RM2016	Cut paraffin sections
Phospho-AKT Antibody	Affinity	Af0832	Primary antibody
Phospho-PI3K Antibody	Affinity	Af3241	Primary antibody
Pipette	Dragonlab	KE0003087/KA0056573	Quantitative liquid transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Beyotime	P1005	Protease inhibition
RIPA Lysis Buffer (Medium)	Beyotime	P0013C	Tissue lysis
Refrigerated Centrifuge	SEILOGEX, China	CF1524R	Low-speed sample separation
SDS-PAGE Electrophoresis System	Beyotime	MiniProGel™ Gel Casting, Electrophoresis and Western Blot Transfer System	Protein electrophoretic separation
SDS-PAGE Precast Gel Kit	MDL	MD911919	SDS-PAGE electrophoresis
SYN (Synapsin) Antibody	Biosynthesis	bs-3501R	Primary antibody
Shaker	Qilinbeier	TS-8	Sample oscillation washing
Tissue Dehydrator	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JJ-12J	Dehydrate paraffin tissue
Tissue Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-P5	Embed tissue in paraffin
Tissue Spreading Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	KD-P	Unfold paraffin slices
Toluidine blue staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2131	Nissl staining
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G2 20 TWIN	Observe ultrastructure
Tri-Color Pre-Stained Broad Range Protein Molecular Weight Marker (10–180 kDa)	Servicebio	G2091	SDS-PAGE electrophoresis
Tyramide-488	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6002	TSA reagents
Tyramide-CY3	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6003	TSA reagents
Ultramicrotome	Leica	Leica UC7	Cut ultrathin EM sections
Ultrasonic Cell Disruptor