Un modèle d’entérocolite accélérée par piroxicam chez des souris knockout interleukine-10 pour étudier les altérations métaboliques induites par l’inflammation

Résumé

Ce protocole utilise le piroxicam pour accélérer le développement de la colite dans le modèle murin knockout à interleucine (IL-10). Le protocole garantit la synchronisation de la colite, aboutissant à des résultats rigoureux et reproductibles, indépendants du sexe, de la tension de fond ou des conditions de vivaire. Il sert de modèle utile pour étudier les altérations métaboliques lors de l’inflammation intestinale.

Résumé

La maladie inflammatoire de l’intestin (MII) est un trouble inflammatoire chronique du tube digestif touchant plus de 10 millions de personnes dans le monde. Bien que des recherches substantielles se soient concentrées sur les mécanismes immunologiques et les conséquences sous-jacentes à la MII, on comprend moins de choses sur la manière dont l’inflammation muqueuse contribue à la dysrégulation métabolique, notamment la perte de poids et la diminution de l’appétit. Ici, les auteurs décrivent un modèle murin d’entérocolite accélérée par piroxicam chez des souris interleukine-10-knockout (IL-10-KO) afin d’étudier la dysrégulation métabolique induite par l’inflammation. Les souris IL-10-KO sont connues pour développer une entérocolite spontanée et une susceptibilité accrue à l’entérocolite déclenchée par des infections ou des médicaments. Cependant, des conditions de vivarius et des antécédents de souche ont été rapportées comme facteurs de confusion dans le développement de la colite dans ce modèle. Le Piroxicam, un anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS), a démontré qu’il déclenche ou accélère, dans des modèles animaux, en augmentant l’exposition muqueuse aux bactéries luminales. Dans ce protocole, les souris mâles et femelles IL-10-KO ont été nourries avec un régime enrichi au piroxicam en remplacement d’un régime alimentaire classique chow. La consommation alimentaire et le poids corporel ont été mesurés quotidiennement pour refléter les altérations métaboliques de l’ensemble du corps, ainsi que des manifestations cliniques de l’entérocolite telles que la diarrhée et les saignements rectaux. Le protocole est efficace et reproductible, induisant simultanément l’entérocolite chez plusieurs souris, et permet d’évaluer la dysrégulation métabolique dans un modèle de maladie inflammatoire de l’intestin. D’autres études utilisant ce protocole pourraient examiner les effets de l’entérocolite sur d’autres composantes de la dysrégulation métabolique, telles que la dépense énergétique et la composition corporelle, révélant des liens plus larges entre la maladie inflammatoire intestinale et le métabolisme de l’hôte.

Introduction

La maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, connues collectivement sous le nom de maladie inflammatoire de l’intestin (MII), sont des troubles auto-immuns chroniques du tractus gastro-intestinal caractérisés par une inflammation muqueuse, avec des manifestations cliniques telles que douleurs abdominales, perte de poids, hématochéie et diarrhée. La MII touche des millions de personnes dans le monde, avec la plus forte prévalence dans les sociétés^{occidentalisées 1}. Aux États-Unis, on estime que plus de 3 millions de personnes sont^{touchées 2,3}, avec une incidence et une prévalence croissantes, en particulier chez les enfants et les jeunes ^4,5.

Les mécanismes exacts sous-jacents à la pathogenèse de la MII restent incomplètement compris, mais on pense largement que la maladie résulte d’une réponse immunitaire exagérée au microbiote intestinal chez des individus génétiquement sensibles. Les cytokines qui modulent les réponses inflammatoires jouent un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie intestinale et dans le développement de la MII. Parmi celles-ci, l’interleukine-10 (IL-10) est une cytokine anti-inflammatoire bien étudiée qui aide à maintenir l’homéostasie immunologique chez l’humain en régulant à la fois les bras innés et adaptatifs de la réponse^{immunitaire 6,7}. Notamment, des polymorphismes chez IL-10 et son récepteur (IL-10RA/B) ont été identifiés chez des nourrissons présentant une MII à début très précoce (VEO-IBD), présentant classiquement une maladie périanale dans les premiers mois de^vie. Cette association est également renforcée par le séquençage exomique à grande échelle chez des patients adultes atteints de la maladie de Crohn, qui a identifié l’IL-10RA comme un locus de susceptibilité à la maladie dans la^{MII 9} non monogénique. De plus, une voie non génétique impliquant des anticorps neutralisants de l’IL-10 a été décrite chez des patients atteints de VEO-IBD, soulignant encore l’importance de cette voie pour le maintien de l’homéostasie immunitaire^{muqueuse 10}.

