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Édition génomique dans les cellules primaires de mammifères via électroporation de l’ARN éditeur

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DOI :

10.3791/71449

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31 juillet 2026

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1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

Dans cet article

Résumé

La délivrance des éditeurs génomiques sous forme d’ARN est un moyen particulièrement puissant de modifier les génomes des cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères. L’objectif de ce protocole est de délivrer des éditeurs de génome sous forme d’ARNm dans les cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères, suivis d’un séquençage ciblé Illumina et d’une analyse afin de quantifier les résultats d’édition.

Résumé

Les éditeurs CRISPR, y compris les nucléases, les éditeurs de bases et les éditeurs principaux, peuvent corriger efficacement les variants génétiques responsables de la maladie ou perturber les gènes cibles. Les résultats d’édition sont couramment évalués dans des cellules primaires cultivées, des cellules dérivées du patient ou des lignées cellulaires modifiées pour étudier l’impact de la variation génétique ou comme première étape avant d’initier des études animales ou une traduction clinique. L’administration d’éditeurs sous forme d’ARNm avec d’ARN-guide synthétiques dans les cellules de mammifères peut améliorer l’efficacité de l’édition par rapport aux approches basées sur des plasmides et prévenir des problèmes tels que l’intégration de l’ADN ou l’édition hors cible d’une expression soutenue. Cet article présente un flux de travail pour préparer l’ARNm de l’éditeur du génome par transcription in vitro (TVI), incluant le co-capsulage et les nucléotides modifiés chimiquement, l’ARNm de l’éditeur électroporé et les ARN guides vers les fibroblastes humains primaires, les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ou les lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL), et quantifier les résultats de l’édition par séquençage ciblé d’amplicons sur une plateforme Illumina suivie d’une analyse utilisant CRISPResso2. Ce flux de travail permet un benchmarking quantitatif des ARN guides, des paramètres d’électroporation et des variantes de l’éditeur, et soutient des applications en continu incluant le clonage unicellulaire, les tests phénotypiques, les études précliniques sur les animaux et le développement thérapeutique.

Introduction

L’édition efficace du génome dans les cellules primaires de mammifères soutient la génération de modèles génétiques et l’évaluation préclinique des stratégies thérapeutiques candidates. Les avancées récentes dans les technologies basées sur CRISPR, notamment l’édition de base et l’édition de base, permettent des modifications précises des nucléotidiques sans introduire de ruptures d’ADN double brin, améliorant ainsi la pureté des résultats d’édition 1,2. Ces technologies ont été appliquées avec succès dans la modélisation des maladies et les études thérapeutiques d’édition du génome, y compris des stratégies pour corriger les variants conduisant à la drépanocytose3 et à la mucoviscidosekystique 4.

Une stratégie particulièrement efficace pour fournir des composants d’édition génomique aux cellules de mammifères est l’électroporation d’ARNm transcrit in vitro (IVT) codant pour l’enzyme d’édition combinée à des ARN-guide synthétiques (gRNA). La délivrance d’ARNm permet une expression transitoire des éditeurs du génome, minimisant l’activité prolongée des nucléases et réduisant la probabilité d’événements d’édition hors cible. Les avancées dans la technologie IVT ont amélioré l’efficacité, le rendement et la qualité de la synthèse d’ARNm 4,5,6. Les modèles d’ADN plasmidique et les modèles d’ADN dérivés de la PCR sont tous couramment utilisés pour la transcription in vitro et présentent chacun des avantages et des limites distincts. Dans ce protocole, les modèles générés par PCR sont préférés afin d’éviter les problèmes liés à la propagation de longs tracts poly(A) dans les plasmides, qui sont sujets à la recombinaison et à la variabilité de la longueur. Cependant, l’utilisation de gabarits PCR comme décrit dans ce protocole nécessite une amorce inversée coûteuse qui abrite la queue poly(A) à 120 nucléotides, et la PCR peut être plus sujette à l’erreur que la propagation bactérienne des plasmides pour les séquences non codées dans les amorces. En alternative, des fournisseurs commerciaux comme Elegen et 4basebio peuvent fournir des modèles d’ADN haute fidélité, offrant une option fiable, bien que plus coûteuse, pour générer des modèles de transcription.

Une conception attentive de l’ARN guidé est un autre élément clé du succès des expériences d’édition du génome. Plusieurs outils informatiques ont été développés pour aider les chercheurs à identifier les séquences gRNA optimales en se basant sur l’efficacité prédite sur la cible et sur une activité hors-cible minimale. Les plateformes largement utilisées incluent CHOPCHOP et CRISPOR, qui permettent d’identifier des séquences guides compatibles avec les exigences du motif adjacent au protospacer (PAM) des enzymes Cas et fournissent des métriques de notation pour prioriser des guides candidats avec une activité et une spécificité préditesélevées 7,8. Les principes fondamentaux et les meilleures pratiques pour la conception d’ARN guide ont été largement décrits dans la littératureCRISPR 9,10,11,12,13.

L’électroporation est couramment utilisée pour délivrer des réactifs d’édition génomique aux cellules de mammifères car elle peut atteindre une grande efficacité de délivrance dans des types cellulaires généralement résistants aux approches de transfection à base de lipides. L’électroporation perméabilise transitoirement la membrane cellulaire, permettant aux acides nucléiques exogènes tels que l’ARNm et les gRNA d’entrer dans le cytoplasme. Des protocoles d’électroporation optimisés ont été développés pour plusieurs types cellulaires de mammifères, notamment les cellules primaires, les fibroblastes, les lignées cellulaires lymphoblastoïdes et les cellules souches pluripotentesinduites 14. Les plateformes commerciales d’électroporation telles que les systèmes Lonza 4D et Amaxa proposent des programmes et réactifs spécifiques aux types cellulaires conçus pour améliorer l’efficacité de la livraison tout en maintenant la viabilité cellulaire. Des systèmes d’électroporation à haut débit tels que la plateforme Shuttle Amax à 96 puits permettent en outre des expériences d’édition génomique évolutives à travers de multiples conditions expérimentales. Le système d’électroporation au néon est également couramment utilisé mais n’est pas le centre de ce protocole.

