Un protocole multicolore de visualisation 3D-STORM haute résolution pour la minéralisation du collagène dans les fibrilles de collagène de type I recombinant auto-assemblées

Summary

Nous présentons ici un protocole pour distinguer la minéralisation intrafibrillaire de la minéralisation extrafibrillaire dans les fibrilles de collagène recombinant à l’aide de 3D-STORM multicolore, intégrant un marquage optimisé, l’imagerie et l’analyse quantitative de la colocalisation.

Abstract

Ce protocole décrit une méthode multicolore de microscopie de reconstruction optique stochastique tridimensionnelle (3D-STORM) pour la visualisation à l’échelle nanométrique de la minéralisation du collagène dans un modèle de fibrille auto-assemblée de type I recombinant de type I. La méthode permet l’imagerie simultanée du collagène, des protéines non collagéniennes (par exemple, le sulfate de chondroïtine) et des phases minérales de phosphate de calcium. La préparation de l’échantillon implique une amino-silanisation et un auto-assemblage du collagène, suivie d’une minéralisation à l’aide d’un milieu phosphate de calcium qui forme du phosphate de calcium amorphe (ACP) à un stade précoce (30 minutes) et mûrit en hydroxyapatite (HAP) en 6 heures. Un marquage par immunofluorescence multiplexé est ensuite réalisé, et les échantillons sont d’abord évalués par microscopie confocale avant l’acquisition de l’image 3D-STORM à l’aide d’un tampon d’imagerie récupérant l’oxygène. Le traitement et l’analyse des données sont réalisés à l’aide de logiciels accessibles au public. Comparé à la microscopie électronique ou confocale conventionnelle, ce protocole combine spécificité moléculaire avec résolution à l’échelle nanométrique (précision latérale typique 20–30 nm, axiale 50–60 nm), permettant une visualisation tridimensionnelle des schémas de minéralisation intrafibrillaire versus extrafibrillaire. Les résultats représentatifs montrent une visualisation claire des réseaux de collagène, des protéines non collagéniennes associées et des phases minérales dans l’espace tridimensionnel. Des métriques quantitatives, dont le coefficient de corrélation de Pearson (0,89 ± 0,04) et le coefficient de chevauchement de Manders (0,91 ± 0,03), sont fournies dans la section Résultats. Ce protocole offre un outil puissant pour les chercheurs en science des biomatériaux, biominéralisation et ingénierie tissulaire osseuse qui ont besoin d’une compréhension nanométrique de la dynamique de la minéralisation.

Introduction

La minéralisation du collagène est un processus biologique fondamental et essentiel à la formation des tissus durs tels que les os et les^{dents 1}. La structure complexe des fibres de collagène, associée à une régulation finement réglée du dépôt minéral, confère à ces tissus une force mécanique et une intégrité structurelle^{remarquables.} Le collagène ne sert pas seulement d’échafaudage passif, mais aussi de participant actif, orchestrant une déposition minérale précise à travers des interactions moléculaires et physiques^{complexes 3}. Élucider ces mécanismes est crucial pour comprendre des pathologies telles que l’ostéoporose et la carie dentaire, ainsi que pour développer des matériaux biomimétiques destinés aux thérapies^{régénératrices 4}.

Le diamètre des fibres de collagène dans les tissus durs varie d’environ 50 à 100 nm, les particules d’hydroxyapatite (HAP) étant encore plus petites (généralement 2 à 5 nm d’épaisseur et 20 à 30 nm de longueur) et intercalées dans des espaces^{fibrillaires 5}. Bien que les zones de gap puissent agir comme des sites de nucléation, dans les tissus indigènes, les minéraux se forment d’abord dans les espaces interfibrillaires puis s’étendent ensuite en compartiments intrafibrillaires. Les méthodes traditionnelles de caractérisation incluent la coloration histologique, la microscopie laser^{confocale 6,7} et la microscopie^{électronique 8,9}. La coloration histologique permet une évaluation macroscopique mais ne peut pas évaluer les états de minéralisation à l’échelle nanométrique. La microscopie confocale permet d’observer des composants spécifiques mais est limitée par la diffraction (~200 nm latéralement), incapable de résoudre la minéralisation intrafibrillaire et^{extrafibrillaire 10}. La microscopie électronique offre une haute résolution mais manque de spécificité moléculaire. Bien que le marquage immunogold puisse fournir une spécificité moléculaire pour la microscopie électronique, il nécessite un traitement spécialisé et est moins adapté à la visualisation multiplexée et tridimensionnelle de plusieurs composants comparé à STORM, et implique de longs cycles expérimentaux et des coûts^{élevés 11}.

La microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) dépasse la limite de diffraction en localisant les fluorophores individuels avec une grande précision, atteignant une résolution latérale^{de ~20 nm 12}. Comparé à d’autres techniques de super-résolution telles que la microscopie à déplétion d’émission stimulée (STED⁾¹³et la microscopie à éclairage structuré (SIM)¹⁴, STORM offre une précision de localisation supérieure (~20 nm latéralement et ~50 nm axialement) et est compatible avec une gamme plus large de fluorophores organiques. En particulier, STED nécessite des colorants spécialisés et des puissances laser élevées pouvant endommager les échantillons biologiques, tandis que le SIM n’offre qu’une résolution de ~100 nm, insuffisante pour résoudre des caractéristiques à l’échelle du fibrille (50–100 nm). STORM offre un équilibre pratique entre résolution, capacité de multiplexage et compatibilité d’échantillons. Les lignes directrices publiées ont décrit des échantillons d’essai standardisés pour faciliter l’optimisation des paramètres d’imagerie STORM et l’évaluation^{de la résolution 15}. Combiné à des capacités d’imagerie tridimensionnelle, 3D-STORM permet la visualisation nanométrique de plusieurs composants^{simultanément 16}. Les avancées récentes ont étendu STORM à l’imagerie multicolore et multiplexée, permettant la visualisation de plusieurs cibles au sein du même échantillon^17,18.

Ce protocole utilise un modèle biomimétique in vitro basé sur des fibrilles de collagène de type I recombinant auto-assemblées et est explicitement conçu pour des modèles de fibrilles autoassemblées de type I recombinant in vitro afin de distinguer la minéralisation intrafibrillaire de l’extrafibrillaire à l’échelle nanométrique. Il n’est pas adapté à l’imagerie de cellules vivantes, car STORM nécessite des échantillons fixes et des tampons récupérant l’oxygène. Il n’est pas non plus adapté aux tissus natifs hautement minéralisés (par exemple, l’os mature) sans décalcification préalable ni prélèvement d’antigènes. Si seule la densité minérale globale ou la morphologie de grande surface nécessite une évaluation, la microscopie confocale conventionnelle ou électronique est plus efficace.