S’appuyant sur des études humaines impliquant l’IL-10 dans la MII, des souris interleukine-10-knockout (IL-10-KO) ont été développées comme modèle pour étudier le rôle de l’IL-10 dans la MII. Les souris IL-10-KO sont connues pour développer une entérocolite spontanée avec une réponse exagérée CD4+ Th1 aux stimuli, généralement à partir de 8 à 12 semaines de¹¹ ans. Cependant, le développement d’entérocolite spontanée chez les souris IL-10-KO peut être imprévisible en l’absence d’un agent^{accélérateur} 12,13,14, selon la souche génétique, la composition du microbiote et les conditions ^{de logement 15,16}. L’utilisation d’un protocole fiable pour induire la colite est essentielle pour que le modèle IL-10-KO soit pratiquement utile. Des études antérieures ont utilisé des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) tels que le piroxicam pour induire l’entérocolite chez des souris IL-10-KO^17,18. Cependant, ces études se sont principalement concentrées sur les altérations immunologiques, avec relativement peu d’accent sur les effets de l’entérocolite sur le métabolisme ou sur le rôle du sexe dans la gravité de la^{colite 19}. Les auteurs ici décrivent l’utilisation d’un régime enrichi au piroxicam pour induire l’entérocolite chez les souris IL-10-KO et caractérisent la dysrégulation métabolique ainsi que les réponses inflammatoires muqueuses dans ce modèle en utilisant à la fois des souris mâles et femelles. Ce protocole mesure le poids corporel et l’apport alimentaire pour refléter les altérations métaboliques de l’ensemble du corps, ainsi que les manifestations cliniques de la colite et les changements histologiques et transcriptomiques reflétant l’inflammation muqueuse. Ce modèle efficace et reproductible offre un outil précieux pour étudier le lien entre la MII et le métabolisme de l’hôte.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément au protocole approuvé par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) du Centre médical University of Texas Southwestern, conformément au « Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire » [Numéro d’approbation : 2017-102011]. L’euthanasie a été réalisée conformément aux directives institutionnelles. Aucune anesthésie n’a été requise pour les interventions réalisées. Les détails spécifiques des matériaux sont décrits dans le Tableau des matériaux.

1. Établissement du modèle d’entérocolite accélérée par piroxicam chez des souris IL-10-KO

1. Maintenir des souris IL-10-KO dans une installation spécifique sans agents pathogènes (SPF) sur un cycle d’éclairage de 12 heures avec un accès improvisé à la nourriture et à l’eau.
2. Individuellement, ils hébergent des souris de 7 à 8 semaines, d’âge et de sexe apparié dans des cages microisolatrices. Permettre aux souris de s’habituer à un logement individuel et à une manipulation quotidienne pendant au moins une semaine avant le début de l’expérience.
   REMARQUE : Assurez-vous que le poids corporel est de >20 g pour les mâles ou de >17 g pour les femelles, et que les souris sont exemptes de blessures de combat.
3. Assigner les souris à un groupe expérimental et à un groupe témoin. Pour le groupe expérimental, remplacer la nourriture standard par une nourriture fortifiée au piroxicam. Pour le groupe témoin, fournissez de la nourriture standard fraîche. Ajoutez 50 g de nourriture à chaque trémie de cage.
   REMARQUE : Allouez au moins cinq souris par sexe à chaque groupe. La nourriture enrichie au piroxicam (200 ppm) a été préparée par Teklad à l’aide du piroxicam fourni par les enquêteurs pour la production d’un régime alimentaire personnalisé pour les animaux de laboratoire. Pour minimiser la variabilité d’un lot à l’autre, il est recommandé que tous les animaux d’une même expérience reçoivent de la nourriture provenant du même lot de production. Lorsque possible, le même lot doit également être utilisé dans les expériences pour améliorer la reproductibilité.

