Un protocole de séparation hémisphérique pour l'observation morphologique et l'extraction combinée d'ARN et de protéines dans des régions du cerveau murin

Résumé

Ce protocole divise en deux parties égales les cerveaux de souris. Un hémisphère est utilisé pour la coloration morphologique, et l'autre pour l'extraction d'ARN et de protéines. Cette stratégie réduit la consommation d'animaux, respecte les principes des 3R et minimise la variabilité interindividuelle.

Résumé

Dans la recherche neuroscientifique quotidienne, les colorations morphologiques et les tests moléculaires d'acides nucléiques/protéines nécessitent généralement des animaux expérimentaux distincts, ce qui augmente l'utilisation d'animaux et va à l'encontre du principe de bien-être animal des 3R. Ce protocole établit un flux de travail d'allocation tissulaire pour le tissu cérébral de souris permettant des analyses morphologiques et moléculaires appariées à partir d'un seul animal. Après une perfusion transcardiaque avec du sérum physiologique à 0,9 %, le cerveau est divisé en deux hémisphères. Un hémisphère est fixé dans du paraformaldéhyde à 4 % pour l'immunohistochimie et l'immunofluorescence ; les sections conservées dans une solution de saccharose-éthylène glycol-polyvinylpyrrolidone (PVP) conservent une qualité de coloration fiable jusqu'à sept ans. L'hémisphère controlatéral est cryopréservé à -80 °C pour une extraction combinée d'ARN et de protéines, avec des rendements suffisants pour des analyses ultérieures par qPCR et immunotransfert (Western Blot). Testée sur des prélèvements de cortex entorhinal de 9 à 10 mg, cette méthode produit des rendements d'ARN et de protéines inférieurs à ceux obtenus par extraction séparée d'ARN ou de protéines individuellement, mais les biomolécules récupérées restent suffisantes pour la détection moléculaire. Ce flux de travail réduit la consommation d'animaux et élimine les différences interindividuelles entre les analyses morphologiques et moléculaires appariées. Il fournit une méthode de préparation tissulaire réalisable pour un profilage multidimensionnel de sous-régions discrètes du cerveau de souris.

Introduction

La recherche en neurosciences s'est considérablement développée au cours des dernières décennies, révélant des mécanismes clés régissant la physiologie du cerveau humain, l'apparition des maladies neurologiques et le développement de traitements. Les modèles animaux restent indispensables à l'investigation neuroscientifique, offrant des plateformes contrôlables et reproductibles pour explorer le développement neural, la fonction physiologique et les processus pathologiques. La manipulation expérimentale et l'observation histologique chez des sujets murins permettent aux chercheurs de caractériser la signalisation neuronale, la formation des circuits neuronaux et les associations entre activité neuronale et comportement. Parallèlement aux progrès techniques, l'éthique expérimentale animale est devenue une préoccupation centrale. Les principes des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement) sont désormais des normes mondialement acceptées pour toutes les études animales^1,2, exigeant des chercheurs qu'ils minimisent l'utilisation d'animaux tout en maintenant la fiabilité des résultats expérimentaux.

Des outils innovants tels que les systèmes d'invalidation conditionnelle permettent une manipulation génétique précise au sein de sous-régions distinctes du cerveau de la souris³. Ces progrès ont stimulé des recherches intensives sur des compartiments cérébraux à micro-échelle, tels que les régions CA1, CA3 et DG de l'hippocampe, qui régulent l'apprentissage, la mémoire et l'humeur⁴. Le décryptage des fonctions complexes de ces petites régions cérébrales exige des mesures coordonnées au niveau morphologique, transcriptionnel et protéique. Malheureusement, leur faible volume tissulaire pose d'importantes difficultés techniques pour la détection multiparamétrique parallèle.

La coloration morphologique, la quantification de l'ARN et la détection immunologique des protéines sont trois analyses fondamentales courantes en neurosciences. Les protocoles de recherche traditionnels nécessitent trois cohortes distinctes d'animaux murins pour réaliser ces trois types d'analyses. Cette pratique augmente considérablement la consommation d'animaux et introduit une variation biologique interindividuelle importante, ce qui affaiblit la comparabilité entre les jeux de données histologiques et moléculaires. Un protocole unifié permettant d'obtenir des signaux morphologiques et moléculaires appariés à partir d'un seul et même animal permettrait de surmonter efficacement ces deux limitations majeures et serait davantage conforme au principe de Réduction des 3R.

Ici, nous décrivons un protocole reproductible de séparation hémisphérique pour le tissu cérébral murin. Après une perfusion systémique au sérum physiologique, l'ensemble du cerveau est divisé en deux hémisphères : un hémisphère est fixé pour des examens morphologiques, tandis que l'hémisphère controlatéral est cryopréservé afin d'extraire simultanément l'ARN et les protéines. Les tissus fixés et stockés dans un tampon protecteur contenant du saccharose, de l'éthylène glycol et de la polyvinylpyrrolidone (PVP) conservent des signaux de marquage stables et de haute qualité pour l'immunohistochimie et l'immunofluorescence pendant jusqu'à sept ans. Nous avons validé cette méthode à l'aide de biopsies très petites (9–10 mg) du cortex entorhinal, un tissu plus léger que les régions couramment étudiées telles que l'hippocampe et le cortex préfrontal. La détection réussie de cet échantillon tissulaire minuscule indique que des sous-régions cérébrales plus petites, telles que l'hypothalamus et l'amygdale, sont également compatibles avec ce protocole. Bien que ce protocole produise des concentrations d'ARN et de protéines inférieures à celles obtenues avec des kits d'extraction spécialisés à usage unique, les biomolécules isolées présentent une qualité suffisante pour permettre des analyses standards en qPCR et en immunotransfert (Western blot). Ce protocole réduit la consommation animale et élimine les différences interindividuelles entre des analyses morphologiques et moléculaires appariées. Il offre une méthode de préparation tissulaire réalisable pour un profilage multidimensionnel de sous-régions discrètes du cerveau murin.