Après la livraison des composants d’édition du génome, les résultats d’édition sont généralement évalués à l’aide d’un séquençage de nouvelle génération (NGS) ciblé de la région génomique entourant le site d’édition. Les bibliothèques de séquençage sont générées par amplification PCR du locus cible, suivie d’indexation et de séquençage à haut débit. Les lectures de séquençage résultantes sont analysées à l’aide de pipelines bioinformatiques spécialisés conçus pour des expériences d’édition génomique. Dans ce protocole, les résultats d’édition sont quantifiés à l’aide de CRISPResso2, une plateforme informatique largement utilisée qui permet une analyse détaillée des résultats d’édition du génome à partir des données deséquençage 15. CRISPResso2 aligne les lectures de séquençage à une séquence de référence et quantifie les résultats d’édition, incluant l’efficacité globale de l’édition, les fréquences d’insertion-suppression (indel), les substitutions précises de nucléotides et les distributions d’édition dans la région cible. Le logiciel fournit également des visualisations graphiques et des résumés statistiques facilitant la comparaison entre les conditions expérimentales et l’optimisation des paramètres de montage.

Ensemble, l’intégration d’une production d’ARNm IVT de haute qualité, une livraison optimisée par électroporation et une analyse de séquençage haute résolution offrent un flux de travail robuste pour évaluer les stratégies d’édition du génome dans les cellules cultivées (Figure 1). Cette approche permet une optimisation itérative de l’efficacité de l’édition, de la spécificité et des paramètres expérimentaux avant de faire progresser les stratégies d’édition du génome vers des études in vivo et des applications thérapeutiques potentielles.

Protocole

Déclaration d’éthique :
Toutes les procédures impliquant des lignées cellulaires d’origine humaine ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et aux protocoles approuvés.

1. Générer un gabarit linéaire d’ADN en utilisant la PCR

Attention : Effectuez toutes les étapes de l’ARN en utilisant des consommables et des surfaces de travail sans RNase. Considérez les éditeurs d’ARNm listés et leurs différentes variantes lors du choix de l’éditeur approprié pour la modification génomique souhaitée (Tableau 1).

  1. Assemblez la réaction PCR sur l’ADN plasmidique extrait de bactéries à l’aide d’un miniprep ou d’un kit midiprep. Utiliser 20 ng d’ADN plasmidique par réaction PCR de 50 μL avec l’enzyme NEBNext Ultra II Q5 Master Mix, en assemblant la PCR comme décrit dans le tableau 2.
    1. Utilisez un amorce avant qui corrige le promoteur T7 inactif sur le plasmide, ce qui empêche la transcription circulaire.
    2. Utilisez une amorce inversée qui introduit une queue poly(A)₁₂₀ de 120 nt pour soutenir une transcription efficace et la stabilité de l’ARNm.
    3. Utilisez la N1-méthyl-pseudouridine à la place de l’uracile et incluez CleanCap AG pour améliorer la traduction de l’ARNm et réduire l’activation immunitaire innée 1,2,3,4 (Figure 1).
      REMARQUE : D’autres analogues nucléotidiques et réactifs de condensation sont disponibles, mais ceux-ci ont montré une forte activité dans l’édition du génome des ARNm. La livraison par nanoparticules est une alternative appropriée mais n’est pas abordée dans ce protocole.
  2. Amplifiez la séquence de codage de l’éditeur par PCR pendant 30 cycles à l’aide d’amorces qui introduisent un promoteur T7 fonctionnel en amont de la région codante et une séquence poly(A) en aval (Tableau 2 et Tableau 3).
    REMARQUE : La séquence nucléotidique du modèle IVT est soulignée dans le tableau 4.
  3. Vérifiez et purifiez le produit PCR
    1. Faites passer 5 μL du produit PCR sur un gel d’agarose à 1 % dans un tampon TE à 180 V pendant 30 minutes. Confirmez la présence d’une seule bande à environ 4000-6500 pb (selon l’éditeur transcrit) avant de procéder à la purification du produit PCR.
    2. Purifiez le produit PCR à l’aide d’un kit de nettoyage PCR (Table of Materials).
      REMARQUE : Si plusieurs bandes ou une mauvaise qualité du produit PCR sont observées, optimisez les conditions de thermocyclage (Tableau 5 – Tableau de dépannage).
    3. Quantifiez l’ADN purifié à l’aide d’un test dsDNA fluorométrique. Pour l’analyse dsDNA Qubit, préparez le mélange maître tampon-colorant en combinant 796 μL de la solution de travail à haute sensibilité Qubit avec 4 μL de colorant, tous deux fournis dans le kit.
    4. Dans des tubes séparés, mélangez 198 μL du mélange maître tampon-colorant avec 2 μL de la norme de basse concentration S1, de la norme à haute concentration S2, et l’échantillon. Insérez chaque étalon et échantillon comme indiqué dans l’instrument fluoromètre Qubit pour mesurer la concentration de stock.
      REMARQUE : Si les échantillons dépassent la plage d’analyse, il peut être nécessaire de préparer des dilutions.