2. Surveillance du poids corporel et du comportement alimentaire

1. À l’aide d’une balance analytique, notez le poids corporel de chaque souris. Peser chaque souris individuellement à la même heure chaque jour, tous les jours pendant 7 jours consécutifs. Déclarez le poids corporel quotidien en pourcentage du poids de base le jour 0 (fixé à 100 %).
   REMARQUE : Une perte de poids supérieure à 20 % indique un stress excessif et un risque de mort imminente. Les souris doivent être euthanasiées si ce seuil est atteint.
2. À l’aide d’une balance analytique, notez le poids initial du repas fortifié au piroxicam et du repas standard dans chaque cage.
3. Ensuite, mesurez le reste de la nourriture dans chaque trémie à la même heure chaque jour, tous les jours pendant 7 jours consécutifs.
4. Calculez la consommation quotidienne de nourriture en soustrayant le poids quotidien du reste de la nourriture de la veille.
   REMARQUE : Vérifiez régulièrement la quantité de nourriture et remplissez si elle est inférieure à 10 g. La convivialité de la nourriture piroxicam n’influence pas la consommation et devrait ressembler étroitement à celle de la nourriture standard.

3. Surveillance de l’activité de la maladie

1. Les jours 0 et 7, inspectez visuellement les granulés fécaux de souris individuelles et déterminez la présence de sang dans les selles.
2. Si aucun sang n’est visible, effectuez un test de sang occulte fécal en étalant un pellet sur la carte, puis en ajoutant le réactif de révélateur fourni. Résultats des scores selon le tableau 1.
3. Les jours 0 et 7, inspectez visuellement les granulés fécaux fraîchement expulsés pour évaluer la consistance des selles. Utilisez des pinces plates pour aider à déterminer la régularité. Résultats des scores selon le tableau 1.
4. Les jours 0 et 7, déterminer le degré de prolapsus rectal en inspectant la région périanale. Résultats des scores selon le tableau 1.
5. Mesurez le poids corporel comme décrit ci-dessus. Résultats des scores selon le tableau 1.
   REMARQUE : Le score de l’indice d’activité de la maladie (DAI) doit être effectué de manière aveugle par le même chercheur tout au long de l’expérience afin d’assurer la cohérence, de minimiser le biais de l’observateur et d’améliorer la fiabilité de l’évaluation.

4. Prélèvement des tissus du côlon

1. Euthanasier les souris par asphyxie au_CO-2 et luxation cervicale comme rapporté ailleurs²⁰.
2. Placez la souris en position couchée et vaporisez à 70 % d’éthanol sur l’abdomen ventral.
3. Soulève la peau avec des pinces et utilise des ciseaux chirurgicaux pour couper le long de la ligne médiane. Exposez la cavité péritonéale et localisez le côlon.
4. Exposez le côlon et le cécum à l’aide d’une dissection contondante. Retirez le côlon en bloc, y compris le cecum et le brassard anal.
5. Placez le côlon sur une surface plane et retirez tout tissu conjonctif.
6. Mesurez et notez la longueur du deux-points.
7. Après mesure de la longueur du côlon, retirez le cécum en découpant à la jonction céco-côlique.
8. Préparez une seringue de 10 mL remplie de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) avec une aiguille en acier réutilisable à bout de 22 calibres attachée. Enfilez l’aiguille dans le côlon et éliminez le contenu intestinal.
9. Placez le côlon rincé dans une boîte de Petri contenant du PBS et rincez pour éliminer les résidus. Une fois dégagé, utilisez-le pour les tests en aval.