L’objectif global de ce protocole est de fournir un flux de travail standardisé et progressif pour l’utilisation de 3D-STORM multicolore afin de visualiser la distribution nanométrique des minéraux et des protéines non collagéniennes au sein des fibrilles individuelles de collagène, en mettant particulièrement l’accent sur la distinction entre minéralisation intrafibrillaire et extrafibrillaire. Ce protocole intègre un immunomarquage optimisé avec un tampon d’imagerie adapté permettant le suivi simultané de multiples composants organiques (collagène, protéines non collagéniques) et des phases inorganiques (ACP, HAP) en trois^{dimensions 19}. Une innovation clé est l’évaluation quantitative des schémas de minéralisation intrafibrillaire versus extrafibrillaire. La quantification est réalisée par deux critères indépendants : (1) calculer le coefficient de colocalisation de Pearson entre les canaux minéraux (un colorant indicateur de calcium (par exemple, la calcéine)) et le collagène (un colorant fluorescent rouge lointain) à l’aide du module de colocalisation dans un logiciel d’analyse d’image (coefficient >0,8 indique une forte association) ; (2) analyse de la persistance du signal minéral à travers les tranches Z de fibrilles individuelles : si le signal minéral est présent dans les tranches centrales (Z = 0 à ±120 nm du centre vertical de la fibrille) à une intensité ≥50 % du maximum, il est classé comme intrafibrillaire. Contrairement à la microscopie électronique ou confocale conventionnelle, ce protocole combine spécificité moléculaire avec résolution nanométrique, permettant une distribution spatiale tridimensionnelle de la minéralisation intrafibrillaire.

Ce protocole est conçu pour les chercheurs en science des biomatériaux, biominéralisation et génie tissulaire osseux nécessitant une compréhension nanométrique de la dynamique de la minéralisation. La procédure standardisée peut également être adaptée pour étudier d’autres systèmes minéralisés de collagène, tels que les tranches de dentine déminéralisées ou les hydrogels à base de collagène, en ajustant en conséquence les étapes initiales de préparation de l’échantillon.

Protocol

Toutes les expériences impliquant des échantillons biologiques ont été menées conformément aux directives et règlements des installations centrales de la Faculté de médecine de l’Université du Zhejiang et ont été approuvées par le Comité de biosécurité institutionnelle (certificat d’approbation n° BSL20235710079). Le protocole expérimental décrit ici utilise des réactifs d’origine commerciale et des systèmes biomimétiques in vitro. Il n’implique pas de participants humains, de sujets animaux ou d’échantillons de tissus humains, et ne nécessite donc pas d’approbation éthique d’un comité d’éthique institutionnel.

ATTENTION : Toutes les procédures impliquant des produits chimiques dangereux doivent être effectuées dans une hotte à fumée équipée d’un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants, lunettes de sécurité). Éliminer les déchets chimiques conformément aux règlements institutionnels. Pour le NaN₃, collectez les déchets dans un récipient dédié marqué « déchets azides » et ne les mélangez pas avec des acides (risque de gaz explosif). Pour le glutaraldéhyde, inactivez avec un excès de 10 % de bisulfite de sodium avant l’élimination. Pour le β-mercaptoéthanol, oxydez avec de l’eau de Javel (1:10 v/v) pendant 1 h avant l’élimination par le drain.

REMARQUE : Le marquage par immunofluorescence DOIT être effectué AVANT la minéralisation afin d’éviter le masquage des épitopes par les dépôts minéraux. Pour les applications nécessitant un marquage post-minéralisation, une récupération d’antigènes peut être nécessaire.

1. Préparation du milieu minéralisé

1. Préparation d’un milieu minéralisé pour les fibrilles de collagène reconstituées
   1. Préparez la solution de bouillon de calcium en ajoutant 100 μL d’acide polyaspartique de 5 mg/mL (p-Asp, Mw 9-11 kDa) goutte à goutte sur 5 mL de solution de 3,44 mM CaCl₂ dans un tube conique de 15 mL.
   2. Mélangez le vortex dans le tube pendant 30 secondes jusqu’à ce qu’il soit homogène.
   3. Ajoutez lentement le p-Asp et mélangez soigneusement pour stabiliser le phosphate de calcium amorphe (ACP).
   4. Ajoutez 5 mL de solution phosphatée (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) à la solution de calcium.
   5. Mélange vortex pendant 1 minute.
      REMARQUE : Concentrations finales après mélange : 1,67 mM de CaCl₂, 9,5 mM de Na₂HPO₄, 150 mM de NaCl et 50 μg/mL de p-Asp.
   6. Préparez le milieu de minéralisation immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker ; utilisez immédiatement le précurseur ACP instable pour obtenir des résultats cohérents.
      REMARQUE : Le stockage conduit à une cristallisation prématurée.
2. Préparation d’un milieu de minéralisation pour gels de collagène/dentine déminéralisée
   1. Préparez une solution contenant du calcium en dissolvant 8,77 g de NaCl, 0,01 g de NaN₃, 6,06 g de Tris et 1,11 g de CaCl₂ dans 800 mL d’eau déionisée.
   2. Réduisez le volume à 1 L avec de l’eau déionisée.
   3. Ajoutez 350 μg/mL d’acide polyacrylique (PAA, MW ~1800) à la solution contenant du calcium.
   4. Vortex pendant 1 minute.
      REMARQUE : Utilisez du PAA au lieu du p-Asp pour une meilleure stabilisation à des concentrations de calcium élevées.
   5. Préparez la solution phosphate en dissolvant 0,85 g de Na₂HPO₄ dans 1 L d’eau déionisée pour obtenir 6 mM de Na₂HPO₄.
   6. Filtrez la solution phosphatée à l’aide d’une membrane de 0,22 μm.
   7. Combinez des volumes égaux (par exemple, 500 mL chacun) de solutions de calcium et de phosphate avec un brassage magnétique à 300 tr/min.
   8. Ajustez le pH à 7,4 avec 1 M HCl ou NaOH tout en surveillant avec un pH-mètre.
      REMARQUE : Maintenez un pH à 7,4 ± 0,1. Ne laissez pas de déviations de pH >0,2, qui provoquent une cristallisation prématurée.