2. Transcrire l’ARNm

  1. Préparez la réaction IVT sur glace en utilisant l’ARN polymérase T7, des NTP, un analogue de la capsule co-transcriptionnelle, et du N1-méthyl-pseudouridine triphosphate comme substitut de l’uridine pour réduire l’activation immunitaireinnée 1˒5˒6.
  2. Préparez le mélange réactionnel IVT selon le tableau 4. Utilisez la séquence de modèles annotés fournie dans le tableau 4. Assemblez chaque réaction de transcription dans un volume final de 40 μL.
  3. Préparez 5 à 10 tubes de réaction pour générer suffisamment d’ARNm pour plusieurs expériences. Chaque réaction de 40 μL génère environ 100 μg d’ARNm. Avec 1 μg d’ARNm utilisé pour l’électroporation en prime editing et 3 μg d’ARNm utilisés pour l’électroporation en édition de bases, cela suffit pour ~33 à 100 électroporations.
  4. Transcrire l’ARN
    1. Mélangez soigneusement la réaction de la TVI en pipettant. Incubez la réaction à 37 °C pendant 2 heures.
  5. Purifier l’ARN
    1. Transférez dans un tube de 1,5 mL et ajoutez une solution de chlorure de lithium (LiCl) de 7,5 M à la réaction IVT à un volume égal à la moitié du volume total de la réaction pour obtenir une concentration finale de LiCl de 2,5 M. Pour une réaction IVT de 40 μL, ajoutez 20 μL de 7,5 M LiCl. Mélangez soigneusement en pipotant doucement.
    2. Incubez la réaction à -20 °C pendant 30 minutes. Centrifugez l’échantillon à 16 000 × g à 4 °C pendant 15 minutes.
    3. Retirez le surnageant avec une pipette et jetez-le. Lavez le pellet avec 1 mL d’éthanol à 70 % à 4 °C. Il n’est pas nécessaire de déranger la pastille. Centrifugez à 16 000 × g à 4 °C pendant 5 minutes.
    4. Retirez complètement l’éthanol et laissez le pellet sécher à l’air pendant 1 à 2 minutes dans un cabinet de biosécurité sans RNase. Ne pas trop sécher les granulés, sinon il peut être difficile de le resuspendre.
  6. Resuspendez et quantifiez l’ARN
    1. Resuspendez l’ARN dans de l’eau sans nucléase. Initialement, resuspendez chaque réaction dans 50 μL d’eau sans nucléase et diluez davantage après avoir mesuré la concentration d’ARN. Quantifiez l’ARN à l’aide d’un test d’ARN fluorométrique tel que le nanodrop.
      Point de pause : Après la quantification de l’ARN et l’aliquotation, stockez les aliquotes d’ARNm à -80 °C jusqu’à l’électroporation. Éviter les cycles répétés de gel-dégel ; Décongelez chaque aliquote une seule fois avant utilisation.
    2. Confirmez que le rendement d’ARNm purifié est d’environ 100 à 400 μg par réaction IVT de 40 μL. Diluez l’ARNm à 2 μg·μL-1 avec de l’eau sans nucléase avant d’aliquoter. Stockez les aliquotes à −80 °C.
      REMARQUE : Évitez les cycles répétés de gel-dégel. Préparez des aliquotes à usage unique et jetez le matériau décongelé non utilisé. Préparez 12,5 μL d’aliquotes dans des bandes PCR pour 8 à 20 électroporations par aliquote.
  7. Évaluer l’intégrité de l’ARN
    1. Évaluer la taille et l’intégrité de l’ARN par électrophorèse sur gel d’agarose ou électrophorèse automatisée (Figure 2)
    2. Préparez un gel d’agarose à 0,8 % contenant 10 000 fois dilué de SYBR Gold. Utilisez une échelle d’ARN simple brin, telle que le marqueur d’ARNss-sn NEB.
    3. Dénaturez l’ARNm à l’aide de 2x colorants de charge en gel d’ARN et chauffez les échantillons à 65 °C pendant 10 minutes avant de charger les échantillons sur le gel.
    4. Confirmez que l’ARNm apparaît comme une bande prédominante à environ 4000-6500 nt, selon l’éditeur transcrit, avec un faible ébauche ou des produits à faible poids moléculaire. Jetez les échantillons d’ARN présentant une dégradation importante, des floues ou plusieurs bandes inattendues.

3. Conception et préparation des ARN-guides

REMARQUE : Identifier les séquences de motif adjacent au protospacer (PAM) au sein du locus génomique cible et sélectionner les ARN-guides compatibles avec l’éditeur choisi et la modification génomique prévue. Des plateformes de conception d’ARN guides telles que CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPRware, IDT Cas9 Checker, Benchling et VectorBuilder peuvent être utilisées pour prioriser les ARN guides avec une activité et une spécificité préditesfavorables 6,7,8,9,10,11,12,13.

  1. Identifier les sites PAM au sein du locus génomique cible compatibles avec la variante nucléase sélectionnée, y compris les variantes compatibles NGN, en utilisant des outils de conception d’ARN-guide.
  2. Sélectionnez les ARN-guides avec une activité prédite élevée sur la cible et une faible activité hors-cible prédite. Confirmez la fenêtre d’édition pour l’ARN guide.
  3. Pour les applications de montage de base ou d’édition principale, sélectionnez des ARN guides qui positionnent l’édition souhaitée dans la fenêtre d’activité optimale de l’éditeur sélectionné.
  4. Ordre sgRNA ou pegARN contenant des analogues de la base 2'-O-méthyle pour les 3 premiers et les 3 derniers nucléotides, ainsi qu’une liaison phosphorothioate 3' entre les 3 premières et les deux dernières bases des guides.
  5. Resuspendez les ARN-guides dans de l’eau sans nucléase ou dans un tampon TE (100μM). Préparez des aliquotes de 5 μL et stockez les aliquotes à −80 °C. Au moment de l’utilisation, décongeler et diluer dans un tampon d’électroporation avant l’électroporation.

4. Préparation en culture cellulaire

REMARQUE : Évaluer l’intégrité cellulaire par microscopie et par tests de viabilité avant électroporation.