5. Analyse histologique

1. Posez le côlon à plat sur une lame en verre. Utilisez des pinces pour enrouler le tissu autour de lui-même, en partant de l’extrémité distale, afin de former un « rouleau suisse ». Ainsi, l’extrémité distale/anale reste dans le rouleau interne, les régions les plus proximales s’étendant jusqu’au rouleau externe.
2. À l’aide d’une aiguille de calibre 27, fixez le côlon roulé pour maintenir le rouleau et placez-le dans une cassette de tissu à incruster.
3. Pour fixer les tissus, immergez les cassettes tissulaires dans une solution de formol tamponnée à 10 % pendant 16 heures à 4 °C.
   ATTENTION : 10 % de formol est nocif en cas de contact avec la peau et peut provoquer de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires. Manipulez prudemment avec des gants de protection et des lunettes scientifiques. Le formol résiduel doit être correctement éliminé conformément aux directives institutionnelles.
4. Après fixation du formol, traitez les tissus pour l’incrustation de paraffine et séparez-les pour le montage sur des lames en verre.
   REMARQUE : Les échantillons doivent être soumis à un laboratoire d’histologie disposant de l’équipement nécessaire pour le traitement des cassettes tissulaires en paraffine, le coupement en rouleau, le montage sur lames, ainsi que la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine.
5. Les lames de tissu colorant avec de l’hématoxyline et de l’éosine (HE), conformément aux protocoles^{établis 21}.
6. En utilisant le système de notation histologique décrit dans le tableau 2, évaluez les caractéristiques histologiques suivantes dans chaque section : lésions tissulaires dues à l’entérocolite, infiltration cellulaire inflammatoire de la lamina propria et pourcentage de la surface concernée. Combinez les scores de chaque section pour générer un score total (Tableau 2).
   Score total = Caractéristiques × Implication (Lésions tissulaires) + Caractéristiques × Implication (Infiltration des cellules inflammatoires de la lamina proprie) (1)
7. Des images histopathologiques représentatives des lésions tissulaires et de l’infiltration cellulaire se trouvent dans la publication d’Erben et^{al. 22}.
   REMARQUE : L’évaluation histologique doit être réalisée de manière aveugle, de préférence par un pathologiste formé, afin d’assurer la cohérence et la fiabilité de l’évaluation.

6. Coloration immunofluorescente de tissu incrusté en paraffine fixée au formol

1. Placez les lames de tissu dans un support à coulisses puis dans un séchoir à coulisses à 55 °C pendant 1 heure pour faire fondre la paraffine.
2. Placez les lames dans un support de teinture et immergez séquentiellement le support pendant 3 minutes dans des bocaux de teinture au xylène. Répétez cette étape à trois reprises.
3. Immergez la grille de coloration pendant 3 minutes dans des bocaux de teinture contenant de l’éthanol à 100 %. Répétez cette étape à trois reprises.
4. Immergez le support de teinture pendant 3 minutes dans le bocal de teinture avec 95 % d’éthanol.
5. Immergez la grille de coloration pendant 3 minutes dans le bocal de teinture avec 80 % d’éthanol.
6. Immergez le support de teinture pendant 5 minutes dans des bocaux de teinture avec de l’eau déionisée (DI).
   REMARQUE : Toutes les étapes précédentes doivent être effectuées dans une hotte ventilée en raison des vapeurs de xylène. Manipulez prudemment avec des gants de protection et des lunettes scientifiques. Le xylène résiduel doit être correctement éliminé conformément aux directives institutionnelles.
7. Transférez les lames sur un support à lames et plongez-les dans un bocal de coloration avec une solution de récupération de 1× citrate.
8. Placez le bocal de teinture dans le support pour la cuvette de teinture.
9. Placez le support pour la vaisselle de teinture dans l’autocuiseur.
10. Faites cuire 15 minutes dans une cocotte-minute.
11. Récupérez les lames de l’autocuiseur et laissez-les refroidir à température ambiante.
12. Incubez des lames avec un tampon bloquant de 300 μL (sérum de chèvre à 3,5 % dilué dans PBS) pendant 1 heure dans une chambre humidifiée. Assurez-vous que le tissu est complètement recouvert par le tampon bloquant.
13. Exposer les lames à 300 μL d’anticorps primaire dilué dans un tampon de blocage pendant 16 heures à 4 °C, à l’intérieur d’une chambre humidifiée. Assurez-vous que le tissu est entièrement recouvert par l’anticorps primaire. L’anticorps principal suivant a été utilisé : Anti-S100A8/S100A9 (1:500).
    REMARQUE : Les dilutions d’anticorps seront spécifiques au réactif et doivent suivre les recommandations du fournisseur.
14. Rincez les glissières en les immergeant en série dans le PBS pendant 5 minutes à 3 reprises dans un bocal à colorer.
15. Exposer les lames à 300 μL d’un anticorps secondaire fluorescent dilué dans un tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante, dans une chambre humidifiée. Assurez-vous que le tissu est entièrement recouvert par l’anticorps secondaire. L’anticorps secondaire fluorescent suivant a été utilisé : anti-lapin de chèvre Alexa Fluor 555 (dilution 1:150).
    REMARQUE : À partir de ce moment, les lames doivent être protégées de la lumière pour éviter le photoblanchiment des fluorophores. Les dilutions des anticorps secondaires seront spécifiques à chaque réactif et devront suivre les recommandations du fournisseur.
16. Rincez les glissières en les immergeant en série dans le PBS pendant 5 minutes à 3 reprises dans un bocal à colorer.
17. Exposez les lames à la coloration nucléaire en les immergeant dans une solution Hoechst diluée à 1:5000 dans PBS pendant 20 minutes dans un pot de coloration.
18. Rincez les glissières en les immergeant en série dans le PBS pendant 5 minutes à 3 reprises dans un bocal à colorer.
19. Essuyez soigneusement tout PBS des lames à l’aide d’un mouchoir non abrasif. Ajoutez 50 μL de médium antifondu et un couvre-cousse.