Protocole

Déclaration éthique

Toutes les expériences animales réalisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université médicale de Dalian (numéro d'approbation AEE18026 pour les expériences sur les rats et numéro AEE24261 pour les expériences sur les souris), République populaire de Chine. Tous les protocoles expérimentaux ont été mis en œuvre conformément aux lignes directrices éthiques pour les animaux de laboratoire et se sont pleinement conformés aux principes des 3R (Réduction, Remplacement et Raffinement) en matière d'expérimentation animale. Tout au long du processus expérimental, des mesures rigoureuses ont été prises pour atténuer efficacement la souffrance et la détresse des animaux. Par ailleurs, le nombre d'animaux utilisés a été limité à la quantité minimale nécessaire pour garantir la fiabilité et la validité des résultats d'analyse statistique. Voir le Tableau des matériaux pour obtenir la liste complète des réactifs, consommables et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Préparation de l'animal expérimental et chirurgie de perfusion transcardiaque

1. Anesthésie et préparation préopératoire
   1. Utiliser des rats Sprague-Dawley ou des souris C57BL/6 mâles adultes de qualité SPF (sans agents pathogènes spécifiques) pour ce protocole. Héberger les animaux dans un environnement à température contrôlée (22 ± 2 °C) avec un cycle lumineux de 12 h d'obscurité et 12 h de lumière. Fournir aux animaux un accès ad libitum à de la nourriture et de l'eau stériles.
   2. Administrer du pentobarbital sodique aux animaux par injection intrapéritonéale à une dose de 80 mg/kg pour les rats ou de 50 mg/kg pour les souris afin d'induire l'anesthésie (voir Figure 1).
2. Procédure de perfusion transcardiale
   1. Fixer les animaux anesthésiés en position dorsale sur une planche chirurgicale.
   2. Ouvrir la paroi abdominale en suivant la ligne médiane, du processus xiphoïde au pubis, à l’aide de ciseaux droits. Inciser bilatéralement la paroi thoracique latérale afin d’exposer complètement le cœur.
   3. Perfuser l’animal avec du sérum physiologique à 0,9 % refroidi sur glace à un débit constant : 100–150 mL sur 10–15 min pour les rats et 20–30 mL sur 5–8 min pour les souris.
3. Prélèvement du cerveau et séparation des hémisphères
   1. Décapiter les animaux à l’aide de grands ciseaux chirurgicaux après la fin de la perfusion. Inciser le cuir chevelu en suivant la ligne médiane afin d’exposer le crâne.
   2. Utiliser une spatule stérile pour soulever délicatement le cerveau de la cavité crânienne. Transférer rapidement l’ensemble du cerveau dans une boîte de Pétri stérile placée sur de la glace.
   3. Utiliser une lame de rasoir stérile et exempte de RNase pour diviser symétriquement le cerveau en hémisphères gauche et droit le long de la suture sagittale.
   4. Transférer immédiatement l’hémisphère gauche dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de solution d’acide paraformaldéhyde à 4 % refroidie sur glace, pour fixation. Transférer l’hémisphère droit dans un tube de cryoconservation étiqueté et exempt de RNase, le congeler instantanément dans l’azote liquide, puis le conserver à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN et des protéines.

2. Fixation, découpage et conservation à long terme des tissus cérébraux

1. Fixation et déshydratation
   1. Immerger complètement l'hémisphère gauche dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % et fixer le tissu à 4 °C pendant 24 h. Après la fixation, transférer l'hémisphère cérébral dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant une solution de saccharose à 30 %, puis déshydrater le tissu à 4 °C.
   2. Remplacer la solution de saccharose à 30 % toutes les 24 heures jusqu'à ce que le tissu cérébral coule au fond du tube.
2. Préparation des coupes cryogéniques
   1. Retirer l'hémisphère cérébral déshydraté de la solution de saccharose et essuyer délicatement l'excès de liquide avec du papier filtre stérile.
   2. Monter l'hémisphère cérébral sur le porte-échantillon du cryostat à l'aide d'un milieu d'inclusion OCT (optimal cutting temperature).
   3. Réaliser des coupes coronales sérielles du cerveau d'une épaisseur de 30 µm à l'aide d'un cryostat. Récolter les sections consécutives dans une plaque de 24 puits contenant du PBS stérile 0,01 M.
3. Conservation à long terme des sections cérébrales
   1. Préparer à l'avance la solution de préservation cryoprotectrice pour tranches cérébrales : ajouter 2 g de PVP400, 60 g de saccharose et 60 mL d'éthylène glycol à 100 mL de PBS 0,01 M. Agiter la solution à température ambiante jusqu'à dissolution complète de tous les composants, puis la conserver à 4 °C jusqu'à utilisation.

3. Extraction de l'ARN avec du TRIzol

1. Homogénéisation des tissus et séparation des phases
   1. Homogénéiser le tissu cortical entorhinal dans 1 mL de réactif TRIzol à l’aide d’un homogénéisateur ultrafin et incuber l’homogénat sur de la glace pendant 15 min. Centrifuger à 8 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
   2. Ajouter 200 µL de chloroforme et vortexer pendant 10 s. Centrifuger à 5 600 × g pendant 15 min à 4 °C. Transférer ensuite la phase aqueuse supérieure dans un tube sans RNase. Ajouter 500 µL d’isopropanol et incuber à -20 °C toute la nuit pour précipiter l’ARN. Centrifuger à nouveau.
2. Précipitation de l’ARN, lavage et évaluation de la qualité
   1. Jeter le surnageant et laver le culot d’ARN avec 1 mL d’éthanol à 75 %. Centrifuger à 5 600 × g pendant 5 min à 4 °C. Éliminer le surnageant, sécher le culot à l’air pendant 10 min, puis dissoudre l’ARN dans 20 µL d’eau traitée au DEPC pendant 10 min.
   2. Mesurer la concentration et la pureté de l’ARN (A₂₆₀/A₂₈₀) à l’aide d’un spectrophotomètre. Conserver l’ARN à -80 °C jusqu’à analyse ultérieure.