  1. Cultivez des fibroblastes primaires ou des cellules HEK293T dans le DMEM complétés avec un stade de 10 % FBS, 4,5 g· L-1 glucose, GlutaMAX, et 110 mg· L-1 pyruvate de sodium. Placez les cellules sur des flasques T75 stériles (surface du TC) à une confluence de 20 % par flasque. Maintenez les cellules entre les passages 1 à 20. Séparez les cellules à 80 % de confluence et utilisez les cellules à 70-80 % de confluence pour l’électroporation.
  2. Culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu mTeSR Plus. Placez les cellules sur des flasques T75 stériles recouvertes de Geltrex à 20 % de confluence par flasque. Changez de milieu quotidiennement et maintenez les cellules entre les passages 1 à 20. Ajoutez le cocktail CEPT au support pour les 24 heures suivant chaque passage. Séparez les cellules à 80 % de confluence et utilisez les cellules à 70-80 % de confluence pour l’électroporation.
  3. Maintenir les cellules à 37 °C en 5 % de CO₂ jusqu’à ce qu’elles atteignent la densité appropriée pour l’électroporation, généralement une confluence de 70 % à 80 %.
  4. Retirez le milieu lorsque les cellules sont à un nombre et une confluence appropriés pour l’électroporation.
  5. Ajoutez l’enzyme TrypLE Express aux cellules (1 mL pour un flacon de T75) et incubez à 37 °C pendant 5 minutes. Pipetez doucement les cellules contre la fiole pour obtenir une suspension unicellulaire. Arrêtez la dissociation en ajoutant 3 mL de milieu de culture cellulaire, et confirmez l’absence de gros amas cellulaires avant de compter.
  6. Pelletez les cellules à 1 000 × g pendant 5 minutes, lavez les cellules une fois avec du sérum physiologique Dulbecco (DPBS) de 15 mL, puis centrifugez à nouveau les cellules.
  7. Évaluer la concentration et la viabilité cellulaires à l’aide d’un test automatisé de viabilité tel que le Nucleocounter NC-3000 avec la solution 13. Combinez 11,4 μL de cellules avec 0,6 μL de solution 13 avant la mesure sur le nucléocompteur. Procéder à l’électroporation uniquement lorsque la viabilité cellulaire est d’au moins 85 %, et rejeter ou repréparer les échantillons en dessous de ce seuil.
  8. Resuspendez les cellules à une densité d’environ 0,5 × 106–2 × 106 cellules·mL-1 dans le DPBS. Comptez les cellules et évaluez leur viabilité à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire.
  9. Ne procédez que si la viabilité cellulaire est ≥ 85 %.
  10. Resuspendez les cellules dans un tampon d’électroporation. Resuspendez 2 × 105 cellules dans 5 μL de tampon d’électroporation froide par réaction.
  11. Préparez le tampon d’électroporation avec la solution de supplément selon les instructions du fabricant immédiatement avant l’utilisation et maintenez le tampon sur glace.
  12. Gardez les cellules froides et procédez rapidement. Maintenez les cellules sur la glace et passez immédiatement à l’installation d’électroporation.

5. Électroporation

REMARQUE : Préparez le montage de la cargaison dans des tubes à bande PCR pour faciliter le pipétage multicanal. Après électroporation, resuspendez les cellules dans un milieu complété avec un cocktail CEPT pour améliorer la survie cellulaire12.

  1. Préparez la cargaison d’ARN.
    1. Préparez la cargaison d’ARN sur glace en combinant l’ARNm éditeur et les ARN-guides dans un tampon d’électroporation.
    2. Pour les éditeurs de bases et les nucléases, préparez une solution finale d’électroporation contenant 1,5 μL (3 μg) d’ARNm, 0,5 μL (50 pmol) d’ARN-guide et 15 μL de tampon d’électroporation par échantillon.
    3. Pour les éditeurs primaires, préparez une solution finale d’électroporation contenant 0,5 μL (1 μg) d’ARNm, 1,5 μL (150 pmol) d’ARN-guides et 15 μL de tampon d’électroporation par échantillon.
    4. Préparez les solutions de cargaison ARN comme un mélange maître de 1,2× pour compenser la perte de volume lors du transfert et de la manipulation de l’échantillon. Optimisez les volumes et ratios de réactifs pour chaque site cible et chaque variante éditrice selon les besoins.
  2. Distribuez les cellules, la cargaison et l’électroporation.
    1. Ajoutez 5 μL de la suspension de la cellule à chaque puits d’électroporation.
    2. Ajoutez 17 μL de cargaison d’ARN dans un tampon d’électroporation à 5 μL de cellules. Mélangez la suspension en pipettant deux fois.
      Attention : Avancez rapidement après avoir combiné les cellules et la cargaison d’ARN, car les RNases sécrétées par les cellules peuvent dégrader rapidement l’ARNm éditeur. Terminez l’électroporation en moins de 2 minutes après avoir mélangé les cellules et la cargaison d’ARN.
    3. Exécutez le programme d’électroporation optimisé pour le type de cellule sélectionné (Tableau 6 ; Figure 2 ; Figure 3).
      1. Pour les fibroblastes cutanés humains primaires ou cellules HEK293T, utilisez le système d’électroporation Lonza 4D avec SF tampon. Ajoutez 200 000 cellules par réaction à une cuvette d’électroporation de 20 μL. Exécutez le programme CM-130. Ajoutez immédiatement 80 μL de DMEM préchauffé + 10 % de FBS, 4,5 g· L-1 glucose, 4 mM de L-glutamine, et 110 mg· L-1 pyruvate de sodium. Récupérer les cellules pendant 10 minutes avant de les diluer en plaques à 96 ou 24 puits.
      2. Pour les cellules souches pluripotentes, utilisez le système d’électroporation Lonza 4D avec tampon P3. Ajoutez 200 000 cellules par réaction à une cuvette d’électroporation de 20 μL. Exécutez le programme DN-100. Ajoutez immédiatement 80 μL de média mTeSR Plus préchauffé. Récupérer les cellules pendant 10 minutes avant de les diluer en plaques à 24 puits.
    4. Examinez les cellules quotidiennement après le plaque pour surveiller la santé cellulaire et la récupération.

6. Extraction d’ADN génomique

REMARQUE : Assurez-vous que l’ADN génomique est d’une qualité suffisante et exempt d’inhibiteurs avant l’amplification par PCR, car la qualité de l’ADN peut influencer la préparation de la bibliothèque de séquençage et la quantification précise des résultats d’édition dugénome 9,10,11.

  1. Laver et prélever les cellules.
    1. Collectez les cellules 2 à 3 jours après l’électroporation. Lavez les cellules une fois avec du DPBS et procédez immédiatement à l’extraction de l’ADN génomique.
    2. Préparez le tampon de lyse incomplet en combinant 10 mL de 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 5 mL de solution de dodécyle sulfate de sodium (SDS) à 10 % (en poid/vol) et de l’eau sans nucléase pour un volume final de 1 L. Conservez le tampon de lyse incomplet à température ambiante pendant jusqu’à 6 mois.
    3. Préparez fraîchement un tampon de lyse complet en ajoutant la protéinase K à une dilution 1:1 000 (vol/vol) à une aliquote de tampon de lyse incomplète. Ajoutez le tampon de lyse complet aux cellules pour initier la lyse. Ajouter 40 μL de tampon de lyse complet à chaque puits contenant environ 80 000 cellules dans une plaque de 96 puits. Ne faites pas de pipettes de haut en bas car cela pourrait entraîner une perte d’échantillon.
  2. Digérez les échantillons.
    1. Incubez les échantillons à 37 °C pendant 60 minutes pour compléter la lyse cellulaire et la digestion de la proténasase K.
  3. Inactiver la protéinase K.
    1. Transférez les lysats sur des tubes PCR ou une plaque PCR à 96 puits. Incubez les échantillons à 80 °C pendant 30 minutes pour inactiver la protéinase K.
  4. Stockez les lysats.