7. Extraction d’ARN

1. Congelez instantanément tout le côlon ou un fragment dans de l’azote liquide, puis conservez à -80 °C. Sinon, immergez dans 1,5 mL de solution de conservation RNALater et stockez selon les instructions du fabricant.
2. Décongelez le côlon précédemment congelé et placez-le sur une surface plane. Perturbez et homogénéisez le tissu avec un homogénéiseur portatif.
3. Isoler l’ARN à l’aide du kit, en suivant les instructions du fabricant.
4. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre. Des rapports_{de 260}/_{A 280} > 1,8 et A₂₆₀/_{A 230} de 2,0–2,2 indiquent une pureté d’ARN acceptable.
5. Procédez à la transcription inverse, suivie d’une qPCR avec un colorant intercalant vert SYBR.
6. Analysez les résultats à l’aide de la plateforme de quantification ou d’un instrument similaire.

Résultats

Les souris mâles et femelles IL-10-KO développent une entérocolite après une courte exposition à un régime enrichi au piroxicam (Figure 1A–E). Au deuxième jour, les souris exposées au piroxicam ont montré une perte de poids statistiquement significativement supérieure à celle de leurs témoins réguliers nourris à la nourriture de même sexe, et une perte de poids comparable a été observée selon les sexes (Figure 1B). L’apport alimentaire quotidien apparent est resté inchangé tout au long de l’exposition au piroxicam et au développement de l’entérocolite, et ressemblait à la consommation standard de nourriture, ce qui indique que la perte de poids dans ce modèle n’est pas principalement due à une réduction de l’apport, mais plutôt à d’autres facteurs favorisant la dépense métabolique (Figure 1C).

Pour approfondir l’étude de la progression de l’inflammation intestinale, l’activité de la maladie a été évaluée à partir d’un score combiné de perte de poids, de sang dans les selles, de consistance des selles et de degré de prolapsus rectal. L’indice d’activité de la maladie modifiée (DAI) a été évalué au départ et au jour 7 ; les scores du jour 7 sont représentés à la Figure 1D. De plus, le développement de l’entérocolite observé chez les souris exposées au piroxicam était associé à une forte tendance à l’augmentation de la mortalité, bien que cette différence ne soit pas statistiquement significative (p = 0,12 ; Figure 1E). Dans ce modèle, la mortalité précoce est secondaire par rapport à l’atteinte de critères humains par la souris (perte de poids > 20 %) et affecte préférentiellement les mâles (Figure 1E). Si la mortalité est un critère expérimental recherché, un nombre plus important d’animaux expérimentaux que ceux utilisés ici peut être envisagé. Dans cette étude, les auteurs ont utilisé le nombre minimum d’animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique par complétion, tenant compte de la mortalité attendue.