4. Extraction des protéines totales avec le kit Minute

1. Lysis et homogénéisation des tissus
   1. Refroidir préalablement la colonne de centrifugation et le tube de collecte sur de la glace. Homogénéiser le tissu dans 100 µL de tampon de lyse cellulaire à l’aide d’un homogénéisateur ultrafin. Rincer l’homogénéisateur avec 100 µL supplémentaires de tampon de lyse cellulaire et rassembler les lysats.
2. Récupération et quantification des protéines
   1. Transférer l’homogénat dans la colonne de centrifugation et incuber 2 min à température ambiante.
   2. Centrifuger à 11 000–14 300 × g pendant 2 min.
   3. Placer immédiatement le tube de collecte sur de la glace après la centrifugation et jeter la colonne de centrifugation. Déterminer la concentration en protéines à l’aide d’un dosage BCA.

5. Extraction simultanée d'ARN et de protéines du cortex entorhinal (9–10 mg)

1. Préparation avant l'expérience et préparation des réactifs
   1. Utiliser le kit d'extraction d'ADN/ARN/protéines pour toutes les étapes. N'utiliser que des consommables certifiés exempts de RNase et de DNase (voir Figure 2).
   2. Préparer le tampon de lyse immédiatement avant utilisation : ajouter le cocktail d'inhibiteurs de protéase au tampon de lyse fourni avec le kit à une dilution de 1:100.
2. Lyse des tissus et séparation des phases
   1. Retirer l'hémisphère cérébral droit congelé du stockage à -80 °C et le placer sur de la glace. Utiliser un punch stérile exempt de RNase pour prélever 9 à 10 mg de tissu de la région cérébrale cible.
   2. Homogénéiser complètement le tissu sur de la glace à l'aide d'un homogénéisateur tissulaire électrique jusqu'à ce qu'aucun fragment tissulaire visible ne subsiste. Incuber l'homogénat sur de la glace pendant 10 min afin d'assurer une lyse complète.
   3. Ajouter 200 µL du réactif de séparation fourni avec le kit à l'homogénat. Vortexer vigoureusement le tube pendant 30 s puis incuber à température ambiante pendant 3 min. Centrifuger le tube à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C pour obtenir une séparation complète des phases.
3. Purification et élution de l'ARN
   1. Prélever soigneusement la phase aqueuse supérieure à l'aide d'une pipette munie d'une pointe exempte de RNase. Transférer la phase aqueuse recueillie dans un nouveau tube de 1,5 mL exempt de RNase. Ajouter un volume égal d'éthanol à 100 % à la phase aqueuse recueillie et mélanger.
   2. Transférer 700 µL du mélange dans la colonne de purification de l'ARN fournie avec le kit. Centrifuger la colonne à 5 600 × g pendant 1 min à température ambiante.
   3. Ajouter 500 µL du tampon de lavage 1 pour ARN fourni avec le kit sur la colonne. Centrifuger la colonne à 5 600 × g pendant 1 min à température ambiante.
   4. Puis ajouter 500 µL du tampon de lavage 2 pour ARN fourni avec le kit sur la colonne, puis centrifuger à nouveau. Centrifuger la colonne vide à 8 000 × g pendant 2 min à température ambiante afin d'éliminer complètement l'éthanol résiduel de la membrane de la colonne.
   5. Transférer la colonne dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL exempt de RNase. Ajouter directement 30 à 50 µL d'eau exempte de RNase (préchauffée à 60 °C) au centre de la membrane de la colonne. Incuber la colonne à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger la colonne à 8 000 × g pendant 1 min à température ambiante pour éluer l'ARN.
4. Précipitation et dissolution des protéines
   1. Ajouter 750 µL d'isopropanol à la phase organique restante et à l'interphase dans le tube d'origine après avoir prélevé la phase aqueuse pour l'extraction de l'ARN. Incuber le mélange à -20 °C pendant 30 min afin de précipiter les protéines.
   2. Centrifuger le tube à 8 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et conserver intact le culot protéique au fond du tube.
   3. Ajouter 1 mL d'éthanol à 95 % au culot protéique. Vortexer brièvement le tube pour laver le culot. Centrifuger le tube à 8 000 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Répéter cette étape de lavage deux fois supplémentaires.
   4. Laisser sécher le culot protéique à l'air à température ambiante pendant 5 à 10 min, jusqu'à ce qu'il devienne translucide et qu'aucun éthanol résiduel ne soit visible.
   5. Ajouter 50 à 100 µL de solution de SDS à 5 à 10 % au culot sec. Vortexer vigoureusement le tube pendant 1 min puis incuber sur de la glace pendant 10 min afin de dissoudre complètement la protéine. Centrifuger le tube à 8 000 × g pendant 5 min à 4 °C. Recueillir le surnageant comme extrait protéique final.