2. Préparation des fibres de collagène recombinant

1. Amino-silanisation des plats à fond de verre
   REMARQUE : Ce traitement utilise du triethoxysilane (3-aminopropyl) (APTES) pour introduire des groupes aminés chargés positivement (-NH₂) sur la surface vitrée, ce qui favorise l’adsorption électrostatique et la stabilisation des monomères de collagène chargés négativement.
   1. Ajouter 200 μL de solution APTES (5 % v/v en éthanol absolu) à chaque bol de culture à fond de verre (35 mm, épaisseur #1,5H, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. Assurez-vous de couvrir complètement la surface de la vaisselle avec la solution APTES.
   3. Incubez dans l’obscurité pendant 2 heures à température ambiante (20–25 °C).
   4. Rincez la vaisselle trois fois avec de l’éthanol pur (2 mL par lavage).
   5. Ultrasoniser dans de l’eau déionisée pendant 10 minutes à 40 kHz. Retirez complètement les résidus d’APTES pour éviter la liaison non spécifique.
   6. Les plats silanisés peuvent être conservés secs à 4 °C pendant jusqu’à 1 semaine.
   7. (Optionnel) Cuire pour une meilleure stabilité : placez la vaisselle lavée et séchée au four à 100–120 °C pendant 30 à 60 minutes.
   8. Laissez refroidir à température ambiante avant de continuer.
      REMARQUE : Si vous utilisez des plats en plastique, baissez la température en dessous de 80 °C pour éviter la déformation. Adapter la procédure de silanisation de Bitter et^{Muir 20}.
2. Auto-assemblage du collagène et réticulation
   1. Pipeter 100 μL de solution de collagène-I (50 μg/mL dans 0,1 acide acétique M) sur chaque plat silanisé.
   2. Incubez à 37 °C pendant 10 heures dans une chambre d’humidité (> 90 % d’humidité relative). Maintenez une humidité stable pour éviter l’évaporation de la solution.
   3. Vérifier la formation de la fibrille par microscopie à contraste de phase ou confocale ; Une préparation réussie montre un réseau de fibrilles fin, semblable à une toile.
   4. Pour vérifier la formation correcte de fibrilles au niveau ultrastructurel, préparez un échantillon séparé sur une grille TEM formelle/revêtue de carbone en polyvinyle en suivant les mêmes conditions d’auto-assemblage (collagène-I 50 μg/mL, 37 °C, 10 h, humidité > 90 %).
   5. Colorez avec un acide phosphotingostique à 1 % (pH 7,0) pendant 10 minutes.
   6. Lavez-le à l’eau déionisée.
   7. Examinez sous un microscope électronique à transmission. La fibrillogenèse réussie est indiquée par le motif caractéristique de bandes périodiques D de 67 nm (voir Figure 3).
   8. Aspirez soigneusement la solution résiduelle de collagène provenant des plats à fond de verre.
   9. Ajoutez 2 mL de solution de sulfate de chondroïtine (CS) (50 mg/mL dans PBS, pH 5,5) dans chaque plat.
   10. Incubez à 4 °C pendant 12 heures pour permettre l’adsorption électrostatique du CS sur les fibrilles de collagène.
   11. Préparer la solution de réticulation EDC/^{NHS 21} : dissoudre 0,2 M EDC (1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide) et 0,05 M NHS (N-hydroxysuccinimide) dans un tampon MES (0,1 M MES, pH 5,5).
       REMARQUE : Le tampon MES peut être préparé en dissolvant l’acide libre MES dans de l’eau déionisée et en ajustant le pH à 5,5 avec NaOH.
   12. Retirez la solution CS et ajoutez 2 mL de la solution de réticulation EDC/NHS.
   13. Incubez à température ambiante pendant 2 h pour immobiliser covalentement le CS sur le collagène.
   14. Lavez la vaisselle trois fois avec du PBS (5 mL chacun, 5 min chacun) pour éliminer les réactifs non réagis.
   15. Conservez les fibres de collagène transformées dans des PBS à 4 °C pendant jusqu’à 24 h avant la minéralisation.

3. Marquage par immunofluorescence (réalisé AVANT la minéralisation)

1. Préparation de l’échantillon
   1. Rincez les fibrilles de collagène trois fois avec une solution de NaCl de 500 mM (10 mL par lavage, 5 min chacun).
   2. Laver trois fois avec de l’eau déionisée (10 mL par lavage, 5 min chacun).
   3. Effectuez les lavages sur une plateforme de vibration horizontale tournant à 50 tr/min pour assurer un nettoyage complet tout en minimisant les forces de cisaillement qui pourraient détacher les fibrilles assemblées.
2. Blocage et incubation primaire des anticorps
   1. Incubez avec un tampon bloqueant (albumine sérique bovine à 5 % dans PBS) à 37 °C pendant 1 heure dans une chambre humidifiée.
   2. Préparez un cocktail d’anticorps dans un tampon de blocage : anticollagène-I de lapin (dilution 1:100) et sulfate anti-chondoïtine de souris (dilution 1:100).
   3. Ajoutez 200 μL de cocktail d’anticorps par échantillon.
   4. Couvrez les échantillons avec un film de scellement de laboratoire.
   5. Incubez à 4 °C toute la nuit (12–16 h).
   6. Protège de la lumière avec du papier aluminium. Après l’incubation primaire des anticorps, les échantillons peuvent être conservés dans le PBS à 4 °C pendant jusqu’à 24 heures.
3. Coloration secondaire par anticorps
   1. Éliminez les anticorps primaires non liés en lavant la vaisselle trois fois avec un tampon de lavage (0,1 % Tween-20 dans PBS), 10 minutes par lavage.
   2. Préparez le mélange d’anticorps secondaires fluorescents dans un tampon de blocage (200 μL par plat de 35 mm) contenant : l’IgG anti-lapin de chèvre conjugué à un colorant fluorescent rouge lointain (1:100) et l’IgM anti-souris de chèvre conjugué à un colorant fluorescent rouge (1:100).
      REMARQUE : À partir de cette étape, protégez les échantillons de la lumière pour éviter le photoblanchiment du fluorophore.
   3. Incuber des échantillons à température ambiante (20–25 °C) pendant 1 heure dans l’obscurité.
   4. Lavez la vaisselle trois fois avec un tampon de lavage (10 min chacun) pour éliminer les anticorps secondaires non liés.
      REMARQUE : Conserver les échantillons marqués dans des PBS à 4 °C (protection de la lumière) jusqu’à 48 heures avant l’imagerie. Incluez des contrôles sans anticorps primaires pour vérifier l’autofluorescence.

4. Minéralisation des fibres de collagène (réalisée APRÈS marquage)

1. Procédé de minéralisation
   1. Ajoutez 2 mL de milieu de minéralisation fraîchement préparé par plat.
   2. Incuber à 37 °C pendant 30 minutes (à court terme) pour la formation minérale précoce (ACP).
   3. Sinon, incubez à 37 °C pendant 6 h (à long terme) pour la cristallisation des minéraux matures (HAP).
      REMARQUE : Maintenez une température exacte à 37 °C ± 0,5 °C à l’aide d’un incubateur calibré.
   4. Aspirez doucement le milieu de minéralisation.
   5. Rincez trois fois avec de l’eau déionisée (5 mL par lavage, intervalles de 1 minute).
2. Marquage au phosphate de calcium
   1. Ajoutez 4 μM d’un colorant indicateur de calcium (par exemple, la calcéine) dans un PBS (200 μL par bol).
   2. Incubez à température ambiante (20–25 °C) pendant 30 minutes dans le noir.
      REMARQUE : Le colorant indicateur de calcium (par exemple, la calcéine) se lie aux ions calcium et ne fait pas de distinction entre les phases amorphe et cristalline ; l’affectation des phases est basée sur le temps de minéralisation (30 min = ACP, 6 h = HAP). Il doit être protégé de la lumière avec des tubes ambrés ou du film aluminium.
   3. Rincez cinq fois : trois lavages à l’eau déionisée et deux lavages à 70 % d’éthanol (1 min chacun), en alternant entre les deux.
3. Préparation de l’échantillon pour l’imagerie
   1. Immergez les échantillons dans un tampon d’imagerie : 10 % (p/v) de glycérol dans le PBS. En option, ajoutez un réactif antifondu selon les instructions du fabricant.
   2. Appliquer un volume suffisant (20 à 50 μL) de tampon d’imagerie pour couvrir l’échantillon.
   3. Placez une enveloppe sur l’échantillon.
   4. Conservez les échantillons à 4 °C dans le noir pendant jusqu’à 72 heures.