Le raccourcissement du côlon est une caractéristique associée à la gravité de la colite dans les modèles murins. Lors de la récolte, les souris mâles et femelles nourries avec un régime piroxicam avaient un côlon plus court que celles nourries avec de la nourriture classique (Figures 2A–B). Lors de l’évaluation histologique, les côlons du groupe nourri au piroxicam ont montré des lésions épithéliales et une infiltration accrue des cellules immunitaires, des modifications associées à la colite (Figure 2C). Ces résultats se traduisirent par un score histologique plus élevé (Figure 2D). De plus, les niveaux transcriptionnels de cytokines pro-inflammatoires impliquées dans les modèles humains de MII et murins de colite ont été^{évalués 23}. Conformément aux rapports antérieurs, les côlons de souris nourries au piroxicam avec IL-10-KO ont montré une augmentation significative des cytokines pro-inflammatoires au niveau des transcrits (Figure 3A–D). À noter, ce changement transcriptionnel n’a pas été observé chez les souris IL-10-KO recevant un repas régulier ou chez les souris WT recevant un régime enrichi au piroxicam, ce qui indique que la signature transcriptionnelle était due à une combinaison de déficit en IL-10 et de piroxicam, plutôt que de l’un ou l’autre facteur seul. Enfin, les auteurs ont confirmé que la signature transcriptionnelle observée dans le côlon chez des souris traitées au piroxicam était associée à une coloration accrue de la calprotectine dans la muqueuse du côlon (Figure 3E)^24,25.

Figure 1 : Entérocolite accélérée par Piroxicam chez des souris IL-10-KO. (A) Aperçu schématique du protocole expérimental. (B) Poids corporel, (C) apport alimentaire, (D) indice d’activité de la maladie (DAI) au jour 7, (E) courbe de survie chez les souris mâles de 8 semaines et les femelles IL-10-KO de 8 semaines recevant un régime enrichi au piroxicam ou un régime régulier. Témoin mâle : n = 5, mâle piroxicam : n = 5, femelle témoin : n = 6, femelle piroxicam : n = 6 pouces (B), (C) et (D). Témoin mâle : n = 6, piroxicam mâle : n = 10, témoin femelle : n = 6, piroxicam femelle : n = 7 in (E). * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 par comparaison par paires des souris mâles (astérisques supérieurs) et femelles (astérisques inférieurs) dans (B). Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide d’un test t non apparié à deux queues dans (B), (C) et (D), et d’un test de rang logarithmique dans (E). Les valeurs moyennes et les barres d’erreur représentant l’erreur standard de la moyenne (SEM) sont représentées. Dans les graphiques à barres, les mesures individuelles sont représentées par des graphiques de gigue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Raccourcissement du côlon et évaluation histologique. (A) Échantillons représentatifs de côlon de souris mâles et femelles de 8 semaines d’interleukine-10-knockout (IL-10-KO) recevant un régime piroxicam (en haut) ou un régime régulier (en bas) pendant 7 jours. Barre d’échelle = 1 cm. (B) Longueur du côlon au jour 7 (témoins mâle : n = 5, mâle piroxicam : n = 5, femelle témoin : n = 6, femelle piroxicam : n = 6). (C) Images représentatives du côlon coloré par HE. Balance bar = 100 μm. (D) score histologique au jour 7. Test t non apparié à deux queues dans (B) et (D). Les valeurs moyennes et les barres d’erreur représentant le SEM sont représentées. Dans les graphiques à barres, les mesures individuelles sont représentées par des graphiques de gigue. Non significatif (NS), * p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001 par comparaison par paires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Modifications inflammatoires de l’entérocolite accélérée par piroxicam. Résultats quantitatifs de RT-PCR de (A) Tnf, (B) Il6, (C) Il1b et (D) Ifng dans le tissu colic de souris sauvages de 8 semaines (WT) et interleukine-10-knockout (IL-10-KO) au moment de la récolte. Pour les panneaux A–D, WT piroxicam n = 7, KO piroxicam n = 6, KO contrôle n = 3. (E) Coloration immunofluorescente représentative de la calprotectine du tissu du colon de souris IL-10-KO âgées de 8 semaines au moment de la récolte. Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide d’un test t non apparié à deux queues. Les valeurs moyennes et les barres d’erreur représentant l’erreur standard de la moyenne (SEM) sont représentées. Dans les graphiques à barres, les mesures individuelles sont représentées par des graphiques de gigue. Barre-échelle dans (E) = 200 μm. Non significatif (NS), * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 par comparaison par paires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Domaine	Partition
Poids	0 – Inchangé
	1 – Perte de 1 à 5 %
	2 – Perte de 6–10 %
	3 – Perte de 11–20 %
	4 – ; Perte supérieure à 20 %
Consistance des selles	0 – Normal ;
	1 - Mou mais formé
	2 – Selles meubles (pas aqueuses)
	4 – Diarrhée (selles liquides)
Saignement	0 – Aucun
	2 – Selles hématooccultes positives
	3 – Sang visible sur les selles
	4 – Saignement macroscopal par rectum
Prolapsus rectal	0 – Absent
	1 – Présent
Total Score	Score total : Somme des (scores de domaine) pour chaque domaine