6. Coloration en immunohistochimie (IHC)

1. Prétraitement des sections et inactivation des enzymes endogènes
   1. Retirer les sections cérébrales du stockage à -20 °C dans le cryoprotecteur. Utiliser une aiguille en verre pour transférer les sections dans une plaque de 24 puits contenant du PBS 0,01 M (pH 7,4).
   2. Laver les sections trois fois avec du PBS 0,01 M, 5 min par lavage, à température ambiante sur un agitateur.
   3. Incuber les sections avec un bloqueur de peroxydase à 3 % d'oxyde d'hydrogène pendant 10 min à température ambiante afin d'inactiver l'activité peroxydasique endogène. Répéter les étapes de lavage après le blocage.
2. Perméabilisation et blocage non spécifique
   1. Incuber les sections dans du Triton X-100 à 0,5 % pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur pour la perméabilisation de la membrane cellulaire. Répéter les étapes de lavage.
   2. Incuber les sections dans de l'albumine de sérum bovin à 4 % pendant 30 min à température ambiante, suivie d'une incubation avec un inhibiteur de coloration non spécifique pendant 30 min supplémentaires à température ambiante.
3. Incubation avec les anticorps primaires et secondaires
   1. Diluer les anticorps primaires dans une solution d'albumine de sérum bovin à 1 % aux dilutions optimisées suivantes : doublecortine (DCX, 1:4000), antigène nucléaire neuronal (NeuN, 1:3000), molécule d'adaptation liant le calcium ionisé 1 (Iba-1, 1:2000) et protéine acide fibrillaire gliale (GFAP, 1:2000).
   2. Ajouter 200 µL de solution d'anticorps primaires diluée dans chaque puits, en veillant à immerger complètement les sections.
   3. Ajouter 200 µL d'anticorps secondaire marqué à la biotine dans chaque puits. Incuber les sections pendant 30 min à température ambiante.
   4. Laver les sections trois fois avec du PBS 0,01 M, 5 min par lavage. Ajouter 300 µL de conjugué streptavidine-peroxydase dans chaque puits. Incuber les sections pendant 30 min à température ambiante. Répéter les étapes de lavage après l'incubation.
4. Développement chromogène au 3,3′-diaminobenzidine (DAB) et montage sous lamelle
   1. Ajouter 200 µL de solution de travail de DAB dans chaque puits. Surveiller la réaction chromogène au microscope optique.
   2. Monter les sections sur des lames de verre recouvertes de gélatine à l'aide d'une aiguille en verre. Laisser sécher complètement à l'air à température ambiante.
   3. Déshydrater les lames à l'aide d'une série d'éthanol graduée (50 %, 70 %, 90 %, 95 %, 100 %, 100 % d'éthanol, 5 min chacune), suivie d'une clarification dans le xylène deux fois, 5 min chacune.

7. Coloration en immunofluorescence (IF)

1. Prétraitement et perméabilisation des sections
   1. Retirer les sections cérébrales du stockage à -20 °C dans le cryoprotecteur. Transférer les sections dans une plaque de 24 puits contenant du PBS 0,01 M (pH 7,4).
   2. Laver les sections trois fois avec du PBS 0,01 M, 5 min par lavage, à température ambiante sur un agitateur.
   3. Incuber les sections dans du Triton X-100 à 0,5 % pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur.
   4. Laver les sections trois fois avec du PBS 0,01 M, 10 min par lavage, après la perméabilisation.
2. Blocage et incubation avec l'anticorps primaire
   1. Incuber les sections dans une solution de blocage contenant 4 % de BSA et un inhibiteur de coloration non spécifique pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humide.
   2. Aspirer la solution de blocage. Diluer les anticorps primaires dans une solution de BSA à 1 % aux concentrations optimisées et ajouter 300 µL de la solution d'anticorps primaires diluée dans chaque puits. Incuber les sections toute la nuit à 4 °C dans une chambre humide et protégée de la lumière.
3. Incubation avec l'anticorps secondaire
   1. Le lendemain, réchauffer les sections à température ambiante pendant 1 h à l'abri de la lumière. Récupérer la solution d'anticorps primaires et laver les sections trois fois avec du PBS 0,01 M, 10 min par lavage, sur un agitateur à l'abri de la lumière.
   2. Diluer les anticorps secondaires marqués avec un fluorochrome dans une solution de BSA à 1 % selon les dilutions recommandées par le fabricant. Ajouter 300 µL de la solution d'anticorps secondaires dans chaque puits. Incuber les sections à température ambiante pendant 1 à 2 h à l'abri de la lumière.
   3. Laver les sections cinq fois avec du PBS 0,01 M, 5 min par lavage, à l'abri de la lumière.

8. Analyse par PCR quantitative en temps réel (qPCR)

1. Élimination de l'ADN génomique et transcription inverse de l'ARN
   1. Réaliser la transcription inverse afin de synthétiser l'ADN complémentaire (ADNc) à l'aide d'un kit de transcription inverse, en utilisant 1 µg d'ARN total par système de réaction de 20 µL. Utiliser le programme thermocyclage recommandé par le fabricant : 25 °C pendant 5 min, 50 °C pendant 15 min, 85 °C pendant 5 min, puis maintien à 4 °C.
   2. Diluer l'ADNc synthétisé au 1/5 avec de l'eau exempte de RNase. Conserver l'ADNc à -20 °C jusqu'à l'amplification par qPCR.
2. Préparation du système de qPCR et amplification
   1. Préparer le système de réaction de qPCR sur de la glace, dans une hotte PCR dédiée et exempte de RNase. Le système de réaction de 20 µL contient : 10 µL de mélange maître de qPCR, 0,4 µL d'amorce sens (10 µM), 0,4 µL d'amorce antisens (10 µM), 2 µL de matrice d'ADNc diluée, 7,2 µL d'eau exempte de RNase.
   2. Réaliser l'amplification par qPCR en utilisant le programme suivant : dénaturation initiale à 95 °C pendant 30 s ; 40 cycles de 95 °C pendant 10 s et 60 °C pendant 30 s ; puis analyse de la courbe de dissociation allant de 60 °C à 95 °C, par incréments de 0,5 °C tous les 5 s.

9. Immunotransfert

1. Quantification des protéines et préparation des échantillons
   1. Effectuer une dilution des extraits protéiques à des concentrations égales à l’aide d’une solution de SDS à 5–10 %, en se basant sur les résultats du test BCA.
2. Électrophorèse SDS-PAGE et transfert des protéines
   1. Préparer un gel de séparation SDS-PAGE à 10 % et un gel de concentration à 5 % selon les protocoles standards de biologie moléculaire.
   2. Déposer 20 µg de protéines totales par puits dans le gel. Pour les expériences de chargement en gradient, déposer 15 µg, 30 µg et 45 µg de protéines par puits.
   3. Réaliser l’électrophorèse à 80 V pendant 30 min jusqu’à ce que le marqueur protéique pénètre dans le gel de séparation, puis augmenter la tension à 120 V pendant 60–90 min jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol atteigne le bas du gel.
   4. Constituer le sandwich de transfert dans l’ordre suivant (du cathode vers l’anode) : éponge, papier filtre, gel, membrane PVDF, papier filtre, et éponge. Veiller à ce qu’aucune bulle d’air ne subsiste entre le gel et la membrane.
   5. Réaliser le transfert humide à un courant constant de 300 mA pendant 90 min dans un bain de glace.
3. Blockage de la membrane et incubation avec les anticorps
   1. Rincer brièvement la membrane PVDF avec du tampon TBST après le transfert. Incuber la membrane dans une solution de BSA à 5 % pendant 2 h à température ambiante sous agitation pour bloquer les sites de liaison non spécifiques.
   2. Diluer les anticorps primaires dans une solution de BSA à 5 % aux concentrations optimisées. Incuber la membrane avec la solution d’anticorps primaires toute la nuit à 4 °C sous agitation.
   3. Laver la membrane trois fois avec du tampon TBST, 10 min par lavage, sous agitation le lendemain.
   4. Diluer l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dans une solution de lait écrémé à 5 % selon le taux de dilution recommandé par le fabricant. Incuber la membrane avec la solution d’anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante sous agitation.
   5. Laver la membrane trois fois avec du tampon TBST, 10 min par lavage, après l’incubation avec l’anticorps secondaire. Incuber la membrane avec la solution de substrat ECL pendant 1–2 min à l’abri de la lumière.

Résultats

Évaluation de la concentration en ARN, électrophorèse sur gel d'agarose et qPCR

Comme indiqué, l'ARN total et les protéines ont été co-extraits à partir de prélèvements de cortex entorhinal (9–10 mg) à l'aide du kit ADN/ARN/protéine. Des échantillons parallèles traités avec du TRIzol (ARN) ou le kit d'extraction des protéines ont servi de témoins. Le protocole a permis d'obtenir 235 ± 12 ng µL⁻¹ d'ARN, soit 36 % de moins que par la méthode au TRIzol (p < 0,05) (Figure 3A). Néanmoins, les gels d'agarose ont révélé des bandes nettes d'ARNr 28S et 18S ainsi que des signaux 5S, indiquant un ARN intact (Figure 3B). La qPCR pour CD86, IL-1β, TNF-α et IL-6 a produit des courbes de dissociation uniques et symétriques (Figure 3C), et des valeurs de Ct plus faibles ont été observées dans le groupe (Figure 3D) ; toutefois, des études supplémentaires, incluant des analyses de l'intégrité de l'ARN, sont nécessaires pour déterminer si ces différences reflètent une meilleure qualité de l'ARN ou une efficacité accrue d'extraction. Bien que le rendement en ARN ait été inférieur à celui obtenu par extraction au TRIzol, la présence de bandes distinctes d'ARNr 28S et 18S ainsi que des courbes d'amplification spécifiques en qPCR indiquaient que l'ARN extrait était de qualité suffisante pour des analyses ultérieures par qPCR.

Évaluation de la concentration en protéines, électrophorèse SDS-PAGE et analyse par immunotransfert

Conformément aux données d'ARN, le protocole d'extraction double a donné des concentrations totales de protéines inférieures à celles du kit de protéines (p < 0,05). Néanmoins, les immunoblottings ont révélé des bandes immunoréactives nettement plus intenses pour chaque cible analysée (Figure 4A). En accord avec les résultats de quantification de l'ARN, le protocole d'extraction concomitante ARN–protéine permet de récupérer moins de protéines totales que le kit de protéines spécifique à usage unique, ce qui peut être observé par la coloration totale des protéines au bleu de Coomassie (Figure 4B–C). La protéine de référence β-Tubuline a présenté des bandes nettes et stables avec les deux méthodes d'extraction, avec une intensité de signal comparable. La protéine ULK, présente en faible abondance, a également été détectée avec succès dans les échantillons co-extraits. Notamment, les signaux des bandes de PSD-95, p-ERK et p-NFκB p65 étaient nettement plus intenses dans le groupe d'extraction concomitante par rapport au kit d'extraction protéique unique. Un chargement protéique en série allant de 15 µg à 45 µg a produit des gradients de bandes dépendants de la dose pour toutes les cibles détectées dans les deux groupes. Dans l'ensemble, bien que le rendement total en protéines du protocole d'extraction double soit inférieur, la qualité des protéines est suffisante pour une analyse standard par immunoblotting, et les performances globales de détection ne sont pas inférieures à celles des kits conventionnels d'extraction protéique unique.

Immunohistochimie et immunofluorescence

L'immunohistochimie réalisée sur des sections cérébrales conservées entre 0,5 et 7 ans a révélé une marquage robuste des neurones naissants DCX⁺, des cellules sécrétrices AVP⁺ et des neurones MAP2/NeuN⁺ avec une morphologie et des fibres intactes (Figure 5A). L'immunofluorescence de sections âgées de 5 à 7 ans a montré des astrocytes GFAP⁺, des microglies Iba-1⁺ et des neurones activés FosB⁺ bien visibles (Figure 5B). Des sections représentatives conservées entre 0,5 et sept ans ont conservé des signaux immunohistochimiques et d'immunofluorescence détectables dans les conditions testées. Ainsi, la solution de conservation préserve l'intégrité tissulaire et l'antigénicité, permettant une conservation fiable à long terme.

Figure 1 : Schéma du flux de travail intégré de séparation hémisphérique pour la détection morphologique et moléculaire du cerveau. Ce schéma illustre l'ensemble du pipeline expérimental, comprenant la perfusion transcardiale de solution saline chez le rongeur, la bissection médiane du cerveau entier isolé, la fixation et la préparation de cryosections de l'hémisphère gauche pour la coloration en immunohistochimie/immunofluorescence, ainsi que la cryoconservation de l'hémisphère controlatéral en vue d'une extraction simultanée d'ARN et de protéines, suivie d'une analyse par qPCR et de western blot. Toutes les illustrations de souris ont été initialement créées par Jimeng AI. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Flux opératoire pour l'extraction simultanée d'ARN et de protéines à partir de tissu cérébral de rongeur congelé. Le schéma illustre les étapes successives comprenant le prélèvement du tissu cible à partir d’hémisphères congelés, la lyse tissulaire et la séparation en trois phases, la purification et l’élution de l’ARN pour la qPCR, ainsi que la précipitation, le lavage et la dissolution des protéines afin de préparer les échantillons pour la détection par immunobuvardage. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Évaluation du rendement en ARN, de l'intégrité de l'ARN et de la compatibilité avec la qPCR à l'aide d'échantillons microscopiques de cortex entorhinal de rat. (A) Concentrations d'ARN quantifiées obtenues par le kit de co-extraction par rapport à la méthode TRIzol (moyenne ± erreur standard de la moyenne). (B) Électrophorèse sur gel d'agarose montrant des bandes intactes d'ARNr 28S et 18S provenant des deux groupes d'extraction. (C) Curves de fusion uniques confirmant l'amplification spécifique des gènes inflammatoires ciblés et de GAPDH utilisé comme gène de référence. (D) Valeurs de Ct des gènes inflammatoires détectés avec une quantité identique d'ARN en entrée pour les deux méthodes d'extraction. *p < 0,05, **p < 0,01 par rapport au groupe TRIzol. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Évaluation par immunotransfert des protéines récupérées à l'aide du protocole de co-extraction ARN/protéine. (A) Chargement progressif des protéines (15/30/45 µg) montrant des signaux de bandes dépendants de la dose pour les protéines synaptiques et de signalisation. (BDétection de la protéine ULK1 de haut poids moléculaire par coloration au bleu de Coomassie des protéines totales, utilisée comme référence de chargement.CComparaison par immunoblot avec chargement équivalent des protéines cibles entre deux protocoles d'extraction. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Coloration immunohistochimique et immunofluorescente de sections cérébrales en suspension libres conservées entre 0,5 et 7 ans. (A) Microphotographies de colorations immunohistochimiques en champ clair prises avec un grossissement de 200× et 400×. La coloration DCX et AVP a été réalisée sur des échantillons de tissu murin, tandis que la coloration MAP2 et NeuN a été effectuée sur des échantillons de tissu rat. (B) Images représentatives d'immunofluorescence obtenues à partir d'échantillons de tissu rat. GFAP marque les astrocytes, IBA-1 marque les microglies, et FOSB indique l'activité neuronale. Toutes les expériences de coloration par immunofluorescence présentées dans ce panneau ont été réalisées à l'aide d'échantillons de rat afin d'évaluer l'expression des marqueurs neuronaux et la localisation cellulaire, microphotographies à un grossissement de 200×.  Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans la recherche murine, les analyses morphologiques et les tests d'acides nucléiques/protéines nécessitent souvent des échantillons d'animaux distincts en raison de leurs procédures de préparation différentes. Cela augmente l'utilisation d'animaux et introduit une variation biologique interindividuelle, ce qui peut réduire la comparabilité entre les jeux de données histologiques et moléculaires. Pour remédier à ces limitations, nous avons mis au point un protocole permettant d'obtenir des données histologiques et moléculaires à partir du même animal.

La conception centrale de ce protocole réside dans la répartition hémisphérique du tissu cérébral après une perfusion transcardiaque avec du sérum physiologique à 0,9 %^5,6. Un hémisphère est fixé dans du paraformaldéhyde à 4 % pour l'immunohistochimie et l'immunofluorescence, tandis que l'hémisphère controlatéral est conservé à −80 °C en vue d'une extraction concomitante d'ARN et de protéines, suivie de qPCR et de western blot. Toutefois, les paramètres choisis pour l'analyse pourraient ne pas être entièrement comparables entre les deux hémisphères cérébraux. Une latéralisation structurelle et fonctionnelle a été décrite dans les cerveaux de rongeurs, et de telles différences hémisphériques pourraient introduire une variabilité lorsque les analyses sont réalisées sur des côtés opposés^7,8. Par conséquent, les chercheurs doivent sélectionner de façon cohérente le tissu provenant du même hémisphère cérébral, conformément à leurs objectifs de recherche.

Un avantage important de cette méthode est la conservation à long terme de sections cérébrales flottantes fixées. Après déshydratation avec du saccharose à 30 %, des sections coronales de 30 µm sont stockées dans une solution de préservation contenant du saccharose, de l'éthylène glycol et de la PVP. Des études antérieures ont montré que les solutions cryoprotectrices à base de saccharose–éthylène glycol–PVP contribuent à préserver la morphologie tissulaire et l'antigénicité pendant un stockage prolongé^9,10. Toutefois, peu d'études ont évalué des durées de stockage s'étendant sur plusieurs années. Les données de notre laboratoire confirment et prolongent ces résultats : des sections représentatives conservées jusqu'à sept ans ont conservé des signaux immunohistochimiques et d'immunofluorescence détectables dans les conditions testées. Ces observations soutiennent la faisabilité d'un stockage de sections cérébrales flottantes sur plusieurs années pour des analyses rétrospectives et des expériences de suivi.

Notamment, ce protocole présente un autre avantage clé grâce à l'extraction simultanée d'ARN et de protéines à partir d'un seul hémisphère cérébral congelé. Bien que ce protocole d'extraction simultanée produise des quantités légèrement inférieures d'ARN et de protéines par rapport aux méthodes conventionnelles d'extraction ciblant un seul type de biomolécule, les biomatériaux obtenus restent suffisants pour une détection fiable par qPCR et par immunotransfert (Western blot). De manière essentielle, l'extraction concomitante permet de quantifier l'abondance des transcrits et des protéines à partir d'échantillons tissulaires identiques, éliminant ainsi la variabilité biologique résultant du traitement séparé d'échantillons distincts et permettant un profilage moléculaire intégré hautement reproductible^11,12. En outre, cette approche nécessite seulement une faible masse tissulaire d'environ 9–10 mg, ce qui la rend particulièrement adaptée à l'analyse de sous-populations cérébrales discrètes et spécifiques de régions où la disponibilité de l'échantillon est limitée.

Malgré ces avantages significatifs, cette méthode présente également certaines limitations qu'il convient de reconnaître. Premièrement, les rendements relativement faibles en ARN et en protéines peuvent limiter son applicabilité pour des expériences nécessitant de grandes quantités d'acides nucléiques ou de protéines, telles que la purification protéique à grande échelle ou le séquençage ARN à grande profondeur. Deuxièmement, bien que le stockage à long terme des sections soit efficace jusqu'à sept ans, une dégradation progressive de certains antigènes ou acides nucléiques labiles peut tout de même survenir au fil du temps, ce qui pourrait compromettre l'intensité de la coloration ou la sensibilité de la détection moléculaire. Troisièmement, la méthode est actuellement optimisée pour le tissu cérébral murin et pourrait nécessiter des modifications pour être appliquée à d'autres tissus ou modèles animaux alternatifs, la composition tissulaire et les caractéristiques structurelles variant selon les espèces et les organes. Enfin, le SDS à 5–10 % peut interférer avec la spectrométrie de masse, les dosages d'activité enzymatique, les études d'interactions protéine-protéine^13,14 et d'autres applications sensibles au SDS. Des procédures supplémentaires de retrait du détergent ou d'échange de tampon pourraient donc être nécessaires.

En conclusion, ce protocole d'allocation hémisphérique permet des analyses morphologiques et moléculaires appariées sur le même animal tout en réduisant l'utilisation d'animaux et les variations interindividuelles. Ce protocole s'avérerait utile dans les études nécessitant des analyses histologiques et moléculaires appariées, notamment lorsque la disponibilité des tissus est limitée. Sa capacité de stockage à long terme des sections pourrait également faciliter les analyses rétrospectives et l'archivage standardisé des échantillons, tandis que l'utilisation d'échantillons provenant de petites régions cérébrales soutient les investigations spécifiques à une région. Ses principales limitations sont des rendements plus faibles en ARN et en protéines, une asymétrie hémisphérique potentielle, une restriction aux tissus cérébraux murins et une compatibilité limitée avec les applications sensibles au SDS. De futures études devraient optimiser la récupération des biomolécules, valider ce protocole dans d'autres tissus et espèces, et évaluer la stabilité à long terme d'autres cibles moléculaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtubes de centrifugation RNase-free de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Collecte des biopsies tissulaires et des fractions d'extraction d'ARN/protéines.
Tubes coniques de centrifugation de 15 mL	Biofil	CFT010150	Fixation, déshydratation au saccharose et stockage des solutions.
Plaques de culture cellulaire à 24 puits	NEST	702001	Collecte, coloration et stockage à long terme de sections cérébrales en suspension libre.
Solution de saccharose à 30 %	Préparée en laboratoire	N/A	Cryoprotection des hémisphères cérébraux fixés avant la cryocoupe.
Solution de paraformaldéhyde à 4 %	Biosharp	BL539A	Fixation par immersion de l'hémisphère cérébral désigné pour l'étude morphologique.
Buffer de chargement des protéines 5×	Beyotime Biotechnology	DL101	Préparation des échantillons protéiques pour l'électrophorèse SDS-PAGE.
Agarose	Solarbio	Cat: A8201	Évaluation de l'intégrité de l'ARN par électrophorèse sur gel d'agarose.
Anticorps anti-doublecortine	Abcam	ab18723	Anticorps primaire pour l'immunohistochimie de la doublecortine.
Anticorps anti-ERK	Beyotime	AB2014	Anticorps primaire pour le Western blot de l'ERK total.
Anticorps anti-GFAP	Abcam	ab10062	Anticorps primaire pour l'immunofluorescence de la protéine acide fibrillaire gliale.
Anticorps anti-Iba1	Wako	NCNP24	Anticorps primaire pour l'immunofluorescence de la molécule d'adaptation liant le calcium ionisé 1.
Anticorps anti-NeuN	Millipore	A60	Anticorps primaire pour la coloration de l'antigène nucléaire neuronal.
Anticorps anti-NF-κB p65	HUABIO	ET1603-12	Anticorps primaire pour le Western blot de NF-κB p65.
Anticorps anti-ERK phosphorylé	Beyotime	ET1610-13	Anticorps primaire pour le Western blot de l'ERK phosphorylé.
Anticorps anti-PSD95	HUABIO	ET1602-20	Anticorps primaire pour le Western blot de la PSD95.
Anticorps anti-ULK1	HUABIO	ET1704-63	Anticorps primaire pour le Western blot de l'ULK1.
Anticorps anti-β-tubuline	ABclonal	AC021	Anticorps primaire de contrôle de chargement pour le Western blot.
Milieu de montage antifade pour fluorescence	Beyotime	P0126-5	Milieu de montage pour les sections colorées en immunofluorescence.
Kit de détection biotine-streptavidine peroxydase	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Système de détection secondaire pour l'immunohistochimie DAB.
Albumine de sérum bovin	Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	Solution de blocage pour l'immunomarquage et le Western blot.
Souris C57BL/6	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	Souris C57BL/6 âgées de 4 semaines	Animaux expérimentaux pour la collecte de tissu cérébral de souris, si inclus.
Système d'imagerie chimiluminescente	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Détection des signaux chimiluminescents du Western blot.
Microscope confocal à balayage laser	Leica Microsystems CMS GmbH	SN: 591974	Acquisition d'images pour les sections en immunofluorescence.
Solution de préservation cryoprotectrice	Préparée en laboratoire	N/A	Stockage à long terme de sections cérébrales en suspension libre à −20 °C.
Cryostat	Leica	CM1950	Préparation de sections coronales cérébrales de 30 μm.
Kit de substrat chromogène DAB	Sigma	SLBP7387V	Développement chromogène pour l'immunohistochimie.
Solution de coloration nucléaire DAPI	Coolaber	SL7100	Contre-coloration nucléaire pour l'immunofluorescence.
Microscope optique numérique	Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.	Modèle NE910+FL-900	Surveillance du développement DAB et imagerie de sections colorées en champ clair.
DNase I	Vazyme	R223-01	Élimination de l'ADN génomique résiduel avant la transcription inverse.
Anticorps secondaire IgG d'âne anti-lapin conjugué à la 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Anticorps secondaire fluorescent pour l'immunofluorescence.
Anticorps secondaire IgG d'âne anti-lapin conjugué à la 594	Abcam	ab150076	Anticorps secondaire fluorescent pour l'immunofluorescence.
Kit E.Z.N.A. ADN/ARN/Protéine	Omega Bio-Tek	D3892-01
Alimentation électrique pour électrophorèse	Bio-Rad	1645050	Alimentation électrique pour l'électrophorèse sur gel d'agarose et SDS-PAGE.
Éthylène glycol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10009828	Constituant de la solution de préservation cryoprotectrice.
Système d'imagerie de gel	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Imagerie des gels d'agarose pour l'évaluation de la qualité de l'ARN.
Lames de verre recouvertes de gélatine	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD	REF: 10127105P P/N: 80312-2101	Montage des sections cérébrales en suspension libre colorées au DAB.
Logiciel d'analyse d'images	National Institutes of Health	ImageJ/Fiji	Analyse densitométrique des bandes de Western blot et traitement d'images.
Isopropanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	80109218	Précipitation des protéines à partir de la fraction organique/interphasique.
Microcentrifugeuse réfrigérée	Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.	TGL16M	Centrifugation pendant l'extraction des ARN/protéines et les étapes de lavage.
Kit Minute d'extraction des protéines	Invent	MS-026
Milieu de montage au baume neutre	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine	N° de catalogue S30509, CAS 96949-21-2	Recouvrement des sections colorées au DAB déshydratées.
Milieu d'inclusion OCT	Sakura	4583	Milieu d'inclusion pour la cryocoupe des hémisphères cérébraux fixés.
Plaques ou tubes qPCR optiques	Axygen	PCR-0208-C	Récipients pour l'amplification qPCR.
Parafilm	amcor	PM996	Fermeture des plaques multi-puits pour le stockage à long terme des sections.
Pentobarbital sodique	Hualan Bio	57-33-0	Agent anesthésique avant la perfusion transcardiaque.
Boîtes de Pétri	Biosharp	BS-90-D	Manipulation du cerveau sur glace et séparation des hémisphères.
Réactif d'extraction d'ARN au phénol/guanidinium	Sparklade	AC0101-B	Réactif comparateur pour les expériences de contrôle d'extraction d'ARN.
Cocktail d'inhibiteurs de phosphatase	APExBIO	K1015-100	Préservation de la phosphorylation pendant l'extraction des protéines.
Solution saline tamponnée au phosphate	Biosharp	BL601A	Solution de lavage, solvant pour solution de saccharose et solvant cryoprotecteur.
Membre en fluorure de polyvinylidène	Millipore	IPVH08100	Membre pour le transfert en Western blot.
Polyvinylpyrrolidone K40	Sigma	9003-39-8	Constituant de la solution de préservation cryoprotectrice.
Cocktail d'inhibiteurs de protéase	Beyotime	P1045	Prévention de la dégradation des protéines pendant la lyse tissulaire.
Kit d'extraction des protéines	Invent	MS-026	Kit comparateur pour les expériences de contrôle d'extraction totale des protéines.
Système de PCR en temps réel	Amolarray	MA6000	Amplification par PCR quantitative et analyse des courbes de fusion.
Dodécylsulfate de sodium	BioFroxx	3250GR500	Dissolution du culot protéique et préparation des échantillons pour SDS-PAGE.
Lames de rasoir stériles	Biosharp	BS-RB-11	Séparation des hémisphères et découpage du tissu sur glace.
Conjugué streptavidine-peroxydase	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Réactif d'amplification/détection du signal pour l'immunohistochimie DAB.
Saccharose	Hushi	57-50-1	Solution de cryoprotection et solution de préservation cryoprotectrice.
Master mix qPCR SYBR	Vazyme	Q711-02	Amplification par PCR quantitative.
Appareil de transfert	Bio-Rad	1703930	Transfert humide des protéines du gel SDS-PAGE vers la membrane.
Solution saline tamponnée au Tris avec Tween 20	Préparée en laboratoire	N/A	Solution de lavage de membrane pour Western blot.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Perméabilisation des sections cérébrales pour l'immunomarquage.
Trizol	Sparklade	AC0101-B
Kit de détection immunohistochimique UltraSensitive SP (pour anticorps primaire de souris/lapin)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Anticorps secondaire/réactif de détection pour l'immunohistochimie DAB.
Rat Wistar	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	280-320 g, mâle	Animaux expérimentaux pour la collecte de tissu cérébral de rat, si inclus.
Xylène	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Décapage des lames colorées au DAB avant le recouvrement.
Milieu de montage au baume neutre	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine	N° de catalogue S30509, CAS 96949-21-2	Recouvrement des sections colorées au DAB déshydratées.
Conjugué streptavidine-peroxydase	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Réactif d'amplification/détection du signal pour l'immunohistochimie DAB.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Perméabilisation des sections cérébrales pour l'immunomarquage.
Kit de détection immunohistochimique UltraSensitive SP (pour anticorps primaire de souris/lapin)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Anticorps secondaire/réactif de détection pour l'immunohistochimie DAB.
Xylène	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Décapage des lames colorées au DAB avant le recouvrement.