Point de pause : Conservez les lysats à −20 °C jusqu’à l’amplification par PCR.

7. Séquençage ciblé des amplicons pour l’analyse d’édition

REMARQUE : Poolez les produits PCR en quantités équimolaires avant le séquençage. Environ 10 000 lectures de séquençage par échantillon suffisent généralement à quantifier les résultats d’édition massive du génome.

  1. Concevoir des amorces spécifiques au locus pour générer environ 300 pb d’amplicons couvrant au moins 25 pb en amont et 25 pb en aval du site d’édition (Tableau 7).
  2. Amplifier le locus génomique cible en réalisant la PCR1 selon les conditions fournies dans le tableau 8, tableau 9.
  3. Ajoutez des indices d’échantillon uniques par PCR en utilisant le produit PCR1 comme modèle, comme avec les amorces montrées dans le tableau 7 « Exemple d’amorces d’indexation PCR ». Utilisez les conditions PCR comme indiqué à l’onglet 2 des Tables 8 et 9.
  4. Faites fonctionner les produits PCR1 et PCR2 sur un gel d’agarose à 1,5 % pour confirmer la présence de bandes simples aux tailles attendues.
  5. Regroupez les produits PCR2 en quantités équimolaires. Nettoyez la bibliothèque PCR2 poolée en utilisant le rapport billes/échantillons AMPure XP de 0,65:1 selon les instructions du fabricant. Éluvez la bibliothèque purifiée dans 30 μL d’eau sans nucléase et confirmez le retrait des dimères adaptateurs par électrophorèse sur gel avant le séquençage.
  6. Quantifiez la bibliothèque finale regroupée à l’aide d’un test dsDNA fluorométrique. Évaluer la distribution de la taille des fragments par électrophorèse capillaire.
  7. Séquencez les bibliothèques en utilisant des lectures à une extrémité unique de 300 cycles sur un instrument Illumina MiSeq. Diluez la bibliothèque finale en pool à 4 nM. Combinez 5 μL de la bibliothèque commune de 4 nM avec 5 μL de 0,1 M NaOH et la pipette pour mélanger. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante pour dénaturer, puis ajoutez 990 μL de tampon HT refroidi fourni avec le kit MiSeq pour neutraliser la solution et diluez à 20 pM. Pic du contrôle PhiX de 15 %. Chargez la bibliothèque sur une cartouche Illumina MiSeq et exécutez un séquençage à une extrémité unique de 300 cycles en utilisant les réglages standards du fabricant. Visez à générer environ 30 000 lectures par échantillon, bien que 10 000 lectures par échantillon suffisent pour l’analysed’édition 12. Le séquençage MiSeq peut être réalisé par échantillon dans certaines entreprises telles que Genewiz ou Quintara.

8. Analyse des résultats d’édition du génome

Note : L’analyse CRISPResso2 permet de quantifier l’efficacité globale du montage, les fréquences de conversion des nucléotides et les fréquences d’insertion/délétion (indel), et peut être utilisée pour caractériser les résultats du montage dans des conditionsexpérimentales 15.

  1. Démultiplexez les données de séquençage et organisez les fichiers FASTQ selon le locus génomique et la condition expérimentale.
  2. Installez CRISPResso2 selon les instructions fournies dans le dépôt Github (https://github.com/pinellolab/crispresso2).
  3. Exécutez une analyse batch CRISPResso2 à l’aide de batch.txt fichiers qui spécifient les fichiers FASTQ d’entrée et les paramètres d’analyse (exemples fournis dans le Tableau 7). Fixez le score minimum de qualité de lecture à 30. Réglez la largeur de la fenêtre « w » à 20. Si l’on utilise des éditeurs de bases de cytosine, certains indels peuvent être centrés autour des nucléotides modifiés en base en plus du site nick. Dans ce cas, ajustez le centre de fenêtre « wc » à -10 plutôt que le centre par défaut au site du nick pour mieux capturer ces indels.
  4. Extraire les sorties quantitatives, telles que les fréquences de conversion des nucléotides, les fréquences d’insertion/délétion (indel), et (le cas échéant) les fréquences HDR ou d’édition nombreuse à partir des fichiers de sortie résumés appropriés. Celles-ci se trouvent généralement dans des fichiers nommés « CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt » et « Nucleotide_percentage_summary.txt », qui peuvent être ouverts dans Microsoft Excel ou d’autres logiciels de retouche de tableurs.
  5. Exportez les valeurs de montage quantitatif pour le tracé en aval et l’interprétation des données, comme dans les Figures 3-4. Utilisez les fichiers « alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf » (comme montré à la Figure 5) pour évaluer les résultats de l’édition allélique.

Résultats

L’utilisation d’un éditeur efficace avec un site de test facilement accessible, comme l’éditeur de base ABE8e avec le site de contrôle HEK3, peut souvent aboutir à des efficacités d’édition supérieures à 90 % si le système de diffusion est bien adapté aux cellules utilisées dans l’expérience. Des gains d’efficacité d’édition plus faibles peuvent survenir s’il y a des problèmes avec l’ARNm de l’éditeur, l’ARN guide, le site cible ou les conditions de diffusion qui rendent l’ARN moins adapté à l’édition. L’utilisation de variantes Cas9 qui accèdent à des séquences PAM plus polyvalentes mais les lient moins étroitement, ou le ciblage des éditeurs vers des nucléotides situés en dehors de leur fenêtre d’édition idéale, peut réduire l’efficacité du montage. Les ARNm éditeurs générés par IVT réussis apparaissent généralement comme une seule bande prédominante avec un faible évoquage ou des produits de dégradation à faible poids moléculaire, indiquant une intégrité élevée des transcrits adaptée à l’électroporation en aval (Figure 2).

Après électroporation de l’ARNm éditeur et des ARN-guides synthétiques, la plupart des cellules se récupèrent en 24 à 48 heures et maintiennent leur morphologie typique grâce à des programmes d’électroporation appropriés (Figure 3–4). Les conditions d’électroporation doivent être adaptées au type de cellule spécifique, car différents tampons peuvent produire des résultats nettement différents. Le Lonza Knowledge Center en ligne propose des recommandations pour des codes tampons et d’électroporation pour les types cellulaires courants, et Lonza propose des kits d’optimisation séparés pour les lignées cellulaires et les cellules primaires. La comparaison empirique des tampons peut aider à identifier des conditions optimales pour une livraison efficace. Des programmes inadaptés peuvent entraîner une absence totale de livraison ou être très toxiques pour les cellules (perdant plus de 50 % ou empêchant la poursuite du cycle cellulaire). Des expériences d’optimisation représentative ont démontré des différences substantielles dans les résultats d’édition selon les conditions d’électroporation, certains programmes offrant de fortes efficacités d’édition tandis que d’autres produisaient une édition minimale, soulignant l’importance de l’optimisation empirique pour chaque type de cellule (Figure 3–4).

À travers les iPSC, les fibroblastes et les LCL, un séquençage ciblé d’amplicons suivi d’une analyse CRISPResso2 est utilisé pour quantifier l’efficacité de l’édition et les sous-produits (Figure 4). L’édition des bases adénine du lieu de test HEK3 est illustrée ici (Figure 4), ce qui a abouti aux conversions nucléotidiques prévues avec de basses fréquences indel dans les échantillons analysés. L’analyse CRISPResso2 permet de visualiser les allèles édités et non modifiés au lieu cible et facilite la quantification des conversions nucléotidiques prévues, des fréquences indel et d’autres sous-produits d’édition, fournissant une évaluation complète des résultats d’édition (Figure 5). L’efficacité du montage est quantifiée en mesurant la fréquence de cette substitution précise d’un seul nucléotide au site cible. Le locus HEK3 est utilisé comme locus de modèle en raison de son profil de montage bien caractérisé et de sa reproductibilité à travers les systèmes expérimentaux, permettant une évaluation robuste des performances de montage de base sous différentes conditions. Nous recommandons de tester ce guide comme contrôle positif dans les cellules humaines lors de l’optimisation de nouvelles procédures d’édition. L’édition de base est généralement enrichie pour les conversions nucléotides prévues avec de basses fréquences d’index, tandis que l’édition de base produit un mélange de modifications précises et de sous-produits bassesfréquences 3,12. Les efficacités du montage variaient selon les conditions, avec des différences nettes observées entre les types cellulaires et les programmes d’électroporation (Figure 3-4). Ces variations reflètent probablement des différences dans l’absorption cellulaire, la viabilité et l’activité de réparation de l’ADN, ainsi que l’influence des paramètres d’électroporation sur l’efficacité de la délivrance. Collectivement, ces résultats soulignent l’importance d’optimiser les paramètres d’électroporation spécifiques au type cellulaire afin d’obtenir des résultats d’édition cohérents et maximaux.

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Figure 1. Préparation de l’ARNm éditeur par transcription in vitro.
Aperçu schématique de la génération d’ARNm de l’éditeur. (Étape 1) Préparation du gabarit plasmidique contenant la séquence de codage de l’éditeur et le promoteur T7. (Étape 2) Amplification par PCR pour générer un modèle linéaire d’ADN. (Étape 3) Transcription in vitro utilisant l’ARN polymérase T7 pour synthétiser l’ARNm plaqué. (Étape 4) Purification de l’ARNm pour éliminer l’ADNm, les enzymes et les nucléotides libres. L’ARNm recouvert obtenu est adapté à une livraison en aval dans les cellules de mammifères par électroporation ou nanoparticule lipidique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2. Exemple d’image d’électrophorèse sur gel d’ARNm 
Image par électrophorèse de trois ARNm éditeurs de génome appliquée sur un gel d’agarose à 1 % à l’aide de coloration à l’or SYBR. L’échelle d’ARNSSss de NEB est indiquée à gauche avec des marqueurs de taille indiqués par leur longueur. L’absence de bavage substantiel ou de petites bandes indique que ces ARNm sont de qualité adéquate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3. Optimisation des conditions d’électroporation pour l’édition du génome dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC). 
Les efficacités de montage obtenues sous différentes conditions d’électroporation dans les iPSC sont montrées. Les cellules ont été électroporées à l’aide de multiples tampons et combinaisons de programmes, notamment le tampon CB-150 P4, le tampon CD-118 P3, le tampon DN-100 P3, le tampon DC-100 P3, tous sur le dispositif de nucléofection Lonza 4D. Le montage a été évalué à l’aide du dispositif d’électroporation néon avec des paramètres (1600 V, 20 ms, 1 impulsion). L’efficacité du montage a été quantifiée par une analyse de séquençage ciblée du locus édité. N=1 par échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 4. Optimisation des conditions d’électroporation pour l’édition génomique chez les fibroblastes.
Efficacité d’édition après électroporation à l’aide de différents programmes de nuccléofection. Les fibroblastes ont été électroporés à l’aide de plusieurs programmes Lonza Nucleofector (CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114 et FF-113), et les résultats de l’édition ont été quantifiés par séquençage ciblé. Les résultats sont présentés pour deux réplications (P2, P3). Un contrôle négatif sans livraison par l’éditeur est inclus. La comparaison des codes d’électroporation met en lumière les différences d’efficacité d’édition selon les paramètres d’électroporation, permettant d’identifier les paramètres optimaux pour l’édition du génome des fibroblastes. N=1 par échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 5. Caractérisation des résultats d’édition génomique au niveau du locus ciblé. 
Sortie de la table de fréquence des allèles de CRISPResso2, qui affiche l’abondance relative des allèles modifiés et non modifiés entourant la région cible de l’ARNsg, telle que déterminée par une analyse de séquençage à haut débit après l’édition. Les annotations rouges indiquent la fenêtre d’édition des bases et le polymorphisme hétérozygote préexistant présent dans la lignée cellulaire utilisée. La séquence d’espacement de l’ARN guide est soulignée en gris. La « position de clivage prédite » indiquée par une ligne pointillée est décalée par rapport à la position typique « PAM moins 3 » pour SpCas9 en raison de la modification du « wc » du centre de la fenêtre dans notre fichier Batch d’analyse (exemple dans le Tableau 8). Cela ne déplace pas réellement la véritable position de clivage prédite, mais la sortie est montrée ainsi pour indiquer que les indels entourant la ligne pointillée dans une fenêtre de 20 nucléotides seront évalués, capturant à la fois les indels centrés au véritable site de la découpe ainsi que ceux centrés aux nucléotides désordonnés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1. Éditeurs et séquences utilisés dans cette étude 
Colonne 1 : Éditeurs génomes disponibles sur AddGene pour la transcription in vitro. Noms et identifiants d’Addgène pour plasmides disponibles susceptibles de transcription in vitro comme décrit dans ce protocole. Colonne 2 : Séquences d’espaceurs d’ARN guides utilisées dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2. Réactifs PCR pour l’amplification du modèle plasmidique d’ARNm.
La liste des réactifs et composants de réaction utilisés pour l’amplification par PCR du modèle plasmidique afin de générer de l’ADN linéaire destiné aux applications en aval, ainsi que la séquence des amorces de transcription directe et inverse. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3. Conditions de cycle PCR pour l’amplification du modèle d’ARNm. 
Ce tableau présente les conditions de thermocyclage utilisées pour l’amplification par PCR du gabarit d’ARNm à partir de l’ADN plasmidique avant les applications en aval. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4. Réactifs utilisés pour les réactions de transcription in vitro (TVI). 
Ce tableau liste les réactifs et composants de réaction utilisés pour la transcription in vitro afin de synthétiser l’ARNm de l’éditeur à partir du modèle linéaire d’ADN. Un exemple de séquence de gabarit (ABE8e) est affiché avec des éléments codés par couleur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5. Guide de dépannage pour les étapes clés du flux de travail d’édition du génome. 
Ce tableau résume les problèmes techniques courants pouvant survenir lors de la préparation de l’ARNm de l’éditeur par transcription in vitro (IVT) et analyse de séquençage MiSeq. Pour chaque étape du flux de travail, des problèmes potentiels, des causes possibles et des solutions recommandées sont fournis afin d’optimiser l’efficacité du montage et d’assurer une détection précise des résultats de montage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6. Programmes d’électroporation optimaux pour différents types cellulaires de mammifères. 
Ce tableau liste les codes de programme d’électroporation et les conditions tampon utilisées pour une livraison efficace de l’ARNm éditeur et guider les ARN vers différents types cellulaires de mammifères. Les paramètres d’électroporation listés ont été testés afin d’identifier des conditions maximisant l’efficacité de l’édition génomique tout en maintenant la viabilité cellulaire. Le même programme peut ne pas fonctionner pour chaque lignée cellulaire ou source de cellules primaires, il est donc recommandé de tester des alternatives issues de cette liste si l’édition échoue initialement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 7. Paramètres d’analyse CRISPResso2 pour la quantification des résultats d’édition du génome. 
Le premier onglet présente un exemple de la conception d’amorce HTS1 utilisée pour l’amplification du locus cible. Le second onglet fournit un exemple des manuels d’indexation utilisés lors de la préparation de la bibliothèque. Le troisième onglet illustre un exemple de l’agencement d’indexation utilisé pour attribuer des indices uniques à chaque échantillon lors du séquençage. Le quatrième onglet contient un fichier batch d’entrée d’exemple pour l’analyse CRISPResso2, et le cinquième onglet fournit un exemple supplémentaire de fichier batch d’entrée d’analyse CRISPResso2. Notez que le centre de fenêtre « wc » est ajusté pour les éditeurs de bases afin de faciliter la détection des indels centrés sur les bases désordonnées en plus de celles centrées sur la coupe ou le site de la découpe ou de la découpe de la nucléase. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 8. Les réactifs PCR1 (Tab 1) et PCR2 (Tab 2) pour la préparation de la bibliothèque MiSeq.
Ce tableau liste les réactifs et composants de réaction utilisés dans l’onglet 1 (PCR1) pour amplifier les loci génomiques cibles et dans l’onglet 2 (PCR2) pour intégrer des séquences indexées spécifiques à chaque échantillon et des adaptateurs de séquençage Illumina, générant des bibliothèques prêtes au séquençage pour l’analyse MiSeq. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 9. Les conditions de cycle PCR1 (Tab 1) et PCR2 (Tab 2) pour la préparation de la bibliothèque MiSeq.

Ce tableau liste les conditions de thermocyclage utilisées dans l’onglet 1 (PCR1) pour amplifier les régions génomiques cibles et dans l’onglet 2 (PCR2) pour intégrer des séquences indexées spécifiques à chaque échantillon et des adaptateurs de séquençage Illumina, générant des bibliothèques prêtes au séquençage pour l’analyse MiSeq. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Ce protocole fournit un flux de travail pour l’édition du génome dans les cellules primaires de mammifères en utilisant l’électroporation de l’ARNm de l’éditeur et des ARN-guides synthétiques. La délivrance en tant qu’ARNm tend à permettre une édition plus efficace par rapport à la délivrance des plasmides, et l’ARNm tend à être plus simple et plus cohérente entre les lots par rapport à la protéine éditrice ou à la ribonucléoprotéine. Lorsque les formes d’ARNm et de ribonucléoprotéines d’éditeurs de bases ont été comparées directement dans certains travaux antérieurs, l’ARNm a obtenu une meilleure efficacitéd’édition 3. Comparé aux méthodes de délivrance plasmidique ou virale, la délivrance basée sur l’ARNm permet une expression transitoire et réduit le risque d’intégration génomique, bien qu’elle puisse nécessiter une optimisation pour différents types cellulaires. En plus d’une efficacité d’édition moindre, l’utilisation de l’ADN plasmidique pour l’édition du génome comporte un risque d’intégration aléatoire dans le génome des cellules cibles et peut augmenter le risque d’édition hors cible due à une expression prolongée de l’éditeur. La combinaison du séquençage par amplicons ciblés et de CRISPResso2 permet une quantification standardisée de l’efficacité du montage et la caractérisation de tout résultatallélique 3.

Plusieurs facteurs sont essentiels à la réussite. Les étapes critiques de ce protocole incluent le maintien de l’intégrité de l’ARN grâce à une manipulation stricte sans RNase, la sélection d’ARN-guides optimaux et l’optimisation soigneuse des conditions d’électroporation pour chaque type cellulaire. L’intégrité de l’ARN et un contrôle attentif de la RNase influencent fortement les résultats, et guider la sélection de l’ARN reste un déterminant principal de l’efficacité et des profils de sous-produits. Les réglages d’électroporation nécessitent une optimisation empirique par type cellulaire et certains programmes offrant un montage élevé peuvent également entraîner une toxicité. Si une faible efficacité d’édition est observée, l’optimisation des paramètres d’électroporation, de la qualité de l’ARN ou de la conception de l’ARN guide doit être envisagée. En cas de toxicité excessive, la réduction de la force d’électroporation ou de l’apport d’ARN peut améliorer la viabilité cellulaire. D’autres stratégies d’optimisation incluent le test de tampons d’électroporation alternatifs et de programmes adaptés au type de cellule cible ou de modifier les concentrations d’ARN en mode éditeur ou guide. Ce flux de travail offre une plateforme pratique pour comparer les éditeurs et produire des cellules modifiées avant le clonage en aval de cellules uniques, le phénotypage, les études in vivo ou le développement translationnel. Ce flux de travail est largement applicable pour évaluer les stratégies d’édition du génome dans les cellules primaires, permettant une comparaison systématique des modalités d’édition entre contextes génomiques et types cellulaires. Il soutient la modélisation de la maladie par l’introduction ou la correction de variants cliniquement pertinents, ainsi que par l’interrogatoire fonctionnel des éléments régulateurs codants et non codants. De plus, il offre une plateforme pour optimiser les approches de montage thérapeutique, notamment l’évaluation de l’efficacité ciblée, de l’activité hors cible et de la durabilité du montage. Le flux de travail peut également servir à filtrer et prioriser les ARN et systèmes d’édition pour guider, évaluer les stratégies de délivrance et tester des variantes spécifiques aux patients dans un cadre de médecine de précision. Collectivement, elle sert de pont polyvalent entre la biologie génomique fondamentale, la recherche translationnelle et le développement préclinique. Une limitation de cette méthode est que l’efficacité de l’électroporation et la viabilité des cellules peuvent varier considérablement selon les types cellulaires, nécessitant une optimisation empirique. De plus, les résultats de l’édition peuvent dépendre de la conception et de la pureté de l’ARN guide, ainsi que de l’accessibilité du locus cible, ce qui peut limiter la reproductibilité entre différents systèmes expérimentaux. Malgré ces contraintes, une optimisation soigneuse des paramètres expérimentaux et de la conception des guides peut atténuer la variabilité, permettant une application fiable et reproductible de cette approche à travers divers systèmes cellulaires.

Déclarations de divulgation

N.W. et E.V.B. ont déposé des demandes de brevet sur des technologies d’édition génomique via l’Université Johns Hopkins. G.A.N. a déposé des demandes de brevet liées aux technologies d’édition du génome via le Broad Institute et l’Université Johns Hopkins.

Contribution des auteurs :
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D. et G.A.N. ont chacun rédigé des sections distinctes du texte. M.V. a rassemblé et édité le texte final suivi de modifications de tous les auteurs.

Remerciements

Nous remercions Beatriz Olalla Sastre pour ses discussions utiles concernant ce protocole. Ce travail a été soutenu par le prix Big Beat Challenge de la British Heart Foundation à CureHeart (référence du prix n° BBC/F/21/220106), la Cystic Fibrosis Foundation (prix NEWBY23XX0), et les National Institutes of Health des États-Unis (R00HL163805 et DP2OD038783 à G.A.N.). J.N.W. remercie de soutenir la subvention NIH n° T32 GM148383.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Agarose Thermo Fisher Scientific R0491 Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter
ATP (100 mM) New England Biolabs N0450 
CEPT Cocktail Bio-Techne / Tocris 7200 
CleanCap AG Reagent TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, 
CTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Custom DNA Primers Integrated DNA Technologies Custom 
DNA Loading Dye New England Biolabs B7024 
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 
GTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Illumina Indexing Primers Illumina FC-131-2001 10uM stocks
Illumina MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003 
Lithium Chloride RNA Precipitation Solution Thermo Fisher Scientific AM9480 
Lonza 4D Nucleofector System Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5ul/ reaction
MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) Illumina MS-102-3002 
N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Nuclease-Free Water Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10ul of cell solution and 0.4167 μL of DAPI solution 
Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
P3 Primary Cell Nucleofector Solution Lonza V4XP-3032 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530L 
Proteinase K Thermo Fisher Scientific EO0491 Quantity: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL)
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 2,000 units/ml 100 units 
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q33230 
Qubit RNA Broad Range Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q10211 
Qubit™ Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher ScientificR06415ul/ reaction
RNA Purification Kit Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
SDS, 10% solutionThermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102 
Synthetic sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Custom 2ug 
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactionsNew England Biolabs E2040L
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 100 mL
TE buffer (Tris-EDTA)Thermo Fisher Scientific AM9849TE, pH 8.0, RNase-free Thermo
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 1X 
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mLThermo Fisher ScientificA5670701
mTSER PLUS STEM cell Technologies# 100-0276
Penicillin/Streptomycin Mixture 10,000 ug/mL, 100 mL, 4-packQuality Biological120-095-721 

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

BiologieNum ro 233Num ro 233Valeur videNum roARNmnucl ofectionIVTCSPifibroblastesditeur de basesditeur prime
Édition génomique dans les cellules primaires de mammifères via électroporation de l’ARN éditeur
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