Tableau 1 : Score d’activité de la maladie (DAI). Un système de notation permettant de déterminer l’activité de la maladie par la perte de poids, la consistance des selles, le sang dans les selles et le prolapsus rectal. Adapté de Sifuentes-Dominguez, et al²⁶.

Lésions tissulaires					Infiltration des cellules inflammatoires de la lamina propria
Caractéristiques		Engagement			Caractéristiques		Engagement
0	Aucun	1	1 à 25 % de la surface		0	Peu fréquent	1	1 à 25 % de la surface
1	Peu fréquents ;	2	26 à 50 % de la surface		1	Augmenté, certains neutrophiles	2	26 à 50 % de la surface
2	Érosions et ulcères muqueuses	3	51 à 75 % de la surface		2	Présence sous-muqueuse de grappes cellulaires inflammatoires	3	51 à 75 % de la surface
3	Dommages importants profondément dans la paroi intestinale	4	76 à 100 % de la surface		3	Infiltrations cellulaires transmurales	4	76 à 100 % de la surface

Tableau 2 : Système de notation histologique. Système de notation pour déterminer les changements histologiques et les dommages. Adapté de Sifuentes-Dominguez, et al²⁶.

Discussion

La maladie inflammatoire de l’intestin est un trouble polygénique complexe où les modèles précliniques servent d’outils inestimables pour disséquer les voies contribuant à la pathogenèse des MII et développer de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques. Actuellement, de nombreux modèles précliniques de MII reposent sur une exposition chimique, telles que le dextran sulfate de sodium (DSS), l’oxazolone et l’acide sulfonique trinitrobenzène (TNBS), en raison de leur facilité d’utilisation. Des modèles génétiques qui développent une colite spontanée sont également disponibles. Parmi ceux-ci, le modèle IL-10-KO est particulièrement précieux car les variations génétiques dans la voie de l’IL-10 sont connues pour provoquer une inflammation intestinale chez l’humain, et les souris IL-10-KO développent une entérocolite chronique spontanée ressemblant à une maladie humaine. Cependant, une limitation majeure de ce modèle est son incapacité à prendre en compte la variabilité phénotypique. Bien que l’entérocolite se développe spontanément, son apparition peut varier selon le fond de la souche et les conditions du vivarium²⁷.

En combinant l’exposition chimique à un modèle génétique, le protocole décrit ici fournit un modèle murien fiable et reproductible de colite expérimentale. L’entérocolite est accélérée chez les souris IL-10-KO par piroxicam, avec une apparition de la maladie dans les 7 jours suivant l’exposition à un régime enrichi au piroxicam. Ce protocole permet la synchronisation du développement de la colite. Le modèle récapitule des caractéristiques observées dans d’autres modèles murins couramment utilisés de colite, notamment la perte de poids, le sang dans les selles, la diarrhée, le raccourcissement du côlon, les lésions histologiques et les modifications transcriptionnelles. De plus, ce modèle est reproductible dans la souche largement utilisée C57Bl/6J, qui facilite l’interrogation de défauts génétiques supplémentaires associés à la MII grâce à la relative facilité de génération de souris portant des mutations supplémentaires dans cette souche.