5. Observation au microscope confocal laser

1. Transfert d’échantillons de stockage à 4 °C à température ambiante (20–25 °C).
2. Laissez 10 minutes d’équilibre pour éviter la condensation.
3. Maintenez une protection légère à l’aide de contenants ambrés ou de film aluminium.
4. Vérifiez que le tampon d’imagerie couvre l’ensemble de l’échantillon.
5. Configurez le microscope confocal avec les réglages suivants :
   1. Pour l’imagerie au collagène (colorant fluorescent rouge lointain) : laser 647 nm, filtre d’émission 650-710 nm.
   2. Pour l’imagerie au phosphate de calcium (colorant indicateur de calcium (par exemple, calcéine) : laser 488 nm, filtre d’émission 500-550 nm.
   3. Objectif : 100× immersion à l’huile (NA 1,4).
   4. Diamètre du trou d’épingle : 1 unité d’air (UA).
   5. Temps de permanence des pixels : 1-2 μs.
      REMARQUE : Effectuez l’alignement laser et la calibration des trous d’épingle avant l’imagerie.
6. Effectuer un balayage séquentiel : premier scan avec excitation de 647 nm (collagène).
7. Effectuer un second balayage avec une excitation minérale de 488 nm.
   REMARQUE : Collectez les canaux séquentiellement pour éviter le passage à travers.
8. Pour la reconstruction 3D, réglez la taille de pas de la pile Z à 0,5 μm ou moins pour garantir un échantillonnage adéquat.
9. Sauvegarder les fichiers avec les métadonnées préservées.
10. Pour l’analyse de colocalisation, utilisez un logiciel d’analyse d’images capable de calculer le coefficient de corrélation de Pearson (par exemple, des logiciels accessibles publiquement avec des plugins appropriés).

6. Imagerie par microscopie de reconstruction optique stochastique tridimensionnelle (3D-STORM)

1. Préparation du tampon d’imagerie^{STORM 22}
   REMARQUE : La glucose oxydase et la catalase sont ajoutées au tampon d’imagerie pour récupérer l’oxygène, réduisant ainsi le photoblanchiment et prolongeant le clignotement des fluorophores, essentiel à la localisation d’une seule molécule dans STORM.
   1. Préparez une solution de glucose oxydase (GOx) à 8 mg/mL dans un tampon d’acétate de sodium de 50 mM (pH 5,1).
   2. Préparez une solution de catalase à 160 μg/mL en 1× PBS.
      REMARQUE : On ajoute les stocks enzymatiques, on les fait congeler instantanément à l’aide d’azote liquide ou un bain de glace sèche/éthanol, et on les conserve à -20 °C ou -80 °C. Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
   3. Préparez un tampon d’imagerie STORM frais sur glace, protégé de la lumière.
   4. Combinez les composants suivants dans l’ordre indiqué pour obtenir un volume final de 1 mL : H₂O stérile sans nucléase (à 1 mL), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM final), 1 M Tris-HCl pH 8,0 (50 μL, 50 mM final), 1 M de cystéamine (MEA) fraîchement préparé ajusté à pH ~7,0 (50 μL, 50 mM final), 50 % (p/v) de glucose (200 μL, 10 % en v/v final), action GOx (200 μL, 1,6 mg/mL final), stock de catalase (200 μL, 32 μg/mL final).
   5. Mélangez doucement par pipette ou inversion. Ne faites pas de vortex.
      REMARQUE : Le tampon doit être préparé frais et maintenu sur la glace, protégé de la lumière. À utiliser dans les 30 minutes suivant la préparation. Pour une optimisation détaillée des conditions d’imagerie STORM, consultez les protocoles établis utilisant les échantillons^{d’essai 15}.
   6. Ajoutez 200 μL de tampon d’imagerie STORM fraîchement préparé pour couvrir complètement l’échantillon.
2. Configuration du système 3D-STORM
   1. Assurez-vous que le chemin d’imagerie est dirigé vers une caméra CCD à multiplication d’électrons (EMCCD).
   2. Activez le module de lentille cylindrique pour l’imagerie 3D.
   3. Réglez le logiciel en mode acquisition 3D STORM.
   4. Configurez les filtres de chemin optique pour les colorants utilisés.
   5. Allumez le laser 647 nm et réglez la puissance à un niveau bas (1-5 mW).
   6. À l’aide d’un objectif d’immersion en huile de 100× (NA ≥1.4), localisez la région d’intérêt en mode aperçu en champ grand ou en mode TIRF en temps réel.
   7. Acquérir une image de fluorescence large champ conventionnelle pour une comparaison ultérieure.
   8. Passer en mode éclairage TIRF.
   9. Calibrez l’angle TIRF pour obtenir un champ d’illumination mince (~100-200 nm) afin de minimiser la fluorescence de fond.
   10. Ajustez le temps d’exposition de l’appareil photo (10-30 ms) en fonction de l’intensité initiale du signal.
   11. Ajustez la puissance du laser d’imagerie en fonction de l’intensité initiale du signal.
   12. Effectuez un bref test d’acquisition.
   13. Vérifiez que les paramètres sont correctement réglés sans provoquer un photoblanchiment rapide.
       REMARQUE : Assurez-vous d’aligner précisément l’axe cylindrique de la lentille avec le plan d’échantillon. La plupart des systèmes modernes disposent d’un étalonnage automatisé. Pour l’étalonnage manuel, utilisez des billes fluorescentes de 100 nm pour vérifier les fonctions d’écartement symétriques et de points ronds (PSF).
   14. Commencez par une exposition de 10 à 30 ms à une puissance laser de 647 nm de 1 à 2 kW^/cm2.
   15. Vérifiez que la densité de clignement est de 0,1 à 1 molécule/^{μm 2}.
   16. Si la densité est trop faible ou trop élevée, ajustez la puissance du laser ou le temps d’exposition en conséquence.
   17. Répétez la vérification et l’ajustement jusqu’à atteindre la densité idéale.
3. Acquisition de données 3D-STORM
   1. Réglez le logiciel d’acquisition en mode « Activation continue ».
   2. Réglez le laser d’imagerie (647 nm) à haute puissance (entrée fibre de 100-500 mW) pour faire passer la plupart des fluorophores à l’état sombre.
   3. Réglez le laser d’activation (405 nm) à faible puissance (0,1–5 mW).
   4. Optimiser empiriquement la puissance de 405 nm pour maintenir 100 à 200 molécules localisées par image dans une région de 256×256 pixels.
   5. Fixez le nombre total d’images entre 10 000 et 20 000.
   6. Utilisez 1 image de lumière d’activation (405 nm) suivie de 5 images de lumière d’imagerie (647 nm) par cycle.
   7. Commencez l’acquisition.
   8. Fonctionne l’EMCCD avec une sensibilité maximale (gain EM appliqué)
   9. Utilisez une exposition de 10 à 30 ms par image.
   10. Lors de l’acquisition, surveillez la densité des molécules actives.
   11. Ajustez la puissance laser de 405 nm pour maintenir un flux constant d’événements à une seule molécule.
       REMARQUE : Les données brutes du film peuvent être stockées sur un disque dur standard pour un archivage à long terme avant reconstruction.
4. Analyse des données de la minéralisation du collagène (utilisant un logiciel d’analyse d’images avec le module STORM)
   1. Dans le logiciel d’analyse, sélectionnez le pilote caméra approprié (module STORM).
   2. Cliquez sur [Interface d’analyse] dans le panneau STORM. La fenêtre d’analyse s’ouvre.
   3. Cliquez sur [Ouvrir le fichier]. Sélectionnez le fichier image brute de microscopie à analyser. Cliquez sur Ouvrir.
   4. Déterminer la valeur minimale de fluorescence (hauteur minimale) pour les signaux valides.
   5. Trouvez la tache la plus sombre encore reconnaissable comme un signal à une seule molécule.
   6. Déplacez la souris vers son centre.
   7. Lisez la valeur de hauteur de pic.
   8. Note cette valeur.
   9. Cliquez sur [Paramètres d’identification]. Dans la boîte de dialogue, définissez les paramètres suivants : Hauteur minimale (entrez la valeur enregistrée à l’étape 6.4.8), Hauteur maximale (20000), Base CCD (100), et pour les données 3D-STORM, cochez « 3D » (décochez pour 2D).
   10. Cliquez >> pour développer plus de paramètres. Réglé : largeur minimale (nm) à 200, largeur maximale (nm) à 700 (400 pour 2D), largeur d’ajustement initiale (nm) à 300, rapport axial max à 2,5 (1,3 pour 2D), et déplacement maximal (pix) à 1.
   11. Cliquez sur OK pour fermer la boîte.
   12. Effectuez une analyse test pour valider les paramètres. Décochez la correction de dérive.
   13. Fixez les périodes à 1.
   14. Cliquez sur [Test].
   15. Après analyse, cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
   16. Vérifiez que les points de signalisation sont correctement identifiés. Le bruit de fond ne doit pas être mal sélectionné. Les vrais endroits ne doivent pas être manqués.
   17. Si cela ne satisfait pas, répétez les étapes 6.4.9–6.4.16 pour ajuster les paramètres jusqu’à ce que les paramètres soient corrects.
   18. Après la validation de l’analyse test, effectuez l’analyse complète. Vérifiez la correction de dérive.
       REMARQUE : Le logiciel d’analyse effectue la correction de dérive à l’aide d’un algorithme de corrélation croisée redondante (RCC) qui maximise la corrélation entre les segments temporels des localisations moléculaires. Aucune perle fiduciaire n’est requise²³.
   19. Conserver les règles = 1.
   20. Cliquez sur [Démarrer] (ou cliquez sur [Test] à nouveau, puis sur [Démarrer]).
   21. Attendez que l’analyse soit terminée. Cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
   22. Après analyse, deux fichiers résultats (.bin et .txt) sont générés dans le même dossier que le fichier .nd2.
   23. Pour l’analyse de colocalisation (canaux 647 nm et 488 nm), affichez les deux canaux simultanément dans la liste des canaux de la fenêtre d’analyse.
   24. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) appropriée.
   25. Utilisez le module de colocalisation pour calculer le coefficient de corrélation de Pearson. Si cela n’est pas automatiquement fourni, exportez manuellement les données du nuage de points vers un plugin de colocalisation dans un logiciel d’analyse d’images accessible publiquement. Notez la valeur.
   26. Effectuer une analyse par tranche Z pour confirmer la minéralisation intrafibrillaire. Dans le menu principal, sélectionnez Afficher > pas en Z > Tranche.
   27. Extraire les plans individuels à des intervalles de 60 nm.
   28. Observez le signal minéral (vert, canal 488 nm). Vérifiez si le signal persiste dans les tranches centrales (Z = 0 nm ±120 nm). La persistance confirme la minéralisation intrafibrillaire.
   29. Optionnel : effectuer un filtrage de densité pour réduire le surcomptage causé par des émetteurs densément compacts. Ouvrez l’image reconstruite STORM dans un logiciel d’analyse d’image accessible publiquement à l’aide d’un plugin pour l’analyse de localisation à une seule^{molécule 24}.
   30. Pour réduire le surcomptage causé par les émetteurs densément compacts, appliquez un filtrage de densité (par exemple, filtre médian ou seuil local de densité) basé sur la densité du signal.
   31. Si la correction de dérive n’a pas été activée à l’étape 6.4.18 ou si une correction supplémentaire est nécessaire, effectuer une correction de dérive. Exact, basé sur le PSF des marqueurs fiduciaires. Sinon, utilisez des algorithmes de corrélation croisée (par exemple, la correction de dérive implémentée dans le même plugin).
   32. Effectuer le démélange spectral pour éliminer la diaphonie du canal. Dans la fenêtre d’analyse STORM, cliquez sur l’outil de suppression de diaphonie (généralement en bas à droite).
   33. Réglez le rayon à 25,0 nm (recommandé). Sélectionnez le canal source. Sélectionnez la méthode de retrait : Statistique est recommandée.
   34. Pour éliminer l’activation croisée causée par le laser d’excitation, sélectionnez Soustraire en plus de NSA > Activation croisée. Cliquez sur OK. Un nouveau canal, Activation Non spécifique-Xt, est automatiquement généré.
   35. Validez les niveaux d’autofluorescence et les signaux de fond à l’aide d’échantillons témoins non colorés. Assurez-vous que tous les signaux sont spécifiquement étiquetés.
   36. Effectuez une visualisation 3D. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) dans la fenêtre d’analyse.
   37. Cliquez sur le bouton [3D] (ou [Afficher 3D]). Générez une projection 3D ou un rendu volumineux.
   38. Faites un clic droit pour ajuster les paramètres de rendu. Exportez des vidéos dans des formats courants (par exemple, .avi ou .mp4).
   39. Pour classer un signal minéral comme intrafibrillaire, effectuer une analyse Z-slice comme dans 6.4.26–6.4.28. Profils d’intensité d’exportation.
   40. Définissons le centre de la fibrille comme le plan Z où le signal du collagène est maximal.
   41. Un signal minéral est considéré comme intrafibrillaire si son intensité en Z = 0 (centre) et en Z = ±60 nm est ≥50 % de l’intensité minérale maximale dans cette fibrille. Si le signal descend en dessous de 30 % à Z = 0, classez comme extrafibrillaire.
   42. Enregistrer la classification pour au moins 50 fibrilles par condition afin de calculer le pourcentage de minéralisation intrafibrillaire.
       REMARQUE : Des plugins publics alternatifs sont également disponibles pour le filtrage de densité, la correction de dérive et le démixage spectral.

Results

La mise en œuvre réussie de ce protocole permet une visualisation tridimensionnelle à haute résolution des fibrilles de collagène minéralisés à l’aide de 3D-STORM multicolore. Les résultats suivants illustrent les résultats typiques, les contrôles qualité et les évaluations quantitatives.

La Figure 1 montre une reconstruction multicolore 3D-STORM d’un réseau de collagène minéralisé avec du phosphate de calcium amorphe (ACP). Le collagène (marqué avec un colorant fluorescent rouge profond) apparaît comme un réseau fibrillaire bien défini. Le sulfate de chondroïtine (GAG, marqué avec un colorant rouge) est étroitement associé aux fibrilles de collagène, et les régions de colocalisation apparaissent cyan dans l’image fusionnée. Il est important de noter que des particules d’ACP (vertes, marquées avec un colorant indicateur de calcium) sont observées dans les limites des fibrilles de collagène, démontrant une minéralisation intrafibrillaire à un stade précoce (30 min). Cette figure met en lumière la capacité du protocole à résoudre simultanément trois composants distincts (collagène, GAG, minéral) à l’échelle nanométrique, un exploit impossible avec la microscopie confocale conventionnelle (voir Figure 5 pour une comparaison de la résolution d’imagerie). La localisation nanométrique de l’ACP dans les fibrilles confirme que le précurseur amorphe peut infiltrer l’intérieur fibrillaire avant la transformation cristalline.

La Figure 2 fournit des preuves quantitatives de la pénétration intrafibrillaire de l’hydroxyapatite mature (HAP) après 6 h de minéralisation. La figure 2A présente des images 2D STORM montrant une implantation extensive du collagène (rouge) et du HAP (vert), avec des canaux fusionnés apparaissant jaunes. La figure 2B est une reconstitution de volumes 3D illustrant l’architecture intégrée. La figure 2C montre l’analyse de tranches sur l’axe Z à des intervalles de 60 nm du haut (Z = −120 nm) au centre (Z = 0) et aux sections plus profondes (Z = +120 nm). Le signal HAP persiste dans les tranches centrales (Z = 0 à ±120 nm) à une intensité ≥50 % du maximum, ce qui répond aux critères de classification pour la minéralisation intrafibrillaire définis aux étapes du protocole 6.4.39–6.4.4.41. L’analyse quantitative de colocalisation de trois expériences indépendantes (n = 3 réplications, chacune avec 5 régions d’intérêt) a donné un coefficient de corrélation de Pearson de 0,89 ± 0,04 et un coefficient de chevauchement de Manders de 0,91 ± 0,03 (moyenne ± écart). Ces valeurs indiquent une association forte et spécifique entre le collagène et le HAP au sein des fibrilles, confirmant que la phase cristalline mature réside également intrafibrillaire.

La figure 3 valide l’intégrité structurelle de l’échafaudage de collagène auto-assemblé à l’aide de la microscopie électronique en transmission. Les fibrilles de collagène colorées à 1 % d’acide phosphotongstique (pH 7,0) présentent le schéma caractéristique de bandes croisées périodiques D de 67 nm, qui est diagnostique de la fibrillogenèse de type native. Cette étape de contrôle qualité est essentielle avant de procéder aux expériences de minéralisation, car elle confirme que l’échafaud est structurellement intact et capable de soutenir le dépôt minéral intrafibrillaire. Sans ce motif de bandes, le collagène peut être dénaturé ou mal assemblé, entraînant des motifs de minéralisation artificielle.

La Figure 4 illustre un résultat négatif représentatif obtenu lorsque les conditions de minéralisation ne sont pas correctement contrôlées (par exemple, l’absence d’acide polyaspartique ou un pH > 7,6). Dans ces conditions sous-optimales, des dépôts de HAP (vert) sont observés exclusivement sur le substrat vitreux à l’extérieur des fibrilles de collagène (rouge), sans invasion intrafibrillaire. Ce résultat constitue un contrôle important : il démontre que la minéralisation intrafibrillaire observée aux Figures 1 et 2 n’est pas due à des précipitations non spécifiques ou à un lavage incomplet, mais nécessite un contrôle précis de l’environnement chimique (pH 7,4 ± 0,1, présence d’acide polyaspartique et utilisation immédiate d’un milieu minéralisé frais). Les chercheurs devraient inclure de tels contrôles négatifs pour valider leur propre système.

La figure 5 montre des images représentatives de microscopie confocale acquises avant l’acquisition STORM pour le dépistage préliminaire des échantillons. Le canal du collagène (Figure 5A) révèle un réseau fibrillaire clair, et le canal HAP (Figure 5B) montre les minéraux associés aux fibrilles. L’image fusionnée (Figure 5C) confirme la colocalisation au niveau limité par la diffraction (~200 nm). Ces images ont deux objectifs : (1) elles vérifient la qualité de l’échantillon (étiquetage adéquat, agrégation minimale et association minérale spécifique) avant de passer à l’imagerie STORM chronophage ; et (2) ils guident la sélection des régions d’intérêt pour l’acquisition 3D-STORM. Il est important de noter que les images confocales manquent de résolution pour distinguer la minéralisation intrafibrillaire de la minéralisation extrafibrillaire. Notez que le signal minéral apparaît continu le long des fibrilles sans révéler s’il est à l’intérieur ou à l’extérieur. Cette limitation souligne la nécessité de l’approche de super-résolution décrite ici.

La figure 6 présente deux expériences témoins. La figure 6A (contrôle sans anticorps primaire) ne montre aucun signal spécifique lorsque seul l’anticorps secondaire est appliqué, confirmant que les signaux observés dans les échantillons marqués ne sont pas dus à une liaison non spécifique à un anticorps secondaire. La figure 6B (contrôle non coloré) ne montre aucun signal de fluorescence (complètement noir), excluant une autofluorescence significative provenant de l’échantillon ou du substrat. Ces contrôles sont essentiels pour valider la spécificité du marquage par immunofluorescence. Tout signal détectable dans ces commandes indiquerait la nécessité d’ajuster les étapes de blocage ou de lavage.

Dans nos conditions d’imagerie optimisées, le système 3D-STORM a atteint une précision de localisation typique de 20–30 nm latéralement et de 50–60 nm axialement, conformément à la littérature originale^{3D-STORM 25}. La correction de dérive a été réalisée lors du post-traitement à l’aide de l’algorithme intégré de corrélation croisée redondante (RCC), qui élimine le besoin de marqueurs fiduciaux^{exogènes 23}. Pour l’assignation des phases, l’ACP a été assigné à 30 minutes de minéralisation et HAP à 6 h, sur la base de la cinétique de maturation établie. La capacité à distinguer ces deux phases temporellement, combinée à la localisation à l’échelle nanométrique, permet aux chercheurs d’étudier la dynamique de la transformation minérale intrafibrillaire.

En résumé, les résultats représentatifs démontrent que ce protocole permet une distinction à l’échelle nanométrique entre la minéralisation intrafibrillaire et extrafibrillaire dans un modèle de collagène recombinant, avec des métriques quantitatives de colocalisation et des contrôles négatifs appropriés. Cette méthode est particulièrement précieuse pour les chercheurs étudiant les mécanismes de biominéralisation, les matériaux biomimétiques et l’ingénierie tissulaire osseuse.

Le tableau supplémentaire 1 résume les problèmes courants rencontrés lors des procédures de minéralisation et d’imagerie STORM, ainsi que leurs causes possibles et les solutions recommandées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 1 : Reconstruction multicolore 3D-STORM des fibrilles de collagène minéralisées. Le collagène (colorant fluorescent rouge, rouge lointain) et le sulfate de chondroïtine (colorant fluorescent GAG, bleu, rouge) sont imaginés simultanément. La colocalisation du collagène et du GAG apparaît sous forme de magenta dans le canal fusionné, et les régions où les trois chevauchements apparaissent blanches. Le phosphate de calcium amorphe (ACP, vert, colorant indicateur de calcium) est également présenté. L’ACP est observé dans les limites des fibrilles de collagène, indiquant une localisation intrafibrillaire. Barre d’échelle : 1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Imagerie 3D-STORM de la minéralisation intrafibrillaire de l’hydroxyapatite (HAP). (A) Images STORM 2D de collagène (colorant fluorescent rouge, rouge lointain), HAP (colorant indicateur de calcium vert) et canal fusionné. (B) Reconstruction de volumes 3D. (C) Analyse de tranche sur l’axe Z à des intervalles de 60 nm (Z = −120, −60, 0, +60, +120 nm). Le signal HAP persistant dans les tranches centrales (Z = 0 à ±120 nm) répond aux critères de classification de la minéralisation intrafibrillaire (intensité ≥50 % du maximum). Localisation quantitative calculée à partir de cette figure : r de Pearson = 0,89 ± 0,04, chevauchement de Mander = 0,91 ± 0,03. Barres d’échelle : 0,1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Validation par microscopie électronique en transmission (MET) des fibrilles de collagène auto-assemblées. Les fibrilles de collagène ont été colorées avec un acide phoshotungstique à 1 % (pH 7,0). Le schéma diagnostique de bandes croisées périodiques D à 67 nm confirme une fibrillogenèse réussie et une intégrité structurelle. Barre-d’échelle : 200 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Résultat négatif représentatif : minéralisation extrafibrillaire. Collagène (colorant rouge, fluorescent rouge lointain) et HAP (colorant indicateur de calcium vert). Le HAP se dépose exclusivement sur le substrat en verre à l’extérieur des fibrilles de collagène, sans invasion intrafibrillaire. Ce résultat sous-optimal est inclus en témoins négatif pour illustrer la gamme des résultats possibles. Barre d’échelle : 0,1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Images confocales représentatives utilisées pour le dépistage préliminaire. (A) Le canal du collagène (colorant fluorescent rouge, rouge lointain) montre un réseau fibrillaire clair. (B) Le canal HAP (colorant indicateur de calcium vert) montre l’association minérale. (C) L’image fusionnée montre la colocalisation du collagène et du HAP. Barre d’échelle = 2 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Expériences témoins. (A) Contrôle sans anticorps primaires : seul anticorps secondaire appliqué ; Aucun signal précis. (B) Contrôle non coloré : pas de fluorophore ni d’anticorps appliqués ; Pas de signal de fluorescence (complètement noir). Barre d’échelle = 1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau complémentaire 1 : Guide de dépannage. Problèmes courants rencontrés lors de la minéralisation et de l’acquisition/analyse 3D-STORM, ainsi que leurs causes possibles et solutions recommandées. Voir le texte pour des numéros d’étape détaillés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole offre un flux de travail complet pour la visualisation nanométrique de la minéralisation du collagène à l’aide du multicolore 3D-STORM. Plusieurs étapes cruciales nécessitent une attention particulière pour garantir des résultats réussis.

Tout d’abord, la préparation de l’échantillon est fondamentale pour une imagerie STORM de haute qualité. L’amino-silanisation des plats à fond de verre doit être approfondie afin d’assurer une fixation stable des fibrilles de collagène lors des étapes suivantes de lavage et d’étiquetage. Les APTES résiduels peuvent provoquer une liaison non spécifique et un fond élevé, tandis que la silanisation incomplète peut entraîner un décollement de fibrille. L’étape d’ultrasonisation recommandée (10 min à 40 kHz) élimine efficacement le silane non lié tout en préservant la fonctionnisation de la surface. Pour les fibres de collagène réticulées, l’EDC/NHS est recommandé²¹ pour une forte spécificité. Sinon, on peut utiliser 0,1 % de glutaraldéhyde (incuber 30 minutes à température ambiante, puis bien laver), mais c’est moins spécifique. Il est crucial de recommander de vérifier la formation correcte des fibrilles par MET avant de procéder à la minéralisation. Comme montré à la Figure 3, la présence du motif caractéristique de bandes périodiques D de 67 nm confirme que le processus d’auto-assemblage a produit des fibrilles de collagène²⁶ structurellement intactes, de type natif et natives. Cette étape de contrôle qualité évite une mauvaise interprétation des résultats résultant d’échafaudages de collagène mal formés ou dénaturés.

Deuxièmement, le milieu de minéralisation doit être préparé avec un contrôle précis du pH (7,4 ± 0,1) et utilisé immédiatement. Le précurseur amorphe du phosphate de calcium (ACP) est très sensible au pH et à la force ionique ; de petites déviations peuvent provoquer une cristallisation prématurée. Par conséquent, le milieu de minéralisation doit être utilisé immédiatement après la préparation. Pour les études nécessitant des comparaisons à travers plusieurs périodes, préparez un nouveau milieu pour chaque expérience plutôt que d’utiliser des solutions stockées. Lorsque les conditions de minéralisation ne sont pas correctement contrôlées (par exemple, un acide polyaspartique insuffisant ou un pH incorrect), la minéralisation extrafibrillaire prédomine, comme le montre la Figure 4. Dans ce témoin négatif, le HAP se dépose exclusivement sur le substrat de verre en dehors des fibrilles de collagène, sans invasion intrafibrillaire. L’inclusion de tels résultats négatifs est essentielle pour valider que le signal intrafibrillaire observé dans les figures 1 et 2 est bien dû à une minéralisation intrafibrillaire contrôlée et non à des précipitations non spécifiques ou à un lavage incomplet. De plus, des études antérieures ont souligné que distinguer la minéralisation intrafibrillaire de l’extrafibrillaire nécessite un contrôle attentif de l’environnement chimique local et la présence d’additifs stabilisateurs tels que l’acide^{polyaspartique 27}.

Troisièmement, le marquage par immunofluorescence nécessite une optimisation minutieuse. La concentration d’anticorps (1:100) fournie convient bien au système de sulfate de collagène et de chondroïtine décrit, mais peut nécessiter une titration pour différents anticorps ou types d’échantillons. Incluez toujours des contrôles sans anticorps primaires pour évaluer l’autofluorescence et la liaison non spécifique. À partir de l’étape secondaire des anticorps, une protection stricte de la lumière est essentielle pour prévenir le photoblanchiment par fluorophore.

Quatrièmement, le tampon d’imagerie STORM doit être préparé frais et utilisé dans les 30 minutes. Le système d’absorption d’oxygène (glucose oxydase/catalase) perd son activité avec le temps, et la cystéamine est à la fois photosensible et sensible à l’oxygène. Pré-aliquote des stocks enzymatiques et leur stockage à -80 °C garantissent une performance constante entre les expériences. La densité de clignotement doit être surveillée en temps réel et ajustée en modulant la puissance laser de 405 nm ; trop peu de molécules prolongent le temps d’acquisition, tandis que trop nombreuses provoquent des PSF chevauchés et une réduction de la précision de localisation. Pour une optimisation détaillée des paramètres d’imagerie STORM, nous renvoions les lecteurs vers les protocoles d’échantillons de test^{établis 15}.

Cinquièmement, le traitement des données nécessite des paramètres standardisés pour des comparaisons significatives entre échantillons. Le seuil minimal de nombre de photons (typiquement 500-1000 photons) exclut les localisations à faible confiance. Si les signaux d’échantillon sont faibles, il peut être réduit à 300 photons, mais il n’est pas recommandé de descendre en dessous de 200 photons. La correction de dérive à l’aide de marqueurs fiduciaux ou d’algorithmes de corrélation croisée est essentielle pour maintenir la résolution, en particulier pour les reconstructions^{3D 28}. Le démélange spectral aide à éliminer la diaphonie entre les canaux, ce qui est essentiel pour une analyse de colocalisation précise. Le dépannage des problèmes courants est présenté dans le Tableau Supplémentaire 1.

Le protocole présente plusieurs limitations. Il est optimisé pour les modèles biomimétiques in vitro ; L’application sur des tissus natifs très minéralisés (par exemple, l’os mature) peut nécessiter des étapes supplémentaires telles que la décalcification ou une récupération d’antigènes plus agressive, ce qui pourrait affecter l’ultrastructure. La dépendance à certains anticorps peut entraîner des problèmes de densité de marquage ou un entrave stérique, en particulier dans les structures densément regroupées. La technique nécessite beaucoup d’équipement, nécessitant l’accès à un microscope STORM haut de gamme avec des lignes laser appropriées et une caméra EMCCD. De plus, le temps total requis (~53 h entre la préparation de l’échantillon et l’analyse des données) peut limiter le débit pour certaines applications.

Malgré ces limitations, ce protocole offre des avantages significatifs par rapport aux méthodes alternatives. Comparé à la microscopie électronique, il assure la spécificité moléculaire grâce au marquage par immunofluorescence, permettant la visualisation simultanée de multiples composants organiques et inorganiques. Comparé à la microscopie confocale, il atteint une résolution spatiale ~10 fois supérieure, permettant de distinguer les schémas de minéralisation intrafibrillaire et extrafibrillaire. La capacité 3D fournit des informations volumétriques essentielles pour comprendre la répartition minérale au sein de la matrice de collagène.

La méthode a une large applicabilité dans la recherche sur la biominéralisation. Les applications potentielles incluent l’étude du rôle des protéines non collagéniennes dans la nucléation minérale, l’évaluation des matériaux biomimétiques pour la régénération osseuse, l’étude de la minéralisation pathologique dans des maladies telles que l’ostéoporose et la carie dentaire, ainsi que l’évaluation des effets des interventions thérapeutiques sur la distribution minérale. Avec des modifications appropriées, le protocole peut être adapté pour étudier d’autres interfaces organo-inorganiques dans les tissus ou biomatériaux.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide polyaspartique (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Stabilisateur pour le phosphate de calcium amorphe
Chlorure de calcium (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Source de calcium
Dibase phosphate de sodium (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Source de phosphate
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Réglage de la force ionique
Acide polyacrylique (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Stabilisateur pour le calcium à haute concentration
Base Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Composant tampon
Azide de sodium (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Agent antimicrobien
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Agent de fonctionnalisation de surface en verre
Éthanol absolu	Sigma-Aldrich	459836	Solvant
Solution de collagène de type I (50 et mu ; g/mL dans 0,1 M acide acétique)	Corning	354249	Échafaudage à auto-assemblage
Sulfate de chondroïtine (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Mimique des protéines non collagéniennes
EDC (1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide)	Sigma-Aldrich	E7750	Réticulateur
NHS (N-hydroxysuccinimide)	Sigma-Aldrich	130672	Activateur de réticulateur
Acide libre MES	Sigma-Aldrich	M5287	Tampon pour la réticulation
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)	Gibco	10010023	Lavage et tampon de dilution
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Agent de blocage
Anticorps anticollagène-I du lapin	Abcam	ab34710	Anticorps primaire du collagène
Anticorps anti-sulfate de chondroïtine de souris	Sigma-Aldrich	C8035	Anticorps primaire pour la SC
Anti-IgG de chèvre conjugué à un colorant fluorescent rouge lointain (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Anticorps secondaire contre le collagène
IgM anti-souris de chèvre conjugué à un colorant fluorescent rouge (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Anticorps secondaire pour l’AC
Calcéine (colorant indicateur calcique)	Sigma-Aldrich	C0875	Marquage au phosphate de calcium
Préadolescent-20	Sigma-Aldrich	P1379	Détergent pour tampon de lavage
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516	Composant tampon d’imagerie
Glucose oxydase (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Récupérateur d’oxygène
Catalase	Sigma-Aldrich	C1345	Récupérateur d’oxygène
Cystéamine (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Thiol pour le clignotement fluorophore
D-glucose	Sigma-Aldrich	G6152	Substrat pour la glucose oxydase
Acétate de sodium	Sigma-Aldrich	S2889	Tampon pour le stock GOx
Acide chlorhydrique (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Ajustement du pH
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	Ajustement du pH
Acide phosphotungstique	Sigma-Aldrich	P4006	Coloration négative pour TEM
Plats de culture à fond de verre (35 mm, #1,5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Échantillonnage de substrat ; épaisseur 0,17 mm
Nettoyeur ultrasonore (40 kHz)	Branson	B200	Dispositif de nettoyage
Chambre d’humidité	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Pour l’auto-assemblage du collagène
Microscope électronique à transmission	Hitachi	HT7800	Imagerie TEM
Grilles TEM Formvar/revêtues de carbone (maillage 200)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	Support des échantillons TEM
Plateforme de vibrateur horizontal	Labnet	S2030-RC	Lavage doux
Microscope laser confocal à balayage	Nikon	A1	Dépistage préliminaire
Système de microscope 3D-STORM (avec lasers 405/488/647 nm, lentille cylindrique, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Imagerie super-résolution
100 et fois ; Objectif d’immersion à l’huile (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	Imagerie haute résolution
Mesure de pH	Mettler Toledo	FiveGo F2	Contrôle du pH
Logiciels d’acquisition et d’analyse STORM	Nikon	NIS-Elements (module STORM)	Acquisition et traitement des données STORM
.nd2 (fichier image brute de microscopie)	Nikon	N/A	Format d’image brut généré par des microscopes Nikon.
Logiciels d’analyse d’images disponibles publiquement	Open source	N/A	par exemple, ImageJ avec le plugin ThunderSTORM pour l’analyse de localisation de molécules uniques (colocalisation, correction de dérive)
Parafilm	Bemis	PM996	Revêtement de l’échantillon pendant l’incubation
Feuille d’aluminium	N’importe quel fournisseur de laboratoires	N/A	Pour la protection de la lumière (par exemple, envelopper des échantillons)
Tubes microcentrifugeuses ambrées	Fisher Scientific	05-669-21	Pour la protection lumineuse des fluorophores
Enveloppes (n° 1.5)	Corning	2855-18	Montage d’échantillons