Le modèle décrit ici fournit un outil utile pour étudier les changements métaboliques lors de l’inflammation intestinale. Dans ce modèle, les souris exposées au piroxicam qui développent une entérocolite accélérée continuent de se nourrir normalement sans diminution significative de leur apport quotidien. Cela indique que la perte de poids dans ce modèle n’est pas due à une alimentation altérée, mais plutôt à des facteurs supplémentaires. D’autres études sont nécessaires pour déterminer si ces résultats sont dus à une augmentation du gaspillage calorique due à l’inflammation, à une perte calorique excessive par diarrhée ou à une thermogenèse altérée. De plus, les souris mâles et femelles présentent des schémas similaires de gravité de la maladie, une constatation qui contraste avec les observations antérieures faites sur les modèles IL-10-KO et^DSS 28,29,30.

Il existe plusieurs étapes importantes de dépannage pour garantir la reproductibilité de ce modèle. Tout d’abord, les souris doivent être habituées à la manipulation quotidienne et à l’observation pendant une semaine avant l’exposition au piroxicam. Cela empêche la perte de poids liée au stress. Deuxièmement, les cages ne doivent pas contenir plus de trois souris, et seules les souris hébergées harmonieusement doivent être incluses dans l’expérience. Les souris présentant un comportement de combat ou des blessures de combat sont plus susceptibles de développer une colite et peuvent succomber avant la récolte^31,32. Troisièmement, si l’apport alimentaire doit être surveillé tout au long de l’expérience, les souris doivent être logées individuellement afin de permettre une mesure précise de la consommation de nourriture. De plus, seuls de gros granulés alimentaires intacts doivent être placés dans les bacs d’alimentation pour éviter qu’ils ne s’effritent dans la litière, ce qui pourrait affecter les mesures. Les méthodes de quantification de la consommation alimentaire décrites ici sont conformes aux directives publiées sur la consommation alimentaire^{des rongeurs 33}. Enfin, les changements de cage doivent être évités pendant l’expérience, car des changements environnementaux soudains peuvent réduire la consommation alimentaire pendant 1 à 2 jours, en particulier chez les jeunes souris.

Ce protocole présente plusieurs limitations. Premièrement, l’évaluation des altérations métaboliques se limite au poids corporel et à l’apport alimentaire, tandis que d’autres mesures du métabolisme systémique, telles que le rapport d’échange respiratoire (RER), la dépense énergétique et l’activité physique, n’ont pas été évaluées. De plus, les mécanismes sous-jacents à la perte de poids n’ont pas été étudiés ; Par conséquent, les contributions relatives à la réduction de la consommation alimentaire, à la dépense énergétique modifiée, à la malabsorption et à d’autres facteurs associés à l’inflammation intestinale restent floues. Deuxièmement, seuls les tissus du côlon ont été collectés et analysés, tandis que d’autres organes impliqués dans la régulation métabolique, notamment le tissu adipeux, le foie et le muscle squelettique, n’ont pas été examinés. Troisièmement, ce protocole a été développé avec des souris C57BL/6 IL-10-KO, qui peuvent présenter une susceptibilité différente à la colite par rapport à d’autres origines génétiques. Malgré ces limites, le protocole peut facilement être adapté pour intégrer un phénotypage métabolique supplémentaire et une analyse des tissus extraintestinaux, permettant d’étudier les mécanismes sous-jacents à la perte de poids ainsi que la relation entre l’inflammation intestinale et les altérations métaboliques^{systémiques 34}, ou l’évaluation de nouveaux nanomatériaux anti-inflammatoires³⁵. De plus, cette approche devrait être applicable à d’autres souches de souris IL-10-KO, bien que des études de validation supplémentaires soient nécessaires.

En résumé, les auteurs rapportent un protocole efficace et reproductible qui induit simultanément l’entérocolite chez plusieurs souris IL-10-KO et permet d’évaluer le comportement alimentaire. Des études supplémentaires sont nécessaires pour étudier les effets de l’entérocolite sur la dépense énergétique et la composition corporelle dans ce modèle, révélant ainsi des liens plus larges entre la MII et le métabolisme de l’hôte.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon